CN115486415A - 蜂帕金森模型的建立方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜂帕金森模型的建立方法，该方法包括下述步骤：动物选择：选择发育成熟的蜂作为建立蜂帕金森模型的对象；制备鱼藤酮蔗糖花粉溶液：将鱼藤酮溶于二甲基亚砜中，再加入蔗糖花粉溶液，制备鱼藤酮蔗糖花粉溶液；模型建立：给发育成熟的蜂饲喂鱼藤酮蔗糖花粉溶液3天以上，即获得蜂帕金森模型；本发明的方法操作简便，成本低廉，造模周期短，建立的蜂帕金森模型可用于筛选预防或/和治疗帕金森相关疾病药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蜂帕金森模型的建立方法及应用。
背景技术
帕金森病 (PD) 是众所周知的常见神经退行性疾病，全球患病率为0.1%–0.2%，症状包括运动功能障碍和非运动症状。运动功能障碍是PD的关键特征，在临床上表现为运动迟缓、静止性震颤、强直和姿势不稳，这些运动缺陷被认为是由大脑多巴胺能神经元的退化引起的。而非运动症状涉及常见的胃肠道功能障碍，如吞咽困难、胃排空障碍与排便困难等。
鱼藤酮是一种天然存在的杀虫剂，是从龙果属和鱼藤属植物的根部提取而得。在1980 年代， Heikkila等人首次将鱼藤酮用于 PD 研究，在大鼠模型中复现了临床上PD的部分症状。目前，鱼藤酮诱导PD模型的方法已在啮齿类动物、秀丽隐杆线虫、果蝇、斑马鱼等动物中广泛使用。
蜜蜂作为新型模式动物，具有成本低廉、操作简单、模型建立周期短、高通量等优势，特别适用于大规模的实验研究。另外，与其他已广泛用于人类疾病研究的简单模式生物一样，蜜蜂具有与人类同源或类似的器官，例如大脑、脂肪体、卵母细胞、胃肠道和循环系统，这为将蜜蜂用于构建人类疾病动物模型提供了天然的优势。目前的多种帕金森动物模型各自有其优点，但部分模型成本较高，建立周期长且模型效果并不稳定，从而使模型的应用以及对帕金森的疾病机制的研究受到限制。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷同时降低模型建立的成本，本发明提供一种稳定高效的蜂帕金森模型的建立方法，其可用于筛选预防或治疗帕金森相关疾病的的药物，同时能够应用于探究帕金森相关疾病的具体机制。
本发明蜂帕金森模型的建立方法如下：
动物选择：选择发育成熟的蜂作为建立蜂帕金森模型的对象；所述发育成熟的蜂为2~15日龄蜂，在挑选蜂时尽量保证统一体型，剔除体型过小或过大的蜂；
制备鱼藤酮蔗糖花粉溶液：首先按花粉添加量为蔗糖溶液体积25-50%的比例将花粉置于质量体积浓度40-60%的蔗糖溶液中，涡旋混匀后，将溶于二甲基亚砜的鱼藤酮溶液加入提前配好的蔗糖花粉溶液中，制备得到鱼藤酮蔗糖花粉溶液；加入适量花粉是未来保证蜂的进食量以保证蜂帕金森模型的建立，蔗糖是蜂饮食的主要碳源，鱼藤酮蔗糖花粉溶液中鱼藤酮的浓度为50μmol/L~250μmol/L；通过改变鱼藤酮的浓度调节模型的炎症程度，随着鱼藤酮浓度的增加，具体疾病表现也会更加明显。但由于高浓度的鱼藤酮诱导会增加蜂的死亡率，导致帕金森模型的可操作试验期缩短，为了在避免蜂存活率不足的同时保证模型较为明显的帕金森症状，推荐使用100μM浓度的鱼藤酮进行蜂帕金森模型的建立。
模型建立：给所述发育成熟的蜂饲喂所述鱼藤酮蔗糖花粉溶液3天以上，以建立蜂帕金森模型。
所述蔗糖溶液采用0.22μm的滤膜过滤除菌，排除环境可能存在的机会致病菌的影响；
所述花粉也使用无菌花粉，排除环境可能存在的机会致病菌的影响，其灭菌条件为：使用强度为20~40kGy的电子束灭菌3~5h。
本发明中所述发育成熟的蜂为2~15日龄蜂，本申请中的“蜂”是指膜翅目除蚁类昆虫以外的其它昆虫的统称，本申请中的蜂种类不做限定，例如可属于蜜蜂科、叶蜂科、姬蜂科、赤眼蜂科、胡蜂科、沙蜂科等，进一步可属于蜜蜂科下的蜜蜂属、熊蜂属、麦蜂属、无刺蜂属、壁蜂属、切叶蜂属等。
所述发育成熟的蜂为蜜蜂科的蜂，为蜜蜂或熊蜂。
蜜蜂科蜜蜂属9种昆虫统称为蜜蜂，典型特征是能采集花蜜和花粉并能将花蜜酿成蜂蜜，其中最常见的是东方蜜蜂中的中华蜜蜂和西方蜜蜂中的意大利蜜蜂、卡尼鄂拉蜂、欧洲黑蜂等，除此之外还有小蜜蜂、黑小蜜蜂、大蜜蜂、黑大蜜蜂、沙巴蜂、苏威拉西蜂、绿奴蜂等蜜蜂。本申请中的蜜蜂种类不做限定，优选为易于购买和获得的蜜蜂种类。
蜜蜂科熊蜂属500余种社会性昆虫统称为熊蜂，典型特征是体粗壮且全身密被黑色、黄色或各色相间的长毛，广泛分布于除了南极洲和大洋洲以外的世界各地，营巢生活且蜂群结构和蜜蜂完全相同，以显花植物的花粉及花蜜为食，主要种类有重黄熊蜂、短头熊蜂、图拟熊蜂等。本申请中的熊蜂种类不做限定，优选为易于购买和获得的熊蜂种类。
本发明中培育得到成熟的蜂的过程为：挑选蜂巢脾，将蜂巢置于温度25~30℃，湿度50%的培养箱中，并用蔗糖溶液培养过夜，观察蜂蛹羽化状况，培育得到羽化的蜂。将羽化的蜂继续培养1~13天，培养过程中饲喂无菌蔗糖及无菌花粉溶液，排除环境可能存在的机会致病菌的影响，以得到发育成熟的蜂。
无菌花粉的制备过程为：将花粉分装至自封袋，严格封口，经强度为20~40kGy的电子束灭菌3~5h，得到无菌花粉。
本发明另一目的是将上述方法构建的蜂帕金森模型应用在筛选预防或/和治疗帕金森相关疾病药物中，或应用在研究帕金森相关疾病机制中。
所述药物包括化学制剂、生物制剂。
本发明的优点和技术效果：
本发明方法以发育成熟的蜂作为建立蜂帕金森模型的对象，该方法能够高效地引发蜂神经炎症，使蜂大脑多巴胺能神经元减少，多巴胺能神经元标记基因表达量降低，进而导致运动行为障碍，同时该模型重现了帕金森病中会伴随发生的胃肠功能紊乱的症状。
相对于现有技术中的其它常见动物模型，该模型操作简便，成本低廉，造模周期短，帕金森病征显著且疾病程度可调节，适用于大规模帕金森模型的试验，并可用于筛选预防或治疗帕金森相关疾病的新方法或新药物，同时能够应用于探究帕金森相关疾病的具体机制。
附图说明
图1为发明中鱼藤酮对熊蜂帕金森模型生存曲线及体重影响结果，其中A图为存活率，B图为体重；
图2为本发明中鱼藤酮对熊蜂帕金森模型飞行运动能力的影响结果；
图3为本发明中鱼藤酮诱导的熊蜂帕金森模型的肠道全肠长度的统计结果，其中A图为统计柱状图，B图为对照组测量实物，C图为鱼藤酮组测量实物；
图4为本发明中鱼藤酮诱导的熊蜂帕金森模型的肠道切片的HE染色结果图；
图5为本发明鱼藤酮诱导的熊蜂帕金森模型的大脑多巴胺能神经元免疫染色图，其中DAPI是细胞核的荧光染色结果，TH为多巴胺能神经元的荧光染色结果，Merge是将前两者合并后的荧光染色结果；
图6为本发明鱼藤酮诱导的熊蜂帕金森模型大脑多巴胺能神经元标记基因表达情况；
图7为使用t-SNE降维方法展示的合并了帕金森模型熊蜂及正常对照熊蜂大脑数据的单细胞转录组图谱；
图8为使用t-SNE降维方法对Glia细胞群进行亚群分群的鉴定结果；
图9为使用t-SNE降维方法对KC细胞群进行亚群分群的鉴定结果；
图10为使用t-SNE降维方法对OLC细胞群进行亚群分群的鉴定结果；
图11为使用t-SNE降维方法对OPN细胞群进行亚群分群的鉴定结果；
图12为AST2细胞亚群鱼藤酮处理后上调基因的KEGG通路富集分析结果；
图13为mKC细胞亚群鱼藤酮处理后上调基因的KEGG通路富集分析结果；
图14为lKC细胞亚群鱼藤酮处理后上调基因的KEGG通路富集分析结果。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
实施例1：以熊蜂为例建立帕金森模型
1、实验前期准备
称量500g蔗糖，用超纯水定容至1L得到质量体积浓度50%的蔗糖溶液，取0.22μm滤膜过滤除菌，得到实验所需的无菌蔗糖溶液。将购买的花粉（青海省油菜花粉）分装至自封袋，保证严格封口，经强度为30kGy的电子束灭菌4h，得到无菌花粉，向50%无菌蔗糖溶液中加入其体积25%的无菌花粉，涡旋混匀后得到无菌蔗糖花粉溶液。
将鱼藤酮（麦克林公司产品）溶于二甲基亚砜，然后加入提前备好的无菌蔗糖花粉溶液，配制鱼藤酮浓度为100μmol/L的鱼藤酮蔗糖花粉溶液，现配现用。
2、实验熊蜂的挑选及培养
观察蜂蛹成熟状况，挑选合适的蜂巢脾放入干净的塑料方盒，盒身侧方或上方插入装有无菌蔗糖溶液的2mL离心管（管壁打孔）。将盛有蜂蛹的方盒置于温度25~30℃，湿度50%的培养箱中培养过夜。
第二日观察蜂巢脾出蜂情况，将已经羽化并出巢的蜂轻柔取出，分装于一次性透明培养杯中，给每杯新生的熊蜂饲喂50%无菌蔗糖溶液，继续置于恒温培养箱1-2日，待其适应新环境后再进行帕金森诱导。
3、动物分组及实验设计
选择发育成熟的熊蜂作为建立熊蜂帕金森模型的对象，设置四个大组：取样组、生存曲线测试组、体重测试组、飞行能力测试组；
随机选择48只正常熊蜂作为取样组，分成2组：对照组、鱼藤酮组，每组24只熊蜂，用于实验取样；随机选择48只正常熊蜂作为生存曲线测试组，分成对照组、鱼藤酮组，每组24只熊蜂，用于观察生存情况；随机选择48只正常熊蜂作为体重测试组，分成对照组、鱼藤酮组，每组24只熊蜂，用于观察体重变化情况；随机选择100只正常熊蜂作为飞行能力测试组，分成对照组、鱼藤酮组，每组50只熊蜂，用于测试熊蜂的飞行运动能力。
生存曲线测试组、体重测试组和取样组中，对照组自由取食常规无菌蔗糖花粉溶液，鱼藤酮组自由取食浓度为100μmol/L的鱼藤酮蔗糖花粉溶液；飞行能力测试组在前7日自由取食常规无菌蔗糖花粉溶液，保证熊蜂在生长前期的良好发育，第7日开始对照组自由取食常规无菌蔗糖花粉溶液，鱼藤酮组自由取食浓度为100μmol/L的鱼藤酮蔗糖花粉溶液。
熊蜂依据分组设计，以自由取食的方式摄入提前配制的鱼藤酮蔗糖花粉溶液以及各对照溶液3天以上。
实施例2：生存曲线及体重检测
生存曲线测试组以及体重测试组分组后，熊蜂以自由取食的方式摄入提前配制的鱼藤酮蔗糖花粉溶液、无菌蔗糖花粉溶液，每日观察并记录各组中熊蜂的生存情况及体重变化；可能存在因发育缺陷或人为造成物理伤害的熊蜂，在使用鱼藤酮干预前即死亡，此类数据理应剔除，不作为最后的统计数据；
结果见图1，当饮食中添加100μmol/L鱼藤酮时，熊蜂在第2天开始出现死亡情况，在第5天时存活率已不足30%，说明鱼藤酮诱导会严重影响熊蜂的生存能力，同时，鱼藤酮还会导致熊蜂体重降低，喂食了鱼藤酮的熊蜂在第2天开始体重均显著低于对照组。
实施例3：飞行运动能力测试
飞行能力测试组在更换饮食后第3至第5天，对鱼藤酮处理组及对照组分别在飞行磨仪器上进行飞行能力测试。蜂被拴系在飞行磨的悬臂上，利用自己的力量实现环绕式的旋转飞行。当飞行悬臂旋转时，磁传感器会传输电压脉冲，电脑端的 LabView 软件将记录电压脉冲信号，然后通过Microsoft Excel计算每次旋转和蜂整个飞行过程的飞行时间、飞行距离和速度；
结果见图2，100μmol/L鱼藤酮组的熊蜂的飞行平均速度显著低于对照组，说明鱼藤酮显著降低了熊蜂的飞行运动能力，重现了帕金森病中的运动障碍症状。
实施例4：熊蜂的肠道实验、大脑免疫荧光染色、实时荧光定量PCR
取样组的对照组、鱼藤酮组在进食后的第3天至第5天（根据对疾病严重程度的需求，在熊蜂存活情况良好的前提下选择取样时间点）进行取样，用镊子解剖出完整的熊蜂肠道并测量长度；同时采集部分形态完整的全肠固定于4w/v%多聚甲醛溶液中，用于后续的HE染色及病理学观察。解剖熊蜂的大脑，一部分大脑完整取出后固定于4w/v%多聚甲醛溶液中，用于后续大脑免疫荧光染色；另一部分大脑在去除腺体及黑色素后，立刻用液氮冷冻处理，保存于-80℃，用于后续相关基因实时荧光定量PCR(qPCR)分析、单细胞转录组测序。
1、肠道长度、肠道HE染色及病理学观察
1.1当饮食中添加100μmol/L鱼藤酮时，熊蜂的全肠长度显著低于对照组，见图3；说明鱼藤酮诱导的熊蜂帕金森特征之一是会导致肠道缩短，进而影响肠道的正常功能；
1.2形态完整的全肠固定于质量体积浓度4%的多聚甲醛溶液中，然后将已固定的肠道组织送于武汉塞维尔生物科技有限公司，进行后续的石蜡包埋、切片、染色等实验操作；待公司返回组织切片后，于显微镜下进行病理学观察，并结合Image Viewer软件拍摄图像。
熊蜂肠道回肠及中肠部位横切HE染色结果见图4，结果显示，鱼藤酮处理对回肠的影响并不明显，但在中肠部位引发了严重的肠壁黏膜增厚的现象，鱼藤酮处理对熊蜂肠道长度及肠屏障的负面影响，与帕金森病临床上胃肠道功能紊乱症状相似。
2、大脑免疫荧光染色
将已固定于质量体积浓度4%多聚甲醛溶液的熊蜂大脑样品送于武汉塞维尔生物科技有限公司，由公司制备石蜡切片并进行后续的抗原修复、画圈血清封闭、抗体添加、细胞核染色、淬灭组织自发荧光、封片等操作，最后将切片于荧光显微镜下观察并采集得到图像。
结果见图5，熊蜂大脑多巴胺能神经元免疫荧光染色结果显示，100μmol/L鱼藤酮处理后熊蜂大脑内多巴胺能神经元数量减少(TH标记的神经元)，多个主要神经元簇被破坏，说明帕金森模型构建成功，重现了帕金森病关键的病理特征。
3、实时荧光定量PCR(qPCR)
使用FastPure 细胞/组织总 RNA 分离试剂盒 V2（南京诺维赞公司）用于从单个大脑样本中提取总 RNA，并使用 HiScript® III RT SuperMix for qPCR（+gDNAwiper）试剂（南京诺维赞公司）进行 RNA 的逆转录。使用 ChamQ™ Universal SYBR qPCR MasterMix（南京诺维赞公司）在荧光定量PCR仪中测量相对基因表达。为了检测多巴胺能神经元标记基因的转录本，本发明设计了相关引物：TH基因（LOC100646624），正向引物：5'-CGATCTTTGGGCTTGAAGAG -3' ，反向引物：5'- AGTTTCAAAGCGAGCATCGT -3'；actin基因（LOC100648239，内参），正向引物：5'- GATGGATGGTCCAGACTCGT -3' ，反向引物：5'-GAATCGCTGACAGAATGCAA -3'；上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，使用actin基因作为内参对TH基因进行标准化，以根据 2-ΔΔCT 方法量化目标基因 mRNA 的相对表达。
结果见图6，使用qPCR进一步验证多巴胺能神经元的损伤情况，结果表明多巴胺能神经元的标记基因TH在100μM鱼藤酮处理后与对照组相比显著下调，与免疫荧光染色结果保持一致，进一步验证鱼藤酮会损害熊蜂大脑多巴胺能神经元，判断为造模成功。
实施例5：大脑单细胞转录组测序分群分析
将去除了腺体及黑色素的熊蜂大脑样品冻存于液氮，干冰邮寄至青岛华大基因研究院进行10X Genomics单细胞转录组测序，该方法基于微流控技术分离出单个细胞，并对单细胞中的微量mRNA进行高效反转录扩增，然后再进行illumina高通量测序；单细胞转录组测序分析中，首先对测序获得的基因表达 (DGE) 数据矩阵进行筛选，将少于 200 个或多于 2,000 个表达基因的细胞核，或来自线粒体基因的 UMI 计数比例较高(>1%)的细胞核移除。然后使用 Seurat (v.4.0)在 R (v.4.0) 环境中进行归一化、整合、降维、聚类、可视化和标记基因分析，以获得熊蜂大脑单细胞水平的转录图谱。
基因表达矩阵经Seurat (v.4.0)在 R (v.4.0) 环境中进行归一化、整合、降维、聚类、可视化和标记基因分析，然后对获得的熊蜂大脑图谱进行分群。熊蜂大脑的32418个细胞根据已知的各种细胞类型标记基因可聚类分成5种具有不同基因表达模式的细胞类型，分别是胶质细胞(Glia)、肯扬细胞(Kenyon Cell,KC)、视叶细胞(Optic Lobes Cell,OLC)、嗅觉投射神经元(Olfactory Projection Neuron, OPN)、其他神经元(Neurons,N)，使用t-SNE(t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding)的降维方法得到的聚类图谱结果，如图7所示。进一步对Glia、KC、OLC等细胞群进行亚群分析，在特定分辨率下Glia可进一步分成两种星形胶质细胞(AST1，AST2)，皮层神经胶质(COR) , 神经节包裹型胶质细胞(ENS)、神经系统最外层胶质细胞(PER)及次外层胶质细胞(subPER)，见图8； KC可进一步分成小型肯扬细胞(sKC)，中型肯扬细胞(mKC)，大型肯扬细胞(lKC)，以及两类二型肯扬细胞(IIKC1，IIKC2)，见图9；OLC可进一步分为六种无法完全鉴定的OLC细胞亚群(OLC1，OLC2，OLC3，OLC4，OLC5，OLC6)，见图10；OPN细胞群因细胞数量有限，未做进一步分群，见图11。然后针对每个细胞类型的亚群，在鱼藤酮处理和对照组之间筛选具有统计学意义的显著差异基因进行通路富集，最终发现在Glia的AST2亚群细胞、KC的mKC以及lKC亚群细胞中，与对照组相比，大量神经退行性疾病的通路在鱼藤酮处理后显著上调，其中便包括帕金森病通路，见图12-14。这说明鱼藤酮导致熊蜂类帕金森症状的机制，很可能就是通过影响了大脑胶质细胞中的星形胶质细胞以及大脑磨菇体内肯扬细胞中的中型以及大型肯扬细胞。近些年研究已发现星形胶质细胞与帕金森病的相关基因存在强相关性，说明本发明的熊蜂帕金森模型构建成功，且该模型拥有进一步在单细胞水平上研究帕金森的疾病机制的巨大潜力。肯扬细胞是指昆虫大脑蘑菇体的内在神经元，它们对昆虫的嗅觉学习和记忆至关重要，本发明的结果表明帕金森病会影响熊蜂大脑的肯扬细胞，进而可能会影响嗅觉以及记忆功能，这与现有的帕金森病相关研究结论保持一致，帕金森病人可能会在早期出现嗅觉衰退的症状，而记忆力和认知能力的衰退也是帕金森病的主要症状之一。而现有的帕金森动物模型研究中，尤其是昆虫动物模型，例如技术较为成熟的果蝇帕金森模型，尚无研究详细报道帕金森病与肯扬细胞之间的相关性，因此本发明为昆虫帕金森模型提供了新的诊断指标，并为研究帕金森病单细胞水平的分子机制提供新的研究方向。
上述结果表明，蜂帕金森模型的建立方法可适用于蜂类，尤其是蜜蜂科的蜂，例如熊蜂等，并且该方法成功复现帕金森病在临床上的诸多表现。但是对于不同的蜂的种类，其各自的具体实验条件需要进行微调才能达到更好的建模效果。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
Claims (6)
1.一种蜂帕金森模型的建立方法，其特征在于，步骤如下：
动物选择：选择发育成熟的蜂作为建立蜂帕金森模型的对象；
制备鱼藤酮蔗糖花粉溶液：将鱼藤酮溶于二甲基亚砜，再与蔗糖花粉液混匀，制备鱼藤酮蔗糖花粉溶液；
模型建立：给发育成熟的蜂饲喂鱼藤酮蔗糖花粉溶液3天以上，即获得蜂帕金森模型。
2.根据权利要求1所述的蜂帕金森模型的建立方法，其特征在于：鱼藤酮蔗糖花粉溶液中鱼藤酮的浓度为50μmol/L~250μmol/L，蔗糖花粉液是按花粉添加量为蔗糖溶液体积25-50%的比例将花粉置于质量体积浓度40-60%的蔗糖溶液中制得。
3.根据权利要求1所述的蜂帕金森模型的建立方法，其特征在于：发育成熟的蜂为2~15日龄蜂，蜂为蜜蜂或熊蜂。
4.权利要求1-3中任一项所述的蜂帕金森模型的建立方法构建的蜂帕金森模型在筛选预防或/和治疗帕金森疾病药物中的应用。
5.权利要求1-3中任一项所述的蜂帕金森模型的建立方法构建的蜂帕金森模型在研究帕金森相关疾病机制中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：蜂帕金森模型的肯扬细胞用于药物筛选。
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