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CN115485392A - 用于鉴别配体阻断性抗体及用于确定抗体效价的方法 - Google Patents

用于鉴别配体阻断性抗体及用于确定抗体效价的方法 Download PDF

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CN115485392A
CN115485392A CN202180024716.3A CN202180024716A CN115485392A CN 115485392 A CN115485392 A CN 115485392A CN 202180024716 A CN202180024716 A CN 202180024716A CN 115485392 A CN115485392 A CN 115485392A
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CN
China
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antigen
barcode
antibody
sequence
labeled
Prior art date
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Pending
Application number
CN202180024716.3A
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English (en)
Inventor
马里恩·弗朗西斯·塞特里夫
伊芙琳·斯特凡诺夫·格奥尔基耶夫
安德里亚·希阿科拉斯
凯尔西·匹列夫斯基
罗希特·温克特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vanderbilt University
Original Assignee
Vanderbilt University
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Publication date
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Abstract

本公开涉及用于检测配体阻断性抗体和用于确定抗体效价的高通量系统和方法。

Description

用于鉴别配体阻断性抗体及用于确定抗体效价的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年1月24日提交的序列号为62/965,257的美国临时专利申请的权益，该专利申请的公开内容以引用的方式明确并入本文。
关于由联邦政府资助的研究的声明
本发明是根据由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的批准号RO1 AI131722在政府支持下进行的。政府在本发明中享有某些权利。
技术领域
本公开涉及用于检测配体阻断性抗体和用于确定抗体效价的高通量系统和方法。
背景技术
抗体组库(存在于个体中的抗体集合)由于其非凡的多样性和通过体细胞超突变微调抗原特异性的能力，可对入侵病原体做出有效响应。这种抗体组库是潜在治疗剂的丰富来源，但其规模使得只能检验总组库的一小部分。从历史上看，已经发展了多种方法来表征人类感染和疫苗接种样品中的抗原特异性B细胞。最常用的方法包括采用荧光抗原诱饵的单细胞分选、永生化B细胞的筛选和B细胞培养。然而，这些将功能性筛选与可变重链(VH)和可变轻链(VL)免疫球蛋白基因的序列偶联的方法是低通量的；一般来说，单独的B细胞只能同时针对少数抗原进行筛选。所需要的是用于检测配体阻断性抗体和用于确定抗体效价的高通量系统和方法。
发明内容
在一些方面，本文所公开的是用于同时检测抗原和特异性阻断所述抗原与其配体之间的相互作用的抗体的方法，该方法包括：
用独特抗原条形码标记多个抗原；
将多个经条形码标记的抗原提供给B细胞群体以形成混合物；
让所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体结合；
用独特配体条形码标记针对所述多个抗原中的一种或多种抗原的一种或多种配体；
将所述一种或多种配体引入至所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体组成的所述混合物；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述抗原条形码，2)所述细胞条形码和抗体序列，和3)所述细胞条形码和所述配体条形码，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI、所述配体条形码或所述抗原条形码的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述抗原条形码和所述抗体序列的第一UMI计数矩阵和包含所述细胞条形码、所述配体条形码和所述抗体序列的第二UMI计数矩阵；
根据所述第一UMI计数矩阵确定第一LIBRA-seq分值以及根据所述第二UMI计数矩阵确定第二LIBRA-seq分值；以及
如果相较于第一参考水平所述第一LIBRA-seq分值较高且相较于第二参考水平所述第二LIBRA-seq分值较低，则确定所述抗体阻断所述抗原与所述配体之间的相互作用。
在一些实施方案中，经条形码标记的抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。在一些实施方案中，经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。
在一些实施方案中，抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。
在一些实施方案中，经条形码标记的抗原包含来自病原体或动物的抗原。在一些实施方案中，抗原未经纯化。在一些实施方案中，来自病原体的抗原包含来自病毒的抗原。在一些实施方案中，来自病毒的抗原包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合所述抗原的抗体的体细胞超突变水平。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合所述抗原的抗体的互补决定区(CDR)的长度。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合所述抗原的抗体的CDR的基序。在一些实施方案中，CDR选自CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些方面，本文所公开的是用于同时筛选抗原和特异性结合所述抗原的抗体的方法，该方法包括：
使用抗原展示技术产生多个抗原，其中所述多个抗原中的每一者与识别特定抗原的核酸序列相连；
将所述多个抗原提供给B细胞群体；
让所述多个抗原与所述B细胞群体结合；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述识别特定抗原的核酸序列，和2)所述细胞条形码和抗体序列，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI或所述识别特定抗原的核酸序列的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述识别特定抗原的核酸序列和所述抗体序列的UMI计数矩阵；
确定LIBRA-seq分值；
确定所述识别特定抗原的核酸序列；以及
如果所述抗体对所述抗原的LIBRA-seq分值高于参考水平，则确定所述抗体特异性结合所述抗原。
在一些实施方案中，抗原展示技术包括核糖体展示技术。
在一些方面，本文所公开的是用于确定抗体对抗原的结合效价的方法，该方法包括：
用独特抗原条形码标记多个抗原；
将多个经条形码标记的抗原提供给B细胞群体；
让所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体结合；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述抗原条形码，和2)所述细胞条形码和抗体序列，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI或所述抗原条形码的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述抗原条形码和所述抗体序列的UMI计数矩阵；
确定LIBRA-seq分值；以及
如果所述抗体对所述抗原的LIBRA-seq分值高于参考水平，则确定所述抗体对所述抗原具有高结合效价。
附图说明
并入并构成本说明书一部分的附图图解说明了下述方面。
图1示出了未经纯化的重组可溶性抗原的LIBRA-seq。抗原的微表达以平板形式进行。将独特DNA条形码添加至每个孔，并然后将带条形码的抗原汇集并与所关注的细胞混合以供LIBRA-seq分析。
图2示出了非可溶重组形式的抗原的LIBRA-seq。左边分图显示整个病毒用DNA条形码标记并用于LIBRA-seq分析。右边分图显示伪病毒可含有内部条形码并用于LIBRA-seq分析。
图3示出了基于平板的单细胞形式的LIBRA-seq。分离所关注的细胞，然后将其与由带DNA条形码的荧光标记抗原组成的抗原筛选文库混合。抗原阳性细胞为通过荧光激活细胞分选到板的各个孔中的单细胞。将细胞裂解，通过PCR使用含有板和孔特异性引物的引物扩增B细胞受体重链和轻链可变基因以及抗原-寡核苷酸序列。汇集扩增子并测序。
图4示出了微孔形式的LIBRA-seq。用带DNA条形码的荧光标记抗原的抗原文库对细胞进行染色后，利用荧光激活细胞分选对抗原阳性细胞进行分选。将单细胞通过重力沉积在微孔阵列上的容纳有试剂和引物微珠的各个分离的微孔中，并进行LIBRA-seq。
图5示出了用于发现具有配体阻断性的抗体的LIBRA-seq：对于B细胞上的BCR。
图6示出了用于发现具有配体阻断性的抗体的LIBRA-seq：对于B细胞上的BCR。左边分图示出了传统的LIBRA-seq流程，该流程经由对独特抗原条形码进行测序来识别抗原特异性。一些抗体通过阻断蛋白质抗原与配体之间的相互作用来发挥作用。为了识别诸如此类抗体，将带条形码的配体用作LIBRA-seq抗原组的一部分。测序后，对于给定抗原具有高LIBRA-seq分值但对于相应配体具有低LIBRA-seq分值的B细胞可能表明当抗原与给定B细胞的BCR结合时，抗原-配体结合可能会被降低。
图7示出了用于高通量抗原筛选和从头抗原发现的LIBRA-seq。该LIBRA-seq流程有利于与诸如核糖体展示之类的高通量抗原筛选方法偶联。可将核糖体上展示的预先限定的或随机生成的筛选文库与所关注的细胞群体混合并测序。在本实例中，将来自每个结合的核糖体的mRNA序列与细胞条形码以及所有其他细胞转录物掺混，用于B细胞受体序列与所展示的开放阅读框(ORF)的生物信息映射。
图8示出了用于抗体-抗原效价确定的LIBRA-seq(定性效价估计)。将VRC01 RamosB细胞和Fe53 Ramos B细胞与由BG505和BG505的三个表位突变体(N160K、K169E、D358R)以及HA构成的抗原筛选文库混合。总体而言，相比于BG505野生型、BG505 K169E和BG505N160K，对于BG505 D368R，VRC01细胞显示出较低的分值，这与相比于野生型对于D368R突变体VRC01的亲和力降低一致。这些数据表明LIBRA-seq可用于对抗体和抗原进行定性效价估计。
图9示出了用于抗体-抗原效价确定的LIBRA-seq(定量效价估计)。为了定量评估抗体-抗原效价，将相同抗原的若干等分试样独立地用不同的独特条形码进行标记，然后以不同倍数稀释度与B细胞混合。在执行LIBRA-seq后，通过将曲线拟合到给定抗原的倍数依赖性LIBRA-seq分值，获得B细胞的拟效价测量值。
图10为LIBRA-seq测定法示意图，示出了其中针对抗原结合的B细胞进行预过滤的LIBRA-seq。制备所关注的细胞。例如，从血液中分离出供体PBMC。然后，将PBMC用一组带DNA条形码的荧光标记抗原染色。带DNA条形码的抗原用荧光标记链霉亲和素标记。(作为另外一种选择，可将荧光标记寡核苷酸条形码用于抗原-寡核苷酸条形码标记。以这种方式，抗原经荧光标记以供使用荧光激活细胞分选(FACS)进行预过滤。将经荧光标记的抗原与所关注的细胞混合。在单细胞测序之前，经由FACS分选抗原阳性细胞。对抗原阳性细胞的单细胞悬液进行处理并测序。
图11A和图11B示出了其中针对抗原结合的B细胞进行预过滤的LIBRA-seq。图11A示出了使用其中针对抗原结合的B细胞进行预过滤的LIBRA-seq。使用三抗原筛选文库(BG505、CZA97和HA)对VRC01 Ramos B细胞系和Fe53 Ramos B细胞系进行了实验。将细胞与用链霉亲和素-PE标记的带DNA条形码的抗原混合并针对抗原阳性进行分选。处理这些单细胞悬液并测序。显示了对于每种抗原的LIBRA-seq分值，并基于这些分值对每种细胞进行绘图。显示的是从低到高的密度图。基于细胞的LIBRA-seq分值将细胞分为两个群体。图11B示出了VRC01细胞，并且对于BG505和CZA97二者细胞展示出高的LIBRA-seq分值。
图12示出了用于其中针对抗原结合的B细胞进行预先过滤的LIBRA-seq的门控方案，该方案应用于来自供体N90的HIV感染样品。将来自供体N90的PBMC与由HIV三聚体和流感三聚体构成的九抗原筛选文库混合，每种抗原都用链霉亲和素PE标记。在前向散射和侧向散射上对细胞进行门控。然后在侧向散射宽度和高度上针对单细胞态对细胞进行门控。基于前向散射宽度和高度针对单细胞态进一步对细胞进行门控。选通的单细胞态为活/CD14-/CD3-/CD19+。从活/CD14-/CD3-/CD19+群体中，针对IgG+对抗原阳性细胞进行分选并富集。还包括抗原-PE荧光减一对照。
图13A-13B示出了用于鉴别有效抗体的LIBRA-seq抗原滴定。为了使用LIBRA-seq技术创建亲和力类型测量并鉴别高效抗体，应用了含有抗原滴定的抗原筛选文库。筛选文库中包括六种不同量的经寡核苷酸标记的SARS-CoV-2 S蛋白。对SARS-CoV-2 S具有高亲和力的抗体对以较低量添加的S蛋白显示出反应性。图13A示出了描述实验设置的示意图-其中将滴定量的经寡核苷酸标记的S蛋白添加至抗原文库中并将供体PBMC用作细胞输入。温育后，对该抗原具有高亲和力的细胞会结合有许多S蛋白，包括以低浓度添加的那些。图13B显示，在单细胞处理和测序之后，可以对抗原结合进行生物信息学评估，并确定哪些细胞对于所包含的许多或所有刺突蛋白抗原具有高LIBRA-seq分值。
图14示出了使用LIBRA-seq通过鉴别ACE2阻断性抗体评估配体阻断功能。为了使用LIBRA-seq评估配体阻断功能，在筛选文库中包括抗原及其配体。如果抗体不破坏蛋白质与其受体之间的相互作用，则该蛋白质和该受体的LIBRA-seq分值高(左)。如果抗体的确阻断了该相互作用，则该蛋白质的分值高，而该受体的分值低(右)。这允许鉴别阻断受体结合的抗体。这也可以指示抗体的中和潜力。该示意图以SARS-CoV-2为例描述了该实验原理——其中将经寡核苷酸标记的刺突蛋白和经寡核苷酸标记的ACE2(刺突蛋白受体)包含在抗原筛选库中。
图15A-15B示出了用于鉴别有效抗体的具有配体阻断的LIBRA-seq抗原滴定。在此示意图中，抗原滴定以及受体的包含被包括在内，以鉴别具有配体阻断功能的有效抗体。图15A示出了描绘实验设置的示意图-其中将滴定量的经寡核苷酸标记的S蛋白连同经寡核苷酸标记的ACE2受体一起添加至抗原文库中，并且将供体PBMC用作细胞输入。温育后，对该抗原具有高亲和力的细胞会结合有许多S蛋白，包括以低浓度添加的那些。可以阻断该受体-蛋白质相互作用的抗体不会使ACE2与刺突蛋白结合。不阻断该相互作用的抗体会使ACE2与刺突蛋白结合。图15示出了在单细胞处理和测序之后，对抗原结合的生物信息评估和确定哪些细胞对于所包括的许多或所有刺突蛋白抗原具有高LIBRA-seq分值。此外，可以确定哪些细胞结合有或不结合有ACE2。在该实例中，ACE2未与刺突蛋白结合，因此具有低的LIBRA-seq分值，从而表明该抗体能够阻断配体结合。
图16示出了鉴别有效的SARS-CoV-2抗体的扩展LIBRA-seq技术。为了评估亲和力测量和配体阻断功能，进行了三个LIBRA-seq实验。为了评估亲和力测量，在实验1中，抗原文库由SARS-CoV-2 S蛋白的抗原滴定以及对照抗原流感HA NC99和HIV ZM197构成。为了评估配体阻断，在实验2中，抗原文库由SARS-CoV-2 S蛋白及其受体ACE2和对照抗原流感HANC99和HIV ZM197构成。为了评估与配体阻断相结合的亲和力测量，在实验3中，抗原文库由SARS-CoV-2 S蛋白的抗原滴定、ACE2和对照抗原流感HA NC99和HIV ZM197构成。将每个抗原文库与SARS-CoV-2恢复期供体PBMC一起温育，并进行LIBRA-seq。在经过单细胞处理、下一代测序和生物信息学分析后，评估了数千个细胞的抗体重链和轻链序列特征以及抗原LIBRA-seq分值。对于抗原滴定实验，鉴别了对于以较低量添加的S蛋白显示出高分值的抗体。对于配体阻断，鉴别了对于S蛋白具有高分值而对于ACE2具有低分值的抗体-从而显示了这些抗体的配体阻断功能。基于这些特征对抗体进行优先级排序以供表达和进一步测试(参见图17)。
图17A-17C示出了利用抗原滴定和配体阻断特征根据LIBRA-seq对具有各种序列特征和功能概况的抗体进行优先级排序。如图16中所示，在SARS-CoV-2的情况下进行三个实验来评估亲和力测量和配体阻断。利用重链序列和轻链序列的遗传特征(包括克隆扩增、VH基因使用、VH同一性、CDRH3序列和序列长度、VL基因使用、VL同一性、CDRL3序列和序列长度)以及每个文库中使用的抗原的LIBRA-seq分值对抗体进行优先级排序以供表达和表征。对于每个实验，示出了选择的优先级排序的抗体，以及它们的遗传特征和LIBRA-seq分值。每行代表一种抗体。文库中的每种抗原的LIBRA-seq分值展示为热图，其中LIBRA-seq分值为-2展示为棕褐色，分值为0展示为白色，分值为2展示为紫色。对这些抗体进行表达、纯化以及对于与SARS-CoV-2 S和SARS-CoV-1 S的结合(显示为曲线下的ELISA面积(AUC))和SARS-CoV-2的中和进行表征。针对抗原的ELISA结合数据展示为AUC分析的热图，其中AUC为0展示为白色，最大AUC展示为紫色。中和显示为弱、部分或强，分别为绿色、黄色和红色。非中和抗体被列为白色。此外，通过测试与各种S蛋白亚结构域的结合来进行表位作图，并列出了所确定的表位。ND代表未完成。HP代表hexapro，表示筛选文库中使用的SARS-CoV-2hexapro S变体。图17A显示根据实验1(使用抗原滴定评估亲和力测量)对九种抗体进行优先级排序和测试。图17B显示根据实验2(配体阻断的评估)对十种抗体进行优先级排序和测试。图17C显示根据实验3(与配体阻断相结合的亲和力测量的评估)对十一种抗体进行优先级排序和测试。除了此处突出显示的选择抗体外，数据集中还有数千种其他抗体。图17A中的序列为CARDPASYYDFWSGYVDYYYYGMDVW(SEQ ID NO：1)、CARDPASYYDLWSGYVDYYYYGMDVW(SEQ ID NO：2)、CARSGGYRLWFGELW(SEQ ID NO：3)、CAREGAVGATSGLDYW(SEQ ID NO：4)、CARGFDYW(SEQ ID NO：5)、CARGAGEQRLVGGLFGVSHFYYYMDVW(SEQ ID NO：6)、CAKSATIVLMVSAIYW(SEQ ID NO：7)、CARVRGGEWVGDLGWYYYYGMDVW(SEQ ID NO：8)、CVKGATKIDYW(SEQ ID NO：9)、CQQYGNSRLTF(SEQ ID NO：10)、CHHYGSSRLTF(SEQ ID NO：11)、CQQYGGSPATF(SEQ ID NO：12)、CYSRDSSGNPLF(SEQ ID NO：13)、CQQYGSSPWTF(SEQ ID NO：14)、CQQYNSYPWTF(SEQ ID NO：15)、CSSYTSTSTLVF(SEQ ID NO：16)、CMQALQTPRTF(SEQ IDNO：17)、CFSYTSGGTRVF(SEQ ID NO：18)。图17B中的序列为CAADPFADYW(SEQ ID NO：19)、CARGLWFGDSETVWFDPW(SEQ ID NO：20)、CVKGKIQLWLGADYW(SEQ ID NO：21)、CARKPLLHSSVNPGAFDIW(SEQ ID NO：22)、CAREKGYSSSSSATYYLDFW(SEQ ID NO：23)、CARRVPGDYYCLDVW(SEQ ID NO：24)、CARGGLWGTFDYW(SEQ ID NO：25)、CARAYGGNYYYGMDVW(SEQ ID NO：26)、CASLGGDSYISGTHYDRSGYDPW(SEQ ID NO：27)、CARVNRVGDGPDFW(SEQ IDNO：28)、CATWDDSLNAWVF(SEQ ID NO：29)、CQQSYSTPPTF(SEQ ID NO：30)、CQQSYNTPWTF(SEQID NO：31)、CQQYATSPRTF(SEQ ID NO：32)、CQSYDSSLTALVF(SEQ ID NO：33)、CQQSFSARVPTF(SEQ ID NO：34)、CQQFAYSLYTF(SEQ ID NO：35)、CQAWDSSTASFVF(SEQ ID NO：36)、CQRRSNWPPFTF(SEQ ID NO：37)、CMQALQTPWTF(SEQ ID NO：38)。图17C中的序列示出了CTRGGWPSGDTFDIW(SEQ ID NO：39)、CAREGGWYSVGWVDPW(SEQ ID NO：40)、CARDRRIIGYYFGMDVW(SEQ ID NO：41)、CARLLIEHDAFDIW(SEQ ID NO：42)、CAREEGSGWWKHDYW(SEQ ID NO：43)、CVRDRRIVGYYFGLDVW(SEQ ID NO：44)、CAKDAFYYGSGSHFYYYYYMDVW(SEQ IDNO：45)、CARDRRGGGWTASFDFW(SEQ ID NO：46)、CARGGWPSGDTFDIW(SEQ ID NO：47)、CAHHTVPTIYDYW(SEQ ID NO：48)、CAKDIGRYDHYNIFGRVGGAFDIW(SEQ ID NO：49)、CQQYGSSRTF(SEQ ID NO：50)、CCPYADTWVF(SEQ ID NO：51)、CMQALHFPYTF(SEQ ID NO：52)、CQQLSGYPYTF(SEQ ID NO：53)、CCSYATTWVF(SEQ ID NO：54)、CQQYGSSPTF(SEQ ID NO：55)、CQQHYSTPGYTF(SEQ ID NO：56)、CQQLNSYPEITF(SEQ ID NO：57)、CSSYAGSNPLVF(SEQ ID NO：58)、CQHYDNLPRF(SEQ ID NO：59)，
图18A-18C示出了使用LIBRA-seq抗原滴定鉴别SARS-CoV-2抗体。利用抗原滴定可以实现亲和力型测量。通过将S抗原的LIBRA-seq分值相对于添加至文库的抗原的量作图，创建了代表性的“结合曲线”。图18A示出了根据实验1(使用抗原滴定评估亲和力测量)，使用该方法从SARS-CoV-2恢复期样品中鉴别的一种抗体的LIBRA-seq分值。图18B显示将这些分值相对于筛选文库中用于滴定的抗原量作图。图18C示出了该示例抗体(以黑色显示)与从该供体鉴别的其他选择抗体(彩色)的比较。有多种LIBRA-seq分值结合曲线可用于估计抗原亲和力。可以从这些曲线估计其他测量值，例如像EC50。
图19示出了用于鉴别有效抗体的具有配体阻断的SARS-CoV-2 S滴定。对于实验3(与配体阻断相结合的亲和力测量的评估)，从实验中鉴别的所有细胞都显示为点，其中y轴为ACE2的LIBRA-seq分值，X轴为SARS-CoV-2 S的LIBRA-seq分值。每个图示出了所添加的SARS-CoV-2 S滴定量中的一者的LIBRA-seq分值。这些图分别从高到低、从左到右示出。通过这些图，可鉴别出SARS-CoV-2 S和ACE2双阳性群体(箭头所示)，以及SARS-CoV-2 S阳性/ACE2阴性群体(箭头所示)。该群体代表具有配体阻断功能的细胞。此外，由于包括了刺突蛋白的滴定，因此可以鉴别对于以较低量添加的刺突蛋白显示出高分值并且对于ACE2也呈阴性的细胞(以红色圆圈示出)。该细胞群体可以是高效的ACE2阻断抗体。
图20A-20C示出了使用流式细胞术区分CD4结合位点定向抗体。图20A示出了概念验证实验的示意图，其中VRC01(红色，左)识别HIV包膜蛋白(灰色)的CD4结合位点，其阻断HIV包膜蛋白与CD4配体(绿色)的相互作用。VRC34(紫色，右)识别HIV包膜蛋白上的一位点，其不阻断这种相互作用。图20B-20C示出了通过流式细胞术测量的可溶性HIV包膜蛋白和CD4蛋白与表达VRC01和VRC34的Ramos B细胞系的结合。示出了作为阴性对照的流感特异性FE53 Ramos B细胞系。
图21示出了用于鉴别来自供体45的病毒特异性抗体的流式分选策略。为了证明LIBRA-seq从HIV感染样品中鉴别配体阻断性抗体序列的能力，使用一组3种经寡核苷酸标记的HIV包膜蛋白抗原和经寡核苷酸标记的可溶性CD4抗原对来自NIH供体45的PBMC进行染色。选择NIH供体45进行调查是因为先前表征的该供体中所鉴别的CD4结合位点抗体谱系的数量。
图22显示LIBRA-seq分值的分布可鉴别来自供体45的cd4结合位点特异性b细胞序列。实验中使用的单种HIV抗原的最大LIBRA-seq分值(LSS)对CD4 LSS的图，其中每个点代表单个细胞。被认为是HIV Ag+CD4-的细胞(暗红色，定义为HIV Ag LSS＞1且CD4 LSS＜1)预计是CD4结合位点特异性的。相反，被认为是HIV Ag+CD4+的细胞(暗紫色，定义为HIV AgLSS＞1且CD4 LSS＞1)预计会在CD4结合位点外识别HIV包膜蛋白。
具体实施方式
本文所公开的是用于检测配体阻断性抗体和用于确定抗体效价的高通量系统和方法。
现在将详细参考本发明的实施方案，其实例在附图和实施例中示出。然而，本发明可以以许多不同的形式来实施并且不应理解为受限于本文列出的实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一致。本文所用的术语“包含”及其变型形式与术语“包括”及其变型形式同义地使用，并且是开放的、非限制性术语。尽管本文已经使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方案，但是术语“基本上由……组成”和“由……组成”可用于替代“包含”和“包括”以提供更具体的实施方案并且也是公开的。如本公开中以及随附的权利要求书中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个指代物，除非上下文另外明确规定。
提供以下定义是为了充分理解本说明书中使用的术语。
术语
本文所用的术语“约”在提及诸如量、百分比等之类的可测量值时，旨在涵盖从所述可测量值变化±20％、±10％、±5％或±1％。
如本文所用，术语“可以”、“任选地”和“可任选地”可互换使用，并且旨在包括其中条件发生的情况以及条件不发生的情况。因此，例如，制剂“可以包含赋形剂”的陈述旨在包括其中制剂包含赋形剂的情形以及制剂不包含赋形剂的情形。
如本文所用，术语“受试者”或“宿主”可以指诸如哺乳动物之类的活生物体，包括但不限于人、家畜、狗、猫和其他哺乳动物。治疗剂的施用可以以有效治疗受试者的剂量和时段进行。在一些实施方案中，受试者为人。
如本文所用，“核苷酸”、“核苷”、“核苷酸残基”和“核苷残基”可意指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸残基，或者其他相似核苷类似物。核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸根部分的分子。核苷酸可以通过它们的磷酸根部分和糖部分连接在一起从而产生核苷之间的键。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸根部分是五价磷酸根。核苷酸的非限制性实例将是3′-AMP(3′-一磷酸腺苷)或5′-GMP(5′-一磷酸鸟苷)。有许多种类的这些类型的分子在本领域中可用并且在本文中可用。
术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体构成的单链或双链聚合物。
本文公开的方法和系统包括使用能够与所公开的核酸相互作用的引物，诸如本文所公开的抗原条形码。在某些实施方案中，将引物用于支持DNA扩增反应。通常，引物能够以序列特异性的方式延伸。引物以序列特异性的方式延伸包括其中与该引物杂交或以其他方式关联的核酸分子的序列和/或组成引导或影响由引物延伸所产生的产物的组成或序列的任何方法。因此引物以序列特异性的方式延伸包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或逆转录。以序列特异性的方式扩增引物的技术和条件是优选的。在某些实施方案中，将引物用于DNA扩增反应，诸如PCR或直接测序。应当理解，在某些实施方案中，也可以使用非酶促技术来延伸引物，其中例如，用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸经修饰，使得它们将发生化学反应而以序列特异性的方式延伸引物。通常，所公开的引物与所公开的核酸或该核酸的区域杂交，或者它们与该核酸的互补物或该核酸的区域的互补物杂交。
术语“扩增”是指产生一个或多个拷贝的遗传片段或靶序列，具体而言为“扩增子”。由于其指的是扩增反应的产物，因此扩增子可与通用的实验室术语诸如“PCR产物”互换使用。
术语“多肽”是指由通过肽键连接的D-氨基酸单链或L-氨基酸单链或者D-氨基酸和L-氨基酸的混合物组成的化合物。
如本文所用，术语“抗原”是指能够刺激免疫应答诸如通过产生对抗原特异的抗体的分子。本发明的抗原可以是例如来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。本发明的抗原也可以是例如人抗原(如癌基因编码的蛋白质)。
术语“抗体”在本文中以广义使用，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”中还包括的是那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子或其片段的人或人源化形式，只要是针对它们与HIV病毒特异性相互作用的能力对其进行选择，从而预防、抑制、减少或延迟HIV病毒感染。可以使用本文所述的体外测定法或通过类似方法测试抗体的所需活性，然后根据已知的临床测试方法测试它们的体内治疗和/或预防活性。人免疫球蛋白有五种主要类型：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中数种可进一步分为亚型(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将会认识到小鼠的类似类型。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
每个抗体分子由两个基因(重链基因和轻链基因)的蛋白质产物组成。重链基因是通过V、D和J基因区段的体细胞重组构建的。在人中，人第14号染色体上有51个VH、27个DH、6个JH、9个CH基因片段。轻链基因是通过V和J基因区段的体细胞重组构建的。人第14号染色体上有40个Vκ、31个Vλ、5个Jκ、4个Jλ基因片段(80个VJ)。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。来自任何脊椎动物物种的抗体的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列归属为两种明显截然不同的类别(称为卡帕(κ)和兰布达(λ))中的一者。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体(即该群体中的个体抗体是相同的，除了可存在于小部分抗体分子中的可能的天然突变)中获得的抗体。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(该嵌合抗体中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类型或亚型的抗体中的相应序列相同或同源)，以及此类抗体的片段，只要它们展现出所需的拮抗活性。
可以使用产生单克隆抗体的任何程序来制备所公开的单克隆抗体。例如，所公开的单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的那些方法。在杂交瘤方法中，通常用免疫剂对小鼠或其他合适的宿主动物进行免疫以引出产生或能够产生特异性结合该免疫剂的抗体的淋巴细胞。作为另外一种选择，可体外免疫淋巴细胞。
也可以通过重组DNA方法制备单克隆抗体。使用常规程序(如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可以容易地分离编码所公开的单克隆抗体的DNA并测序。还可以使用噬菌体展示技术，例如，如授予Burton等人的美国专利No.5,804,440和授予Barbas等人的美国专利No.6,096,441中所述的技术，产生并筛选抗体或活性抗体片段的文库。
体外方法也适于制备单价抗体。可以使用本领域已知的常规技术来消化抗体以产生其片段，尤其是Fab片段。例如，可以使用木瓜蛋白酶进行消化。木瓜蛋白酶消化的实例描述于1994年12月22日公开的WO 94/29348和美国专利No.4,342,566中。抗体的木瓜蛋白酶消化通常会产生两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，各有一单个抗原结合位点)以及一个残留的Fc片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的片段。
如本文所用，术语“抗体或其抗原结合片段”或“抗体或其片段”涵盖具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及片段，诸如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv、scFv等，包括杂合片段。因此，提供了保留结合其特异性抗原的能力的抗体片段。这样的抗体和片段可以通过本领域已知的技术制备，并且可以根据实施例中阐述的方法和用于产生抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法(参见Harlow和Lane.Antibodies，ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，纽约市，(1988))来筛选特异性和活性。
还包括在“抗体或其抗原结合片段”的含义内的是抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物。还包括在“抗体或其抗原结合片段”的含义内的是免疫球蛋白单可变结构域，诸如例如纳米抗体。
片段(无论是否附接至其他序列)还可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、置换或其他选定的修饰，只要与未经修饰的抗体或抗体片段相比该抗体或抗体片段的活性未明显改变或受损。这些修饰可以提供一些额外的特性，诸如用以移除/添加能够形成二硫键的氨基酸、用以增加其生物寿命、用以改变其分泌特性等。在任何情形中，抗体或抗体片段必须具有生物活性，诸如与其同源抗原的特异性结合。抗体或抗体片段的功能区或活性区可以通过诱变该蛋白质的特定区域，然后表达并测试所表达的多肽来鉴别。此类方法对本领域技术人员来说是显而易见的并且可以包括编码抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变。(Zoller，M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3：348-354，1992)。
如本文所用，术语“抗体”还可以指人抗体和/或人源化抗体。许多非人抗体(如，源自小鼠、大鼠或兔的抗体)在人中具有天然抗原性，因此在施用于人时会产生不良的免疫应答。因此，在该方法中使用人抗体或人源化抗体有助于减少施用给人的抗体会引发不良免疫应答的机会。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列的固有特性，用以在生物过程中充当合成其他聚合物和大分子的模板，所述其他聚合物和大分子的模板具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于编码蛋白质的基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与该mRNA序列相同并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA的转录的模板)都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，术语“配体”是指具有结合靶标的能力或亲和力的生物分子或化学实体。配体可包括可由活生物体产生或合成的许多有机分子，例如蛋白质或其部分、肽、多糖、寡糖、糖、糖蛋白、脂质、磷脂、多核苷酸或其部分、寡核苷酸、适体、核苷酸、核苷、DNA、RNA、DNA/RNA嵌合体、抗体或其片段、受体或其片段、受体配体、核酸-蛋白质融合物、半抗原、核酸、病毒或其部分、酶、辅因子、细胞因子、趋化因子，以及小分子(如化合物)，例如初级代谢物、次级代谢物，和能够激活、抑制或调节生化途径或过程的其他生物分子或化学分子，和/或任何其他亲和剂等等。配体可以来自许多来源，包括文库，诸如小分子文库、噬菌体展示文库、适体文库，或者任何其他文库，这对于本领域普通技术人员在阅读本公开的公开内容后将是显而易见的。在一些实施方案中，靶标是抗原。
在本发明中，“特异的”和“特异性”意指其中分子中的一者涉及选择性结合的条件。因此，对一种抗原特异的抗体或配体选择性地结合该抗原并且基本上不识别或结合其他抗原。
如本文关于抗体所用的，所谓术语“特异性结合”意指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的该抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变将抗体分类为特异性的，在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可能结合该抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变将抗体分类为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意指该相互作用取决于存在所述化学物质上的特定结构(如，抗原决定簇或表位)；例如，抗体识别并结合至特定的蛋白质结构而不是普通地结合至蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，则在含有经标记的“A”和该抗体的反应物中，含有表位A(或游离、未经标记的A)的分子的存在将减少与该抗体结合的经标记的A的量。
“药学上可接受的”组分可以指在生物学上或其他方面不是需要避免的组分，即可将该组分掺入本发明的药物制剂中并如本文所述施用于受试者而不会引起显著的不良生物学效应或不会以有害的方式与含有它的制剂的任何其他组分相互作用。当关于施用给人使用时，该术语通常意味着该组分已符合所需的毒理学和制造测试的标准，或者其包含在美国食品和药品监督管理局(U.S.Food and Drug Administration)制定的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)意指可用于制备通常安全且无毒的药物组合物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括可接受用于兽用和/或人药物或治疗用途的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。
如本文所用，术语“纯化”和“进行纯化”是指从生物样品(即血液、血浆、组织、外来体、病原体或细胞)中分离。如本文所用，术语“纯化的”当用于例如抗原、抗体、多肽或核酸的上下文中时，是指所关注的抗原、抗体、多肽或核酸至少60％不含、至少75％不含、至少90％不含、至少95％不含、至少98％不含、甚至至少99％不含在纯化之前该抗原、该抗体、该多肽、该核酸与之相关联的其他组分。在一些实施方案中，未纯化的抗原是指所述抗原仍与生物样品相关联和/或附着。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”受试者包括以治愈、治好、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善、稳定或影响疾病或障碍，或者疾病或障碍的症状的目的向受试者施用药物。术语“治疗”和“处理”还可以指降低症状的严重性和/或频率，消除症状和/或根本病原，以及改善或补救损害。
组合物的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效实现所需治疗结果的量。给定治疗剂的治疗有效量通常会随着诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重之类的因素而变化。该术语还可以指有效促进期望的治疗效果(诸如咳嗽缓解)的治疗剂的量，或者治疗剂的递送速率(如，随时间推移的量)。确切的期望治疗效果将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的作用剂和/或作用剂制剂(如，治疗剂的效价、作用剂在制剂中的浓度等等)，以及本领域普通技术人员理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间段内向受试者施用多剂组合物后实现所需的生物学或医学响应。
方法
在一些方面，本文所公开的是用于同时检测抗原和特异性阻断所述抗原与其配体之间相互作用的抗体的方法，该方法包括：
用独特抗原条形码标记多个抗原；
将多个经条形码标记的抗原提供给B细胞群体以形成混合物；
让所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体结合；
用独特配体条形码标记针对所述多个抗原中的一种或多种抗原的一种或多种配体；
将所述一种或多种配体引入至所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体组成的所述混合物；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述抗原条形码，2)所述细胞条形码和抗体序列，和3)所述细胞条形码和所述配体条形码，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI、所述配体条形码或所述抗原条形码的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述抗原条形码和所述抗体序列的第一UMI计数矩阵和包含所述细胞条形码、所述配体条形码和所述抗体序列的第二UMI计数矩阵；
根据所述第一UMI计数矩阵确定第一LIBRA-seq分值以及根据所述第二UMI计数矩阵确定第二LIBRA-seq分值；以及
如果相较于第一参考水平所述第一LIBRA-seq分值较高且相较于第二参考水平所述第二LIBRA-seq分值较低，则确定所述抗体阻断所述抗原与所述配体之间的相互作用。
在一些实施方案中，第一参考水平等于第二参考水平。在一些实施方案中，第一参考水平比第二参考水平高约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或90％，或至少高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、40倍、80倍、100倍、500倍。
因此，在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合所述抗原的抗体的体细胞超突变水平。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合所述抗原的抗体的互补决定区(CDR)的长度。本文所用的术语“互补决定区(CDR)”是指抗体重链或轻链的可变区的氨基酸序列。CDR对于抗原结合是必需的并且确定抗体的特异性。每个可变区通常具有三个CDR，标识为CDR1(CDRH1或CDRL1，其中“H”表示重链CDR1，“L”表示轻链CDR1)、CDR2(CDRH2或CDRL2)和CDR3(CDRH3或CDRL3)。CDR可提供在抗体与抗原或表位结合中起主要作用的接触残基。具有比CDR更高度保守的氨基酸序列的四个框架区将VH或VL中的CDR区分开。
因此，在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括确定特异性结合所述抗原的抗体的CDR的基序。在一些实施方案中，CDR选自CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括鉴别与抗原特异性的任何特定组合相关的IGHV、IGHD、IGHJ、IGKV、IGKJ、IGLV或IGLJ基因或其组合。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括鉴别与抗原特异性的任何特定组合相关的重链或轻链FW1、FW2、FW3或FW4中的突变。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括鉴别整体基因表达谱或选择上调或下调与抗原特异性的任何特定组合相关的基因。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括通过例如荧光激活细胞分选或寡核苷酸缀合的与抗原特异性的任何特定组合相关的抗体来鉴别表面标志物。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括鉴别与抗原特异性的任何特定组合相关的BCR序列特征(例如，免疫球蛋白基因、序列基序或CDR长度)、基因表达谱或表面标志物谱的任何组合。
在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括训练关于与抗原特异性的任何特定组合相关的序列特征、序列基序或编码序列特性的机器学习算法(例如通过基德拉(Kidera)因子)，以供后续应用于由于未使用LIBRA-seq或别的原因而缺少抗原特异性信息的经测序的抗体。
在一些实施方案中，经条形码标记的抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。在一些实施方案中，经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。
应当理解，上述条形码以本领域普通技术人员已知的方式缀合至经条形码标记的抗原。缀合物可以以化学方式连接至核苷酸或核苷酸类似物。此类缀合物包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6553-6556)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1994，4，1053-1060)、硫醚如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660，306-309；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3，2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.AcidsRes.，1992，20，533-538)、脂肪链如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人，EMBO J.，1991，10，1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.，1990，259，327-330；Svinarchuk等人，Biochimie，1993，75，49-54)、磷脂如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙铵1，2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229-237)、或者十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923-937。也可以使用Solulink蛋白质-寡核苷酸缀合试剂盒(Solulink Protein-Oligonucleotide Conjugation Kit)(TriLink目录号为S-9011)根据制造商的说明将寡核苷酸条形码缀合至抗原。简而言之，将寡核苷酸和蛋白质脱盐，然后用4FB交联剂修饰氨基-寡核苷酸，并用S-HyNic修饰生物素化抗原蛋白。然后，将4FB-寡核苷酸和HyNic-抗原混合在一起。这导致蛋白质与该寡核苷酸之间形成稳定的键。在一些实施方案中，该经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。在一些实施方案中，该经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列的第二条形码标记。在一些实施方案中，该经细胞条形码标记的微珠用包含RNA序列的第二条形码标记。在一些实施方案中，该经细胞条形码标记的微珠在微珠的内侧上用条形码标记。在一些实施方案中，该经细胞条形码标记的微珠用封装在微珠内的条形码标记。在一些实施方案中，该经细胞条形码标记的微珠在微珠的外侧上用条形码标记。
如本文所用，“微珠”不限于具体类型的微珠。相反，大量微珠可用并且是本领域普通技术人员已知的。可以基于所需的最终用途和对各种规程的适用性来选择合适的微珠。在一些实施方案中，微珠是或包含颗粒或微珠。在一些实施方案中，固体载体微珠是磁性的。现有技术中已在例如美国专利No.5,084,169、美国专利No.5,079,155、美国专利No.473,231和美国专利No.8,110,351中描述了包含颗粒的微珠。可以优化颗粒或微珠大小以结合单细胞乳液中的B细胞，以及优化用于后续的PCR反应。
这些含有细胞条形码的寡核苷酸：既(1)使得能够通过模板转换寡核苷酸来扩增细胞mRNA转录物，该模板转换寡核苷酸是含有细胞条形码的寡核苷酸的一部分，又(2)从抗原直接退火至含有抗原条形码的寡核苷酸。在一些实施方案中，从微珠递送的寡核苷酸具有一般结构：P5_PCR_柄-细胞_条形码-UMI-模板_转换_寡核苷酸。
上面指出，如果抗体对抗原的LIBRA-seq分值相比于对照样品增加，则该抗体被确定为特异性结合该抗原。本文中应当理解，在每种抗原的最小(y轴，顶部)与最大(y轴，底部)LIBRA-seq分值之间，针对100个截止值中的每一者将每种抗体分类为抗原阳性或阴性的能力测试了其能力，其中抗原阳性定义为LIBRA-seq分值大于或等于被评价的截止值，抗原阴性定义为LIBRA-seq分值低于截止值。
在一些实施方案中，抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。在一些实施方案中，抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列。在一些实施方案中，抗体序列包含免疫球蛋白轻链(VJ)序列。
在一些实施方案中，经条形码标记的抗原包含来自病原体或动物的抗原。在一些实施方案中，经条形码标记的抗原包含来自病原体的抗原。在一些实施方案中，经条形码标记的抗原包含来自动物的抗原。在一些实施方案中，动物为哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(如人和非人灵长类动物)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施方案中，受试者为人。
在一些实施方案中，抗原在用条形码标记之前经纯化。在一些实施方案中，抗原在用条形码标记之前未经纯化。
因此，在一些实施方案中，本文公开的LIBRA-seq可用于未经纯化的可溶性抗原。抗原可布置成平板形式以供微表达。每种抗原都在板上的单孔中的微量培养中表达。在一些实施方案中，将独特条形码添加至每个孔，将带条形码的抗原混合在一起，与B细胞混合，并且如本文所述进行LIBRA-seq。
在一些实施方案中，本文所公开的LIBRA-seq可用于非可溶形式的抗原。在一些实施方案中，用一种或多种条形码标记整个病毒。在一些实施方案中，整个病毒可以使用scRNA-seq来利用相同病毒的变体(如不同的HIV-1毒株)内的内在多样性。在一些实施方案中，假病毒可以含有内部条形码供LIBRA-seq。在一些实施方案中，综合突变病毒文库可以使用(例如Dingens等人(2019).An Antigenic Atlas of HIV-1 Escape from BroadlyNeutralizing Antibodies Distinguishes Functional and StructuralEpitopes.Immunity，50(2)：520-532.e3)的方法生成。在一些实施方案中，可以通过条形码的慢病毒转染或基于CRISPR的标记法来标记整个细胞。在一些实施方案中，膜锚定抗原(特别是膜蛋白的那些抗原)，如脂质体上的抗原，用一种或多种条形码标记。
也可以将抗原布置成抗原微阵列格式(例如，如Xu Gj等人.Comprehensiveserological profiling of human populations using a synthetic humanvirome.Science.2015；348(6239)：aaa0698中所述的VirScan技术)。可以使用DNA微阵列，然后进行抗原的噬菌体展示。在本文的一些实施方案中，将独特条形码添加至微阵列中的每种抗原。
本发明的抗原也可以是来自病原体或动物的抗原。在一些实施方案中，抗原来自人。在一些实施方案中，来自人的抗原是由癌基因编码的抗原。在一些实施方案中，由癌基因编码的抗原可以是例如NY-ESO-1、MAGEA-A3、hTERT、酪氨酸酶、gp100、MART-1、melanA、β-连环蛋白、CDC27、hsp70、HLA-A2-R170J、CEA、AFP、PSA、EBV-EBNA、HPV16-E7、MUC-1、HER-2/neu或乳腺珠蛋白-A。
在一些实施方案中，来自病原体的抗原包含来自病毒的抗原。在一些实施方案中，来自病毒的抗原包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
在一些实施方案中，来自病毒的抗原包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原。在一些实施方案中，来自病毒的抗原包含来自流感病毒的抗原。在一些实施方案中，来自病毒的抗原包含来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
在一些实施方案中，来自HIV的抗原包含来自HIV-1的抗原。在一些实施方案中，来自HIV的抗原包含来自HIV-2的抗原。在一些实施方案中，来自HIV的抗原包含HIV-1包膜蛋白。在一些实施方案中，来自流感病毒的抗原包含血凝素(HA)。在一些实施方案中，来自RSV的抗原包含RSV F蛋白。在一些实施方案中，抗原选自表1中列出的抗原。
表1.用于人B细胞样品分析的抗原筛选文库.对于一组病原体，所示出的是选定的蛋白质靶标、株系的数量和筛选文库中得到的抗原的总数。
Figure BPA0000327197490000221
*流感：A(6种HA，4种NA)和B(2种HA)；^轮状病毒：6种G、2种P变体
在一些实施方案中，B细胞的群体包含记忆B细胞、浆细胞、幼稚B细胞、活化B细胞或B细胞系。在一些实施方案中，B细胞的群体包含记忆B细胞、浆细胞、幼稚B细胞、活化B细胞或B细胞系。在一些实施方案中，B细胞的群体包含浆细胞。在一些实施方案中，B细胞的群体包含幼稚B细胞。在一些实施方案中，B细胞的群体包含活化B细胞。在一些实施方案中，B细胞的群体包含B细胞系。
在一些方面，本文所公开的是用于同时筛选抗原和特异性结合所述抗原的抗体的方法，该方法包括：
使用抗原展示技术产生多个抗原，其中所述多个抗原中的每一者与识别特定抗原的核酸序列相连；
将所述多个抗原提供给B细胞群体；
让所述多个抗原与所述B细胞群体结合；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述识别特定抗原的核酸序列，和2)所述细胞条形码和抗体序列，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI或所述识别特定抗原的核酸序列的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述识别特定抗原的核酸序列和所述抗体序列的UMI计数矩阵；
确定LIBRA-seq分值；
确定所述识别特定抗原的核酸序列；以及
如果所述抗体对所述抗原的LIBRA-seq分值高于参考水平，则确定所述抗体特异性结合所述抗原。
在一些实施方案中，包含细胞条形码和识别特定抗原的核酸序列的扩增子以及包含细胞条形码和抗体序列的扩增子是单独的扩增子。在一些实施方案中，抗体序列可以是重链序列和/或轻链序列。在一些实施方案中，抗体序列是重链序列。在一些实施方案中，抗体序列是轻链序列。
在一些实施方案中，抗原展示技术包括核糖体展示技术。
在一些实施方案中，识别特定抗原的核酸序列是编码核酸。在一些实施方案中，识别特定抗原的核酸序列是与该抗原共价连接的编码核酸序列。在一些实施方案中，识别特定抗原的核酸序列是来自DNA(例如，病毒DNA)的核酸序列。在一些实施方案中，识别特定抗原的核酸序列是外显子序列。在一些实施方案中，识别特定抗原的核酸序列是转录序列。在一些实施方案中，识别特定抗原的核酸序列是抗原条形码。
在一些实施方案中，抗原展示技术包括噬菌体展示技术、酵母展示技术或核糖体展示技术。在一些实施方案中，本文所用的术语“噬菌体展示技术”意指在H.BenjaminLarman，Nat Biotechnol.2011年6月；29(6)：535-541和美国专利NO.6,017,732中更充分描述的那些形式，出于所有目的将这两篇参考文献通过引用并入本文中。在一些实施方案中，本文所用的术语“核糖体展示技术”意指在Zhu等人，Nat Biotechnol.2013年4月；31(4)：331-334、WO2001/75097和美国专利NO.774557中更充分描述的那些形式，出于所有目的将这些参考文献通过引用并入本文中。还可参见Science.2015年6月5日；348(6239)。
在一些实施方案中，从所关注的样品(例如，肿瘤浸润物)纯化B细胞；获得来自所关注样品的非B细胞群体(例如，由许多肿瘤细胞组成)以对外显子组进行测序；利用外显子的核糖体展示制作抗原筛选文库；以及针对抗原筛选文库筛选B细胞。
在一些方面，本文所公开的是用于确定抗体对抗原的结合效价的方法，该方法包括：
用独特抗原条形码标记多个抗原；
将多个经条形码标记的抗原提供给B细胞群体；
让所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体结合；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述抗原条形码，和2)所述细胞条形码和抗体序列，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI或所述抗原条形码的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述抗原条形码和所述抗体序列的UMI计数矩阵；
确定LIBRA-seq分值；以及
如果所述抗体对所述抗原的LIBRA-seq分值高于参考水平，则确定所述抗体对所述抗原具有高结合效价。
本文所用的术语“结合效价”是指产生某种效果(诸如与一定量的抗原结合)所需的抗体的浓度或量。可以使用多种技术例如ELISA、SPR、BLI等测量抗体-抗原结合效价。
在一些实施方案中，将本文的方法用于表位作图。在一些实施方案中，任何前述方面的方法还包括对抗原结合的B细胞进行预先过滤的步骤。
实施例
下文阐述以下实施例以说明根据所公开主题的系统、方法和结果。这些实施例不旨在包括本文所公开主题的所有方面，而是为了说明代表性的方法和结果。这些实施例不旨在排除对本领域技术人员显而易见的本发明的等同物和变型形式。
实施例1.用于发现具有配体阻断性的抗体的LIBRA-seq
在一些抗体发现工作中，重要的是鉴别功能性(相对于仅结合)的抗体，并且在许多情形中，所关注的功能是鉴别可以阻断抗原与其同源配体相互作用的抗体。并非对抗原结合性抗体进行标准筛选，然后对选择的抗体进行配体阻断测定，本文所公开的是使LIBRA-seq适于从同一测序实验中同时获得有关所鉴别的B细胞的配体阻断能力的信息的方法。为了实现这一点，对于给定的抗原，也可以用独特条形码标记已知的同源配体。首先将B细胞与来自筛选文库的抗原混合，然后与任何配体混合(图5)。测序后，对于给定抗原具有高LIBRA-seq分值但对于相应配体具有低LIBRA-seq分值的B细胞表明，当该抗原与该给定B细胞的BCR结合时，抗原-配体结合降低(图6)。
使用带条形码的配体及其各自的在筛选库中的带条形码的抗原搭配物，连同可以阻断和不阻断相同抗原的配体结合的抗体的B细胞系一起进行LIBRA-seq实验。例如，将可溶性CD4用作HIV-1包膜蛋白抗原的配体，连同VRC01 B细胞(其可阻断包膜蛋白-CD4结合)和另一种HIV-1 B细胞系(如2G12，其不能阻断包膜蛋白-CD4结合)一起。在这些实验中，变动并评价了多个参数，包括配体量、每个配体分子的寡核苷酸数量、条形码变化、配体与抗原的比率等。最终，使用已知抗原-配体和B细胞系组合的基准系统，这些实验为优化LIBRA-seq准确鉴别配体阻断性抗体的能力的参数选择提供了信息。
实施例2.用于高通量抗原筛选和从头抗原发现的LIBRA-seq.
典型的LIBRA-seq平台需要对一组靶标抗原进行寡核苷酸标记。可以扩展LIBRA-seq以使用抗原展示技术(诸如噬菌体展示、酵母展示或核糖体展示)，这样对于每种给定的B细胞，可以同时对所有结合的展示抗原进行测序。例如，蛋白质抗原的核糖体展示是一种已确立的技术(例如，Zhu等人，Nat Biotechnol.2013年4月；31(4)：331-334。)。LIBRA-seq可以通过结合B细胞侧的分析利用展示技术，从而产生成对的BCR序列-抗原身份信息(图7)。特别是，这种方法允许对所展示抗原的遗传物质进行测序。例如，通过噬菌体展示，可以对噬菌体DNA进行测序；对于核糖体展示，抗原mRNA通过缺乏终止密码子而与其编码的抗原蛋白相连。展示技术的优势在于，与使用对于每种单独的抗原都需要制备和纯化的传统方法筛选的数十到数百种抗原相比，可以在单次实验中筛选出极其大的一组抗原(数万到可能数十亿)。抗原展示文库可以是靶向的(如，同一抗原蛋白的多种变体)或者可以是通用的(如，数千种人蛋白质)。重要的是，这种方法使得抗原能够被发现：可以针对大规模人蛋白质组、病毒组、微生物组等抗原文库筛选B细胞，而无需预先设想这些B细胞可以靶向的特定抗原靶标，从而使得抗体和抗原二者能够同时被发现。
实施例3.用于确定抗体-抗原效价的LIBRA-seq.
许多抗体发现工作的主要目标之一是有效地选择对靶标抗原具有特异性的高效价抗体而不是低效价抗体。因此，使LIBRA-seq能够估计B细胞对靶标抗原的效价或至少对其按等级排序是有价值的。为了实现这一点，本文公开了几种方法。
定性效价估计。对于许多具有生物医学意义的靶标抗原，已经存在可以使用标准技术(诸如生物层干涉测量法)进行效价测量的抗体。为了研究LIBRA-seq基于BCR对靶标抗原的效价区分B细胞的能力，对LIBRA-seq进行评价以对对同一抗原具有不同亲和力的B细胞进行评分。具体而言，对来自筛选文库的不同流感HA抗原与B细胞系中呈现的不同流感抗体的LIBRA-seq分值进行比较，因为所有这些抗体-抗原对都具有已知的效价。此外，使用表达Fe53的低效价种系恢复形式的BCR的B细胞。以不同的B细胞比率进行这些实验，以探询抗原特异性B细胞的LIBRA-seq检测随效价和相对丰度二者变化的极限。测序后，给定抗原的LIBRA-seq分值对于效价较高的B细胞较高，而对于效价较低的B细胞则较低。最终，对于存在已知抗体的抗原，LIBRA-seq实验可以设置为使用具有已知抗原效价的B细胞对照，以便对新鉴别的B细胞基于它们的LIBRA-seq分值与该对照相比而进行优先级排序。图8中的数据显示与野生型抗原相比，VRC01细胞对较低效价的D368R突变的分值较低，从而表明LIBRA-seq分值可用作抗体-抗原效价的相对指标。
定量效价估计。还探索了LIBRA-seq以更定量的方式估计抗体-抗原效价的能力。为了实现这一点，等分给定的抗原并用不同的独特条形码标记(每等分样品一种条形码)。然后进行滴定系列，使得B细胞与来自给定抗原的每份带条形码的等分试样的不同的(但预先确定的)量混合。在测序后，通过将曲线拟合至相同抗原的不同带条形码的等分试样的LIBRA-seq分值，可以获得给定B细胞的假效价测量值(图9)。该实验设置使用来自上述筛选文库的不同抗原，然后将得到的各抗原特异性B细胞系的拟效价测量值与各抗体的测定效价进行比较。评价了许多参数(包括每个抗原的独特条形码数量(如4至10之间)、每种带条形码的抗原变体的量等等)对LIBRA-seq效价估计准确性的影响。这种方法允许在不同的抗体和抗原之间进行比较，并且甚至在多个LIBRA-seq实验之间进行比较，而无需已知的抗体-抗原效价对照，以便使得能够基于任何给定靶标抗原的效价估计值对B细胞进行优先级排序。
实施例4.针对抗原结合的B细胞进行预先过滤的LIBRA-seq.
虽然LIBRA-seq抗原筛选文库可以适于每个特定的测序实验，但在任何给定的样品中，可能存在大量对未纳入筛选文库中的抗原具有特异性的B细胞(给定的抗原的抗原特异性B细胞通常是低频率的)。当将此类B细胞纳入测序实验时，仅获得其BCR序列信息，而没有任何关于其抗原特异性的信息，因为对于这些B细胞抗原筛选文库中没有匹配的抗原。
为了解决这个问题，探索了将测序专门针对抗原结合的B细胞(可以获得其抗体序列和抗原特异性信息)的策略。即，分选抗原阳性细胞，使用以下策略对抗原筛选文库中的抗原进行荧光标记：(a)荧光标记的链霉亲和素和(b)荧光标记的寡核苷酸条形码，由西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)合成，具有四个内部荧光素-dT和一个5′氨基C6接头。
对于这两种策略中的每一种，荧光标记抗原都与单种颜色相关(与抗原无关)。在样品处理(例如，10X)和NGS之前，使B细胞-抗原混合物经受荧光激活细胞分选(FACS)，以选择与带条形码的抗原结合的B细胞。对于分选，对细胞进行计数并使用台盼蓝评估活力，通过离心(300g条件下，7分钟)用补充有1％牛血清白蛋白的DPBS(DPBS-BSA)洗涤，重新悬浮在DPBS-BSA中并用各种细胞标记物(包括CD3-APCCy7、IgG-FITC、CD19-BV711、CD14-V500和LiveDead-V500)染色。将荧光标记的抗原-寡核苷酸缀合物添加至该染色物中，因此可以进行抗原特异性分选。在室温下避光染色30分钟后，用DPBS-BSA以300g持续7分钟洗涤细胞3次。然后，将细胞重新悬浮在DPBS-BSA中并在流式细胞仪/细胞分选仪上进行分析和/或分选。抗原特异性B细胞被认为是：活的、CD14-CD3-CD19+IgG+，且PE颜色阳性，所有带条形码的抗原都被其标记(图11A、图11B和图12)。
该方法使得能确定筛选文库中的任何抗原的抗原结合B细胞。为了增加稳健性，可以用两种不同的颜色标记每种带条形码的抗原，以便只保留对两种颜色双阳性的B细胞。抗原的荧光标记不影响在后续的单细胞分析和NGS测序实验中区分不同抗原条形码的能力。本质上，荧光标记有助于选择抗原结合的B细胞，而后续对抗原寡核苷酸条形码的测序有助于确定哪些抗原与所分选的抗原结合B细胞每一者结合。与非荧光抗原实验的主要区别在于，此处仅对抗原结合的B细胞进行测序，从而增加了效率及可从单次测序实验获得的信息量。该过滤步骤针对稀有的抗原特异性B细胞群体，从而确保为对筛选文库中的任何抗原具有特异性的B细胞提取最大信息(图10)。如果需要，也可以使来自同一样品的非抗原特异性B细胞进行单独的制备(例如10X)和测序，以使从给定样品中提取的BCR序列信息量最大化。
实施例5.LIBRA-Seq方法
在LIBRA-seq实验之后，产生了2对FASTQ文件：(1)B细胞受体文库(含有重链和轻链重叠群)和(2)抗原条形码文库(含有来自抗原筛选文库的抗原识别性DNA条形码序列)。在一些实施方案中，应当理解本文所述的方法用于将来自这两个测序文库的信息结合起来。因此，在一些实施方案中，将上述移除缺少细胞条形码、UMI或抗原条形码的序列的步骤用于从抗原条形码文库中移除缺少细胞条形码、UMI或抗原条形码的序列。将此处描述的方法用于处理抗原条形码。该处理有两个目的：(1)经测序读段的质量控制和注释，以及(2)从经注释的测序读段鉴别结合信号。在执行以下步骤之前，处理BCR文库以便确定具有VDJ序列的细胞条形码列表。
抗原条形码读段和BCR序列重叠群的处理。本文所示的流程将寡核苷酸文库的双端测序fastq文件作为输入，对细胞条形码、UMI和抗原条形码的读段进行处理和注释，并生成细胞条形码-抗原条形码UMI计数矩阵。可以使用cellranger(10X Genomics)处理BCR重叠群，使用GRCh38作为参考。对于抗原条形码文库，通过fastp(Chen等人，2018)使用过滤的默认参数进行初始质量和长度过滤。这导致抗原条形码文库中仅保留高质量读段。在插入长度的直方图中，这会导致52-54的预期插入片段大小的尖峰。然后将Fastx_collapser用于对相同的序列进行分组并将输出转换为去重的fasta文件。然后，去除低质量读段后，只处理R2序列，因为整个插入片段都存在于R1和R2二者中。每个独特的R2序列(或R1，或R1和R2的共有序列)都使用以下步骤逐一处理：
(1)确定R2序列的反向互补序列(如果使用R1，则跳过步骤1)。
(2)筛选与在处理BCR V(D)J fastq文件期间由cell ranger输出的filtered_contig.fasta文件中存在的任何有效细胞条形码具有精确(或接近精确)匹配的序列。没有BCR相关细胞条形码的序列将被剔除。
(3)将紧邻细胞条形码3′的10个碱基注释为读段的UMI。
(4)对UMI的3′序列的其余部分筛选与筛选文库中所用的任何抗原条形码具有0、1或2的汉明距离的13或15bp序列。在该处理之后，仅大约预期长度的序列得以保留(序列的长度可以比预期长度短超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基至比预期长度长超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基)，因此允许细胞条形码外的删除、插入，或者细胞条形码两侧的碱基。
这一通用过程要求序列拥有分析所需的所有元素(细胞条形码、UMI和抗原条形码)，但允许在UMI与抗原条形码之间的TSO区域中插入或缺失。在逐一处理每个序列后，筛选细胞条形码-UMI-抗原条形码冲突。移除有多种抗原条形码与其相关的任何细胞条形码-UMI组合(指示独特的寡核苷酸分子)。然后构建细胞条形码-抗原条形码UMI计数矩阵，其作为后续分析的基础。此外，使用HighV-Quest(Alamyar等人，2012)将BCR重叠群(Cellranger输出的filtered_contigs.fasta文件)与IMGT参考基因进行比对。使用ChangeO(Gupta等人，2015)解析HighV-Quest的输出，并与UMI计数矩阵合并。
上述程序可以概括为以下步骤：
1)移除低质量读段；
2)移除过长或过短而不能成为含有细胞条形码、UMI和抗原条形码的有效抗原条形码读段的读段；
3)对于每个优质读段，注释：
a.细胞条形码，
b.UMI
c.抗原条形码，通过使用汉明距离阈值允许测序/PCR错误。
LIBRA-seq分值的确定。从UMI计数矩阵开始，可将超过一个UMI(例如，超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个UMI等等)的所有计数设为0，其想法是这些低计数可归因于噪声。在此之后，UMI计数矩阵精简为仅含有对于至少1种抗原计数超过上述噪声过滤步骤中的最小值一个或多个UMI的细胞。然后计算每个细胞的每种抗原UMI计数的中心对数比(CLR)(Mimitou等人，2019；Stoeckius等人，2017，2018)。因为由于在寡核苷酸-抗原缀合期间寡核苷酸负载不同，对于每种抗原UMI计数在不同的标度上，因此使用scikit learn中的StandardScaler方法(Pedregosa和Varoquaux，2011)重新调整UMI计数的CLR。最后，对经z分值归一化的来自O UMI计数的CLR执行校正程序，对于供体NIAID45实验和N90实验对于每种抗原将它们设为最小值，对于Ramos B细胞系实验将它们设为-1。这些经CLR转换、Z得分归一化、校正的值用作最终的LIBRA-seq分值。使用Cytobank(Kotecha等人，2010)可视化LIBRA-seq分值。
序列特征的鉴别-抗原特异性关联。在确定LIBRA-seq分值(上文)后，并且由于将抗体序列与抗原特异性(以LIBRA-seq分值的形式)联合，因此可以建立序列-特异性关联。
除非另外指明，否则本文使用的所有科技术语的含义与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的一致。本文引用的出版物及其中引用的材料明确地以引用方式并入。
本领域的技术人员将理解，可以对本发明的优选实施方案进行许多改变和修改，并且可以在不背离本发明的精神的情况下进行这些改变和修改。因此，所附权利要求旨在涵盖所有落入本发明的真正精神和范围内的等价变型形式。
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Claims (38)

1.一种用于同时检测抗原和特异性阻断所述抗原与其配体之间的相互作用的抗体的方法，所述方法包括：
用独特抗原条形码标记多个抗原；
将多个经条形码标记的抗原提供给B细胞群体以形成混合物；
让所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体结合；
用独特配体条形码标记针对所述多个抗原中的一种或多种抗原的一种或多种配体；
将所述一种或多种配体引入至所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体组成的所述混合物；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述抗原条形码，2)所述细胞条形码和抗体序列，和3)所述细胞条形码和所述配体条形码，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI、所述配体条形码或所述抗原条形码的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述抗原条形码和所述抗体序列的第一UMI计数矩阵和包含所述细胞条形码、所述配体条形码和所述抗体序列的第二UMI计数矩阵；
根据所述第一UMI计数矩阵确定第一LIBRA-seq分值以及根据所述第二UMI计数矩阵确定第二LIBRA-seq分值；以及
如果相较于第一参考水平所述第一LIBRA-seq分值较高且相较于第二参考水平所述第二LIBRA-seq分值较低，则确定所述抗体阻断所述抗原与所述配体之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经条形码标记的抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述经条形码标记的抗原包含膜锚定抗原。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述经条形码标记的抗原包含来自病原体或动物的抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗原未经纯化。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述来自病原体的抗原包含来自病毒的抗原。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述来自病毒的抗原包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的体细胞超突变水平。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的互补决定区(CDR)的长度。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的CDR的基序。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述CDR选自由CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3组成的组。
14.一种用于同时筛选抗原和特异性结合所述抗原的抗体的方法，所述方法包括：
使用抗原展示技术产生多个抗原，其中所述多个抗原中的每一者与识别特定抗原的核酸序列相连；
将所述多个抗原提供给B细胞群体；
让所述多个抗原与所述B细胞群体结合；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述识别特定抗原的核酸序列，和2)所述细胞条形码和抗体序列，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI或所述识别特定抗原的核酸序列的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述识别特定抗原的核酸序列和所述抗体序列的UMI计数矩阵；
确定LIBRA-seq分值；
确定所述识别特定抗原的核酸序列；以及
如果所述抗体对所述抗原的LIBRA-seq分值高于参考水平，则确定所述抗体特异性结合所述抗原。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述多种抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中所述多个抗原包含来自病原体或动物的抗原。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗原未经纯化。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述来自病原体的抗原包含来自病毒的抗原。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述来自病毒的抗原包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的体细胞超突变水平。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的互补决定区(CDR)的长度。
24.根据权利要求14至23中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的CDR的基序。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述CDR选自由CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3组成的组。
26.根据权利要求14至25中任一项所述的方法，其中所述抗原展示技术包括核糖体展示技术。
27.一种用于确定抗体对抗原的结合效价的方法，所述方法包括：
用独特抗原条形码标记多个抗原；
将多个经条形码标记的抗原提供给B细胞群体；
让所述多个经条形码标记的抗原与所述B细胞群体结合；
从所述B细胞群体中洗掉未结合的抗原；
将所述B细胞分离成单细胞乳液；
向每个单细胞乳液中引入经独特细胞条形码标记的微珠；
从所述单细胞乳液制备单细胞cDNA文库；
进行PCR扩增反应以产生多个扩增子，其中
所述扩增子包含：1)所述细胞条形码和所述抗原条形码，和2)所述细胞条形码和抗体序列，并且其中每个扩增子包含独特分子标识符(UMI)；
对所述多个扩增子进行测序；
移除缺少所述细胞条形码、所述UMI或所述抗原条形码的序列；
将所述抗体序列与免疫球蛋白V、D、J和C序列的参考文库进行比对；
构建包含所述细胞条形码、所述抗原条形码和所述抗体序列的UMI计数矩阵；
确定LIBRA-seq分值；以及
如果所述抗体对所述抗原的LIBRA-seq分值高于参考水平，则确定所述抗体对所述抗原具有高结合效价。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述经条形码标记的抗原用包含DNA序列或RNA序列的第一条形码标记。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述经细胞条形码标记的微珠用包含DNA序列或RNA序列的第二条形码标记。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述抗体序列包含免疫球蛋白重链(VDJ)序列或免疫球蛋白轻链(VJ)序列。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述经条形码标记的抗原包含来自病原体或动物的抗原。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述抗原未经纯化。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述来自病原体的抗原包含来自病毒的抗原。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述来自病毒的抗原包含来自人免疫缺陷病毒(HIV)的抗原、来自流感病毒的抗原或来自呼吸道合胞病毒(RSV)的抗原。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的体细胞超突变水平。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的互补决定区(CDR)的长度。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，所述方法还包括确定与所述抗原特异性结合的抗体的CDR的基序。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述CDR选自由CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3组成的组。
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