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CN115478041A - 一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工程菌的构建及应用 - Google Patents

一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工程菌的构建及应用 Download PDF

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CN115478041A
CN115478041A CN202110596118.5A CN202110596118A CN115478041A CN 115478041 A CN115478041 A CN 115478041A CN 202110596118 A CN202110596118 A CN 202110596118A CN 115478041 A CN115478041 A CN 115478041A
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朱兵峰
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李清华
刘忠
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Shandong New Time Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种高效合成5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸工程菌的构建及应用。本发明所述重组工程菌表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)、二甲苯单加氧酶(XMO)、苯甲醇脱氢酶(BADH)和苯甲醛脱氢酶(BZDH)。并利用本发明所述的重组工程菌为出发菌株，在含有L‑苏氨酸的培养基中进行发酵生产得到5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸。本发明实现了以L‑苏氨酸为底物一步高效合成5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸，转化率高达85％以上，本发明的方法工艺简单，生产周期短，底物转化率高，产物易于从反应液中分离纯化，工艺污染小，能耗低，易于放大生产。

Description

一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工程菌的构建及应用
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，具体涉及一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工程菌的构建及应用。
背景技术
5-甲基吡嗪-2-羧酸(5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid，MPCA)是一种米白色固体结晶，CAS号为5521-55-1，分子式为C6H6N2O2，分子量为138.12，熔点166-169℃，具有刺激性气味，暴露在空气中会缓慢氧化。5-甲基吡嗪-2-羧酸在医药工业领域有着广泛的用途，主要用于合成降血糖药物格列吡嗪、新型抗高血压药物阿昔莫司及抗结核药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等药物。
目前其合成主要采用化学合成法，可分为分子间环合法、吡嗪侧链多步合成法、直接氧化法和电化学法。但化学合成法存在反应条件要求高、使用大量氧化剂、生产成本高、对环境污染较大的问题。生物转化法则具有合成工艺简单，底物选择性好，催化效率高，杂质少，对环境污染小的优点，极具发展前景。
瑞士Lonza公司已经实现了利用含二甲苯单加氧酶的菌株在批次补料反应器中制备5-甲基吡嗪-2羧酸。郑裕国等，化学与生物工程，2012，29(9)：19-25，筛选得到一株含二甲苯单加氧酶的恶臭假单胞菌，并利用该菌株进行5-甲基吡嗪-2-羧酸的生物制备，经过补料发酵产率可达到75.6％，产物浓度达到20.41g/L，周期长达22天。
CN106434434A公开了一株具有高区域选择性的催化单加氧反应的产二甲苯单加氧酶的菌株HW-1，并利用该菌株发酵制备5-甲基吡嗪-2-羧酸，经过摇瓶发酵并适时进行补料，产物累积浓度可达到34.19g/L，产率81.4％。
CN107312806A公开了一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，所述的酶为醛脱氢酶或醛脱氢酶的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白，以5-甲基-2-吡嗪醛为反应底物，在上述酶的催化下反应12h，得到产物5-甲基-2-吡嗪羧酸17.02mM。
CN107974428A公开了一种利用重组大肠杆菌转化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，该方法主要是以来源于Pseudomonasputida ATCC 33015所携带的内源性制粒pWWO为模板，构建重组质粒，利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的重组大肠杆菌表达二甲苯单加氧酶以及苯甲醇脱氢酶，然后全细胞转化底物2,5-二甲基吡嗪，产量为2.5g/L，摩尔转化率为96.2％。该方法转化用时较短，且摩尔转化率较高，但是该方法产量相对较低。
现有技术也存在以L-苏氨酸为底物催化合成2,5-二甲基吡嗪，例如CN111411067A公开了一种高产2,5-二甲基吡嗪的大肠杆菌重组菌。所述的重组菌以大肠杆菌K-12为宿主，过表达了L-苏氨酸脱氢酶，并异源表达了NADH氧化酶和氨基丙酮氧化酶，同时敲除了重组菌的2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶基因kb1和伯胺氧化酶基因tynA。曹艳丽等，以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪高产菌株构建，食品与发酵工业，2020,46(1)：1-10.构建了一种以L-苏氨酸为发酵底物的2,5-二甲基吡嗪的生产菌株。通过利用Bacillussubtilis168(B.subtilis 168)外源表达不同微生物种属来源的L-苏氨酸脱氢酶(L-threonine dehydrogenase，TDH)，并比较其利用L-苏氨酸为底物合成2，5-DMP的产量，挑选出2，5-DMP高产菌种，在此基础上进一步外源表达NADH氧化酶(NADH oxidase，NOX)，以促进辅因子再生。构建了一株高产2，5-DMP的基因工程菌株B.subtilis168/pMA0911-tdh(Ec)-nox。该菌株以5.83g/L的L-苏氨酸为底物，发酵24h后2，5-DMP的产量高达616.04mg/L。
综上，现有技术多是以2,5-二甲基吡嗪为起始底物，由二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶三步催化后生成5-甲基吡嗪-2-羧酸。各自存在着操作不稳定，产能较低，生产成本高、周期长等缺陷，因此生产工艺简单、绿色环保且高效的5-甲基吡嗪-2-羧酸的生产方法亟待开发。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工程菌，该菌可以L-苏氨酸为底物发酵生产5-甲基吡嗪-2-羧酸，实现了L-苏氨酸一步转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸。
本发明第一方面，提供一种生物催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的重组工程菌，所述重组工程菌表达了苏氨酸脱氢酶(TDH)、二甲苯单加氧酶(XMO)、苯甲醇脱氢酶(BADH)和苯甲醛脱氢酶(BZDH)。
所述的苏氨酸脱氢酶为Escherichia coli来源的苏氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述的二甲苯单加氧酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的二甲苯单氧合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述的苯甲醇脱氢酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的苯甲醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
所述的苯甲醛脱氢酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的苯甲醛脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
本发明的第二方面，提供所述重组工程菌的构建方法。
一种生物催化合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的重组工程菌的构建方法，包括将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆到表达载体上构建得到重组表达质粒，然后将构建的表达质粒转入宿主细胞中进行表达。
优选地，所述重组工程菌的表达载体选自pRSFDuet-1、pET-28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1中的一种或几种；在一个实施方案中，所述载体为pRSFDuet-1；在另一种实施方案中，所述载体为pET-28a及pETDuet-1；在另一种实施方案中，所述载体为pET-28a及pCDFDuet-1；在另一种实施方案中，所述载体为pET-28a、pETDuet-1及pCDFDuet-1；在另一种实施方案中，所述载体为pETDuet-1；在另一种实施方案中，所述载体为pETDuet-1和pET-28a。
所述的表达是将相应酶的基因连接到表达载体的重组表达质粒上，然后将表达质粒转入宿主细胞进行表达。
优选地，所述重组工程菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主构建得到的。
在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pRSFDuet-1上得到重组表达质粒pRSFDuet-1-tdhxmobadhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pRSFDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pRSFDuet-1第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh和二甲苯单氧合酶xmo基因序列、苯甲醇脱氢酶badh和苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分两步利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pRSFDuet-1进行连接，构建表达载体pRSFDuet-1-tdhxmobadhbzdh；然后将表达质粒pRSFDuet-1-tdhxmobadhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pET28a上得到重组表达质粒pET28a-tdh，二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pETDuet-1上得到重组表达质粒pETDuet-1-xmobadhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pETDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh、二甲苯单氧合酶xmo基因序列、苯甲醇脱氢酶badh和苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a、pETDuet-1进行连接，构建表达载体pET28a-tdh和pETDuet-1-xmobadhbzdh；然后将表达质粒pET28a-tdh和pETDuet-1-xmobadhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pET28a上得到重组表达质粒pET28a-tdh，二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pCDFDuet-1上得到重组表达质粒pCDFDuet-1-xmobadhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo和苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pCDFDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pCDFDuet-1的第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh、二甲苯单氧合酶xmo基因序列和苯甲醇脱氢酶badh、苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a、pCDFDuet-1进行连接，构建表达载体pET28a-tdh和pCDFDuet-1-xmobadhbzdh；然后将表达质粒pET28a-tdh和pCDFDuet-1-xmobadhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pET28a上得到重组表达质粒pET28a-tdh，将二甲苯单氧合酶基因xmo连接到表达载体pETDuet-1上得到重组表达质粒pETDuet-1-xmo，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pCDFDuet-1上得到重组表达质粒pCDFDuet-1-badhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pETDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pCDFDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pCDFDuet-1第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh、二甲苯单氧合酶xmo基因序列、苯甲醇脱氢酶badh、苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1进行连接，构建表达载体pET28a-tdh、pETDuet-1-xmo和pCDFDuet-1-badhbzdh。然后将表达质粒pET28a-tdh、pETDuet-1-xmo和pCDFDuet-1-badhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pET28a上得到重组表达质粒pET28a-tdh，将二甲苯单氧合酶基因xmo连接到表达载体pCDFDuet-1上得到重组表达质粒pCDFDuet-1-xmo，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pETDuet-1上得到重组表达质粒pETDuet-1-badhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pCDFDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pETDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI的酶切位点，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh、二甲苯单氧合酶xmo基因序列、苯甲醇脱氢酶badh、苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1进行连接，构建表达载体pET28a-tdh、pCDFDuet-1-xmo和pETDuet-1-badhbzdh。然后将表达质粒pET28a-tdh、pCDFDuet-1-xmo和pETDuet-1-badhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
在一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pETDuet-1上得到重组表达质粒pETDuet-1-tdhxmobadhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pETDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh和二甲苯单氧合酶xmo基因序列、苯甲醇脱氢酶badh和苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建表达载体pETDuet-1-tdhxmobadhbzdh。然后将表达质粒pETDuet-1-tdhxmobadhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
在另一种实施方式中，所述表达，是将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pET28a上得到重组表达质粒pET28a-tdh，二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pETDuet-1上得到重组表达质粒pETDuet-1-xmobadhbzdh，具体操作是将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo和苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pETDuet-1第一个多克隆位点的酶切位点SacI和NotI之间，将苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的酶切位点NdeI和XhoI之间。分别在引物的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh、二甲苯单氧合酶xmo基因序列和苯甲醇脱氢酶badh的连续基因、苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用SacI和NotI、NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a和pETDuet-1进行连接，构建表达载体pET28a-tdh和pETDuet-1-xmobadhbzdh。然后将表达质粒pET28a-tdh和pETDuet-1-xmobadhbzdh转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
本发明的第三方面，提供一种合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，所述方法是利用L-苏氨酸为底物，通过苏氨酸脱氢酶，二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶为催化剂催化反应制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。
一种合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，利用本发明所述的重组工程菌为出发菌株，在含有L-苏氨酸的培养基中进行发酵生产得到5-甲基吡嗪-2-羧酸。
优选地，所述的发酵是以L-苏氨酸为唯一底物进行发酵生产。
发酵所用的培养基包括碳源、氮源、无机盐等；本发明不特别限定发酵培养基，只要有利于菌种生长即可，本领域技术人员可选择市售培养基或根据需要自行配置。在一个实施方式中，所述的发酵过程所用的培养基为蛋白胨1.2％、酵母浸粉2.4％、K2HPO417mM、KH2PO472mM、甘油0.5％，消泡剂SAG6300.001％。
优选地，底物L-苏氨酸的浓度为6-12g/L，优选为8-12g/L，进一步优选为10g/L。
优选地，所述的反应时间为8-12h，优选为8h。
优选地，所述的反应温度为22-30℃，优选为28℃。
优选地，所述的反应体系pH为6.5-7.5，优选pH为7.0～7.2。
下面将进一步详述一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，将表达苏氨酸脱氢酶、二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组工程菌接种逐级扩大培养，按发酵液体积1～10％的接种量，并接种至装有培养基的发酵罐中，37±0.5℃下培养，控制pH6.5～7.5，待OD600达到12或以上时，加入终浓度为20-200μg/ml的诱导剂IPTG，22～30℃下培养3～5h，流加底物L-苏氨酸2～5h至终浓度为6-12g/L，继续发酵培养8～12h，反应结束。
更进一步地，所述加入诱导剂IPTG的终浓度为20～28μg/ml，优选24μg/ml。
更进一步地，所述的诱导温度为22～30℃，优选为28℃。
与现有技术相比，本发明取得了如下的有益效果：
本发明通过构建同时表达苏氨酸脱氢酶、二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的重组工程菌，实现了以L-苏氨酸为底物一步高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸，摩尔转化率高达85％以上，本发明的方法工艺简单，生产周期短，底物转化率高，产物易于从反应液中分离纯化，工艺污染小，能耗低，易于放大生产。
附图说明
图1：表达载体pRSFDuet-1-tdhxmobadhbzdh质粒构建图；
图2：表达载体pET28a-tdh质粒构建图；
图3：表达载体pETDuet-1-xmobadhbzdh质粒构建图；
图4：表达载体pCDFDuet-1-xmobadhbzdh质粒构建图；
图5：表达载体pETDuet-1-xmo质粒构建图；
图6：表达载体pCDFDuet-1-badhbzdh质粒构建图；
图7：表达载体pCDFDuet-1-xmo质粒构建图；
图8：表达载体pETDuet-1-badhbzdh质粒构建图；
图9：表达载体pETDuet-1-tdhxmobadhbzdh质粒构建图；
图10：表达载体pETDuet-1-xmobadhbzdh-1质粒构建图；
图11：不同构建方式的菌种对底物转化率的影响；
图12：不同诱导剂浓度对底物转化率的影响；
图13：不同诱导温度对底物转化率的影响；
图14：不同诱导时间对底物转化率的影响；
图15：不同底物浓度对底物转化率的影响；
图16：反应时间对产物浓度的影响；
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明的技术方案进行描述，应理解的是，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的保护范围。
以下实施例中所用到的试剂、材料等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。实验中未介绍到的详细的实验条件、参数等均为本领域常规技术，基因克隆操作可参考J.萨姆布鲁克等编写的《分子克隆实验指南》。
本发明实施例中基因工程操作所用的一步克隆试剂盒均购自Vazyme，南京维诺赞生物科技有限公司；质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coli BL21(DE3)、质粒等购自上海生工；DNAmarker、FastPfu DNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂、引物合成与基因测序工作由上海生工有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。
本发明实施例采用高效液相色谱法对5-甲基吡嗪-2-羧酸进行定量检测，具体条件如下：
色谱柱：YMC-Triart C18，5μm，4.6×250mm；
柱温：25℃；
流动相：甲醇-0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液(体积比15：85)(磷酸调至pH6.0)；
流速：1.0ml/min；
检测波长：264nm；
进样量：20μl。
本发明实施例所涉及的基因：
苏氨酸脱氢酶为Escherichia coli来源的苏氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
二甲苯单加氧酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的二甲苯单氧合酶，其序列如SEQ ID NO：3所示；核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
苯甲醇脱氢酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的苯甲醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5；核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
苯甲醛脱氢酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的苯甲醛脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7；核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
相关引物说明：
引物1:GAGCTCATGAAAGCGTTATCCAAACTGA；
引物2:GCGGCCGCTCAAATGCTAGCCACCCG；
引物3:CATATGATGGAAATCAAAGCAGCAAT；
引物4:CTCGAGTCAAAATGGGTAATTAGCTG。
引物5:GCGGCCGCTTAATCCCAGCTCAGAATAA；
引物6:GAGCTCATGGACACGCTTCGTTATTA；
引物7:GCGGCCGCTCAACCAATCCGGAGTACCG；
引物8:CATATGATGCGGGAAACAAAAGAGCA；
引物9:GAGCTCATGGAAATCAAAGCAGCAAT。
实施例1重组大肠杆菌的构建
(1)感受态细胞的制备
从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E.coli BL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5ml的LB培养基的试管中，37℃、180rpm培养9h；从试管中取200μl菌液，接种到50μl的LB培养基中，37℃、180rpm培养OD600至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10min，4℃、5000rpm离心10min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30min；4℃、5000rpm离心10min，弃上清，用预冷的含15％甘油的0.1mol/L的CaCl2水溶液重悬沉淀细胞，取100μl重悬细胞分装至灭菌的1.5ml离心管中，保藏于-80℃冰箱，备用。
(2)以筛选到的Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa strain菌株基因组为模板，通过PCR获得苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh，并通过一步克隆技术将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接在一起，形成完整的基因序列并构建到pET28a质粒上(位于SacI和NotI酶切位点之间)，获得质粒pET28a-tdhxmobadhbzdh。
(3)质粒构建
质粒构建1：将苏氨酸脱氢酶基因tdh和二甲苯单氧合酶基因xmo完整序列克隆在pRSFDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pRSFDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI酶切位点之间。在引物(1和2)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh和二甲苯单氧合酶xmo的连续基因序列，测序后利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(3和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醇脱氢酶badh和苯甲醛脱氢酶bzdh的连续基因序列，测序后NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将两片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pRSFDuet-1进行连接，构建得到表达载体pRSFDuet-1-tdhxmobadhbzdh，如图1所示。
质粒构建2：将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pETDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI酶切位点之间。在引物(1和5)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh基因序列，测序后用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，测序后利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a进行连接，构建得到表达载体pET28a-tdh。在引物(6和2)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得二甲苯单氧合酶xmo基因序列，测序后利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(3和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醇脱氢酶badh和苯甲醛脱氢酶bzdh的连续基因序列，测序后利用NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将两片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建得到表达载体pETDuet-1-xmobadhbzdh。表达载体pET28a-tdh如图2所示，表达载体pETDuet-1-xmobadhbzdh如图3所示。
质粒构建3：将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pCDFDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pCDFDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI的酶切位点之间。在引物(1和5)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh，测序后用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，测序后利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a进行连接，构建得到表达载体pET28a-tdh。在引物(6和7)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得二甲苯单氧合酶xmo和苯甲醇脱氢酶badh基因连续序列，测序后利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(8和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pCDFDuet-1进行连接，构建得到表达载体pCDFDuet-1-xmobadhbzdh。表达载体pET28a-tdh如图2所示，表达载体pCDFDuet-1-xmobadhbzdh如图4所示。
质粒构建4：将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pETDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pCDFDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pCDFDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI酶切位点之间。在引物(1和5)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh基因，测序后用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，再利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a进行连接，构建得到表达载体pET28a-tdh。在引物(6和2)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得二甲苯单氧合酶xmo基因序列，利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，再利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建得到表达载体pETDuet-1-xmo。在引物(9和7)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醇脱氢酶badh基因序列，利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(8和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醛脱氢酶bzdh基因序列，利用NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，再利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将两片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pCDFDuet-1进行连接，构建得到表达载体pCDFDuet-1-badhbzdh。表达载体pET28a-tdh如图2所示，表达载体pETDuet-1-xmo如图5所示，表达载体pCDFDuet-1-badhbzdh如图6所示。
质粒构建5：将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pCDFDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pETDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI酶切位点之间。在引物(1和5)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh，测序后用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，再利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a进行连接，构建得到表达载体pET28a-tdh。在引物(6和2)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得二甲苯单氧合酶xmo基因序列，利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，再利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pCDFDuet-1进行连接，构建得到表达载体pCDFDuet-1-xmo。在引物(9和7)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醇脱氢酶badh基因序列，利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(8和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，获得苯甲醛脱氢酶bzdh基因序列，利用NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，再利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将两片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建得到表达载体pETDuet-1-badhbzdh。表达载体pET28a-tdh如图2所示，表达载体pCDFDuet-1-xmo如图7所示，表达载体pETDuet-1-badhbzdh如图8所示。
质粒构建6：将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo克隆在pETDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，将苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI酶切位点之间。在引物(1和2)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh和二甲苯单氧合酶xmo的连续基因序列，测序后利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(3和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，苯甲醇脱氢酶badh和苯甲醛脱氢酶bzdh的连续基因序列，测序后NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将两片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建得到表达载体pETDuet-1-tdhxmobadhbzdh，表达载体pETDuet-1-tdhxmobadhbzdh如图9所示。
质粒构建7：将苏氨酸脱氢酶基因tdh克隆到pET28a的酶切位点SacI和NotI之间，将二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh克隆到pETDuet-1第一个多克隆位点的SacI和NotI酶切位点之间，苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆在pETDuet-1第二个多克隆位点的NdeI和XhoI酶切位点之间。在引物(1和5)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得苏氨酸脱氢酶tdh，测序后用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，测序后利用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET28a进行连接，构建得到表达载体pET28a-tdh。在引物(6和7)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得二甲苯单氧合酶xmo和苯甲醇脱氢酶badh连续基因序列，测序后利用SacI和NotI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理；在引物(8和4)的引发下，以pET28a-tdhxmobadhbzdh质粒为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，和苯甲醛脱氢酶bzdh的基因序列，测序后分别利用NdeI和XhoI限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并分别利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将两片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pETDuet-1进行连接，构建得到表达载体pETDuet-1-xmobadhbzdh-1。表达载体pET28a-tdh如图2所示，表达载体pETDuet-1-xmobadhbzdh-1如图10所示。
(4)共表达tdh、xmo、badh和bzdh的重组大肠杆菌构建
首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内分别加入5μl的酶连产物体系，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600μl的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；分别涂布于含有50μg/ml含相应抗性(pET28a为卡那霉素抗性，pRSFduet-1为卡那霉素抗性，pCDFduet-1为链霉素抗性，pETduet-1为氨苄青霉素抗性)的LB平板，37℃下培养8-12h，每个平板随机挑取10个克隆抽提质粒进行测序鉴定，分别进行筛选，各获得1株含有步骤(3)中每种表达重组质粒的重组大肠杆菌。由步骤(3)中质粒构建1-7所得重组大肠杆菌分别依次编号为1-7号菌株。
(5)菌种库的筛选
种子瓶：将上述7株重组大肠杆菌菌种分别接种至种子瓶(培养基组分：蛋白胨1.2％、酵母浸粉2.4％、K2HPO417mM、KH2PO472mM、甘油0.5％)中，在37℃下培养12h。
筛选体系：将上述种子瓶分别接种1％至发酵瓶(培养基组分：蛋白胨1.2％、酵母浸粉2.4％、K2HPO417mM、KH2PO472mM、甘油0.5％，L-苏氨酸0.6％)中，在37℃下培养，pH控制7.0，待OD600达到12时加入诱导剂IPTG，IPTG终浓度为24μg/ml，降温至28℃诱导培养10h，反应结束，HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2羧酸的含量，检测结果如图11所示。从图11结果可知，7号菌株BL21(DE3)-AXMS7摩尔转化率最高。
实施例2重组大肠杆菌BL21(DE3)-AXMS7发酵和催化条件的建立
发酵培养基组分：蛋白胨1.2％、酵母浸粉2.4％、K2HPO417mM、KH2PO472mM、甘油0.5％，消泡剂SAG6300.001％。
补料培养基成分：蛋白胨1.5％，酵母浸粉1％，甘油3％。
底物L-苏氨酸溶液：浓度500g/L。
将重组大肠杆菌BL21(DE3)-AXMS7接种至同时含有50μg/ml卡那霉素和氨苄霉素抗性的30ml的一级种子瓶培养基中，37℃，220rpm下培养8h。再以体积浓度1％接种量接种至同时含有50μg/ml卡那霉素和氨苄霉素抗性的150ml的二级种子瓶培养基中，于37℃，220rpm下培养10h，以3％接种量接种至含有15L培养基的发酵罐中。
(1)诱导剂浓度的筛选
在发酵罐培养过程中，在37℃、pH7.0下培养，待OD600达到12时，降温到28℃，加入诱导剂IPTG，IPTG终浓度为20、22、24、26、28μg/ml，溶氧DO迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，在28℃下诱导培养3h后，开始流加底物L-苏氨酸至终浓度为10g/L，流加速度为100ml/h，流加完毕后继续28℃发酵培养8h，反应结束，HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2羧酸的含量，结果如图12所示。从图12可以看出，诱导剂浓度为20、22、24、26、28μg/ml，产物转化率相当，诱导剂浓度为24μg/ml时产物转化率略高。
(2)诱导温度的筛选
在发酵罐培养过程中，在37℃、pH7.0下培养，待OD600达到12时，分别降温至22、25、28、30℃下，加入终浓度为24μg/ml的诱导剂IPTG，溶氧迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，分别培养3h后，开始流加底物L-苏氨酸至终浓度为10g/L，流加速度为100ml/h，继续分别在22、25、28、30℃下培养8h后结束，HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2羧酸的含量，结果如图13所示。从图13可以看出，诱导温度为28℃时，产物转化率较高。
(3)诱导时间的筛选
在发酵罐培养过程中，37℃、pH7.2条件下培养，待OD600达到12时，降温至28℃加入终浓度为24μg/ml的诱导剂IPTG，溶氧迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，分别在诱导3、4、5、6小时后开始流加底物L-苏氨酸至终浓度为10g/L，流加速度为100ml/h，继续在28℃下发酵培养8h后反应结束HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图14所示。从图14可以看出，诱导时间对转化率的影响较小。
(4)底物浓度的筛选
在发酵罐培养过程中，37℃、pH7.2条件下培养，待OD600达到12时，降温至28℃加入终浓度为24μg/ml的诱导剂IPTG，溶氧迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，分别在诱导3小时后开始流加底物，流加速度为100ml/h，分别流加底物L-苏氨酸终浓度为4、6、8、10、12g/L，继续在28℃下发酵培养8h后反应结束，HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图15所示。从图15可以看出，随着底物浓度的增大，转化率有下降趋势，为了高浓度的产物5-甲基吡嗪-2羧酸，优选底物L-苏氨酸的浓度为10g/L。
(5)反应时间的筛选
在发酵罐培养过程中，37℃、pH7.2条件下培养，待OD600达到12时，降温至28℃加入终浓度为24μg/ml的诱导剂IPTG，溶氧迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，在诱导3小时后开始流加底物L-苏氨酸至终浓度为10g/L，流加速度为100ml/h，继续在28℃下发酵培养12h，每小时取样通过HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，结果如图16所示。从图16可知，随着反应时间的延长，产物浓度逐渐增大，但达到8h以后产物浓度增加极其缓慢，因此，优选反应时间为8h。
实施例3 5-甲基吡嗪-2羧酸的合成
发酵培养基组分：蛋白胨1.2％、酵母浸粉2.4％、K2HPO417mM、KH2PO472mM、甘油0.5％，消泡剂SAG6300.001％。
补料培养基成分：蛋白胨1.5％，酵母浸粉1％，甘油3％。
底物L-苏氨酸溶液：浓度500g/L。
将重组大肠杆菌BL21(DE3)-AXMS7接种至同时含有50μg/ml卡那霉素和氨苄霉素抗性的30ml的一级种子瓶培养基中，37℃，220rpm下培养8h。再以体积浓度1％接种量接种至同时含有50μg/ml卡那霉素和氨苄霉素抗性的150ml的二级种子瓶培养基中，于37℃，220rpm下培养10h，以3％接种量接种至含有15L培养基的发酵罐中。待OD600达到12时，降温至28℃加入终浓度为24μg/ml的诱导剂IPTG，溶氧迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，在诱导3小时后开始流加底物L-苏氨酸至终浓度为10g/L，流加速度为100ml/h，继续在28℃下发酵培养8h后反应结束，HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，达到9.97g/L，转化率为85.99％。
实施例4 5-甲基吡嗪-2羧酸的合成
发酵培养基组分调整：蛋白胨1.0％、酵母浸粉2.5％、K2HPO417mM、KH2PO472mM、甘油0.8％，消泡剂SAG6300.001％。
补料培养基成分：蛋白胨1.5％，酵母浸粉1％，甘油3％。
底物L-苏氨酸溶液：浓度500g/L。
将重组大肠杆菌BL21(DE3)-AXMS7接种至同时含有50μg/ml卡那霉素和氨苄霉素抗性的30ml的一级种子瓶培养基中，37℃，220rpm下培养8h。再以体积浓度1％接种量接种至同时含有50μg/ml卡那霉素和氨苄霉素抗性的150ml的二级种子瓶培养基中，于37℃，220rpm下培养10h，以3％接种量接种至含有15L培养基的发酵罐中。待OD600达到12时，降温至28℃加入终浓度为24μg/ml的诱导剂IPTG，溶氧迅速上升时补加补料培养基，通过补料维持DO在30％～40％之间，在诱导3小时后开始流加底物L-苏氨酸至终浓度为10g/L，流加速度为150ml/h，继续在28℃下发酵培养8h后反应结束，HPLC检测产物5-甲基吡嗪-2-羧酸的含量，达到9.86g/L，转化率为85.04％。
序列表
<110> 山东新时代药业有限公司
<120> 一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸工程菌的构建及应用
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actggtctag acatcgcaaa gcgtctaaat accggtatgg tccatattaa tgaccagcca 1320
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Claims (10)

1.一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌表达苏氨酸脱氢酶TDH、二甲苯单加氧酶XMO、苯甲醇脱氢酶BADH和苯甲醛脱氢酶BZDH。
2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于，所述的苏氨酸脱氢酶为Escherichia coli来源的苏氨酸脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述的二甲苯单加氧酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的二甲苯单氧合酶，其氨基酸序列如SEQID NO：3所示；所述的苯甲醇脱氢酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的苯甲醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5；所述苯甲醛脱氢酶为Pseudomonas aeruginosa strain来源的苯甲醛脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7。
3.一种权利要求1或2所述的重组工程菌的构建方法，其特征在于，包括将苏氨酸脱氢酶基因tdh、二甲苯单氧合酶基因xmo、苯甲醇脱氢酶基因badh、苯甲醛脱氢酶基因bzdh克隆到表达载体上构建得到重组表达质粒，然后将构建的表达质粒转入宿主细胞中进行表达。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的表达载体选自pRSFDuet-1、pET-28a、pETDuet-1、pCDFDuet-1中的一种或几种；优选所述的表达载体为pET-28a和pETDuet-1。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，将苏氨酸脱氢酶基因tdh连接到表达载体pET28a上得到重组表达质粒pET28a-tdh；二甲苯单氧合酶基因xmo与苯甲醇脱氢酶基因badh的连续基因、苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pETDuet-1上得到重组表达质粒pETDuet-1-xmobadhbzdh，然后将构建的表达质粒都转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述二甲苯单氧合酶基因xmo与苯甲醇脱氢酶基因badh连接到表达载体pETDuet-1的第一个克隆位点，苯甲醛脱氢酶基因bzdh连接到表达载体pETDuet-1的第二个克隆位点上。
8.一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1-2任一项所述的重组工程菌为出发菌株，在含有L-苏氨酸的培养基中进行发酵生产得到5-甲基吡嗪-2羧酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，L-苏氨酸的浓度为8-12g/L。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应时间为8-12h，反应温度为22～30℃。
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