CN115465853B - 一种基于柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇橙光碳点及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光纳米材料领域，具体为基于柠檬酸和手性2‑氨基‑1,2‑二苯基乙醇的橙色荧光碳点及其制备方法与应用。以柠檬酸、手性2‑氨基‑1,2‑二苯基乙醇为原料，不添加任何溶剂，进行高温固相反应，然后通过柱层析来分离提纯目标荧光碳点，其中，以(1R,2S)‑2‑氨基‑1,2‑二苯基乙醇制备的碳点命名为RCDs，以(1S,2R)‑2‑氨基‑1,2‑二苯基乙醇制备的碳点命名为SCDs。RCDs和SCDs均具有双光子荧光性质，有优异的单光子、双光子细胞成像效果。由于RCDs具有较好的产羟基自由基的能力和光热转换能力，发明人将其用于光动力和光热联合治疗，在小鼠荷瘤模型中，成功地抑制了肿瘤的生长，体现出良好的联合治疗效果，是潜在的光动力、光热联合治疗剂。
Description
技术领域
本发明属于荧光纳米材料领域，具体为基于柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇的橙色荧光碳点及其制备方法与应用。
背景技术
癌症治疗一直是医学界需攻克的难题，患者通常接受化疗、放疗、手术，但这些常规疗法具有严重副作用，给患者身体带来极大负担。光动力、光热治疗是人类在与癌症的不断斗争中打磨出的亮剑，其精准治疗且毒副作用低。在光动力疗法(PDT)中，光敏剂在光照下产生高浓度ROS来氧化损伤恶性细胞；在光热疗法(PTT)中，光热剂在激光照射下迅速积累热量从而提高肿瘤部位的局部温度来杀死癌细胞。但由于肿瘤细胞的缺氧微环境或耐热性，单独使用PDT或PTT的效果受限，使肿瘤细胞不能根除，将PDT和PTT结合起来是必要的选择，但这可能涉及到繁琐的设计步骤和高成本投入，因此开发出一种同时能实现PDT和PTT的简易治疗剂是迫切的。
碳点(Carbon Dots，CDs)是一种新型碳纳米材料。2004年，这种发光的碳纳米材料首次出现在科研者们的视野中，2006年，这种材料被首次冠以碳点的名称报道，CDs的优异光致发光(PL)性质使其获取了众多学者的重视，随着对CDs的进一步认识、研究，CDs更多优越的性能被挖掘，其已在传感、生物、光电器件、防伪等领域展现出了巨大应用优势，CDs已然是纳米材料领域的一大研究热点。近来研究发现，碳点可以实现PDT、PTT协同治疗，并且其具有成本低、制备简单、抗光漂白性、低毒等优点，可实现体内肿瘤成像引导PDT/PTT联合治疗，此外，多光子荧光激发具有更深的穿透深度和更小的毒副作用，这更利于碳点的生物应用。碳点在临床上具有很大应用潜力，因此开发出更多优异光动力、光热性能的碳点来证实、支撑其可作为光疗剂用于肿瘤治疗是具有重大意义的。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种基于柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点及其制备与应用，该碳点具有单或双光子荧光性质，并且其体外、体内PDT/PTT联合治疗效果优异，可作为一种安全低毒的光疗剂用于癌症治疗。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种基于柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇的橙色荧光碳点，原料由柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇或(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇组成，柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇的摩尔比为1:1-5。
本发明中，所述柠檬酸与(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的荧光碳点(以下简称RCDs)粒径范围为0.8-6.3nm；进一步地，平均粒径为2.7nm。
本发明中，所述柠檬酸与(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的荧光碳点(以下简称SCDs)粒径范围为1.3-5.6nm；进一步地，平均粒径为3.0nm。
本发明还提供一种上述荧光碳点(RCDs或SCDs)的制备方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇或(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇混合，进行高温固相反应；
(2)将步骤(1)所得反应物进行冷却、溶解、柱层析分纯处理，得所述碳点。
本发明中，所述步骤(1)中高温固相制备的温度为180-220℃，制备时间为6-10h。
本发明中，所述步骤(2)中，加入溶剂充分溶解步骤(1)中所得反应物，然后以柱层析的方式分离提纯；
进一步地，步骤(2)中所述溶剂选自有机溶剂，例如乙酸乙酯、二氯甲烷等。
发明人研究结果表明，本发明中的橙色荧光碳点，RCDs与SCDs，均表现出单或双光子荧光特性。对于双光荧光特性，RCDs与SCDs分别在不同功率及长波长激发光(红外光区激发光)下，激光功率和发射光强度之间为对数关系，表明两者均具有双光子荧光特性。
本发明还将上述橙色荧光碳点用于荧光成像。
进一步地，是将上述橙色荧光碳点作为单光子和/或双光子细胞成像探针或染料。
本发明的一些实施方案中，将上述橙色荧光碳点用于荧光成像，具体地是将荧光碳点加入培养液中，与细胞共孵育后，用PBS洗掉未进入细胞内的碳点，然后在共聚焦荧光显微镜下观察，细胞内部呈现橙色荧光；
本发明中，对于柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇荧光碳点，单光子荧光成像时的激发光波长为380nm～540nm，优选488nm；双光子荧光成像时的激发波长为800nm～1000nm，优选900nm。
本发明中，对于柠檬酸和(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇荧光碳点，单光子成像时的激发光波长为380nm～540nm，优选490nm；双光子荧光成像时的激发波长为800nm～1000nm，优选850nm。
本发明还提供一种荧光成像探针或染料，所述探针或染料包括RCDs和/或SCDs。
发明人研究发现，RCDs与SCDs的光动力及光热性能良好，在光照射下，能够产生ROS，且能够将光能转化为热能。
基于此，本发明还将上述橙色荧光碳点用于制备抗癌药物；
进一步地，是将橙色荧光碳点用于制备抗腺癌药物；
更进一步地，是将橙色荧光碳点用于制备抗乳腺癌药物。
本发明中所述腺癌是腺上皮细胞形成的癌症，例如乳腺癌、结肠癌和前列腺癌等。
在本发明的一些实施例中，是将上述橙色荧光碳点用于制备光动力和/或光热治疗剂，用于癌症治疗。
本发明还提供一种光动力和/或光热治疗剂，光动力和/或光热治疗剂中包括RCDs和/或SCDs。
本发明的有益效果：
(1)本发明以柠檬酸为碳源、手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇为氮源，所用氮源未曾被报道，原料具有新颖性；
(2)本发明中碳点制备过程简单、成本也较低；
(3)本发明中提供的RCDs与SCDs均具有双光子荧光性质，可作为双光子荧光成像探针或染料，具备组织自发荧光背景小、穿透深度大、对生物组织损伤轻微的优点；
(4)本发明中提供的RCDs还具有较好的产羟基自由基的能力和光热转换能力，在808nm激光(1w/cm2)照射下，RCDs溶液温度可升至约46℃，这表明RCDs有潜力用于光动力、光热联合治疗。实验结果证明，RCDs的体外、体内光动力、光热联合治疗效果优异，在小鼠荷瘤模型中，成功的抑制了肿瘤生长，并且血生化检测、组织H&E染色结果证明，RCDs对小鼠没有显著毒性，其有潜力作为肿瘤光疗的候选药物。
附图说明
图1为本发明制备的RCDs的透射电镜/高分辨透射电镜(TEM/HRTEM)图。
图2为(a)RCDs固体在490nm、900nm激发下的荧光谱图；(b)RCDs在不同功率900nm激发下的双光子荧光谱图以及(c)激光功率与RCDs荧光强度之间的关系图。
图3为不同光照时间下RCDs溶液(含有DCFH)的荧光谱图。
图4为光照处理后的RCDs溶液的电子顺磁共振(EPR)谱图。
图5为808nm激光照射下RCDs溶液和空白溶液的温度变化图。
图6为与RCDs共孵育后的4T1细胞单光子、双光子荧光成像图。
图7为Calcein-AM/PI染色的4T1细胞荧光图像。
图8为(a)治疗期间小鼠的肿瘤生长情况；(b)14天后的肿瘤组织大小；(c)小鼠的体重变化趋势图。
图9为本发明制备的SCDs的透射电镜/高分辨透射电镜(TEM/HRTEM)图。
图10为(a)SCDs固体在490nm、850nm激发下的荧光谱图；(b)SCDs在不同功率850nm激发下的双光子荧光谱图以及(c)激光功率与SCDs荧光强度之间的关系图。
图11为与SCDs共孵育后的4T1细胞单光子、双光子荧光成像图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明中提供的技术方案进行详细描述，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
RCDs的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.384g研磨后的柠檬酸和0.640g(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇(摩尔比1:1.5)混匀加入高压反应釜中，置于鼓风干燥箱内，待温度升至180℃后保持6h；
(2)反应结束后，需待反应釜自然冷却至室温后才开釜，向里加入乙酸乙酯搅拌溶解；通过柱层析的方式分离提纯橙色荧光碳点RCDs。
图1为本实施例所制备RCDs的透射电镜(TEM)图像，从图中可以看出，所制备的RCDs近似圆形，分散性良好；粒径范围在0.8-6.3nm间，平均粒径为2.7nm。RCDs的高分辨透射电镜(HRTEM)图像显示碳点有明显的晶格条纹，晶面间距为0.23nm。
图2(a)是RCDs固体在490nm、900nm激发下的荧光谱图，发射峰位置均约在590nm处；图2(b)为RCDs固体在不同功率900nm激发下的双光子荧光谱图，随着输出功率越大，RCDs荧光越强；图2(c)显示了激光功率和RCDs发射荧光强度对数之间的关系，斜率为1.83，表明RCDs具有双光子荧光特性。
图3为不同光照时间下RCDs溶液(含有DCFH)的荧光谱图，图中显示，约525nm处的峰随着光照时间的增加而逐渐增强，这是因为RCDs溶液在光照条件下会产生活性氧(ROS)，DCFH与ROS作用后被氧化生成了强绿色荧光的DCF。
图4为光照处理后的RCDs溶液的电子顺磁共振(EPR)谱图。以DMPO为自由基捕获剂，对光照处理后的RCDs溶液进行电子顺磁共振(EPR)测试，测试结果显示，有较强羟基自由基信号。结合图3、图4，光动力性能测试结果表明，RCDs有潜力用于I型光动力治疗。
图5显示了808nm激光照射下RCDs溶液的温度变化趋势，RCDs溶液的初始温度为21.7℃，10min时，温度可升至42.4℃，20min时，温度接近46℃，而空白对照溶液照射10min时，温度只有29.3℃，20min时，温度约为32℃，RCDs溶液的升温速率显著高于空白对照，且其温度能高达46℃，表明RCDs具有较好的光热转换能力，有潜力用于光热治疗。
实施例2：
SCDs的制备方法，包括以下步骤：
(1)将0.384g研磨后的柠檬酸和0.640g(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇(摩尔比1:1.5)混匀加入高压反应釜中，置于鼓风干燥箱内，待温度升至180℃后保持6h；
(2)反应结束后，需待反应釜自然冷却至室温后才开釜，向里加入乙酸乙酯搅拌溶解；通过柱层析的方式分离提纯橙色荧光碳点SCDs。
图9为本实施例所制备SCDs的透射电镜(TEM)图像，从图中可以看出，所制备的SCDs近似圆形，分散性良好；粒径范围在1.3-5.6nm间，平均粒径为3.0nm。SCDs的高分辨透射电镜(HRTEM)图像显示碳点有明显的晶格条纹，晶面间距为0.21nm。
图10(a)是SCDs固体在490nm、850nm激发下的荧光谱图，发射峰位置均约在590nm处；图10(b)为SCDs固体在不同功率850nm激发下的双光子荧光谱图，随着输出功率越大，SCDs荧光越强；图10(c)显示了激光功率和SCDs发射荧光强度对数之间的关系，斜率为1.77，表明SCDs具有双光子荧光特性。
应用例1
将本发明实施例1中所得RCDs用于小鼠乳腺癌细胞(4T1)荧光成像，具体步骤如下：
(1)将4T1细胞接种在直径为20mm的激光共聚焦培养皿中，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育；
(2)取出步骤(1)中的共聚焦小皿，吸出旧培养基，用PBS润洗细胞后，重新加入含有RCDs的培养基(RCDs浓度为20μg/mL)，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中继续孵育4h；
(3)孵育结束后，吸出旧培养基，然后用PBS溶液润洗细胞3次以除去多余的未进入细胞内的RCDs后，置于共聚焦荧光显微镜下观察。
图6为与RCDs共孵育后的4T1细胞荧光成像图，可以看出，RCDs在488nm、900nm激发下都有明亮荧光，其单光子、双光子成像效果均优异，并且，RCDs主要富集在了溶酶体部位，显示出溶酶体靶向性。
应用例2
将本发明实施例1中所得RCDs用于小鼠乳腺癌细胞(4T1)光疗，具体步骤如下：
(1)将处于对数生长期的4T1细胞接种至4个共聚焦小皿中，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育24h；
(2)将步骤(1)中的4个共聚焦小皿分别标记为空白组、仅光照组(白光+808nm激光)、仅给药组(RCDs)、给药+光照组，然后做相应实验处理：仅光照组细胞加入新培养基后，用氙灯(200mw/cm2)和808nm激光(1w/cm2)照射细胞10min后，再孵育12h；仅给药组细胞用含RCDs(20μg/mL)的培养基替换掉旧培养基后继续孵育；给药+光照组细胞用含RCDs(20μg/mL)的培养基替换掉旧培养基后，再以氙灯(200mw/cm2)和808nm激光(1w/cm2)照射细胞10min，放入培养箱继续孵育；空白组加入新培养基后，不作任何处理，继续孵育。
(3)孵育结束后，去除旧培养基，加入Calcein-AM/PI缓冲液孵育30min，最后用PBS润洗后，置于共聚焦荧光显微镜下观察。
图7显示，仅光照组和仅给药组中的细胞均被Calcein-AM标记，在488nm激发下有强绿色荧光，在552nm激发下，未观察到PI染色的死细胞的红色荧光，表明光照或RCDs对细胞几乎没有毒性；而给药+光照组的细胞在552nm激发下表现出大区域红色荧光信号，几乎所有细胞的细胞核都被PI染色，这表明RCDs在白光照射下产生的ROS和在808nm激光照射下产生的热对4T1有较好的杀伤效果。RCDs在细胞层次上成功实现了光动力/光热协同治疗。基于此，我们进一步构建小鼠皮下肿瘤模型研究了其体内光疗效果。
应用例3
将本发明实施例1中所得RCDs用于小鼠皮下肿瘤光疗，具体步骤如下：
(1)构建小鼠肿瘤模型：以BALB/C小鼠(雌性，4周大)为实验对象，取100μL 4T1细胞的PBS悬浮液(约2×106)通过皮下注射进小鼠尾侧，然后置于小鼠饲养房内正常饲养，小鼠均能自由进食；
(2)癌细胞接种五天后，将小鼠平均分为四组，即空白对照组、仅给药组、仅光照组、给药+光照组，再分别进行不同处理。实验步骤为：空白对照组不进行任何处理；对仅光照组小鼠的肿瘤原位注射100μL的PBS溶液，以氙灯(200mw/cm2，2min)、808nm激光(1w/cm2，10min)照射小鼠的肿瘤部位；对仅给药组小鼠的肿瘤原位注射100μL的RCDs溶液(100μg/mL)，不进行光照；对给药+光照组小鼠的肿瘤原位注射100μL的RCDs溶液(100μg/mL)，以氙灯(200mw/cm2，2min)、808nm激光(1w/cm2，10min)照射小鼠的肿瘤部位。
(3)每两天记录一次小鼠体重和肿瘤大小，观察14天。肿瘤体积计算公式：1/2×肿瘤长度×肿瘤宽度2。
图8(a)是治疗期间小鼠的肿瘤体积变化，从图中可以看出，空白组、仅给药组小鼠的肿瘤在快速、持续生长，仅光照组小鼠的肿瘤受光辐照影响，生长略缓，而给药+光照组小鼠的肿瘤生长受到显著抑制；图8(b)是14天后的肿瘤组织体积大小，可以直观看出，给药+光照组小鼠的肿瘤体积明显小于其余三组，甚至完全消融，这表明RCDs具有显著的光疗效果。图8(c)反映了小鼠的体重变化，从图中可以看出，四组小鼠的体重在治疗期间没有显著降低，并且均在逐渐增重，这表明实验所用治疗手段对小鼠身体没有大的毒副作用。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式只局限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (15)
1.一种基于柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇的橙色荧光碳点，其特征在于，原料由柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇或(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇组成，柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇的摩尔比为1:1-5；
制备碳点的方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇或(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇混合，进行高温固相反应；
(2)将步骤(1)所得反应物进行冷却、溶解、柱层析分纯处理，得所述碳点；
所述步骤(1)中高温固相制备的温度为180-220℃，制备时间为6-10h。
2.根据权利要求1所述的碳点，其特征在于，所述基于柠檬酸与(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点粒径范围为0.8-6.3nm；所述基于柠檬酸与(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点粒径范围为1.3-5.6nm。
3.根据权利要求1所述的碳点，其特征在于，所述基于柠檬酸与(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点平均粒径为2.7nm；所述基于柠檬酸与(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点平均粒径为3.0nm。
4.制备如权利要求1-3任意一项所述碳点的方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇或(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇混合，进行高温固相反应；
(2)将步骤(1)所得反应物进行冷却、溶解、柱层析分纯处理，得所述碳点。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中高温固相制备的温度为180-220℃，制备时间为6-10h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，加入溶剂充分溶解步骤(1)中所得反应物，然后以柱层析的方式分离提纯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种或两种。
8.如权利要求1-3任意一项所述的碳点在荧光成像中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是将碳点作为单光子和/或双光子细胞成像探针或染料。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是将碳点加入培养液中，与细胞共孵育后，用PBS洗掉未进入细胞内的碳点，然后在共聚焦荧光显微镜下观察，细胞内部呈现橙色荧光。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，对于基于柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点，单光子荧光成像时的激发光波长为380nm～540nm；双光子荧光成像时的激发波长为800nm～1000nm；对于基于柠檬酸和(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点，单光子成像时的激发光波长为380nm～540nm；双光子荧光成像时的激发波长为800nm～1000nm。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，对于基于柠檬酸和(1R,2S)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点，单光子荧光成像时的激发光波长为488nm；双光子荧光成像时的激发波长为900nm；对于基于柠檬酸和(1S,2R)-2-氨基-1,2-二苯基乙醇的碳点，单光子成像时的激发光波长为490nm；双光子荧光成像时的激发波长为850nm。
13.一种荧光成像探针或染料，其特征在于，包括权利要求1-3任意一项所述的碳点。
14.如权利要求1-3任意一项所述的碳点在制备抗乳腺癌药物中的应用。
15.一种光动力和/或光热治疗剂，其特征在于，包括权利要求1-3任意一项所述的碳点。
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