CN115397987A - 调节人l1反转录转座子rna的方法和用于其中的组合物 - Google Patents

Abstract

提供了用于在有需要的受试者中上调L1RNA活性的组合物和方法。该组合物包括编码L1RNA的核酸或L1RNA，单独或包含在表达载体中和/或进一步包含在基因工程化以表达L1RNA的成骨祖细胞例如间充质干细胞中。在这方面，组合物用于增加L1RNA水平，例如，需要增加其骨量指数的受试者中的L1RNA拷贝数。在优选的实施方案中，骨祖细胞是自体细胞。还提供了用于在有需要的受试者中下调L1RNA水平/活性的组合物和方法。该组合物包括一种或多种有效量的试剂以敲减细胞中的L1RNA。该组合物可用于治疗与衰老相关的病症。优选的试剂是L1RNA反义寡核苷酸。

Description

调节人L1反转录转座子RNA的方法和用于其中的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年10月16日提交的美国申请号62/916,096和2019年12月9日提交的美国申请号62/945,535的优先权，其公开内容通过引用整体纳入本文。

技术领域

本发明大体涉及在有需要的受试者中调节人L1反转录转座子RNA活性的方法，以及用于其中的组合物。

背景技术

长散布核元件(LINE)是一组非LTR(长末端重复)反转录转座子，其广泛存在于许多真核生物的基因组中。LINE组成了一个转座子家族，其中每个LINE的长度约为7000个碱基对。LINE被转录成mRNA并被翻译成充当逆转录酶的蛋白质。逆转录酶生成LINE RNA的DNA拷贝，其可以在新的位点整合到基因组中。人类中唯一丰富的LINE是LINE-1。L1约占人类基因组的21％(Lander,et al.Nature(2001),doi:10.1038/35057062)，但只有几十个，属于L1HS(L1人特异性的)Ta(转录的，子集a)亚家族，通过依赖于ORF2的RNA介导的“复制和粘贴”机制(Fent,et al.Cell(1996),doi:10.1016/S0092-8674(00)81997-2；Luan,et al.,Cell(1993),doi:10.1016/0092-8674(93)90078-5；Cost,et al.EMBO J.(2002),doi:10.1093/emboj/cdf592)，仍然保留自主反转录转座的能力(Sassaman,et al.Nat.Genet.(1997),doi:10.1038/ng0597-37；Brouha,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.(2003),doi:10.1073/pnas.0831042100)。尽管细胞已经进化出几种防御机制来防止有害的不受控制的转座(Kazazian,et al.N.Engl.J.Med.(2017),doi:10.1056/NEJMra1510092)，但证据表明，体细胞L1动员发生在发育中的大脑中，有助于个体体细胞镶嵌现象(Coufal,etal.Nature(2009),doi:10.1038/nature08248；Muotri,et al.Hippocampus(2009),doi:10.1002/hipo.20564；Baillie,et al.Nature(2011),doi:10.1038/nature10531；Evrony,et al.Cell(2012),doi:10.1016/j.cell.2012.09.035)，尽管它的功能仍然未知。有趣的是，在小鼠中，大脑中的L1重新激活与早期生活应激条件的暴露相关(Bedrosian,etal.Science 359(6382):1395-1399(2018),doi:10.1126/science.aah3378)。然而，其他组织是否支持L1动员，以及L1扩增是否有助于组织稳态在很大程度上尚未探索。

本发明的目的是提供用于在有需要的受试者中调节L1的组合物和方法。

发明内容

一个实施方案提供了用于在有需要的受试者中上调L1 RNA活性的组合物和方法。L1优选地属于L1HS-Ta1家族。组合物包括单独的或包含在表达载体中的编码L1 RNA的核酸或L1 RNA。NA优选地在对受试者药学上可接受的载体中，或者它可以通过基因改造骨髓来源的成骨祖细胞例如间充质干细胞掺入到所述祖细胞中以表达L1 RNA，并将表达L1 RNA的细胞悬浮在药学上可接受的载体中。在这方面，组合物用于增加L1 RNA水平，例如，需要增加其骨量指数的受试者中的L1 RNA拷贝数。示例性受试者包括绝经后妇女、被诊断患有骨质疏松症或有发生骨质疏松症风险的受试者以及接受逆转录病毒疗法例如NRT1的受试者。该方法包括向有需要的受试者施用编码L1 RNA的核酸(NA)或L1 RNA。NA可以在药学上可接受的载体中施用至受试者，或者它可以在药学上可接受的载体中以经基因工程改造以表达L1 RNA的骨髓来源的成骨祖细胞，例如，间充质干细胞的形式施用。在优选的实施方案中，骨祖细胞是自体细胞。

另一个实施方案提供了用于在有需要的受试者中下调L1 RNA水平/活性的组合物和方法。优选的试剂是L1 RNA反义寡核苷酸，特别优选的是氟代阿糖核酸(FANA)修饰的反义寡核苷酸。该组合物包括含有一种或多种用于消耗L1 RNA的试剂的制剂。在优选的实施方案中，该方法包括下调受试者细胞例如成纤维细胞，优选地皮肤成纤维细胞中的L1 RNA水平/活性。优选实施方案中的方法包括施用有效量的一种或多种试剂以敲减受试者细胞例如皮肤成纤维细胞中的L1 RNA。组合物可用于治疗与衰老和加速衰老相关的病症，包括但不限于早衰综合征和皱纹。

附图说明

图1A-1H显示CTR和OP组的骨活检中的L1 DNA拷贝数与骨骼代谢相关的临床参数和其他临床指标相关。(图1A)PCR引物和探针定位，和骨质疏松症(OP)和健康(CTR)绝经后妇女的骨基因组中L1-5'UTR-ORF1(左图，OP/CTR P＝0.0003)和L1 ORF2(右图，OP/CTR P＝0.0002)序列的CNV测定。平均值之间的显著性通过单尾斯氏t检验确定。个体L1 5'UTR-ORF1拷贝数与和骨骼代谢相关(图1B-D)或不相关(图1E-1H)的临床参数之间的相关性分析。正方形和圆圈分别标识健康(CTR)和骨质疏松(OP)参与者。

图2A-2G显示了CTR和OP组中，L1 ORF2拷贝数与骨骼代谢相关的临床参数以及其他临床指标之间的相关性。个体L1 ORF2拷贝数与与骨骼代谢相关(图2A-2C)或不相关(图2D-2G)的临床参数之间的相关性分析。正方形和圆圈分别标识健康(CTR)和骨质疏松(OP)参与者。图2H显示了CTR和OP组的血液和骨活检中的L1 DNA拷贝数。PCR引物和探针定位，和健康(CTR，N＝13)和骨质疏松(OP，N＝9)绝经后妇女骨骼和外周血单个核细胞(PBMC)基因组中L1-5'UTR-ORF1(左图)和ORF2(右图)序列的CNV分析。结果作为与健康骨骼相关的归一化值给出。平均值之间的显著性通过单尾斯氏t检验确定，将CTR骨骼与其他骨骼进行比较。

图3A-3B显示了分化成骨细胞中L1的RNA表达和基因组CNV。图3A)模型系统：人骨髓来源的间充质干细胞的离体骨生成。图3B)PCR引物和探针定位，和离体骨生成过程中L1表达和L1拷贝数变化的时间线。结果来自对三个不同供体(N＝3)进行的单独实验。平均值之间的显著性通过未配对的单尾斯氏t检验确定。图3C显示了所有测试的供体的定量矿化分析。与其他人相比，矿化开始较早的供体(左图)未包括在研究中(右图)。图3D)RUNX2(Runt相关转录因子2)；OSX(Osterix，SP7)；OCN(骨钙蛋白)；OPN(骨桥蛋白)；BSP(骨唾液蛋白)。图3E显示了用质粒电穿孔的细胞的结果，该质粒在L1 3'UTR中含有反转录转座感受态人L1(RC-L1)和反转录转座指示盒，由被内含子在与L1相同的转录方向中断的反向增强绿色荧光蛋白(EGFP)组成。盒的方向确保细胞基因组DNA中剪接的EGFP序列仅在一轮反转录转座后出现。*1243nt是含内含子EGFP DNA序列的预期的PCR扩增子长度(未反转座的)；*342nt是在剪接和反转录转座后EGFP DNA序列的预期的PCR扩增子长度。

图4A显示了L1 RNA敲减策略：FANA-ASO被递送至细胞，结合L1RNA中的互补序列并触发RNaseH介导的L1转录物降解。图4B.抗L1FANA-ASO与阴性对照(SCR)之间的成骨基因表达比率。L1敲减降低了OCN(-10％,p＝0.047)、RUNX2(-23％,p<0.001)、OSX(-43％,p＝0.066)、BSP(-44％,p＝0.018)、OPN(-40％,p＝0.005)的表达。图4C.拉米夫定3TC处理(3TC)和对照(DMSO)细胞中L1 5'UTR-ORF1(左)和L1 ORF2(右)的CNV时间线。结果来自对三个不同供体(N＝3)进行的单独实验。图4D显示了拉米夫定3TC处理的(3TC)和对照(DMSO)细胞之间的成骨基因表达比率。第14天：OPN(-18％,p＝0.016),OSX(-60％,p＝0.002)BSP(-34％,p＝0.015)。第21天：RUNX2(+32％,p<0.001),OPN(-23％,p＝0.069),OSX(-50％,p＝0.058),BSP(-60％,p＝0.002)。右图：分化14天和21天后，拉米夫定处理(3TC)和对照(DMSO)细胞。图4E，左图，拉米夫定3TC处理(3TC)和对照(DMSO)细胞中矿物质沉积的时间线定量。分化21天后，拉米夫定3TC处理的细胞矿化减少(-69％,p＝0.003)。细胞内脂质含量的定量用作阴性对照。平均值之间的显著性由未配对的单尾斯氏t检验确定。图4F显示，对于含有5'UTR-ORF1的L1序列，ASO的敲减效率为45％(左，p<0.001)，对于含有ORF2的L1序列，ASO的敲减效率为30％(右，p＝0.003)。平均值之间的显著性由未配对的单尾斯氏t检验确定。

图5A-5D显示在分化脂肪细胞中，L1动力学和拉米夫定3TC介导的对L1扩增的抑制。图5A.模型系统：骨髓来源的间充质干细胞的离体脂肪生成。图5B.PCR引物和探针的定位，和在离体脂肪生成过程中L1表达和L1拷贝数变化的时间线。结果来自对三个不同供体(N＝3)进行的单独实验。图5C.拉米夫定3TC处理(3TC)和对照(DMSO)细胞之间的脂肪基因表达比率。图5D显示拉米夫定3TC处理的(3TC)和对照(DMSO)细胞中细胞内脂质含量的时间线定量。

图6A-G显示了在30名健康和骨质疏松妇女的群组中L1拷贝数和骨骼标记转录物信号水平之间的相关性。正方形和圆圈分别标识健康和骨质疏松的参与者。SATA＝人着丝粒α卫星重复DNA。Affymetrix信号水平的原始数据可从欧洲生物信息学研究院(EMBL-EBI:ID:E-MEXP-1618)获得。

图7A显示离体分化14、17和21天后MSC矿化的定量。MSC来自4名健康(D188、D239、D247、D170)和4名OP患者(HUK7、HUK9、HUK12、HUK16)的股骨。每个供体和时间点的N＝9个技术重复。图7B显示实验工作流程和流式细胞仪分析，显示离体骨生成第7天L1 RNA递送6小时后阳性细胞的百分比。典型实验(右)还显示了转染三天后合成L1(虚线左侧的斑点)和骨基质(虚线右侧的斑点)产生的细胞内定位。图7C显示了4个OP患者来源的MSC(HUK7、HUK9、HUK12、HUK16)中L1 RNA(OS+L1)或随机RNA序列(OS)递送三天后的骨基质定量(上图)。每个患者的每个条件N＝12个技术重复。RFU＝相对荧光单位

图8A-F，左图：在6孔板中递送增加剂量的Cy5-L1 RNA 6小时后对MSC进行流式细胞仪分析。右图：Cy5-L1 RNA递送48小时后的细胞图像。选择毒性最小的最高剂量(红色矩形)进行实验。图8G显示转染后72小时，与未转染的细胞(MSC)相比，未分化(MSC+L1)和分化的(OS+L1)细胞中凋亡基因BAX(BCL-2相关的X)和干扰素介导的反应基因IFNa2(干扰素α2)、IFNb1(干扰素β1)、IFI44(干扰素诱导的蛋白44)的水平。

图9A显示了通过相对荧光(RFU，485/572)定量的细胞内脂质积累的时间线。图9B显示PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)；FABP4(脂肪酸结合蛋白4)；LPL(脂蛋白脂肪酶)；FASN(脂肪酸合酶)。

图10显示了99名绝经后妇女的扩展群组中血清TRAP5B与总身体骨矿物质密度(BMD)相关，该群组分为三组：健康(CTR)、骨质疏松(OP)和具有中间表型(中间)。

图11A显示在从野生型(WT，每对柱中的左柱)和LAKI小鼠分离的尾尖成纤维细胞(TTF)中测量的三种活性鼠L1亚家族(L1-Tf、L1-Gf和L1-Af)的表达。图11B显示了在原位杂交测定(FISH)中使用RNA荧光确认的L1表达的荧光强度。图11C-11D显示通过qPCR和RNAFISH确认的L1 RNA消耗；L1-AON(每对柱中的右柱)。图11E显示了用L1-AON处理的LAKI TTF对p53肿瘤抑制途径(p16、p21、Atf3和Gadd45b)、衰老相关金属蛋白酶Mmp13和促炎性白细胞介素IL1a中的应激反应基因表达的影响。图11F显示在用L1-AON处理的LAKI TTF中对活性衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-B-gal)阳性的细胞数量减少。

图12A-12B显示了与scrbl L1 AON(每对柱中的左柱，对于12B)和L1-AON(每对柱中的右柱，对于12B)处理相比，野生型中的H3K9me3水平，和与乱序(scramble)处理的对照细胞和wt相比，L1-AON处理对LAKI细胞中H3K9me3异染色质病灶的强度(图12A)，以及具有异常细胞核结构的细胞数量(图12B)的影响。进行了RNA免疫沉淀(RIP)，结果显示L1 RNA的5’末端和3’末端均与LAKI TTF中的SUV39H1/2蛋白结合(图12C)。图12D显示了确定L1 RNA是否对在LAKI细胞细胞核中积累的SUV39H1/2起抑制作用的研究。在存在L1正义定向转录物的情况下，使用重组SUV39H1/2蛋白进行H3K9特异性组蛋白甲基转移酶测定。L1反义转录物用作阴性对照。

图13A显示了如通过qPCR证实的几种组织，包括皮肤、胫骨前骨骼肌、肝脏、肾脏、脾脏和胃部中L1 RNA的敲减。图13B显示了L1-AON处理(每对柱的右柱)对所分析的不同组织中SASP基因表达的影响。图13C显示了L1-AON(每对柱的右柱)对小鼠皮肤、脾脏和肾脏的组织学特征的影响。图13D和13E显示L1-AON(每对柱的右柱)处理对处理的小鼠的体重(图13D)和寿命(图13E)的影响。

图14A是qPCR，显示了LINE-1Ta元件在人Wt(左柱)、早衰综合征(HGPS，中间柱)和WRN-/-细胞(右柱)中的表达。N＝3。图中显示了S.E.M和T检验。图14B显示了Sa-B-Gal测定的结果，显示了用L1-AON处理的HGPS和WRN-/-细胞(每对柱的右柱)和对照(每对柱的左柱)中的衰老细胞的数量。该图显示了测定的定量。N＝6。S.E.M.显示在图中。图14C为来自qPCR的结果，显示了L1-AON处理后HGPS细胞中衰老相关基因的表达(每对柱中的右柱)。N＝6。图中显示了S.E.M和T检验。图14D为来自qPCR的结果，显示了L1-AON处理后WRN-/-细胞中衰老相关基因的表达(每对柱中的右柱)。N＝6。图中显示了S.E.M和T检验。图14E是显示用L1-AON处理的HGPS细胞和LAKI对照细胞的H3K9me3强度的图。图中显示了单次重复、S.E.M和T检验。图14F是显示用L1-AON处理的WRN-/-细胞和LAKI对照细胞的H3K9me3强度的图。图中显示了单次重复、S.E.M和T检验。

发明详述

所公开的组合物和方法是基于发现L1动员得到其他组织支持，并且L1扩增是否有助于组织稳态在很大程度上是未探索的。典型的L1元件是大约6,000个碱基对长，由两个不重叠的开放阅读框(ORF)组成，其侧翼是非翻译区(UTR)和靶标位点重复。L1具有5′非翻译区(UTR)，后跟开放阅读框1(ORF1)、ORF间区域、开放阅读框2(ORF2)和具有多聚A位点和相关多聚A尾的3′UTR。在人中，ORF2被认为是通过非常规的终止/重新启动机制翻译的。L1元件的5'非翻译区(UTR)在正义上包含强大的内部RNA聚合酶II转录启动子。L1转录产生全长mRNA，其产生两种蛋白质:ORF1p和ORF2p。第一个ORF编码500个氨基酸-40kDa的蛋白质，它与任何已知功能的蛋白质都缺乏同源性。L1的第二个ORF编码具有核酸内切酶和逆转录酶活性的蛋白质。

所公开的组合物和方法在属于L1HS(L1人特异性的)Ta(转录的，子集a)亚家族的具体实施方案中调节L1的细胞水平。L1 LINE(长散布元件)的Ta(转录的，子集a)亚家族的特征在于3'非翻译区的3-bp ACA序列，并且在人类基因组中包含约520个成员。

I.定义

如本文所用，“化妆品组合物”是指用于局部应用于哺乳动物，尤其是人的皮肤或毛发的组合物。这样的组合物通常可以被分类为免洗型或冲洗型，并且包括任何应用于人体以改善外观或整体美感的产品。

如本文所用，“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个DNA区段以引起插入区段的复制。本文所述的载体可以是表达载体。

如本文所用，“表达载体”是包括一种或多种表达控制序列的载体。

如本文所用，“表达控制序列”是控制和调节另一个DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水和乳液例如油/水或水/油乳液，以及各种类型的润湿剂。

如本文所用，术语“治疗”包括减轻与特定病症或病况相关的症状和/或预防或消除症状。

“可操作地连接的”是指并置，其中组件被配置为执行它们的通常功能。例如，与编码序列可操作地连接的控制序列或启动子能够影响编码序列的表达，而与蛋白质可操作地连接的细胞器定位序列将引导连接的蛋白质定位于特定细胞器。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指可引入重组载体的细胞。

如本文所用，“转化的”和“转染的”包括通过本领域已知的许多技术将核酸(例如载体)引入细胞中。

“有效量”和“治疗有效量”可互换使用，如应用于本文所述的纳米颗粒、治疗剂和药物组合物，是指产生所需治疗结果所必需的量。例如，有效量是有效治疗、治愈或减轻正被施用组合物和/或治疗剂或药物组合物的疾病症状的水平。

术语“抑制”和“减少”是指降低或减少活性或表达。这可以是完全抑制或降低活性或表达，或部分抑制或降低。可以将抑制或减少与对照或标准水平进行比较。抑制可以是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90,91,92,93,94,95,96,97,98,99，或100％。

II.在受试者中增加L1 RNA的组合物和方法

所公开的组合物和方法是基于以下发现：在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)分化成骨细胞中，L1 RNA表达降低，导致转座降低，强烈损害细胞产生矿化骨基质的能力。增加受试者例如绝经后妇女骨髓间充质细胞中L1 RNA(优选地人中，L1HS-Ta1)的量将抵消骨质流失，从而减轻与骨质疏松症相关的症状。L1驱动的结构变化与骨量密切相关，并特异性地区分健康与骨质疏松绝经后妇女的骨基因组和骨量。体外细胞培养实验公开了以下机制：1)L1基因组扩增对从MSC发育而来的成骨细胞中的骨形成有积极贡献，2)在发育中的成骨细胞中L1反转录转座受阻导致成骨程序缺乏激活和矿化减少，3)L1的动员对骨生成具有特异性，因为它在脂肪细胞从MSC(骨质疏松症患者的积累细胞类型)分化过程中不会发生。目前的研究还表明，即使在分化成骨细胞中L1 RNA的适度消耗也足以诱导成骨细胞相关转录因子的表达显著降低。

此外，由活性L1编码的酶ORF2是L1转座所必需的，是抗逆转录病毒疗法中使用的核苷逆转录酶抑制剂(NTRI)的脱靶点。导致骨质疏松症的骨矿物质密度显著降低是用NRTI治疗的患者的主要并发症。一些实施方案中公开的组合物和方法是基于以下发现：对分化为骨细胞的HBMSC进行NRTI处理防止L1逆转录转座，导致骨矿化减少。

因此，一个实施方案公开了用于在有需要的受试者中增加骨祖细胞中的L1 RNA的方法。示例性受试者包括患有骨质疏松症或患有需要骨再生/增加骨量指数的病症的患者。第二个实施方案公开了用于在有需要的受试者中增加骨祖细胞中的L1 RNA的组合物。该组合物包括编码L1 RNA的核酸、L1 RNA和任选地已知上调L1逆转录转座的小分子。

A.骨质疏松症和需要增加骨量指数的病症

原发性骨质疏松症是一种骨骼疾病，通过降低骨密度和破坏其微结构而容易导致低冲击性骨折。骨骼具有很强的遗传倾向，因为70-80％的BMD是可遗传的(1)(2)。原发性骨质疏松症具有多因素起因，基因和环境都对其有贡献(3)。在骨质疏松症中，骨髓生态位的MSC池以牺牲造骨的成骨细胞为代价促进脂肪细胞的发育。这种机制单独或与增加的骨吸收率一起导致净骨质流失(4)(5)。骨质疏松症是全世界发病率、死亡率和生活质量下降的主要原因(6)，每年导致超过890万例骨折(7)。在基于NRTI的ART下，对于所有年龄段的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染个体，BMD显著降低、骨骼脆性增加和骨折风险也是一个关键的临床问题。

骨在不断变化——也就是说，旧骨被移除并被新骨取代。在童年时期，产生的骨比去除的骨多，因此骨骼的大小和强度都在增长。对于大多数人来说，骨量在生命的第三个十年达到峰值。到这个年龄，男性通常比女性积累更多的骨量。在此之后，骨骼中的骨量通常开始缓慢下降，因为旧骨的去除超过了新骨的形成。

五十多岁的男性不会像女性在绝经后的几年中那样经历骨量的快速流失。然而，到65岁或70岁时，男性和女性以相同的速度流失骨量，而终生骨骼健康所必需的营养素钙的吸收在两性中都会减少。骨质流失过多会导致骨变得脆弱，更容易骨折。骨质疏松症有两种主要类型：原发性和继发性。在原发性骨质疏松症的情况下，该病症是由与年龄相关的骨质流失(有时称为老年性骨质疏松症)引起的或原因不明(特发性骨质疏松症)。术语特发性骨质疏松症通常仅用于70岁以下的男性；在老年男性中，与年龄相关的骨质流失被认为是原因。大多数患有骨质疏松症的男性至少有一个(有时不止一个)次要原因。在继发性骨质疏松症的情况下，骨质流失是由某些生活方式、疾病或药物引起的。男性继发性骨质疏松症的一些最常见原因包括暴露于糖皮质激素药物、性腺机能减退(睾酮水平低)、酗酒、吸烟、胃肠道疾病、高钙尿症和固定术。

用于增加骨量指数的干预方法可能有用的其他情况包括脊柱融合疗法，其中将自体移植物或骨移植物单独或与细胞组合递送至脊柱融合部位(通常是两个椎骨之间的部位)以治疗病症，例如退行性椎间盘疾病、脊椎前移、椎管狭窄、脊柱侧凸、椎骨骨折、感染、椎间盘突出和肿瘤。该干预旨在促进骨生长和脊柱融合疗法插入其间的椎骨的最终融合。本申请中公开的组合物可以与标准脊柱融合疗法组合以改善该部位的骨生长。所公开的组合物也可用作骨折愈合的辅助疗法，尤其是在老年人中。

B.在有需要的受试者中增加L1 RNA的方法

在一个实施方案中所公开的方法包括向有需要的受试者提供骨祖细胞，例如通过离体基因工程改造以上调L1 RNA的成骨骨髓来源的细胞，或提供基因疗法以增加L1的细胞量。在其他实施方案中，该方法包括向有需要的受试者提供L1 RNA或编码L1 RNA的基因，单独或与提供本文公开的基因改造的成骨骨髓来源的细胞组合。

L1 RNA可以在体外合成，然后在体外或体内引入目标细胞中，或者，可以对宿主细胞进行改造，以在某些条件下诱导L1基因表达L1 RNA。一种方法包括将核酸转移到培养中的原代细胞中，然后将离体转化的细胞移植(优选地自体)到宿主中(宿主全身或移植到特定的器官或组织中)。示例性受试者包括绝经后妇女、被诊断患有骨质疏松症的受试者、接受抗逆转录病毒疗法例如NRT1的受试者。

在一个实施方案中，所公开的组合物包含单独或在载体中转移到原代细胞中的人L1 RNA(L1-Ta亚家族)的序列。

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ID NO:1)。

然而，该组合物可以包括L1 RNA的片段，例如单独的或前面有5′非翻译区(UTR)的L1开放阅读框1(ORF1)，或开放阅读框2(ORF2)。ORF2表达构建体公开于例如Gasior,etal.,J.Mol.Biol.,357(5):1383-1393(2006)中。

i.离体方法

离体方法可以包括例如从受试者收获细胞、培养细胞、用包括编码L1 RNA的DNA或L1 RNA的表达载体转导它们以及将细胞维持在适合于表达编码的RNA的条件下的步骤。这些方法在分子生物学领域是已知的。在优选的实施方案中，细胞对于被治疗的受试者是自体的。优选的宿主细胞是hBMSC。用于分离hBMSC的方法是本领域已知的(Baghaevi,et al.,Gastroenterol Hepatol Bed Bench,10(3):208-2013(2017))。

1.载体

还提供了编码L1 RNA的载体。可以将核酸，例如上述那些，插入载体中以在细胞中表达。如本文所用，“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，其中可以插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。载体可以是表达载体。“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体，并且“表达控制序列”是控制和调节另一个DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。

载体中的核酸可以与一种或多种表达控制序列可操纵地连接。例如，可以将控制序列掺入基因构建体中，从而使表达控制序列有效地控制目标编码序列的表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由DNA分子区域组成的表达控制序列，通常位于转录开始点上游100个核苷酸内(通常靠近RNA聚合酶II的起始位点)。为了将编码序列置于启动子的控制之下，必须将多肽翻译阅读框的翻译起始位点定位在启动子下游1至约50个核苷酸之间。Hamann,et al.,J.Biol.Eng.,13:7(2019)证明，由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的hBMSC中的基因表达导致转基因表达比用含有延伸因子1α(EF1α)或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子的质粒转染的转基因表达高10倍。

增强子在时间、位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同，增强子可以在距转录位点不同距离时发挥作用。增强子也可以位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录为mRNA时，编码序列在细胞中与表达控制序列“可操作地连接”并“受其控制”，然后所述mRNA可以翻译成编码序列编码的蛋白质。

合适的表达载体包括但不限于源自例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒和腺伴随病毒的质粒和病毒载体。许多载体和表达系统可从诸如公司如Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)和Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA)商购。最近的转染研究调查了微环DNA(mcDNA)，即源自通过重组去除了细菌序列的pDNA的核酸。可以使用本领域已知的方法，使用mcDNA 将L1 RNA引入宿主细胞(Mun et al.Biomaterials,2016；101:310–320)。

2.宿主细胞转化

可以将含有待表达核酸的载体转移到宿主细胞中。术语“宿主细胞”旨在包括其中可以引入重组表达载体的骨祖细胞。如本文所用，“转化的”和“转染的”包括通过多种技术之一将核酸分子(例如，载体)引入细胞中。尽管不限于特定技术，但这些技术中的许多在本领域内是成熟的。可以通过包括例如磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔或显微注射的技术将核酸转染到哺乳动物细胞中。优选的宿主细胞包括骨祖细胞，例如HBMSC或成骨细胞。

转导步骤可以通过用于离体基因疗法的任何标准方法来完成，包括例如磷酸钙、脂质转染、电穿孔、病毒感染和基因枪基因转移。或者，可以使用脂质体或聚合物微粒。然后可以选择已成功转导的细胞，例如，用于表达编码序列或药物抗性基因。然后可以对细胞进行致命照射(如果需要)并注射或植入受试者体内。

离体MSC的非病毒转染的有效策略通常采用破坏细胞膜以将核酸转移到细胞中(例如显微注射、电穿孔和微穿孔)或用纳米载体材料包装核酸，从而通过内吞作用促进细胞内化。

将核酸离体转移到MSC的电穿孔的主要替代方法是用纳米载体转染，纳米载体是一种将核酸静电凝聚或封装成纳米颗粒或聚集体复合物的材料，这些纳米颗粒或聚集体复合物通过电荷相互作用或表面受体结合有利地与细胞膜结合，随后通过巨胞饮作用、网格蛋白介导的内吞作用或胞膜窖介导的内吞作用内化，主要取决于纳米颗粒的大小和电荷。已证明载体促进MSC的转染，包括但不限于聚合物、脂质、多糖、肽和无机材料。实例包括但不限于纳米羟基磷灰石(nHA)、普遍存在的阳离子聚合物转染试剂25kDa支链聚乙烯亚胺(bPEI)，优选地用透明质酸功能化，以及重复的精氨酸-丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸(RALA)两亲肽，聚(酰氨胺)(PAMAM)、聚(β-氨基酯)(PBAE)、PEI包衣的PLGA纳米颗粒等，在Hamann,etal.,J.Biol.Eng.,13:7(2019)中进行了综述。

用于提高转录效率的细胞培养条件可用于确保导入细胞中的核酸被有效摄取。例如，糖皮质激素(Gc)可以显著增强离体MSC中的转染。在转染前0-30分钟递送100nM的Gc地塞米松(DEX)显示增加hBMSC中的转基因表达。

转化的骨祖细胞优选地在GMP条件下分离和培养以纯化并获得确定的剂量范围。

ii.体内方法

体内方法包括将本文公开的工程化骨祖细胞引入有需要的受试者，或将L1 RNA或编码L1 RNA的DNA直接转移到有需要的受试者中。所公开的方法还可以包括向受试者施用已知上调L1 RNA转录和反转录转座的小分子和化合物。例如试剂苯并[a]芘、喜树碱、细胞松弛素D、merbarone、长春花碱；PPARα激动剂(苯扎贝特和非诺贝特)和非甾体抗炎药(二氟尼柳、氟灭酸、水杨酰胺和舒林酸)已被证明诱导L1启动子活性(Terasaki,et al.,PLoSOne.2013；8(9):e74629)。

可以使用本领域已知的方法，例如静脉内将细胞(基因工程化以包括含有L1 RNA或编码L1 RNA的DNA的载体)引入受试者。自体转化的BMSC可以以200万细胞/Kg至500万细胞/kg的剂量静脉内输注。在静脉内递送细胞的实施方案中，在输注日将转化的细胞重新悬浮在盐水中至浓度为每1mL 500万个细胞，并且优选地，岩藻糖基化。然后，可以将最终产品包装在注射器中，以便通过外周静脉通路向患者静脉内施用。使用岩藻糖基转移酶改善hBMSC归巢到骨髓的方法是本领域已知的。本质上，外源引入的岩藻糖基转移酶用于将MSC表达的CD44修饰为HCELL(造血细胞E-/L-选择蛋白配体)，这是一种对HSC归巢至骨髓至关重要的有效的E-选择蛋白配体。本质上，外源引入的岩藻糖基转移酶用于将MSC表达的CD44修饰为HCELL(造血细胞E-/L-选择蛋白配体)，这是一种对HSC归巢至骨髓至关重要的有效E-选择蛋白配体(在Krueger,et al.,Stem Cells Translational Med.,7:651-663(2018)中进行了综述)。

可以采用体内基因疗法，从而将遗传物质直接转移到患者体内。在这些实施方案中，通过源自病毒的载体或通过非病毒技术将遗传物质引入患者。体内核酸疗法可以通过将功能活性DNA在体内直接转移到哺乳动物体细胞组织或器官中来完成。核酸通过病毒方式在体内施用。治疗性基因表达盒通常由驱动基因转录的启动子、目标转基因和终止基因转录的终止信号组成。这样的表达盒可以嵌入质粒(环状双链DNA分子)作为递送载体。质粒DNA(pDNA)可以通过多种注射技术直接注射到体内，其中流体动力注射通过快速注射大体积的pDNA溶液并在细胞膜上暂时地诱导孔隙，从而在主要器官中实现最高的基因转移效率。为了帮助带负电荷的pDNA 分子穿透疏水细胞膜，包括阳离子脂质和阳离子聚合物的化学物质已被用于分别将pDNA浓缩成脂质复合物(lipoplexes)和多聚物(polyplexes)。

L1 RNA或编码L1 RNA的核酸分子可以使用产生复制缺陷型逆转录病毒的包装细胞系包装到逆转录病毒载体中，如本领域公知的。也可以使用其他病毒载体，包括重组腺病毒和痘苗病毒，其可以被赋予非复制性。核酸也可以通过其他载体递送，包括脂质体、聚合物微粒和纳米颗粒以及聚阳离子，例如去唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸。使用所公开的载体(vectors)和运载体(carriers)进行体内基因递送的各种技术和方法是本领域已知的(Wang,et al.,Discov.Med.,18(97):67-77(2014)中进行了综述)。DNA载体设计的重大进步是微环DNA(mcDNA)，它与pDNA的不同之处在于缺乏源自细菌的、富含CpG的骨架序列。在体内施用时，mcDNA比传统pDNA介导更安全、更高和更可持续的转基因表达。

III.在受试者中降低L1 RNA的组合物和方法

所公开的方法和应用依赖于在有需要的受试者中降低L1 RNA、编码line1 RNA的核酸或L1 RNA编码的蛋白质的水平。这些方法和应用是基于以下发现：降低的L1 RNA水平会降低衰老标志物，例如成纤维细胞中的标志物细胞衰老，和皮肤健康，例如表皮层的厚度。

L1 RNA表达的下调可用于治疗与衰老相关的病症，例如早衰综合征。Hutchinson-Gilford早衰综合征(“早衰症”或“HGPS”)是一种罕见的致命遗传病症，其特征是儿童出现加速衰老。虽然他们出生时看起来很健康，但早衰症儿童在出生后的头两年内开始表现出许多加速衰老的特征。早衰迹象包括生长不足、身体脂肪和头发减少、看起来老化的皮肤、关节僵硬、髋脱位、全身动脉粥样硬化、心血管(心脏)疾病和中风。其他早衰综合征包括Werner综合征，也称为“成人早衰症”，其直到青少年晚期才发病。早衰无法治愈，但如果孩子的关节僵硬，职业和物理疗法可以帮助他们继续活动。所公开的组合物和方法可以改善与早衰综合征相关的加速老化症状。下面的实例表明，从HGPS小鼠模型(LAKI)获得的细胞中，使用反义寡核苷酸(AON)消耗L1 RNA恢复了表观遗传标记的水平，降低了衰老相关基因的表达，并延长了寿命。

L1 RNA表达的下调也可以在化妆品组合物中找到应用。在一些实施方案中，化妆品组合物可以局部或皮下使用以治疗衰老迹象。这些迹象包括细纹和皱纹的形成、皮肤紧致度不足、皮肤光泽减少、皮肤缺乏光滑度、皮肤弹性差、老年斑的形成、斑点、灰黄色、色素沉着不均匀及其组合。在一些实施方案中，所述组合物有效提高表皮层的厚度。

A.L1 RNA下调/抑制

可以通过处理细胞下调L1 RNA水平来下调L1 RNA。该步骤包括使细胞与一种或多种试剂接触以抑制L1 RNA。如本文所用的抑制L1 RNA的试剂包括但不限于减少细胞中L1RNA逆转录转座的试剂和抑制由L1RNA表达的蛋白质的任何活性的试剂。L1 RNA抑制剂可以是核酸、肽(例如，肽适体)或小分子。

已发现抑制Line 1逆转录转座的化合物包括但不限于辣椒辣素(Nishikawa,etal.,Int J Mol Sci.2018Oct；19(10):3243)，以及三种选择性的Line 1逆转录酶抑制剂：GBS-149、恩曲他滨和拉米夫定，公开于Banuelos-Sanchez,et al.,Cell Chem.Biol.26(8):P1095-1109(2019)中。

L1 RNA可以使用功能性核酸(在本文中，L1 RNA-抑制性NA)或编码其的载体来抑制，其下调L1ORF1、L1-ORF2或其组合的表达。实例包括但不限于反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA、EGS、核酶和适体(核酸和肽适体)。在特别优选的实施方案中，使用反义寡核苷酸，例如对L1-ORF1 RNA序列特异的氟代阿糖核酸(FANA)修饰的反义寡核苷酸(ASO)，在有需要的受试者中下调L1 RNA。L1 RNA抑制性ASO(或表达其的载体)可以如本文所述配制并施用于有需要的受试者。

i.RNA干扰

在一些实施方案中，通过RNA干扰(RNAi)抑制L1 RNA表达。这种沉默最初是通过添加双链RNA(dsRNA)观察到的(Fire,et al.(1998)Nature,391:806-11；Napoli,et al.(1990)Plant Cell 2:279-89；Hannon,(2002)Nature,418:244-51)。一旦dsRNA进入细胞，它就会被RNase III样酶切丁酶(Dicer)切割成长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA)，其在3'末端包含2个核苷酸突出端(Elbashir,et al.(2001)Genes Dev.,15:188-200；Bernstein,et al.(2001)Nature,409:363-6；Hammond,et al.(2000)Nature,404:293-6)。在依赖于ATP的步骤中，siRNA整合到多亚基蛋白质复合物中，通常被称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC)，其将siRNA引导至靶标RNA序列(Nykanen,et al.(2001)Cell,107:309-21)。在某个点，siRNA双链体解开，反义链似乎仍然保持与RISC结合，并通过内切核酸酶和外切核酸酶的组合指导互补mRNA序列的降解(Martinez,et al.(2002)Cell,110:563-74)。然而，RNAi或siRNA的作用或其用途不限于任何类型的机制。

短干扰RNA(siRNA)是一种双链RNA，其可诱导序列特异性转录后基因沉默，从而降低甚至抑制基因表达。在一个实例中，siRNA触发在siRNA和靶RNA之间的序列同一性区域内的同源RNA分子(例如mRNA)的特异性降解。例如，WO 02/44321公开了当与3'突出端碱基配对时能够序列特异性降解靶标mRNA的siRNA，这些siRNA的制备方法通过引用纳入本文。

序列特异性基因沉默可以在哺乳动物细胞中使用合成的短双链RNA来实现，该短双链RNA模拟由酶切丁酶产生的siRNA(Elbashir,et al.(2001)Nature,411:494 498)(Ui-Tei,et al.(2000)FEBS Lett 479:79-82)。SiRNA可以是化学合成的或体外合成的，也可以是在细胞内加工成siRNA的短双链发夹样RNA(shRNA)的结果。合成siRNA通常使用算法和常规的DNA/RNA合成仪进行设计。供应商包括Ambion(Austin,Texas),ChemGenes(Ashland,Massachusetts),Dharmacon(Lafayette,Colorado),Glen Research(Sterling,Virginia),MWB Biotech(Esbersberg,Germany),Proligo(Boulder,Colorado)和Qiagen(Vento,The Netherlands)。也可以使用试剂盒例如Ambion的

siRNA构建试剂盒在体外合成SiRNA。

从载体产生siRNA更常见的是通过短发夹RNA酶(shRNA)的转录来完成。用于生产包含shRNA的载体的试剂盒是可用的，例如Imgenex的GENESUPPRESSOR^TM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-IT^TM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。

ii.反义

LI RNA可以使用反义分子来抑制。反义分子被设计成通过规范或非规范碱基配对与靶标核酸分子相互作用。反义分子和靶标分子的相互作用旨在通过例如RNAse H介导的RNA-DNA杂合体降解促进靶标分子的破坏。或者，反义分子被设计为中断通常发生在靶标分子上的加工功能，例如转录或复制。可以基于靶标分子的序列设计反义分子。有许多方法可以通过寻找靶标分子最容易接近的区域来优化反义效率。示例性方法包括体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选反义分子以小于或等于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的解离常数(K_d)结合靶标分子。

“反义”核酸序列(反义寡核苷酸)可以包括与编码蛋白质的“正义”核酸互补，例如，与LI RNA互补的核苷酸序列。反义核酸序列和递送方法在本领域中是众所周知的(Goodchild,Curr.Opin.Mol.Ther.,6(2):120-128(2004)；Clawson,et al.,Gene Ther.,11(17):1331-1341(2004))。反义核酸可以与靶标序列的整个编码链互补，或仅与其一部分互补。反义寡核苷酸的长度可以是例如约7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或更多个核苷酸。

ASO可以与全长L1RNA、L1 5'UTR、L1RNA ORF1、L1 RNA ORF2和/或L1 3'UTR互补。下面提供了示例性的反义寡核苷酸。

针对L1 5'UTR的寡核苷酸

GTACCTCAGATGGAAATGCAG(SEQ ID NO:57)

ATGAACCCGGTACCTCAGATG(SEQ ID NO:58)

CCCTAGTGAGATGAACCCGGT(SEQ ID NO:59)

GTCTGGCACTCCCTAGTGAGA(SEQ ID NO:60)

TGCGCCCACTGTCTGGCACTC(SEQ ID NO:61)

CACACTGGCCTGCGCCCACTG(SEQ ID NO:62)

GGTGCGCACACACACTGGCCT(SEQ ID NO:63)

GCTCGCGCAAGGTGCGCACAC(SEQ ID NO:64)

CCCTGCTTCGGCTCGCGCAAG(SEQ ID NO:65)

CAATGCCTCGCCCTGCTTCGG(SEQ ID NO:66)

CCAGGTGAGGCAATGCCTCGC(SEQ ID NO:67)

CTTGCGCTTCCCAGGTGAGGC(SEQ ID NO:68)

TCCCTGACCCCTTGCGCTTCC(SEQ ID NO:69)

GAAAGGGAACTCCCTGACCCC(SEQ ID NO:70)

CTTTGACTCGGAAAGGGAACT(SEQ ID NO:71)

TCACCCCTTTCTTTGACTCGG(SEQ ID NO:72)

GGTGCGTCCGTCACCCCTTTC(SEQ ID NO:73)

CGATTTTCCAGGTGCGTCCGT(SEQ ID NO:74)

GGGAGTGACCCGATTTTCCAG(SEQ ID NO:75)

ATATTCGGGTGGGAGTGACCC(SEQ ID NO:76)

针对L1 ORF1的寡核苷酸

CTTTGTTCTGTTGCTGGTGAG(SEQ ID NO:77)

CTCCATCCAGCTTTGTTCTGT(SEQ ID NO:78)

CAAAATCATTCTCCATCCAGC(SEQ ID NO:79)

CTCAGCTCGTCAAAATCATTC(SEQ ID NO:80)

GCCTTCTTCTCTCAGCTCGTC(SEQ ID NO:81)

ATCGTCTGAAGCCTTCTTCTC(SEQ ID NO:82)

GAGTAATTTGATCGTCTGAAG(SEQ ID NO:83)

CCGTAGCTCAGAGTAATTTGA(SEQ ID NO:84)

GAATGTCCTCCCGTAGCTCAG(SEQ ID NO:85)

CCTTTGGTTTGAATGTCCTCC(SEQ ID NO:86)

AACTTCTTTGCCTTTGGTTTG(SEQ ID NO:87)

CAAAGTTTTGAACTTCTTTGC(SEQ ID NO:88)

AAATTTTTTTCAAAGTTTTGA(SEQ ID NO:89)

ACATTCTTCTAAATTTTTTTC(SEQ ID NO:90)

TTCTAGTTATACATTCTTCTA(SEQ ID NO:91)

GTATTGGTTATTCTAGTTATA(SEQ ID NO:92)

GCACTTCTCTGTATTGGTTAT(SEQ ID NO:93)

GCTCCTTTAAGCACTTCTCTG(SEQ ID NO:94)

AGCTCCATCAGCTCCTTTAAG(SEQ ID NO:95)

CTTGGTTTTCAGCTCCATCAG(SEQ ID NO:96)

针对L1 ORF2的寡核苷酸

TGTTATGTGTGAATTTGATCC(SEQ ID NO:97)

AAGTTAATATTGTTATGTGTG(SEQ ID NO:98)

TTTATATTTAAAGTTAATATT(SEQ ID NO:99)

ATTTAGTCCATTTATATTTAA(SEQ ID NO:100)

TAATTGCAGAATTTAGTCCAT(SEQ ID NO:101)

CTGTGTCTTTTAATTGCAGAA(SEQ ID NO:102)

ACTTGCCAGTCTGTGTCTTTT(SEQ ID NO:103)

TCTTTATGCAACTTGCCAGTC(SEQ ID NO:104)

GGGTCTTGACTCTTTATGCAA(SEQ ID NO:105)

GCACACTGATGGGTCTTGACT(SEQ ID NO:106)

TGTGGGATCGGTGGTGATATC(SEQ ID NO:107)

TTTGTATTTCTGTGGGATCGG(SEQ ID NO:108)

CTGATGGTAGTTTGTATTTCT(SEQ ID NO:109)

GTAGTATTCTCTGATGGTAGT(SEQ ID NO:110)

AGAGGTGTTTGTAGTATTCTC(SEQ ID NO:111)

TTATTTGCGTAGAGGTGTTTG(SEQ ID NO:112)

ATTTTCTACTTTATTTGCGTA(SEQ ID NO:113)

TTTCTTCTAGATTTTCTACTT(SEQ ID NO:114)

AATGTATCCATTTCTTCTAGA(SEQ ID NO:115)

TGTGTCGAGGAATGTATCCAT(SEQ ID NO:116)

针对L1 3'UTR的寡核苷酸

TAGCATTAGGTATATCTCCCA(SEQ ID NO:117)

ATGTGTCATCTAGCATTAGGT(SEQ ID NO:118)

GCACCCACTAATGTGTCATCT(SEQ ID NO:119)

CTGGTGCGCTGCACCCACTAA (SEQ ID NO:120)

ATGTGCCATGCTGGTGCGCTG(SEQ ID NO:121)

ATATGTATACATGTGCCATGC(SEQ ID NO:122)

GGTTAGTTACATATGTATACA(SEQ ID NO:123)

ACATTGTGCAGGTTAGTTACA(SEQ ID NO:124)

GTACATGTGCACATTGTGCAG(SEQ ID NO:125)

AAGTTTTAGGGTACATGTGCA(SEQ ID NO:126)

ATTATACTCTAAGTTTTAGGG(SEQ ID NO:127)

OSA可以是锁核酸(LNA)修饰的ASO。LNA ASO已在许多不同的环境中使用，例如反义gapmer、反microRNA(antagomiRs)和反基因方法。LNA是一种修饰的RNA核苷酸，其中核糖部分用连接2'氧和4'碳的额外桥进行修饰。桥将核糖“锁定”在3'-内(北)构象中，这在A型双链体中很常见。LNA设计可分为两大类：mixmers和gapmers。在mixmer中，LNA和DNA核苷散布在整个寡核苷酸序列中，而在gapmer中，寡核苷酸两端的两个LNA片段被DNA核苷的中心片段或间隙隔开。Gapmers优选用于RNA抑制。这是因为当gapmer与mRNA杂交时，中心DNA/PS片段(比7-8个DNA核苷酸(nt)长)会募集RNA切割酶RNase H。

可以使用本领域已知的程序使用化学合成和酶促连接反应构建反义核酸。例如，反义核酸(例如，反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或经设计以增加分子的生物学稳定性或增加在反义和正义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸，例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸进行化学合成。反义核酸也可以使用表达载体来生物学地产生，其中核酸已经以反义方向亚克隆到所述表达载体中(即，从插入的核酸转录的RNA将对目标靶标核酸为反义方向，在以下小节中进一步描述)。

有用的反义寡核苷酸(AON/ASO)的其他实例包括α-异头核酸。α-异头核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中与通常的β-单位相反，这些链彼此平行(Gaultier etal.,Nucleic Acids.Res.15:6625-6641(1987))。反义核酸分子还可以包含2'-o-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.Nucleic Acids Res.15:6131-6148(1987))或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue et al.FEBS Lett.,215:327-330(1987))。

特别优选的反义寡核苷酸(ASO)是对L1-ORF1 RNA序列特异的氟代阿糖核酸(FANA)修饰的ASO。FANA ASO结合靶标序列并充当RNAseH介导的切割的对接元件。

1.适体

在一些实施方案中，抑制分子是适体。适体是与靶标分子相互作用的分子，优选地以特定方式相互作用。适体可以以非常高程度的特异性结合靶标分子。例如，已分离的适体在靶标分子与仅在分子上的单个位置不同的另一分子之间的结合亲和力差异大于10,000倍。由于它们的紧密结合特性，并且由于适体靶标的表面特征经常对应于蛋白质靶标的功能相关部分，因此适体可以成为有效的生物拮抗剂。通常，适体是长度范围为15-50个碱基的小核酸，可折叠成确定的二级和三级结构，例如茎环或G-四联体(quartets)。适体可以结合小分子，如ATP和theophiline，以及大分子，如逆转录酶和凝血酶。适体可以与靶标分子以小于10^-12M的K_d非常紧密地结合。优选地，适体以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的K_d结合靶标分子。优选适体与靶分子的K_d比与背景结合分子的K_d低至少10、100、1000、10,000或100,000倍。当对分子如多肽进行比较时，优选背景分子是不同的多肽。

2.核酶

使用核酶可以抑制L1 RNA表达。核酶是能够在分子内或分子间催化化学反应的核酸分子。优选核酶催化分子间反应。有许多不同类型的核酶催化核酸酶或核酸聚合酶类型的反应，这些反应基于天然系统中发现的核酶，例如锤头状核酶。还有一些在天然系统中没有发现的核酶，它们被改造为从头催化特定的反应。优选的核酶切割RNA或DNA底物，更优选地切割RNA底物。核酶通常通过识别和结合靶标底物以及随后的切割来切割核酸底物。这种识别通常主要基于规范或非规范碱基对相互作用。这种性质使核酶成为核酸的靶标特异性切割的特别好的候选物，因为靶标底物的识别是基于靶标底物序列的。

3.三链体形成寡核苷酸

使用三链体形成分子可以抑制L1 RNA表达。三链体形成功能性核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶标区域相互作用时，会形成一种称为三链体的结构，其中三链DNA依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对形成复合物。三链体分子是优选的，因为它们可以以高亲和力和特异性结合靶标区域。优选地，三链体形成分子以小于10^-6、10^-8、10^-10或10^-12的K_d结合靶标分子。

4.外部指导序列

L1 RNA表达可以使用外部指导序列来抑制。外部指导序列(EGS)是与靶标核酸分子结合形成复合物的分子，该复合物被RNase P识别，然后其切割靶标分子。EGS可以被设计为特异性靶向所选的RNA分子。RNAse P有助于处理细胞内的转移RNA(tRNA)。通过使用EGS，可以募集细菌RNAse P切割几乎任何RNA序列，引起靶标RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物。类似地，真核EGS/RNAse P指导的RNA切割可用于切割真核细胞内的所需靶标。如何制备和使用EGS分子以促进多种不同靶标分子的切割的代表性实例是本领域已知的。

5.ShRNA

L1 RNA表达可以使用小发夹RNA(shRNA)和工程化以表达shRNA的表达构建体来抑制。shRNA的转录起始于聚合酶III(pol III)启动子，并被认为终止于4-5-胸腺嘧啶转录终止位点的第2位。表达时，shRNA被认为折叠成具有3'UU突出端的茎环结构；随后，这些shRNA的末端被加工，将shRNA转化为大约21个核苷酸的siRNA样分子(Brummelkamp et al.,Science 296:550-553(2002)；Lee et al.,Nature Biotechnol.20:500-505(2002)；Miyagishi and Taira,Nature Biotechnol.20:497-500(2002)；Paddison et al.,GenesDev.16:948-958(2002)；Paul et al.,Nature Biotechnol.20:505-508(2002)；Sui(2002)supra；Yu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(9):6047-6052(2002))。

B.制剂

本文提供了用于抑制L1 RNA的制剂。本文所述的NA、小分子和肽可配制用于肠胃外施用、肠胃外施用或局部施用至皮肤。所公开的核酸、小分子和肽可以使用用于将治疗剂和核酸递送至皮肤的剂型和方法以抑制皮肤中的L1 RNA的有效量施用于皮肤。在某些实施方案中，制剂包括一种或多种细胞渗透剂，例如转染剂。NA试剂与转染试剂(或其混合物)混合或掺合(admixed)，所得混合物用于转染细胞。优选的转染剂是阳离子脂质组合物，特别是单价和多价阳离子脂质组合物，更特别地是

LIPOFECTAMINE^TM、

DMRIE-C、DMRIE、DOTAP、DOSPA和DOSPER，和树状聚体(dendrimer)组合物，特别是G5-G10树状聚体，包括致密星状树状聚体、PAMAM树状聚体、接枝树状聚体和称为树枝状移植物(dendrigrafts)和

的树状聚体。

i.肠胃外制剂

本文所述的化合物(即L1 RNA、编码L1 RNA的载体、抑制L1RNA的NA(或编码它们的载体)和L1 RNA抑制剂)可以配制为用于肠胃外施用。

例如，肠胃外施用可以包括通过静脉内、皮内、腹膜内、病灶内、肌内、皮下、通过注射、通过输注等施用至患者。

可以使用本领域已知的技术将肠胃外制剂制备为水性组合物。通常，此类组合物可以制备为可注射制剂，例如溶液剂或混悬剂；适用于在注射前加入重构介质后制备溶液剂或混悬剂的固体形式；乳剂，例如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体(emulsomes)。

运载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油，例如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合。适当的流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

作为游离酸或碱或其药学上可接受的盐的活性化合物的溶液和分散体可以在水或另一种溶剂或分散介质中制备，该溶剂或分散介质适于与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，所述赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸和烷基芳基磺酸的钠、钾、铵盐，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，例如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，例如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐，例如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂酰二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚4-油酸甘油酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、

401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛脂酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性乙酸盐(myristoamphoacetate)、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱(lauryl sulfobetaine)。

该制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。该制剂还可以包含抗氧化剂以防止活性剂降解。

制剂通常缓冲至3-8的pH值，以便在重构时肠胃外施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。

水溶性聚合物常用于肠胃外施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

可以通过将所需量的活性化合物与一种或多种以上列出的赋形剂(根据需要)掺入适当的溶剂或分散介质中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散体是通过将各种已灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备的，该载体含有基本分散介质和来自上面列出的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。粉末可以以这样的方式制备，即颗粒本质上是多孔的，这可以增加颗粒的溶解度。制备多孔颗粒的方法在本领域中是众所周知的。

1.控释制剂

本文所述的肠胃外制剂可配制成用于控释，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。

a.纳米颗粒和微粒

对于肠胃外施用，可以将一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂掺入提供化合物和/或一种或多种另外的活性剂的控释的微粒、纳米颗粒或其组合中。在其中制剂含有两种或更多种试剂的实施方案中，试剂可以被配制为用于相同类型的控释(例如，延迟、延长、立即或脉冲)，或者试剂可以独立地被配制为用于不同类型的释放(例如，立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲等)。

例如，可以将化合物和/或一种或多种另外的活性剂掺入聚合物微粒中，其提供药物的控释。试剂的释放通过试剂扩散出微粒和/或聚合物颗粒通过水解和/或酶促降解而降解来控制。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成纤维素衍生物。与DNA和mRNA一样，siRNA和miRNA可以通过纳米载体递送。例如，Benoit et al.Biomacromolecules.2012；1311:3841–3849开发了一种二嵌段共聚物(pDMAEMA-b-p(DMAEMA-共-PAA-共-BMA))，由siRNA复合嵌段(pDMAEMA)和内体逃逸嵌段(PAA、BMA和DMAEMA的三元共聚物)组成，用于高效的siRNA递送。

在水性环境中缓慢溶解并形成凝胶的聚合物，例如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷，也可以适合作为含药物微粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酐、聚(酯酸酐)、聚羟基酸，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物、聚己内酯及其共聚物、以及其组合。

或者，可将试剂掺入由材料制备的微粒中，所述材料不溶于水溶液或缓慢溶于水溶液但能够通过包括酶促降解、胆汁酸的表面活性剂作用和/或机械侵蚀在胃肠道内降解。如本文所用，术语“缓慢溶于水”是指在30分钟内不溶于水的材料。优选的实例包括脂肪、脂肪物质、蜡、蜡样物质及其混合物。合适的脂肪和脂肪物质包括脂肪醇(例如月桂醇、肉豆蔻醇硬脂醇、鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇)、脂肪酸和衍生物，包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和氢化脂肪。具体实例包括但不限于氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、可在商品名

下获得的氢化油、硬脂酸、可可脂和硬脂醇。合适的蜡和蜡样材料包括天然或合成蜡、烃和普通蜡。蜡的具体实例包括蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡。如本文所用，蜡状材料定义为在室温下通常为固体并且具有约30至300℃的熔点的任何材料。

在某些情况下，可能需要改变水渗入微粒的速率。为此，可以将速率控制(芯吸)剂与上面列出的脂肪或蜡一起配制。速率控制材料的实例包括某些淀粉衍生物(例如，蜡质麦芽糖糊精和转筒干燥的玉米淀粉)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素)、海藻酸、乳糖和滑石粉。此外，可添加药学上可接受的表面活性剂(例如卵磷脂)以促进此类微粒的降解。

不溶于水的蛋白质，例如玉米醇溶蛋白，也可以用作形成含试剂的微粒的材料。此外，水溶性的蛋白质、多糖及其组合可以与试剂一起配制成微粒并随后交联以形成不溶性网络。例如，环糊精可以与单个试剂分子复合并随后交联。

2.制造纳米颗粒和微粒的方法

可以通过已知的药物制剂技术实现将试剂包封或掺入载体材料中以产生含试剂的微粒。在脂肪、蜡或蜡状材料中的制剂的情况下，通常将载体材料加热到其熔化温度以上并添加试剂以形成包含悬浮在载体材料中的试剂颗粒、溶解在载体材料中的试剂的混合物，或其混合物。随后可以通过几种方法配制微粒，所述方法包括但不限于凝结、挤出、喷雾冷却或水分散体的方法。在优选的方法中，将蜡加热到其熔化温度以上，加入试剂，并且随着混合物冷却，在不断搅拌下使熔融的蜡-试剂混合物凝结。或者，可以将熔融的蜡-试剂混合物挤出并滚圆以形成丸粒或珠粒。这些方法在本领域中是已知的。对于一些载体材料，可能需要使用溶剂蒸发技术来生产含试剂的微粒。在这种情况下，试剂和载体材料共溶解在互溶剂中，然后微粒可以通过多种技术生产，包括但不限于在水或其他合适的介质中形成乳液、喷雾干燥或通过蒸发掉本体溶液中的溶剂和研磨所得材料。

在一些实施方案中，颗粒形式的试剂均匀地分散在水不溶性或水缓慢溶解材料中。为了使组合物中试剂颗粒的尺寸最小化，可在配制前研磨试剂粉末本身以产生细颗粒。制药领域中已知的喷射研磨法可用于此目的。在一些实施方案中，通过将蜡或蜡样物质加热到其熔点以上并在搅拌混合物的同时添加药物颗粒，将颗粒形式的药物均匀地分散在蜡或蜡样物质中。在这种情况下，可以将药学上可接受的表面活性剂添加到混合物中以促进药物颗粒的分散。

颗粒也可以用一种或多种改良释放包衣包衣。被脂肪酶水解的脂肪酸固体酯可以喷涂到微粒或药物颗粒上。玉米醇溶蛋白是天然不溶于水的蛋白质的实例。可通过喷涂或湿法制粒技术将其包衣到含有药物的微粒或药物颗粒上。除了天然不溶于水的物质外，一些消化酶底物可以通过交联程序处理，从而形成不溶性网络。已经报道了许多由化学和物理方法引发的蛋白质交联方法。获得交联的最常见方法之一是使用化学交联剂。化学交联剂的实例包括醛类(戊二醛和甲醛)、环氧化合物、碳二亚胺和京尼平(genipin)。除了这些交联剂之外，还使用氧化糖和天然糖来交联明胶。也可以使用酶促方法完成交联；例如，转谷氨酰胺酶已被批准为用于交联海产品的GRAS物质。最后，交联可以通过物理方法如热处理、紫外线照射和伽马照射来引发。

为了在含有药物的微粒或药物颗粒周围产生交联蛋白质的包衣层，可以将水溶性蛋白质喷涂到微粒上并随后通过上述方法之一进行交联。或者，可以通过凝聚相分离(例如，通过添加盐)将含药物微粒微囊化在蛋白质内，然后交联。用于此目的的一些合适蛋白质包括明胶、白蛋白、酪蛋白和谷蛋白。

多糖也可以交联以形成不溶于水的网络。对于许多多糖来说，这可以通过与钙盐或多价阳离子反应来实现，它们会交联聚合物主链。果胶、藻酸盐、葡聚糖、直链淀粉和瓜尔胶在多价阳离子存在下发生交联。带相反电荷的多糖之间也可以形成复合物；例如，果胶和壳聚糖可以通过静电相互作用进行络合。

3.可注射/可植入制剂

本文所述的化合物可掺入可注射/可植入固体或半固体植入物，例如聚合物植入物。在一个实施方案中，将化合物掺入在室温下为液体或糊状的聚合物中，但在与水性介质例如生理流体接触时，表现出粘度增加以形成半固体或固体材料。示例性聚合物包括但不限于衍生自与羟基链烷酸共聚的至少一种不饱和羟基脂肪酸的共聚的羟基链烷酸聚酯。聚合物可以熔化、与活性物质混合并浇铸或注塑成装置。这种熔体制造要求聚合物的熔点低于物质被递送和聚合物降解或变得具有反应性的温度。该装置还可以通过溶剂浇铸制备，其中聚合物溶解在溶剂中，药物溶解或分散在聚合物溶液中，然后蒸发溶剂。溶剂法要求聚合物可溶于有机溶剂。另一种方法是对聚合物和载有活性剂的药物或聚合物颗粒的混合粉末进行压缩成型。

或者，可以将化合物掺入聚合物基质中并模制、压缩或挤出成在室温下为固体的装置。例如，可以将化合物掺入可生物降解的聚合物中，例如聚酐、聚氢链烷酸(PHA)、PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚酯、聚酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、蛋白质和多糖例如胶原蛋白、透明质酸、白蛋白和明胶，以及它们的组合中，并压缩成固体装置，例如盘，或挤压成装置，例如棒。用于核酸递送的聚酰胺描述于美国专利号8,236,280中。

可以通过选择聚合物、聚合物的分子量和/或聚合物的改性以增加降解，例如孔的形成和/或掺入可水解的键来改变一种或多种化合物从植入物中的释放。用于改变可生物降解聚合物的性质以改变化合物从植入物中的释放曲线的方法在本领域中是众所周知的。

ii.肠内制剂

合适的口服剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和锭剂。片剂可以使用本领域熟知的压缩或模制技术制备。明胶或非明胶胶囊可以使用本领域公知的技术制备成硬胶囊壳或软胶囊壳，其可以包封液体、固体和半固体填充材料。

可以使用药学上可接受的载体制备制剂。如本文一般使用的“载体”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。

载体还包括包衣组合物的所有组分，其包括增塑剂、色素、着色剂、稳定剂和助流剂。

合适的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，例如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚醋酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名

(Roth Pharma,Westerstadt,Germany)商购的甲基丙烯酸树脂、玉米醇溶蛋白、虫胶和多糖。

此外，包衣材料可包含常规载体，例如增塑剂、色素、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

“稀释剂”，也称为“填充剂”，通常是增加固体剂型体积所必需的，以便为片剂的压制或珠粒和颗粒的形成提供实用的尺寸。合适的稀释剂包括但不限于二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预胶凝淀粉、二氧化硅、二氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。

“粘合剂”用于赋予固体剂型以粘性，从而确保片剂或珠粒或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶凝淀粉、明胶、糖类(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、纤维素，包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸铝镁(veegum)，以及合成聚合物，例如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

“润滑剂”用于促进片剂的制造。合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。

“崩解剂”用于促进剂型在施用后崩解或“分解”，通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻蛋白碱(alginine)、树胶或交联聚合物，例如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的

XL)。

“稳定剂”用于抑制或延缓药物分解反应，其包括例如氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂、丁羟甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐和酯；维生素E、生育酚及其盐；亚硫酸盐，例如焦亚硫酸钠；半胱氨酸及其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯和丁羟茴香醚(BHA)。

1.控释肠内制剂

口服剂型，例如胶囊剂、片剂、溶液剂和混悬剂，可以配制成用于控释。例如，一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂可配制成纳米颗粒、微粒及其组合，并封装在软或硬明胶或非明胶胶囊中或分散在分散介质中以形成口服混悬剂或糖浆剂。颗粒可以由试剂和控释聚合物或基质形成。或者，试剂颗粒可以在掺入最终剂型之前用一种或多种控释包衣进行包衣。

在另一个实施方案中，一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂分散在基质材料中，该基质材料在与水性介质例如生理流体接触时凝胶化或乳化。在凝胶的情况下，基质膨胀，包裹活性剂，随着时间的推移，活性剂通过基质材料的扩散和/或降解缓慢释放。这种基质可以配制成片剂或硬胶囊和软胶囊的填充材料。

在还另一个实施方案中，将一种或多种化合物和任选的一种或多种另外的活性剂配制成固体口服剂型，例如片剂或胶囊剂，并且固体剂型用一种或多种控释包衣包衣，例如延迟释放包衣或延长释放包衣。一种或多种包衣也可以含有化合物和/或另外的活性剂。

a.延长释放剂型

延长释放制剂通常制备为本领域已知的扩散或渗透系统。扩散系统通常由两种类型的装置组成，储存器和基质，并且在本领域中是众所周知的和已描述的。基质装置通常通过将试剂与缓慢溶解的聚合物载体压缩成片剂形式来制备。用于制备基质装置的三种主要材料是不溶性塑料、亲水性聚合物和脂肪化合物。塑料基质包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水性聚合物包括但不限于纤维素聚合物如甲基和乙基纤维素、羟烷基纤维素如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和

934、聚环氧乙烷及其混合物。脂肪化合物包括但不限于各种蜡，例如巴西棕榈蜡和三硬脂酸甘油酯，以及蜡类物质，包括氢化蓖麻油或氢化植物油，或其混合物。

在某些优选的实施方案中，塑料材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物，包括但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酸酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酐)和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物。

在某些优选实施方案中，丙烯酸聚合物由一种或多种甲基丙烯酸铵共聚物组成。甲基丙烯酸铵共聚物在本领域中是众所周知的，并且在NF XVII中被描述为具有低含量季铵基团的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。

在一个优选的实施方案中，丙烯酸聚合物是丙烯酸树脂漆，例如可从Rohm Pharma以商品名EUDRAGIT

商购获得的丙烯酸树脂漆。在进一步优选的实施方案中，丙烯酸聚合物包含两种丙烯酸树脂漆的混合物，它们分别以商品名

RL30D和

RS30D从Rohm Pharma商购。

RL30D和

RS30D是丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，季铵基团含量低，在

RL30D中铵基团与剩余的中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比为1:20，和在

RS30D中为1:40。平均分子量约为150,000。

S-100和

L-100也是优选的。规定名称RL(高渗透性)和RS(低渗透性)是指这些试剂的渗透性特性。

RL/RS混合物不溶于水和消化液。然而，形成的包含它们的多颗粒系统在水溶液和消化液中是可膨胀的和可渗透的。

上述聚合物如

RL/RS可以以任何所需的比例混合在一起，以最终获得具有所需溶解曲线的缓释制剂。例如，可以从100%

RL,50％

Rl和50％EUDRAGIT

RS,和10％

RL和90％

RS获得所需的缓释多颗粒系统。本领域技术人员将认识到也可以使用其他丙烯酸类聚合物，例如

L。

或者，可以使用渗透系统或通过向剂型施加半渗透包衣来制备延长释放制剂。在后一种情况下，可以通过以合适的比例组合低渗透性和高渗透性包衣材料来实现所需的试剂释放曲线。

上述具有不同试剂释放机制的装置可以组合成包含单个或多个单元的最终剂型。多个单元的实例包括但不限于多层片剂和含有片剂、珠子或颗粒的胶囊。立即释放部分可以通过使用包衣或压缩工艺在延长释放芯顶部施加立即释放层添加到延长释放系统中或添加到多单元系统例如包含延长和立即释放珠子的胶囊中。

含有亲水性聚合物的延长释放片剂通过本领域公知的技术制备，例如直接压制、湿法制粒或干法制粒。它们的制剂通常掺入聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。常用的稀释剂包括惰性粉末物质，例如淀粉、粉末纤维素，尤其是结晶和微晶纤维素，糖例如果糖、甘露醇和蔗糖，谷物粉和类似的可食用粉末。典型的稀释剂包括例如各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是有用的。典型的片剂粘合剂包括物质例如淀粉、明胶和糖例如乳糖、果糖和葡萄糖。也可以使用天然和合成树胶，包括阿拉伯树胶、海藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水聚合物、乙基纤维素和蜡也可以用作粘合剂。片剂制剂中需要润滑剂以防止片剂和冲压机粘在模具中。润滑剂选自这样的湿滑固体例如滑石粉、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油。

含有蜡材料的延长释放片剂通常使用本领域已知的方法制备，例如直接混合法、凝结法和水分散法。在凝结法中，将试剂与蜡材料混合，然后喷雾凝结或凝结并筛选和加工。

b.延迟释放剂型

延迟释放制剂可以通过用聚合物薄膜包衣固体剂型来制造，聚合物薄膜不溶于胃的酸性环境，而溶于小肠的中性环境。

例如，可以通过用选定的包衣材料包衣试剂或含试剂的组合物来制备延迟释放剂量单位。含试剂的组合物可以是例如用于掺入胶囊的片剂、用作“包衣芯”剂型中的内核的片剂、或用于掺入片剂或胶囊中的多个含试剂珠、颗粒或粒子。优选的包衣材料包括可生物可侵蚀的、逐渐水解的、逐渐水溶性的和/或可酶降解的聚合物，并且可以是常规的“肠溶”聚合物。如本领域技术人员将理解的，肠溶聚合物在下胃肠道的较高pH环境中变得可溶或随着剂型通过胃肠道而缓慢侵蚀，而酶促降解聚合物被存在于下消化道，尤其是结肠内的细菌酶降解。用于实现延迟释放的合适包衣材料包括但不限于纤维素聚合物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸偏苯三酸纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯，以及以商品名

(Rohm Pharma；Westerstadt,Germany)商购的其他甲基丙烯酸树脂形成，包括

L30D-55和L100-55(在pH 5.5及以上溶解)、

L-100(在pH6.0及以上溶解)、

S(由于更高的酯化度，在pH 7.0及以上溶解)和

NE、RL和RS(具有不同程度的渗透性和膨胀性的水不溶性聚合物)；乙烯基聚合物和共聚物例如聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等；可酶降解的聚合物，例如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米醇溶蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以应用使用不同聚合物的多层包衣。

特定包衣材料的优选包衣重量可由本领域技术人员通过评估用不同量的各种包衣材料制备的片剂、珠粒和颗粒剂的个体释放曲线来容易地确定。正是材料、方法和应用形式的组合产生了所需的释放特性，这只能从临床研究中确定。

包衣组合物可包含常规添加剂，例如增塑剂、色素、着色剂、稳定剂、助流剂等。增塑剂通常存在以降低包衣的脆性，并且通常相对于聚合物的干重占约10重量％至50重量％。典型增塑剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、三醋精、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化甘油单酯。优选使用稳定剂来稳定分散体中的颗粒。典型的稳定剂是非离子乳化剂，例如脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。推荐助流剂以减少成膜和干燥过程中的粘着效应，通常约为包衣溶液中聚合物重量的25重量％至100重量％。一种有效的助流剂是滑石粉。也可以使用其他助流剂，例如硬脂酸镁和单硬脂酸甘油酯。也可以使用色素如二氧化钛。少量消泡剂，例如硅酮(例如二甲基硅油)，也可以添加到包衣组合物中。

iii.局部制剂

用于局部施用的合适剂型包括霜剂、软膏剂、油膏剂、喷雾剂、凝胶剂、洗剂、乳剂和透皮贴剂。该制剂可以配制用于经粘膜、经上皮、经内皮或经皮施用。制剂可以包括用于局部制剂的已知赋形剂，包括但不限于在化妆品可接受的载体中的防晒剂、表面活性剂、防腐剂、脱屑剂、止汗剂、着色剂、增稠剂、皮肤增白剂、维生素和其他治疗活性剂。该组合物还可包含一种或多种化学渗透增强剂、膜渗透剂、膜转运剂、润肤剂、表面活性剂、稳定剂、缓冲剂及其组合。

“渗透增强剂”是本领域已知的并且包括但不限于脂肪醇、脂肪酸酯、脂肪酸、脂肪醇醚、氨基酸、磷脂、卵磷脂、胆酸盐、酶、胺和酰胺、络合剂(脂质体、环糊精、改性纤维素和二酰亚胺)、大环化合物，例如大环内酯、酮和酸酐和环状脲、表面活性剂、N-甲基吡咯烷酮及其衍生物、DMSO和相关化合物、离子化合物、氮酮(azone)和相关化合物，和溶剂，例如醇、酮、酰胺、多元醇(例如乙二醇)。这些类别的实例在本领域中是已知的。

“防腐剂”可用于防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯甲醇、氯化十六烷基吡啶、氯丁醇、苯酚、苯乙醇和硫柳汞。

“表面活性剂”是降低表面张力从而提高产品的乳化、起泡、分散、扩散和润湿性能的表面活性剂。合适的非离子表面活性剂包括乳化蜡、单油酸甘油酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚维酮及其组合。在一个实施方案中，非离子表面活性剂是硬脂醇。

使用局部应用的局部核酸递送，例如，裸DNA、DNA/脂质体或乳液复合物、脂质体乳膏，以及物理方法例如剥离、电穿孔和微机械破坏方法等的局部应用。

将核酸(NA)递送至皮肤的方法是本领域已知的。物理方法包括微针注射、微穿孔、电穿孔、离子电渗疗法、超声促渗或使用聚合物纳米粒子的被动递送；脂质体；肽；或树状聚体。(在Zakrewsky,et al.,J.Control Release,219:445-456(2015)中进行了综述)。

皮内注射是将NA递送到皮肤中最简单和最直接的方法。在这里，通过将NA直接注射到皮肤的活组织层中，完全克服了SC的屏障特性。有用的皮内针包括微针阵列。微针阵列包括长度仅为100-700μm的针。当放置在皮肤上时，它们锋利的尖端可以轻松插入角质层，而较短的长度确保充分渗透到皮肤中，而不会破坏更深皮肤组织中的神经。微针可用于递送本文公开的核酸，例如编码L1 RNA的质粒DNA、阳离子脂质-DNA复合物(～100nm直径)、siRNA等。

微孔化是另一种利用SC(角质层)的物理破坏来递送大的治疗剂或治疗载体的技术。可以将电阻元件阵列放置在皮肤上。脉冲通过阵列的电流导致与阵列接触的角质层细胞的局部消融。或者，铒：钇-铝-石榴石(Er：YAG)激光阵列可用于SC和表皮的局部消融。该技术已被用于成功地将质粒DNA、CpG寡核苷酸、siRNA等递送至皮肤。

电穿孔可用于渗透皮肤并增强试剂的被动扩散。电穿孔的机制与电诱导微穿孔的机制完全不同。电诱导微穿孔利用电场来诱导SC微结构的热消融，在皮肤中形成孔。另一方面，电穿孔是对皮肤施加短持续时间(<0.5s)和高强度(<100V)电脉冲，其导致皮肤中的脂质双层瞬时透化并同时透化表皮角质形成细胞的细胞膜。电穿孔也有望产生通过皮肤的水性孔。Huang,et al.,Theranostics 2018；8(9):2361-2376中公开了通过微针辊和柔性交错电穿孔阵列的组合使用将核酸分子高效递送至皮肤。

离子电渗疗法可用于驱动带电药物(如NA)的运输。以恒定电流施加连续低强度(<10V)电场。

脂质体也被广泛研究用于核酸递送以治疗皮肤病。

高度有序的球形核酸复合物(球形核酸)由于其增强向皮肤的递送、内化到皮肤细胞中以及保护NA免于降解而显示出治疗皮肤病的潜力。具体来说，涂有一层致密的高度有序和共价结合的siRNA的金纳米粒子导致被动转运通过完整的小鼠SC并排他性地定位在真皮和表皮中。

制剂可以包括已知的皮肤渗透增强剂。已经鉴定了几种肽，其具有增强NA转运到皮肤中并引发治疗反应的能力。使用噬菌体展示筛选发现的这些肽的第一个是TD-1(ACSSSPSKHCG)(SEQ ID NO:55)。Hsu和Mitragotri使用噬菌体展示筛选鉴定了另一种肽，即SPACE肽(ACTGSTQHQCG)(SEQ ID NO:56)，它不仅能够增强siRNA穿过皮肤的递送，而且还能增强细胞内摄取(Hsu T,Mitragotri S Proc Natl Acad Sci U SA.2011 108(38):15816-21)。

通过以下非限制性实施例将进一步理解本发明。

实施例

I.向骨质疏松症患者来源的间充质干细胞递送LINE-1反转录转座子RNA刺激成骨分化和骨基质产生

材料和方法

参与者

从103名BMD高度可变的挪威女性(50-86岁)中，根据年龄、体重和关键血清参数选择了30名，并分为两组：骨质疏松(T-评分≤-2.5)和健康(T评分>-1)。先前描述了患者登记、经髂骨活检和血液取样的程序。(47)(48)参与者是通过报纸上的广告招募的和/或通过Lovisenberg Diaconal医院门诊包括在内的。该研究得到了挪威区域伦理委员会(REK编号:2010/2539)的批准，并根据赫尔辛基宣言进行。

人MSC分化

骨髓来源的MSC(#C-12974,PromoCell GmbH,Heidelberg,Germany)在0.1％明胶溶液(#07903,StemCell)包被的板上生长，直到第4代。生长培养基(#PT-3001，Lonza)每3天更换一次。在接种于1:50Matrigel(#356237,Corning)包被板上的70％汇合细胞上，通过用成骨分化培养基(#PT-3002,Lonza)替换生长培养基来诱导成骨分化。在接种于1:50MatMatrigel(#356237,Corning)包被板上的汇合后细胞上，通过三个循环的诱导/维持脂肪生成分化培养基(#PT-3004,Lonza)诱导脂肪生成分化。

基因组DNA提取和基于TaqMan qPCR的L1 CNV测定

按照制造商的说明，使用MagAttract HMW DNA试剂盒(#67563，Qiagen)分离高分子量基因组DNA(HMW-gDNA)。在裂解过程中，样品在37℃下用RNase H和蛋白酶K(均在试剂盒中提供)处理至少1小时，以分别去除RNA/DNA底物和蛋白质污染。分离的HMW-gDNA最后用核酸外切酶I(#M0568，NEB)在37℃下处理30分钟，然后在80℃失活15分钟以去除游离ssDNA。然后使用7900HT快速实时PCR(Applied Biosystems)分析HMW-gDNA的L1拷贝数。L1的所有拷贝数测定均在作为DNA输入浓度的重复内源对照的人着丝粒α卫星(SATA)上归一化。一式三份分析每个样品。对于每个反应，将20μl gDNA (25pg)、靶标特异性引物(0.2μM)、靶标特异性FAM标记探针(0.4μM)、ROX被动参考染料(0.4μl，#1725858，Bio-Rad)和IQMultiplex Powermix(10μl，#1725849，Bio-Rad)在95℃下孵育3分钟，然后在95℃下45秒进行40个变性循环，然后在59℃下进行引物退火/延伸45秒。用于CNV研究的活性、反转录转座感受态的L1的TaqMan探针和引物序列已发表(Coufal,et al.Nature(2009),doi:10.1038/nature08248；Goodier,et al.DNA(2014),doi:10.1186/1759-8753-5-11)，如下所示，是本研究中使用的引物和探针。

L1 5'UTR-ORF1

正向引物：5’-GAATGATTTTGACGAGCTGAGAGAA-3’(SEQ ID NO:2)；

反向引物：5’-GTCCTCCCGTAGCTCAGAGTAATT-3’(SEQ ID NO:3)；

探针序列：5’-AAGGCTTCAGACGATC-3’(30,37)(SEQ ID NO:4)；

L1 ORF2

正向引物：5’-TGCGGAGAAATAGGAACACTTTT-3’(SEQ ID NO:5)；

反向引物：5’-TGAGGAATCGCCACACTGACT-3’(SEQ ID NO:6)；

探针序列：5’-CTGTAAACTAGTTCAACCATT-3’^(30,37)(SEQ ID NO:7)。

SATA

正向引物：5’-GGTCAATGGCAGAAAAGGAAAT-3’(SEQ ID NO:8)；

反向引物：5’-CGCAGTTTGTGGGAATGATTC-3’(SEQ ID NO:9)；

探针序列：5’-TCTTCGTTTCAAAACTAG-3’(30,37)(SEQ ID NO:10)；

RPL13A

正向引物：5’-GAAAGCCAAGATCCACTACC-3’(SEQ ID NO:11)；

反向引物：5’-TGGGTCTTGAGGACCTCTGT-3’(SEQ ID NO:12)；

RUNX2

正向引物：5’-TCAACGATCTGAGATTTGTGGG-3’(SEQ ID NO:13)；

反向引物：5'-GGGGAGGATTTGTGAAGACGG-3'(SEQ ID NO:14)；

OCN

正向引物：5’-GGCGCTACCTGTATCAATGG-3’(SEQ ID NO:15)；

反向引物：5’-GTGGTCAGCCAACTCGTCA-3’(SEQ ID NO:16)；

OPN

正向引物：5’-GAAGTTTCGCAGACCTGACAT-3’(SEQ ID NO:17)；

反向引物：5’-GTATGCACCATTCAACTCCTCG-3’(SEQ ID NO:18)；

BSP

正向引物：CACTGGAGCCAATGCAGAAGA(SEQ ID NO:19)；

反向引物：5’-TGGTGGGGTTGTAGGTTCAAA-3’(SEQ ID NO:20)；

OSX

正向引物：5’-CCTCTGCGGGACTCAACAAC-3’(SEQ ID NO:21)；

反向引物：5’-AGCCCATTAGTGCTTGTAAAGG-3’(SEQ ID NO:22)；

TBP

正向引物：5’-GCTGGCCCATAGTGATCTTT-3’(SEQ ID NO:23)；

反向引物：5’-CTTCACACGCCAAGAAACAGT-3’(SEQ ID NO:24)；

PPARγ

正向引物：5’-ACCAAAGTGCAATCAAAGTGGA-3’(SEQ ID NO:25)；

反向引物：5’-ATGAGGGAGTTGGAAGGCTCT-3’(SEQ ID NO:26)；

FABP4

正向引物：5’-ACTGGGCCAGGAATTTGACG-3’(SEQ ID NO:27)；

反向引物：5’-CTCGTGGAAGTGACGCCTT-3’(SEQ ID NO:28)；

FASN

正向引物：5’-AAGGACCTGTCTAGGTTTGATGC-3’(SEQ ID NO:29)；

反向引物：5’-TGGCTTCATAGGTGACTTCCA-3’(SEQ ID NO:30)；

LPL

正向引物：5’-AGGATGTGGCCCGGTTTATC-3’(SEQ ID NO:31)；

反向引物：5’-CCAAGGCTGTATCCCAAGAGAT-3’(SEQ ID NO:32)；

GFP-968/1013

正向引物：5’-GCACCATCTTCTTCAAGGACGAC-3’(SEQ ID NO:33)；

反向引物：5’-TCTTTGCTCAGGGCGGACTG-3’(SEQ ID NO:34)；

进行了L1 TaqMan引物和探针特异性分析：L1-5'-ORF1引物和探针组匹配309个序列(246个L1HS-Ta1；1个L1HS-Ta0；1个L1HS-preTa；61个L1PA2)，L1-ORF2引物和探针组匹配181个序列(161个L1HS-Ta1；3L1-HS-Ta0；4个L1HS-preTa；6个L1PA2；1个L1PA3；5个L1PA4)。

拉米夫定3TC处理

将拉米夫定3TC(#L1295,Sigma)重悬于DMSO中，每24小时以150μM终浓度添加到细胞培养基中。

矿化测定

细胞在PBS中洗涤并用4％多聚甲醛固定15分钟。根据制造商的指示，通过使用OsteoImage矿化测定(#LOPA503，Lonza)评估矿化。使用具有适当激发(492)/发射(520)波长的GloMax Discover读板器(Promega)对矿化进行定量分析。

脂质含量测定

将细胞在PBS中洗涤一次并与AdipoRed测定试剂(#LOPT7009,Lonza)一起孵育10分钟。使用具有适当激发(485)/发射(572)波长的GloMax Discover读板器(Promega)定量测定脂质含量。

RNA提取和cDNA制备

收获细胞并重悬于1ml QIAzol裂解试剂(#79306，Qiagen)中。然后使用RNeasyPlus Mini试剂盒(#74134,Qiagen)纯化总RNA，对制造商的说明进行最少的修改。进行DNase处理(无RNase的DNase组，#79254，Qiagen)以去除任何残留的DNA。使用Nanodrop2000分光光度计(ThermoFisher)检查RNA质量和浓度。根据制造商的方案，使用Superscript III第一链cDNA合成系统(#18080051，ThermoFisher)从200ng的每个RNA样品中合成cDNA。

L1 RNA转染

携带全长L1序列的载体人-L1_pBluescript II sk(+)通过美国GenScript定制。大规模人L1 mRNA由美国TriLink Biotechnologies进行体外转录、修饰和纯化(ARCA加帽和2'Omethymalted(CapI)，完全被5-甲基-C取代，25％的花菁-5-U取代和75％的假-U取代，酶促聚腺苷酸化，DNase和磷酸酶处理，硅胶膜纯化)。在第7天，采用经过修改的方案，使用Lipofectamine^TM MessengerMAX^TM(Invitrogen，美国，目录号LMRNA003)在分化中的成骨细胞中转染L1 RNA，转染的RNA量(少10倍)低于推荐的转染量。RFP mRNA(SystemBioscience,USA,目录号MR800A-1)用作阴性对照。转染3天后，用OsteoImage矿化测定(Lonza,Basel,瑞士,目录号LOPA503)对骨基质进行定量。

茜素红染色

成骨细胞用1×PBS(Kantonsapotheke Zürich，瑞士，目录号A171012)洗涤，并用4％(v/v)甲醛(Sigma，美国，目录号F8775)在1×PBS中固定30分钟。用ddH₂O洗涤两次后，加入茜素红染色溶液(0.7g茜素红S(Sigma，USA，目录号A5533)稀释于50 ml ddH₂O，pH ＝4.2)20分钟。之后，细胞用ddH₂O洗涤四次，干燥，并在黑暗中储存直到图像采集。对于吸光度测量，用300μl 10％(w/v)氯化十六烷基吡啶在0.01 MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄水溶液中在pH＝7下从染色的成骨细胞中洗脱茜素红S 1 小时。将150微升转移到96孔板上，在560nm处测量吸光度。将0.01 MNa₂HPO₄/NaH₂PO₄水溶液中的10％(w/v)氯化十六烷基吡啶用作空白。如前所述(Eggerschwiler et al.,Stem Cell Res.Ther.(2019).doi:10.1186/s13287-019-1170-8)获取、处理和分析图像。

成骨细胞和脂肪细胞分化中的基因表达分析

使用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行实时定量聚合酶链式反应(qPCR)。每个样品一式三份进行分析，并用内源对照、用于骨生成的核糖体蛋白L13A(RPL13A)和用于脂肪生成的Tata结合蛋白(TBP)归一化，用于cDNA 输入浓度。不包括模板和RT作为阴性对照。对于每个15μl反应，将10ng(L1为1ng)cDNA与1μM特异性引物混合物和7.5μl Sybr Select Master mix(#4472908，Life Technologies)混合。将反应物在95℃孵育10分钟，然后进行40个循环：在95℃变性15秒，在60℃退火30秒，和在72℃延伸30秒。通过7900HT快速实时PCR RQ管理器软件(Applied Biosystems)计算Ct值，然后将其归一化为目的基因和内源性校准物之间的DCt。本研究中用于基因表达分析的引物是使用Primer3(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计的。在所有引物对中，每个引物匹配不同的外显子。扩增子长度为80-130个核苷酸。引物序列在表1中报告。

体外反转录转座测定

将150x10³MSC与3μg LRE3-EGFP质粒(由Fred Gage教授友情提供)孵育，并用Neon转染系统(ThermoFisher)进行电穿孔。细胞经受一次990V 40ms的脉冲，恢复48小时，然后诱导分化成成熟成骨细胞两周。收获细胞并分离DNA。以50ng DNA为模板，用内含子侧翼寡核苷酸扩增EGFP序列，以区分质粒携带的含有内含子的RC-L1序列(1243bp，非逆转座的)和剪接的新插入的序列(343bp，逆转座的)。PCR反应用0.5μM的每种引物和10μl的热启动预混Taq DNA聚合酶(#R028A，Takara)进行，最终体积为20μl，94℃孵育30秒变性，58℃孵育30秒用于引物退火并在72℃下1分钟用于引物延伸。该循环重复30次。GFP引物序列已发表(38)并在表1中报告。

细胞周期分析

2x10⁵个MSC在37℃下胰蛋白酶化5钟，用PBS和2％BSA洗涤，通过70μM过滤器(#352350，Corning)，然后在-20℃下在70％乙醇中固定30分钟。用PBS和4％BSA洗涤后，将细胞重新悬浮在PBS中，并在37℃下与RNAse一起孵育1小时。然后洗涤细胞并重悬于100μl流式细胞术染色缓冲液(R&D System，#FC001)中。将10μl 1mg/ml碘化丙锭(PI)染色溶液(#P3566)添加到单细胞溶液中，轻轻混合，并在黑暗中孵育5分钟。在BD FACSCanto II流式细胞仪系统上使用BD FACSDiva软件进行细胞周期分析。

反义寡核苷酸递送

对于L1敲减实验，对5个不同的LINE-1ORF1 RNA区域具有特异性发FANA(2-脱氧-2-氟阿糖核酸)修饰的ASO，以及用作阴性对照发一个乱序(scrambled)(SCR)，根据生产商的说明通过gymnosis递送(AUMbiotech)。将冻干的寡核苷酸以500μM的浓度重新悬浮在无核酸酶的水中，然后每三天在细胞培养基中稀释至5μM。

统计学分析

为了确定两个平均值之间的显著性，通过适当的斯氏t检验进行比较，其中0.05置信水平被接受为统计学显著性。*＝P值<0.05；**＝P值<0.005；***＝P值<0.0005；****＝P值<0.00005。在相关性分析中，使用GraphPad(https://www.graphpad.com/quickcalcs/)计算p值和决定系数(R-平方的，R2)。生物学重复数(N)显示在图表或图例中。

结果

L1 DNA拷贝数在健康骨骼的基因组中扩增

在来自年龄匹配的绝经后妇女(分类为健康(CTR，n＝14，BMD t-评分≥-1)或骨质疏松症(OP，n＝16，BMD t-评分<-2.5)(数据未显示)的30个经髂骨活检组织的基因组DNA中分析了活性的、反转录转座感受态的L1的拷贝数的变化。简而言之：所有供体都采用标准的挪威饮食，并具有相似的营养补充剂和生活方式因素，包括身体接触。她们具有正常的内分泌、临床、生化和营养状况，绝经后未使用雌激素药物至少2年。她们没有接受已知会影响骨更新的药物治疗，并且没有其他骨骼原发性或继发性疾病。患者和健康人之间的再吸收标志物(血清TRAP5B、1CTP、尿NTX或尿DPD)不存在差异，根据国际标准，它们都在正常的实验室范围内。在骨形成标志物中，血清骨钙素在正常范围内，组间没有差异，而骨特异性碱性磷酸酶(ALP)虽然在正常变动范围内，但在骨质疏松症中显著升高(p<0.019)。

为了估计L1基因组拷贝数的变化，使用与分离高分子量基因组DNA、分别通过核酸外切酶I和RNase H处理去除ssDNA(例如逆转录但未整合的L1 cDNA)和RNA/DNA底物偶联的TaqMan qPCR，如方法中报道的。该程序是最先进的，以排除未整合到基因组中的L1序列的检测，因此，避免如先前预期(Goodier,et al.DNA(2014),doi:10.1186/1759-8753-5-11；Goodier,et al.DNA(2016),doi:10.1186/s13100-016-0070-z)和最近报道(34)的那样高估其基因组拷贝数。使用TaqMan qPCR，在拷贝数变化(CNV)测定中扩增了L1 DNA序列的两个不同区域(5'UTR-ORF1和ORF2)。

两组之间L1拷贝数的变化对于两个序列都非常显著，显示出患者中强烈减少(图1A)。使用了两组经过验证的TaqMan引物和探针，这些引物和探针对潜在的活性、反转录转座感受态的L1具有特异性(参见TaqMan引物和探针特异性分析的方法)(Coufal,etal.Nature(2009),doi:10.1038/nature08248；Muotri,et al.Nature(2010),doi:10.1038/nature09544)。一致地，观察到的健康和患者之间L1拷贝数的相对变化代表了仅限于潜在活性L1HS-Ta1家族的一小部分的差异。数据显示，骨基因组中的L1 5'UTR-ORF1拷贝数与所有测量部位的BMD呈正相关：头部(R2＝0.275；p＝0.006)(图1B)，全髋(R2＝0.355；p＝0.0005)(图1C)和脊柱(R2＝0.347；p＝0.0006)(图1D)。相比之下，与骨骼代谢不严格相关的个体参数(例如体重(R2＝0.012；p＝0.565)(图1E)、体重指数(R2＝0.031；p＝0.356)(图1F)、血清中的甲状旁腺激素水平(R2＝0.041；p＝0.282)(图1G)和年龄(R2＝0.028；p＝0.375)(图1H)没有观察到统计学上显著的相关性。当使用定义的引物和探针将临床参数与L1 ORF2拷贝数相关时，获得了一致的结果(图2A-G)。

为了评估CTR和OP女性之间L1拷贝数的变化是否对骨组织具有特异性，对取自相同供体的外周血单核细胞(PBMC)的基因组进行拷贝数变异(CNV)测定。在PBMC基因组中，L1拷贝数明显低于健康骨中的，但最重要的是，在CTR和OP组之间没有观察到变异(图2H)。这些结果表明，当比较骨质疏松症患者与健康供体时，L1基因组拷贝数的定量变异是在骨中特异性检测到的，而不是在不受病理学影响的其他中胚层衍生组织中检测到的，这证明了在骨质疏松症中L1动力学改变的骨特异性。

MSC的成骨分化触发L1基因组扩增

骨质疏松症的遗传原因尚不清楚，但它与MSC向骨髓生态位中成骨谱系的错误分化有关。绝经后骨质疏松骨的基因组中观察到的L1拷贝数减少表明L1动员和骨发育之间存在潜在关联，并且L1再激活的失败可能与缺陷的骨形成有关。因此，另外的研究调查了L1反转录转座子的激活和扩增是否确实发生在成人MSC的生理骨生成过程中发生。从健康供体的髂骨中分离出的骨髓来源的MSC在三周内分化为成熟的成骨细胞(图3A)。用光学显微镜检测成熟成骨细胞沉积的骨样结节(图3A)。钙化基质沉积和成骨基因表达的增加表明骨分化在离体成功发生(数据未显示，和图3C-D)。此外，由于MSC供体之间矿化的开始可能不同，因此选择了年龄匹配的供体(与所研究的队列年龄大致相同)，呈现相似的矿化动力学(图3C)以及相似的标记基因表达(图3D)，以确保细胞系统的一致行为。首先，使用实时qPCR监测L1表达在正发育的成骨细胞中的时间线，发现在成骨诱导后不久，L1 RNA的细胞内水平逐渐升高，然后在分化结束时降低(图3B)。在HMW-gDNA上使用基于TaqMan qPCR的CNV测定，研究调查了分化诱导的L1表达是否伴随着L1从头基因组整合的变化。如图3B所示，与未分化细胞(第7天)相比，成熟成骨细胞(第21天)中的L1拷贝数显著增加。之前用于多项研究(Coufal,et al.Nature(2009),doi:10.1038/nature08248；Ostertag,et al.NucleicAcids Res(2000),doi:gkd248[pii]；MacIa,et al.Genome Res.(2017),doi:10.1101/gr.206805.116)的一种基于工程化L1反转录转座GFP报告基因的测定证实L1增殖伴随骨细胞分化(图3E)。

L1动力学受损不利于成骨细胞的成熟

为了了解发育中的成骨细胞中的L1再激活和基因组扩增是否影响成骨表型，通过使用对L1-ORF1 RNA序列特异的氟阿糖核酸(FANA)修饰的ASO敲减L1 RNA。FANA ASO结合靶标序列并充当RNAseH介导的切割的对接元件(图4A)，从而避免RNA诱导的沉默复合物(RISC)的任何脱靶效应。重要的是，L1序列经常存在于基因的内含子中，因此也存在于许多可能成为抗L1 ASO靶标的RNA的核前体中。用于敲减L1RNA的ASO大多被排除在细胞核之外(数据未显示)。这进一步降低了脱靶的可能性。每三天将五种FANA ASO的混合物递送到分化中的成骨细胞，并通过实时qPCR分析骨相关基因的表达。有点令人惊讶的是，L1RNA的适度消耗(图4F)足以诱导成骨细胞相关转录因子Osterix(OSX，-43％)和Runt相关转录因子2(RUNX2，-23％)的的表达的显著减少，在诱导骨形成后16天进行分析。此外，对成骨细胞特异性基因骨钙蛋白(OCN或BGLAP，-10％)和骨组织骨桥蛋白(OPN，-40％)和骨唾液蛋白(BSP，-44％)(Fig.4B)的两种主要非胶原成分进行了类似的观察。结果表明，体细胞L1 RNA的消耗破坏了细胞激活成骨程序和产生矿化骨的能力。

NRTI介导的L1基因组扩增抑制降低了发育中的成骨细胞的成熟并损害了发育中的成骨细胞的矿化

此外，初步研究调查了NRTI拉米夫定3TC(3TC)阻断ORF2介导的L1反转录转座(阻止发育中的成骨细胞中L1拷贝数的扩增)是否会影响骨细胞的成熟和功能。每天用或不用3TC处理分化中的成骨细胞，持续三周，并在三个不同的分化时间点测量L1拷贝数。正如预期的那样，该药物有效地阻止了成骨细胞成熟过程中的L1 DNA扩增(图4C)。为了评估3TC对成骨标志物可能的表型影响，在分化中的成骨细胞中分析了用(3TC)和不用(DMSO)3TC处理的标记基因的表达。在终末分化细胞(第21天)中，观察到OPN(-23％)、OSX(-50％)和BSP(-60％)的表达极显著降低(图4D)。一致地，矿物基质沉积显著减少(-60％)(图4E)。通过碘化丙锭染色，然后对3TC处理的成骨细胞进行细胞周期FACS分析，排除药物对细胞活力的潜在有害影响。用拉米夫定3TC处理(3TC)或未处理(DMSO)的人间充质干细胞的FACS细胞周期分析结果和亚G1峰中凋亡细胞数的测量显示没有显著差异(数据未显示)。这些结果证实了L1基因组扩增抑制代表了NRTI治疗与ART患者中矿化损失之间的紧密联系的假设。

MSC分化成脂肪细胞缺乏L1动员

我们的研究结果一致表明，当L1再激活被抑制时，MSC无法有效地分化为功能性成骨细胞。在绝经后骨质疏松症中，随着脂肪含量的增加，红色骨髓从红色变为白色(Devlin,et al.Lancet Diabetes Endocrinol.(2015),doi:10.1016/S2213-8587(14)70007-5；Ambrosi,et al.Cell Stem Cell(2017),doi:10.1016/j.stem.2017.02.009)。当中胚层祖细胞离体分化为脂肪细胞时(图5A)，用光学显微镜很容易检测到脂肪细胞积累的脂滴(图5A)。细胞内脂肪酸含量和脂肪生成基因表达的增加表明脂肪生成成功地离体发生(图9A-B)。

监测L1的表达和拷贝数(图5B)，但未观察到分化时的显著变化。这与先前的报告一致，表明分化为脂肪细胞的MSC不是反转录转座感受态的(MacIa,et al.Genome Res.(2017),doi:10.1101/gr.206805.116)。最后，如五个不同的供体所示，MSC中L1扩增的3TC介导的抑制不会显著影响脂肪形成标记基因的表达(图5C)，并且细胞内脂质的积累没有改变(图5D)。这些研究得出的结论是，在发育中的MSC中，体细胞L1再激活似乎是谱系特异性的，并且是成骨程序所必需的，而它不参与脂肪细胞的形成，脂肪细胞是骨质疏松症患者的骨髓生态位中普遍存在的细胞类型。

LINE-1反转录转座RNA递送至间充质干细胞刺激成骨分化和骨基质产生

骨L1拷贝数与成熟成骨细胞和骨细胞活性相关。

图6A-F显示了在30名选定参与者的活检中，L1拷贝数与成骨细胞、骨细胞和破骨细胞特异性基因的表达之间的相关性。成骨细胞中的RUNX2转录水平对于5'UTR-ORF1区域略微显著(图6A和6B)。在四种骨细胞标志物中，有两种与L1拷贝数呈正相关：SOST(对于5'UTR-ORF1，p＝0.005；对于ORF2，p＝0.0002)(图6A、C和D)和MEPE(对于5'UTR-ORF1，p＝0.007；对于ORF2,p＝0.0006)(图6A、E和F)。在成熟成骨细胞和骨细胞中普遍表达的SPP1与5'UTR-ORF1区域拷贝数之间也发现了显著相关性(p＝0.009)(图6A和G)，但对于破骨细胞特异性标志物ACP5和CALCR没有发现显著相关性(图6A)。这些数据将骨质疏松症患者骨中L1拷贝数的减少与同一组织内成骨细胞/骨细胞的受损的合成代谢活性强烈地联系起来。

合成的l1 RNA递送到骨质疏松症患者的MSC触发培养物中的基质矿化

骨质疏松骨在体内显示出明显的L1再激活缺陷，可能对成骨细胞骨形成产生负面结果。因此，额外的研究试图测试是否将L1 RNA直接递送至从骨质疏松症供体获得的分化为成骨细胞MSC，可以提高成熟和成骨能力。MSC从四名健康供体和四名患者的股骨中分离出来，并测试它们支持成骨分化的能力(图7B)。将低剂量(图8A-G)的Cy5缀合的合成全长L1RNA以高效率(图7B)转染到这些分化中的成骨细胞中。正如预期的那样，外源性脂转染胺介导的RNA递送导致形成细胞内囊泡(图7B，红色病灶)，其中L1 RNA随着时间的推移缓慢释放(Kirschman,J.L.et al Nucleic Acids Res.2017；doi:10.1093/nar/gkx290)。虽然来自患者的细胞显示出明显延迟和减少的矿化(图7A)，但用L1 RNA转染的细胞显示出恢复的骨基质生成(图7C)。值得注意的是，加帽、5'末端的2'-O-甲基化、多腺苷酸化(200个腺苷)、5-甲基胞苷(m5C)的完全取代和75％的假尿苷取代用于稳定RNA并绕过细胞内先天免疫系统(Koski et al.,J.Immunol 2004；doi:10.4049/jimmunol.172.7.3989；Pardi et al.,Methods Mol.Biol.(2013).doi:10.1007/978-1-62703-260-5_2；Ludwig,J.etal.Nat.Struct.Mol.Biol.(2010).doi:10.1038/nsmb.1863；Karikóet al.,Immunity(2005).doi:10.1016/j.immuni.2005.06.008；Anderson,B.R.et al.Nucleic Acids Res.(2010).doi:10.1093/nar/gkq347；Kormann,et al.Nat.Biotechnol.(2011)doi:10.1038/nbt.1733)。

因此，L1 RNA转染既没有诱导细胞凋亡也没有诱导干扰素反应基因(图8G)。结果表明，在所有测试的患者中，将L1 RNA递送至体外分化中的MSC极大地促进了成骨细胞的成熟，并完全挽救了矿化基质的产生。

讨论

原发性骨质疏松症是世界范围内与社会开支和人类丧失能力相关的最常见和最昂贵的疾病之一(Cunningham,et al.Osteoporos.Int.(2016),doi:10.1007/s00198-016-3620-9)。由于其他疾病、药物和营养不足，经常发生的继发性骨质疏松症可能更加频繁，但受到的关注较少，尤其是接受基于NRTI的抗逆转录病毒治疗的患者。这些研究报告称，L1基因组结构变异与30名绝经后妇女的骨密度相关，其中与骨质疏松骨相比，在健康人群中观察到更高数量的L1 DNA拷贝(图1A)。值得注意的是，CTR和OP女性之间的这种结构性L1驱动的基因组变异在骨骼中特异性地观察到，但在也代表间充质来源的细胞并从相同的供体获得的外周血中没有观察到(图2H)。在明确的绝经后健康女性与骨质疏松女性中进行的体内观察表明，L1元件的扩增可能代表了正常骨骼发育和/或结构维持的基因组记录。使用来自人骨髓的间充质干细胞祖细胞，离体成人骨形成被重演，研究证明了伴随成骨细胞成熟的L1的发育调节再激活和动员(图3A-B)。ASO介导的L1 RNA降解以及骨形成过程中L1反转录转座的NRTI介导的抑制严重影响成骨细胞成熟，对矿化产生有害影响(图4A-E)。显著的表型效应不是由于一般的细胞毒性作用(图5A-B)，而是似乎是谱系和成骨发育程序特异性，如L1功能丧失对脂肪生成缺乏显著影响所显示的(图5A-D)。值得注意的是，L1基因组扩增的NRTI介导的抑制并没有改变关键脂肪基因的表达，也没有改变发育中的脂肪细胞中的脂质积累。我们的发现：在分化中的MSC中降低的L1活性导致缺陷的骨生成和成骨细胞依赖性矿化减少，但不会限制发育中的脂肪细胞中的脂质积累，这与表征原发性骨质疏松症的骨质流失和骨髓脂肪组织增加是一致的(Hawkes,et al.Bone(2018),doi:10.1016/j.bone.2018.03.012)。此外，最近已证明拉米夫定体内处理增加小鼠的骨髓脂肪组织(Cecco,et al.Nature 566,73–78(2019)。我们的数据与基于NRTI的治疗与患者骨质流失之间的充分记录的关联一致(Grigsby,et al.Osteoporos.Int.(2004),doi:10.1007/s00198-004-1627-0；Brown,et al.AIDS(2006),doi:10.1097/QAD.0b013e32801022eb；Madeddu,et al,Q J Nucl Med Mol Imaging(2004))，并且与ORF2是NRTI的既定和公认的靶标这一事实一致(Jones,et al.PLoS One(2008),doi:10.1371/journal.pone.0001547；Bachiller,et al.Brain.Behav.Immun.(2017),doi:10.1016/j.bbi.2016.12.018)。还考虑了破骨细胞的可能贡献。然而，骨质疏松症和健康绝经后妇女的骨吸收和破骨细胞活性的所有血清标志物相似(数据未显示)。通过测量99名不同BMD的绝经后妇女的扩展群组的血清中的酒石酸抗性磷酸酶5b(TRAP5b)，特别检查了可能的破骨细胞参与(图10)。BMD和血清TRAP5b之间存在小但不显著的负相关(p＝0.13，R2＝0.026)。此外，在健康者和患者之间没有观察到差异(p＝0.31，数据未显示)。因此，L1介导的对破骨细胞的作用的被忽视的影响不太可能改变目前的结果。患者血清ALP水平较高(p＝0.019)，尽管值在正常范围内，表明代偿性的但不足的骨形成以抵消原发性骨质疏松过程。在非病理环境，例如骨发育和早期胚胎发生(Kano,et al.Genes Dev.(2009),doi:10.1109/TLA.2016.7459581；van denHurk,et al.Hum.Mol.Genet.(2007),doi:10.1093/hmg/ddm108；Fadloun,Nat.Struct.Mol.Biol.(2013),doi:10.1038/nsmb.2495；Jachowicz,et al.Nat.Genet.(2017),doi:10.1038/ng.3945)和正在发育的大脑(Coufal,et al.Nature(2009),doi:10.1038/nature08248；Bedrosian,et al.,doi:10.1126/science.aah3378)中L1再激活的功能意义仍有待了解。事实上，L1和其他转座子活性是一个复杂的现象，涉及从长的非编码RNA(lncRNA)产生到受控的DNA 损伤和修复、染色质重塑和整合位点的基因座特异性的顺式效应几个步骤。因此，可以想象，由L1再激活触发的不止一种机制将有助于组织特异性表型表达。因此，未来的研究将需要阐明L1反转录转座子动力学的抑制是否可能是骨质疏松症发展的因果或伴随事件。然而，L1动力学支持成骨和L1相关基因组结构变异区分体内健康和骨质疏松骨的报道的事实可能表明了以前无法预见的研究前沿，以制定减轻绝经后妇女和接受抗逆转录病毒治疗方案的患者骨流失的策略。

II.L1 RNA抑制保留H3K9M3异染色质防止小鼠早衰模型中的组织退化

LINE-1(L1)元件可通过激活促炎反应引起细胞毒性，这是由于L1RNA/cDNA在细胞质中的积累独立于它们的反转录转座。这些研究调查了LAKI小鼠中的L1表达，以发现散在的重复序列的转录与衰老表型的发生之间的相关性。

材料和方法

动物和体内处理：

所有动物程序均根据NIH指南进行，并经索尔克研究所动物护理委员会(Committee on Animal Care at the Salk Institute)批准。携带LMNA突变G609G(LAKI)的Hutchinson-Gilford早衰综合征(HGPS)小鼠模型由西班牙奥维耶多大学的Carlos López-Otín产生，并由巴克研究所的Brian Kennedy慷慨捐赠。

在8周龄时对两种性别的WT和LAKI小鼠进行了实验。对于寿命实验，将一窝的两种性别小鼠随机分配到对照组和实验组。排除在实验开始前看起来不健康的任何动物。没有使用纳入标准。小鼠以06:00至18:00之间12小时的光/暗循环饲养在温度控制室(22±1℃)中，可自由获取水和食物。

LINE-1特异性或乱序的(scramble)2'-脱氧-2'氟-β-d-阿糖核苷酸(FANA ASO)以2-10mg/Kg每两周一次的剂量通过腹膜内或皮下注射递送。

尾尖成纤维细胞分离和培养：

从WT和LAKI小鼠中分离尾尖成纤维细胞(TTF)，并在37℃下在含有Gluta-MAX、非必需氨基酸和10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Invitrogen)中培养。对于LINE-1敲减，每2将TTF与溶解在培养基中的1μM FANA ASO一起孵育，并在一周后收集用于衰老标记表达或免疫组织化学。

组织学分析：

对于组织学分析，在FANA-ASO注射8周后，在16周龄时收集组织样本。用PBS和10％缓冲福尔马林溶液灌注小鼠。随后，将组织在4℃的10％缓冲福尔马林溶液中固定过夜，用PBS中的30％蔗糖冷冻保存过夜，包埋在OCT基质(Kaltek)中并在液氮中快速冷冻。7μm冷冻切片用于苏木精和伊红染色(H&E)或用于免疫组织化学。

免疫组织化学：

细胞在室温(RT)下用PBS中的4％甲醛固定10分钟。固定后，在室温下用PBS中的0.5％Triton X-100处理细胞5分钟。用PBS中的4％BSA封闭30分钟后，将细胞与一级抗体在4℃下孵育过夜，然后在PBS中洗涤并在室温下与相应的二级抗体孵育1小时。使用DAPI-Fluoromount-G(SouthernBiotech)封固细胞。使用Zeiss LSM 780激光扫描显微镜(CarlZeiss Jena)进行共聚焦图像采集。使用足够的激光(488-nm、568-nm、633-nm和405-nm)以0.25μm间隔在z截面拍摄图像。激光强度通常设置为最大强度的3％–5％透射率，并建立设置以避免任何激光的信号饱和。

使用HistoVT One(Nacalai Tesque)对组织切片进行透化和抗原恢复。随后，组织切片用PBS中的5％级分V BSA(Sigma-Aldrich)和免疫球蛋白掩蔽试剂(VectorLaboratory)封闭，并与一级抗体孵育过夜。最后，将组织切片与封闭缓冲液中的二级抗体在室温下孵育60分钟(invitrogen)。组织切片用DAPI Fluoromount G封固剂(SouthernBiotech.)封固。

荧光原位杂交：

TTF和组织切片中的RNA-FISH或免疫RNA FISH根据制造商的标准方案(BiosearchTechnologies)进行。在3％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟，然后在杂交前用1％triton X-100在室温下透化5分钟。杂交在38度过夜进行，使用48个单分子探针，这些探针设计为跨越活性小鼠L1spa元件的长度，识别大部分转录的LINE-1RNA。探针组由BiosearchTechnologies设计和生产。通过使用

FISH Probe Designer(BiosearchTechnologies,Inc.,Petaluma,CA)针对L1spa设计了用CalFluor610标记的定制

FISH探针，该

FISH Probe Designer可在www.biosearchtech.com/stellarisdesigner在线获取。

LINE-1RNA体外转录和SUV39酶活性测定：

使用含有L1spa元件的pTNC7质粒作为模板，使用MAXIscript转录试剂盒(Invitrogen)体外转录LINE-1RNA。在反应之前，pTNC7已用NotI限制酶线性化以转录全长正义LINE-1RNA或用XhoI限制酶线性化以转录反义LINE-1RNA。按照RNA净化方案，用RNAeasy mini试剂盒(qiagen)纯化转录的RNA。重组Suv39H1(Activemotif)组蛋白甲基转移酶(HMT)活性使用EpiQuik^TM组蛋白甲基转移酶活性/抑制测定试剂盒(Epigentek)按照制造商说明进行检测。简而言之，将1μg重组SUV39H1与10ng或50ng体外转录的正义LINE-1RNA一起孵育。反义LINE-1RNA用作如Camacho et al.elife 2017中的阴性对照。1μg SUV39H1单独或与RNA复合用于与1μl阳性对照酶平行的测定。在酶标仪上读取450nm处的吸光度，HMT活性计算如下：HMT活性＝OD(样品-空白)/孵育时间(Hr)。

RNA提取和实时qPCR：

使用RNAeasy Plus mini试剂盒(Qiagen)从细胞和组织中提取总RNA，然后使用iScript Reverse Transcription Supermix for RT-PCR(Bio-Rad)合成cDNA。使用SsoAdvanced SYBR Green Supermix或iQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)进行qPCR。

mp16-Fwd CGTGAACATGTTGTTGAGGC(SEQ ID NO:35)；

mp16-Rev GCAGAAGAGCTGCTACGTGA(SEQ ID NO:36)；

mp21-Fwd CGGTGTCAGAGTCTAGGGGA(SEQ ID NO:37)；

mp21-Rev ATCACCAGGATTGGACATGG(SEQ ID NO:38)；

mAtf3-Fwd CTCTGGCCGTTCTCTGGA(SEQ ID NO:39)；

mAtf3-Rev GGTCGCACTGACTTCTGAGG(SEQ ID NO:40)；

mGadd45b-Fwd CGGCCAAACTGATGAATGT(SEQ ID NO:41)；

mGadd45b-Rev TCTGCAGAGCGATATCATCC(SEQ ID NO:42)；

mBtg2-Fwd GCGAGCAGAGACTCAAGGTT(SEQ ID NO:43)；

mBtg2-Rev TAGCCAGAACCTTTGGATGG(SEQ ID NO:44)；

mMMP13-Fwd TGATGAAACCTGGACAAGCA(SEQ ID NO:45)；

mMMP13-Rev GGTCCTTGGAGTGATCCAGA(SEQ ID NO:46)；

mIL6-Fwd TGATGCACTTGCAGAAAACA(SEQ ID NO:47)；

mIL6-Rev ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC(SEQ ID NO:48)；

mLap2a-Fwd TTCTCGAGCGACGAGGAG(SEQ ID NO:49)；

mLap2a-Rev AGCCTGGGCTTATCAGTTTT(SEQ ID NO:50)；

mGapdh-Fwd GGCAAATTCAACGGCACAGT(SEQ ID NO:51)；

mGapdh-Rev GTCTCGCTCCTGGAAGATGG(SEQ ID NO:52)；

mL1–Fwd GCGGTTCCTCAGAAAATTGG(SEQ ID NO:53)；

mL1–Rev TGCCCAGGAGAGGTATTGCT(SEQ ID NO:54)；

衰老相关的β-半乳糖苷酶酶活性测定：

如本文所述，简要地进行衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-βgal)测定。简而言之，首先，将细胞在室温下在4％多聚甲醛中固定5分钟。接下来，将细胞用PBS洗涤两次，并在含有40mM柠檬酸/磷酸钠缓冲液、5mM K₄[Fe(CN)₆]3H₂O、5mM K₃[Fe(CN)₆]、150mM氯化钠、2mM氯化镁和1mg/ml X-gal的染色溶液中37℃孵育过夜。最后，细胞用PBS洗涤两次，用甲醇洗涤一次。将板干燥并使用明场显微镜拍摄细胞照片。

结果和讨论

使用多重TaqMan测定法，在从野生型(WT)和LAKI小鼠分离的尾尖成纤维细胞(TTF)中测量三种活性鼠L1亚家族(L1-Tf、L1-Gf和L1-Af)的表达。在LAKI TTF中，观察到L1元件的表达高出3到6倍(图11A)。使用RNA荧光原位杂交测定(FISH)进一步证实了L1表达，并且引人注目的是，注意到细胞核内L1 RNA的强烈积累(图11B)。为了从胞质溶胶和核区室中敲减L1 RNA，使用了L1特异性2'F-ANA修饰的AON(L1-AON)。L1 RNA消耗通过qPCR和RNAFISH确认(图11C-D)。有趣的是，用L1-AON处理的LAKI TTF显示p53肿瘤抑制途径(p16、p21、Atf3和Gadd45b)、衰老相关金属蛋白酶Mmp13和促炎性白细胞介素IL1a中应激反应基因的表达显著降低(图11E)。一致地，在用L1-AON处理的LAKI TTF中，活性衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-B-gal)阳性的细胞数量减少(图11F)。

LAKI小鼠的特点是H3K9me3和去浓缩的异染色质水平显著降低。在L1-AON处理时，与乱序(scramble)处理的对照细胞相比，LAKI细胞中H3K9me3异染色质灶的强度增加，并且更接近WT(野生型)细胞中的水平(数据未显示，和图12A)。因此，具有异常细胞核结构的细胞数量也减少了(数据未显示和图12B)。

负责H3K9三甲基化的染色质修饰剂SUV39H1/2酶，能够结合重复的RNA，特别是从“正义”DNA链转录的L1 RNA。进行了RNA免疫沉淀(RIP)，结果显示L1 RNA的5’末端和3’末端都被LAKI TTF中的SUV39H1/2(每对柱的右柱)蛋白结合(图12C)。此外，SUV39H1/2病灶与LAKI TT中的L1 RNA斑点共定位(数据未显示)。考虑到L1-ASO处理恢复了异染色质并降低了衰老相关基因的表达，进行进一步研究以确定L1 RNA是否对LAKI细胞核中积累的SUV39H1/2起抑制作用。在存在L1正义定向转录物的情况下，使用重组SUV39H1/2蛋白进行AnH3K9特异性组蛋白甲基转移酶测定。L1反义转录物用作阴性对照。与单独的蛋白质或L1反义RNA的活性相比，L1正义RNA对SUV39H1/2酶活性具有很强的抑制作用(图12D)。

为了测试体内L1 RNA消耗是否对LAKI小鼠在预防衰老表型的发生方面有任何有益影响，从8周龄开始对LAKI小鼠进行乱序AON和L1-AON处理。对小鼠进行AON(T.B.D.)的腹膜内注射。L1-AON处理的LAKI小鼠在16周龄时被处死，用于分子和组织学分析。通过qPCR证实了几种组织中L1 RNA的敲减，所述组织包括皮肤、胫骨前骨骼肌、肝脏、肾脏、脾脏和胃(图13A)。重要的是，与注射乱序AON的小鼠相比，8周的L1-AON处理恢复了H3K9me3异染色质标记的水平(数据未显示)。此外，L1-AON处理降低了分析的不同组织中SASP基因的表达(图13B)。

还研究了L1 FANA寡核苷酸在来自早衰症患者(HGPS)或重演Werner综合征(WRN-/-)的人细胞中的有益作用。与在小鼠中获得的数据一致，早衰症和Werner综合征人细胞的特征在于L1 RNA的较高表达(图14A)。使用人特异性L1-AON细胞显示SA-B-Gal活性降低和衰老相关基因表达降低(图14B-D)。此外，即使在人系统中，L1 RNA的消耗也与H3K9me3异染色质的恢复有关(图14E-F)。

为了评估处理在保护器官免受与过早衰老相关的病理变化方面的功效，对早衰综合征中受损的组织进行组织学分析(Cesta,2006；Khanna et al.1988；Kurbanand Bhawan,1990；Zhou et al.,2008；Osorio et al.,2011)。苏木精-伊红染色显示，注射L1-AON的小鼠皮肤、脾脏、胃部和肾脏的组织学特征得到改善(数据未显示)。特别地，皮肤的特征在于表皮层较厚，脾脏中胚核较宽，胃部上皮层体积较大，肾小球直径增大(图13C)。总之，这些结果证实，L1 RNA的稳定减少改善了LAKI小鼠多个器官中与年龄相关的组织学变化。

最后，监测经处理小鼠的体重和寿命。与组织学分析一致，与对照和未处理的小鼠相比(图13E)，L1-AON处理防止LAKI小鼠典型的体重逐渐减轻(图13D)，并且观察到中位寿命增加(15-25％)。

内源性L1元件在生理(cit.)和病理(HGPS，图11A-11E)老化细胞中均具有转录活性。这项研究表明，在像早衰综合征这样的加速衰老模型中，L1 RNA在细胞核中的积累导致异染色质的丢失和SASP相关基因的表达增加。这里的数据表明，使用AON敲减这种重复RNA防止H3K9me3异染色质去浓缩并降低与年龄相关的基因的表达。此外，LAKI小鼠体内的L1RNA消耗延迟了不同组织中早衰表型的发生、体重减轻并增加了经处理小鼠的寿命。此外，还证明了L1 RNA作为SUV39H1/2的负调节剂的新功能。

总之，在这项研究中，首次表明针对重复RNA的基于反义寡核苷酸的疗法足以改善LAKI小鼠的衰老相关表型。因此，特别是基于AON的干预，或降低体内L1 RNA水平的其他干预措施，对于像早衰综合征这样的破坏性疾病来说可能是一种有吸引力的治疗选择。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文引用的出版物和引用的材料通过引用具体纳入。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在包含在以下权利要求中。

Claims (25)

1.用于增加L1 RNA拷贝数的组合物，其包含在药学上可接受的载体中的L1 RNA或其片段。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述L1 RNA是L1HS-Ta1。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其包含L1 RNA的ORF1或ORF2。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述L1 RNA或其片段在表达载体中。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述表达载体选自由质粒、小环DNA(mcDNA)和病毒载体组成的组。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述载体选自由噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒和腺伴随病毒组成的组。

7.根据权利要求5或6所述的组合物，其中所述表达载体在骨祖细胞中。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述骨祖细胞是骨髓来源的间充质干细胞。

9.根据权利要求7或8所述的组合物，其中，所述L1 RNA包含SEQ ID NO：1。

10.增加在有需要的受试者中L1-RNA表达的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求中任一项的组合物以增加受试者的一个或多个细胞中的L1 RNA表达。

11.根据权利要求10所述的方法，其包括将经基因工程改造以表达L1 RNA或其功能性片段的骨祖细胞施用于受试者中有需要的部位。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述细胞是自体细胞。

13.根据权利要求11或12所述的方法，包括将所述细胞施用至需要骨生长或修复的部位。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的方法，其中，所述部位是脊柱融合部位或骨折部位。

15.根据权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述组合物在被诊断患有选自由退行性椎间盘疾病、脊椎前移、椎管狭窄、脊柱侧凸、椎骨骨折、感染、椎间盘突出和肿瘤组成的组的病症的受试者中有效增加骨折部位或脊柱融合部位的骨量指数。

16.根据权利要求10-15中任一项所述的方法，其中所述组合物包含SEQ ID NO:1。

17.用于减少L1 RNA的组合物，其包含在药学上可接受的载体中的一种或多种用于抑制L1 RNA表达的试剂。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述用于抑制L1 RNA的试剂选自在药学上可接受的载体中的由小分子、反义寡核苷酸(ASO)、siRNA、miRNA、shRNA、外部指导序列和适体组成的组。

19.根据权利要求17或18所述的组合物，其包含L1 RNA ASO、L1RNA ORF1 ASO和/或L1RNA ORF2 ASO。

20.根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述ASO与L1 RNA、L1 RNA ORF1或L1 RNAORF2的片段互补，并且任选地，其中所述ASO的长度不超过24个核苷酸。

21.在有需要的受试者中减少L1 RNA拷贝数的方法，包括向所述受试者施用根据权利要求17-20中任一项所述的组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物通过注射施用。

23.根据权利要求22所述的方法，包括将所述组合物皮下施用至所述受试者。

24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述组合物减轻受试者早衰综合征的一种或多种症状。

25.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述组合物减轻皮肤老化的一种或多种症状。

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