CN115381860A - 一种保护酒精性肝损伤组合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种保护酒精性肝损伤组合物及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。菌剂中包括采用具有强的胃肠道消化系统的抗性，抗氧化能力及对胆盐耐受能力的副干酪乳杆菌(lactobacillus paracei)JN‑8冻干菌粉，多酚类化合物和维生素。本发明提供的副干酪乳杆菌JN‑8菌可产生抗氧化物质对抗酒精性肝损伤产生的。添加的多酚类化合物也是具有强抗氧化活性的物质；此外还添加具抗氧化，提高免疫等功能的维生素，从而有效保护小鼠的酒精性肝损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种保护酒精性肝损伤组合物及其制备方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
当饮酒后，肝代谢酶系统将乙醇转化为乙醛，乙醛又被脱氢酶氧化生成乙酸，最后代谢为二氧化碳和水排至体外。当大量饮酒后，产生的大量乙醛可刺激产生肾上腺素、去甲肾上腺素等，表现为面红、头昏、头痛、心率加快等情况。重度乙醇中毒者表现为昏睡、血压低、呼吸减慢、心率加快，甚至导致死亡。酒精性肝损伤主要是由大量饮酒对肝脏造成氧化性损伤。主要机制是酒精的大量摄入会使机体产生大量的活性氧自由基，导致机体内氧化水平升高，抗氧化水平降低，从而对肝脏造成损伤。
口服益生菌是天然、安全、有效的干预疾病手段，乳酸菌在各种炎症疾病中显示出许多有益的作用。副干酪乳杆菌通过增加有益细菌的数量，减少有害菌的数量，可以减少活性氧自由基起到抗氧化的作用，恢复机体氧化与抗氧化间的平衡，进一步减轻酒精对肝脏的损伤，对肝脏起到保护作用，此外多酚类化合物和维生素具有强的抗氧化和抗炎的能力，进而降低酒精引起的氧化应激和炎症反应。因此，利用益生菌组合物保护酒精性肝损伤具有广阔的前景。
目前，轻中度酒精性肝损伤依旧采取药物治疗，药物治疗对人体的副作用大，而且长期的服药会给肝，肾器官增加一定的负担。因此，急需开发更多的能够预防和治疗酒精性肝损伤的益生菌产品。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种含有副干酪乳杆菌JN-8的菌粉组合物，本发明结合了对肠炎具有较好治疗效果的副干酪乳杆菌JN-8、多酚类化合物、维生素和脱脂乳粉，制备得到一种可以保护酒精性肝损伤的菌粉组合物。
本发明的第一个目的是提供一种保护酒精性肝损伤组合物，所述的菌粉组合物包括副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-8冻干菌粉、多酚类化合物和维生素，其中，所述的副干酪乳杆菌JN-8于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCCNo.22746。
进一步地，按重量份计，所述的菌粉组合物包括50～70份副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉、10～30份多酚类化合物和20～30份维生素。
进一步地，所述的副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉中活菌数不低于1×109CFU/g。
进一步地，所述的副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉中还包括占副干酪乳杆菌JN-8菌体质量10～20％的脱脂奶粉。
进一步地，所述的多酚类化合物为茶多酚，葡萄多酚，白藜芦醇，花青素中的一种或多种。
进一步地，所述的维生素为维生素C、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素A、维生素D、维生素D3、叶酸、维生素K中的一种或多种。
本发明的第二个目的是提供一种保护酒精性肝损伤组合物的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将所述的副干酪乳杆菌JN-8接种量接种于MRS固体培养基中，36～38℃培养36～48h，获得菌株单菌落；
(2)挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-8单菌落，接种于MRS液体培养基中， 36～38℃厌氧培养20～24h，得到初级种子液；
(3)将初级种子液以4～5％的接种量接种于液体MRS培养基中，36～38℃厌氧培养20～24h，得到发酵液；
(4)将得到的发酵液3000～5000rpm/min离心10～15min，收集并洗涤菌体，得到副干酪乳杆菌JN-8菌体；
(5)向收集到的副干酪乳杆菌JN-8菌体进行冷冻干燥，得到所述的冻干菌粉；
(6)按照重量份的原料，将副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉、多酚类化合物和维生素混合，制成所述的保护酒精性肝损伤的菌粉组合物。
进一步地，在步骤(5)中，脱脂奶粉的添加量为副干酪乳杆菌JN-8菌体质量的 10～20％。
进一步地，MRS固体培养基：胰蛋白胨8～12g/L；酵母粉4～6g/L；牛肉膏8～12g/L；葡萄糖15～25g/L；柠檬酸氢二胺1～3g/L；乙酸钠4～6g/L；K2HPO4·3H2O 2.5～2.7g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.3g/L；MnSO4·4H2O 0.04～0.06g/L；吐温80 0.8～1.2mL/L；1.5～2％的琼脂粉。
进一步地，MRS液体培养基：胰蛋白胨8～12g/L；酵母粉4～6g/L；牛肉膏8～12g/L；葡萄糖15～25g/L；柠檬酸氢二胺1～3g/L；乙酸钠4～6g/L；K2HPO4·3H2O 2.5～2.7g/L；MgSO4·7H2O 0.1～0.3g/L；MnSO4·4H2O 0.04～0.06g/L；吐温80 0.8～1.2mL/L。
本发明的第三个目的是提供一种所述的菌粉组合物在保护酒精性肝损伤的产品中的应用。
进一步地，所述的产品为药品。
本发明的有益效果是：
本发明采用具有强的胃肠道消化系统的抗性及对胆盐耐受能力的副干酪乳杆菌JN- 8冻干菌粉，配合多酚类化合物和维生素，制备得到副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物。本发明的副干酪乳杆菌JN-8具有强的消化道和胆盐耐受能力，在消化道中具有高的存活率，进而保证了副干酪乳杆菌JN-8的益生活性。副干酪乳杆菌JN-8能够减少活性氧自由基起到抗氧化的作用，恢复机体氧化与抗氧化间的平衡，减轻酒精对肝脏的损伤；本发明还添加多酚类化合物，具有强抗氧化，抗炎的作用；此外还添加具有抗氧化，抗炎，提高免疫等功能的维生素，从而保护酒精性肝损伤。
本发明的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物能够显著降低血清中ALT和AST的水平，降低肝脏中GST的水平，减轻肝脏的损伤。此外，增加肝脏中GSH及GSH-Px的水平，提高了肝脏的抗氧化能力，恢复机体氧化与抗氧化的平衡，缓解酒精摄入造成的肝脏损伤，可以作为一种具有良好预防或治疗酒精心肝损伤的药品。
生物材料保藏：
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-8，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，保藏编号为CGMCC No.22746。
附图说明：
图1为小鼠血清中AST和ALT的水平。###与正常组比较P＜0.001；***与模型组相比较，P ＜0.001；**与模型组相比较，P＜0.01；*与模型组比较，P＜0.05；
图2为各组小鼠肝脏中GSH，GSH-Px和GST水平的统计结果。###与正常组比较P＜0.001；***与模型组相比较，P＜0.001；**与模型组相比较，P＜0.01；*与模型组比较，P＜0.05；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
MRS固体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K2HPO4·3H2O 2.6g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·4H2O 0.05g；吐温80 1mL；1.5～2％的琼脂粉。pH调节6.8±0.2；定容至1L。
MRS液体培养基：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K2HPO4·3H2O 2.6g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·4H2O 0.05g；吐温 80 1mL。pH调节6.8±0.2；定容至1L。
LB培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，超纯1.0L，调节pH至7.4。
在本发明实施例中，所添加的多酚类化合物是抗性糊精和低聚木糖按照质量比1:1混合得到，维生素是维生素A和维生素E按照质量比1:1混合得到。
实施例1：
本发明所采用的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-8，于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22746。
该副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-8的性能测试如下：
菌株的人工胃肠液抗性实验：
1、模拟唾液、胃液和肠液的制备：
(1)胃肠储备液的制备(见表1)
表1模拟唾液，胃液和肠液制备
a在使用前添加CaCl2(H2O)2
(2)调节pH：利用NaOH溶液或HCl溶液调节SGF溶液pH至3；SIF溶液pH调节至7。
(3)SGF溶液中添加胃蛋白酶溶液和胃脂肪酶溶液，最终混合物的活性分别达到2,000U/mL和60-75U/mL；SIF溶液中添加胰蛋白酶，最终混合物的活性分别达到100U/ mL。
(4)在实验过程中保持37℃的温度，不断搅拌，可以用来模拟胃肠的蠕动。
2、胃肠液抗性实验操作
乳酸菌菌液以10％的接种量接种到SGF中，置37℃厌氧培养，分别在0h和3h时，取样测定OD600计算各菌种的存活率(％)。吸取经人工胃液处理3h后的菌液，接种于无菌的SIF中，静置于37℃厌氧培养，在0h，3h取样测定OD600。存活率＝A1/A0×100％
3、按照以上操作步骤对植物乳杆菌植物亚种CICC 20263，副干酪乳杆菌CICC20262，副干酪乳杆菌CICC 20273，副干酪乳杆菌JN-8和嗜酸乳杆菌CICC 22162进行胃肠液抗性实验。结果见表2，菌株JN-8的存活率大大高于其他菌株，显示出更强的胃肠液抗性。
表2乳酸菌落对人工胃肠液的耐受性结果
实施例3：菌株的对胆盐的耐受性实验
1、含胆盐的MRS培养基配置：胰蛋白胨10g；酵母粉5g；牛肉膏10g；葡萄糖20g；柠檬酸氢二胺2g；乙酸钠5g；K2HPO4·3H2O 2.6g；MgSO4·7H2O 0.2g；MnSO4·4H2O 0.05 g；吐温80 1mL，定容至1L。胆盐分别添加0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％和0.6％。
2、耐胆盐实验步骤：将乳酸菌按2％的接种量分别接种于含不同浓度胆盐的MRS液体培养基中，放置于37℃厌氧培养，24h分别测定OD600。
3、耐胆盐实验结果见表3，与其他菌株相比，JN-8展现出更强的耐胆盐特性见表3，与其他菌株相比，JN-8展现出更强的耐胆盐特性。
表3乳酸菌样品在含有不同浓度胆盐的培养基中培养16h的生物量
实施例2：
一种保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物的制备方法如下：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-8接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-8单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以3％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养22h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-8的菌体；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入10％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌JN-8的活菌数为1×109CFU/g；
(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉60份，多酚类化合物10份，维生素10份，混合，制成保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物。
实施例3：
一种保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物的制备方法如下：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-8接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-8单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以3％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-8的菌体；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入15％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌JN-8的活菌数为1×109CFU/g；
(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉60份，多酚类化合物15份，维生素25份，混合，制成保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物。
实施例4：
一种保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物的制备方法如下：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌JN-8接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-8单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以4％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养24h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌JN-8的菌体；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入15％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌JN-8的活菌数为1×1010CFU/g；
(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉70份，多酚类化合物20份，维生素10份，混合，制成保护酒精性肝损伤的副干酪乳杆菌JN-8菌粉组合物。
对比例1：
一种副干酪乳杆菌CICC 20262菌粉组合物的制备方法如下：
(1)菌种的活化：将副干酪乳杆菌CICC 20262接种量接种于MRS固体培养基中，37℃培养24h，获得菌株单菌落；
(2)初级种子液制备：挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌CICC 20262单菌落，接种于 MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到初级种子液；
(3)菌种的扩大培养：将初级种子液以4％的接种量接种于液体MRS培养基中，37℃厌氧培养20h，得到发酵液；
(4)菌体收集：将得到的发酵液4000rpm/min离心10min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体，重悬菌体，离心去上清，重复一次洗涤，得到副干酪乳杆菌CICC 20262的菌体；
(5)菌体冻干：向收集到的菌体中加入10％脱脂奶粉进行冷冻干燥，得到冻干菌粉；该冻干菌粉中副干酪乳杆菌CICC 20262的活菌数为1×109CFU/g；
(6)菌粉组合物制备：按照重量份的原料：冻干菌粉50份，多酚类化合物20份，维生素10份，混合，制成副干酪乳杆菌CICC 20262菌粉组合物。
试验例：
保护酒精性肝损伤的应用性能
1实验方案
C57BL/6小鼠，5～6周雄性，60只。
实施例1、实施例2、实施例3、对比例2的制得冻干菌粉组合物(由本单位生产)、无水乙醇。
将小鼠随机分成8组，每组10只，分为正常组、模型组、给药组1、给药组2、给药组3、给药组4分别对应着。分组及给药关系如表1所示。
表1分组及给药情况
小鼠在环境中适应7天。第1-7天正常饮食，正常组与模型组每天灌胃1g/mL生理盐水。给药组每天灌胃1g/mL本法明产品。再第7天模型组和给药组单次灌胃5g/kg b.w.的无水乙醇，禁食12后，进行麻醉后将小鼠脱颈处死，收集小鼠肝脏，血清，检测小鼠血清中的AST、ALT及肝脏中的GSH，GSH-Px及GST的水平。
2、实验结果
本实验测定了小鼠血清中肝功酶水平(AST、ALT)。由图1可知，与正常组想比，模型组小鼠血清中的AST和ALT的水平显著升高(p<0.001)。与模型组相比，经过本发明实施例1，2，3产品处理的小鼠血清中AST和ALT的水显著降低(p<0.05；p<0.01；p<0.001) 其中本发明实施例3产品处理组的效果最佳。然而经过本发明对比例1产品处理组与模型组相比不具有显著性。
进一步地，本实验检测了肝脏损伤指标GST及抗氧化指标GSH-Px及GSH的水平。结果如图2所示，与正常组相比，模型组中GST水平显著升高(p<0.001)，表明肝脏出现明显的损伤。经过本发明实施例1,2,3产品处理，GST水平较模型组相比显著降低(p<0.05；p<0.01；p<0.001)，其中本发明实施例3产品处理效果最佳。与正常组相比，抗氧化指标GSH-Px及GSH的水平在模型组中的水平显著降低(p<0.001)。与模型组相比，经过本发明实施例1,2,3产品处理，GSH-Px及GSH的水平显著升高，其中本发明实施例3产品处理效果最佳。本发明对比例1产品处理组小鼠肝脏中GSH-Px及GSH的水平有所升高，但与模型组相比不具有显著性。
综上，血清中相关指标的水平显示本法明产品显著降低酒精性肝损伤小鼠血清中AST、ALT的含量，降低酒精性肝损伤小鼠肝脏中GST的水平，减轻肝细胞损伤。肝脏中抗氧化指标的结果中也显示出本发明产品可显著增加GSH及GSH-Px的水平，说明本发明产品可以显著提高肝脏内抗氧化水平，恢复机体氧化与抗氧化间的平衡，保护酒精性肝损伤。以上结果说明本发明产品能够显著缓解酒精摄入造成的肝脏损伤，副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉具有显著保护酒精性肝损伤的效果，可以作为一种具有良好保护酒精性肝损伤效果的食品或药物。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种保护酒精性肝损伤组合物，其特征在于，所述的菌粉组合物包括副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)JN-8冻干菌粉、多酚类化合物和维生素，其中，所述的副干酪乳杆菌JN-8于2021年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22746。
2.根据权利要求1所述的保护酒精性肝损伤组合物，其特征在于，按重量份计，所述的菌粉组合物包括50～70份副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉、10～30份多酚类化合物和20～30份维生素。
3.根据权利要求2所述的保护酒精性肝损伤组合物，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉中活菌数不低于1×109CFU/g。
4.根据权利要求3所述的保护酒精性肝损伤组合物，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉中还包括占副干酪乳杆菌JN-8菌体质量10～20％的脱脂奶粉。
5.根据权利要求1所述的保护酒精性肝损伤组合物，其特征在于，所述的多酚类化合物为茶多酚、葡萄多酚、白藜芦醇、花青素中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的保护酒精性肝损伤组合物，其特征在于，所述的维生素为维生素C、维生素B6、维生素B12、维生素E、维生素A、维生素D、维生素D3、叶酸、维生素K中的一种或多种。
7.一种权利要求1～6任一项所述的保护酒精性肝损伤组合物的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)将所述的副干酪乳杆菌JN-8接种量接种于MRS固体培养基中，36～38℃培养36～48h，获得菌株单菌落；
(2)挑取固体培养基中的副干酪乳杆菌JN-8单菌落，接种于MRS液体培养基中，36～38℃厌氧培养20～24h，得到初级种子液；
(3)将初级种子液以4～5％的接种量接种于液体MRS培养基中，36～38℃厌氧培养20～24h，得到发酵液；
(4)将得到的发酵液3000～5000rpm/min离心10～15min，收集并洗涤菌体，得到副干酪乳杆菌JN-8菌体；
(5)向收集到的副干酪乳杆菌JN-8菌体进行冷冻干燥，得到所述的冻干菌粉；
(6)按照重量份的原料，将副干酪乳杆菌JN-8冻干菌粉、多酚类化合物和维生素混合，制成所述的保护酒精性肝损伤的菌粉组合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，脱脂奶粉的添加量为副干酪乳杆菌JN-8菌体质量的10～20％。
9.一种权利要求1～6任一项所述的菌粉组合物在制备治疗或预防酒精性肝损伤的产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的产品为药品。
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