CN115364036B

CN115364036B - 一种含有蜗牛发酵滤液的组合物及其应用

Info

Publication number: CN115364036B
Application number: CN202211057233.6A
Authority: CN
Inventors: 袁洪洁; 李恩秀; 魏茂林; 李亨载; 崔亨振
Original assignee: Shanghai Ruidian Biotechnology Co ltd; Hanfo Cosmetics Huzhou Co ltd
Current assignee: Shanghai Ruidian Biotechnology Co ltd; Hanfo Cosmetics Huzhou Co ltd
Priority date: 2022-08-31
Filing date: 2022-08-31
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2042-08-31
Also published as: CN115364036A

Abstract

本发明公开了一种含有蜗牛发酵滤液的组合物及其应用，涉及的是化妆品领域。本发明中通过将蜗牛发酵滤液与醇类助剂和水复配混合，制备得到组合物，该组合物稳定性好，活性强，具有优异的酪氨酸酶抑制作用，同时能够很好地清除自由基，达到良好的美白抗氧化效果，同时其还表现出优异的抑制刺激、抗敏舒缓修复功效，将其用于护肤品中实现了产品同时具有良好的美白效果抗氧化功效和强效抑制舒缓刺激。此外，本发明中得到的蜗牛发酵分泌滤液与未发酵的蜗牛黏液相比，能够大大提高蜗牛黏液的生物活性，而且发酵滤液中杂质少，安全性好。

Description

一种含有蜗牛发酵滤液的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及的是化妆品领域，A61K8/98，尤其涉及一种含有蜗牛发酵滤液的组合物及其应用。

背景技术

皮肤在环境中的暴露(紫外线辐射、污染、物理刺激、有毒化学品和其他有害物质)会导致接触性皮炎、痤疮、皮肤脱色、皮肤癌和其他急性和慢性皮肤损伤。敏感皮肤表现为皮肤易出现灼热、瘙痒、刺痛及紧绷感等主观症状，伴或不伴红斑、鳞屑以及毛细血管扩张等客观体征。近年来受敏感性皮肤问题困扰的人越来越多。导致肌肤敏感的因素有很多，比如紫外线照射引起的氧化应激反应，清洁类产品使用不当引起的皮肤脂质过度流失、皮肤屏障功能破坏以及空气污染、精神压力等，甚至季节的变换都能引起肌肤的敏感。敏感皮肤的机制涉及皮肤屏障、神经血管和免疫炎症的复杂过程。近年，探索天然原料成分作为舒缓剂的科学研究与日俱增。

蜗牛分原液含天然尿囊素、钙、甘醇酸、骨胶原、蛋白质和维生素等。作为化妆品使用有着悠久的历史。其中存在许多有益的天然化合物，例如糖蛋白和维生素，它们可以刺激胶原蛋白、弹性蛋白和真皮成分的形成，从而修复光老化的迹象并最大限度地减少自由基产生的损害。此外，蜗牛黏液还是一种天然抗生素，能够杀死皮肤上的某些细菌，保护皮肤免受病菌损害。如今，蜗牛因其伤口愈合和抗衰老特性而被广泛应用于食品和化妆品中。中国专利申请CN103860451B公开了一种含有蜗牛黏液提取物的功效性护肤品及制备方法，功效性护肤品包括蜗牛黏液提取物、功效性化妆品添加剂、甘油、透明质酸钠、PEG-100硬脂酸酯、水，蜗牛黏液提取物可用于辅助修护受损皮肤屏障，抗炎症、抗皮肤老化，对各种皮肤屏障受损相关的皮肤病具有良好的疗效及安全性。中国专利申请CN104042548B公开了一种蜗牛黏液提取物及其制备方法和在化妆品中的应用，将蜗牛黏加温加压后破碎提取，随后通过离心、微滤、超滤、纳滤得到提取液，提取液中包括硫酸软骨素、尿囊素、胶原蛋白、小分子多肽，有利于修复受损肌肤，促进愈合，加速细胞再生。

目前市场上常见的针对敏感性皮肤的产品多以舒缓皮肤炎症反应或修护皮肤屏障作为产品的功能，尚未有含有蜗牛发酵滤液的强效抑制舒缓刺激的化妆品的研究。此外，现有蜗牛粘液的制备技术中，天然的蜗牛黏液分泌量非常稀少，采集的原液中杂质较多；采用水煮方式制备的原液，在经过长时间高温处理后，部分有效成分招到破坏，大大限制了蜗牛粘液的广泛使用。因此开发一款以蜗牛粘液为抑制舒缓刺激的功效，也鲜有有效的临床数据和产品的研究。同时具有良好的美白效果和抗氧化功效的化妆品产品。

发明内容

为了解决上述问题，本发明第一方面提供了一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，按重量百分比计，制备原料包括：蜗牛发酵滤液10-25％、醇类助剂2-9％，去离子水添加余量。

所述蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：

S1.制备发酵滤液：将菌种的菌悬液在培养基中培养得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。

S2.制备蜗牛黏液：将收集到的蜗牛黏液离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。

S3.制备蜗牛发酵滤液：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液混合，并进行酶解反应，随后离心并收集上清液，即得。

优选地，所述蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：

S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在25-37℃，100-200rpm条件下培养19-21h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在25-37℃，100-230rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。

S2.制备蜗牛黏液：将收集到的蜗牛黏液经在3500rpm-5500rpm下离心5-15min并收集上清液，在冰箱中储存备用。

S3.制备蜗牛发酵滤液：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液混合，调节混合液体的pH，并进行酶解反应，随后在3500rpm-5500rpm下离心5-15min并收集上清液，即得。

S1中

在一些优选的实施方式中，所述菌种选自酵母菌、乳杆菌、米曲霉中的任意一种；优选为酵母菌；进一步优选为酿酒酵母菌。

在一些优选的实施方式中，所述菌悬液的浓度采用分光光度法测定，具体值为OD_600nm＝5.2-5.5。

在一些优选的实施方式中，所述培养基为YM培养基，具体配制方法为：将YM固体培养基取21.0g溶于1000mL去离子水中，调节pH至6.0-6.4，然后在121℃灭菌锅中灭菌15min，并在-4℃冰箱储存备用。

在一些优选的实施方式中，所述发酵液为MRS肉汤培养基，与培养基的营养物质相同，具体实施方式同培养基。

在一些优选的实施方式中，所述菌悬液与培养基的体积比为(150～230)μL：30mL；优选为200μL：30mL。

在一些优选的实施方式中，所述种子液的浓度通过紫外吸收光度法测定得到。优选地，所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.2-5.5。

在一些优选的实施方式中，所述种子液在接种到发酵液中时需要按照一定的接种量进行；优选地，所述接种量为280-220μL/30mL；进一步优选为200μL/30mL。

在一些优选的实施方式中，所述发酵时间为24-72h，因此，能够得到不同发酵时间段的发酵液(如图1所示)。

在一些优选的实施方式中，所述离心的转速为3500rpm-6000rpm，时间为5-20min；优选地，转速为4000-5000rpm，时间为10-15min；进一步优选地，转速为4200rpm，时间为10min。

S2中

在一些优选的实施方式中，所述蜗牛黏液的收集方法选自水煮收集、自然滴落收集、水洗收集中的任意一种。

在一些优选的实施方式中，所述水煮收集的具体操作为：将蜗牛清洗后放入到100℃的沸水中煮30min，收集水煮液即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为1号蜗牛黏液。

在一些优选的实施方式中，所述自然滴落收集的具体操作为：将蜗牛放入到清洗干净的容器中，使其自由爬行，然后收集器滴落的液体，即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为2号蜗牛黏液。

在一些优选的实施方式中，所述水洗收集的具体操作为：采用本司发明的多功能化妆品生产仪器，控制温度处于20-30℃，湿度为65-90％RH，每天喷洒温水两到三次，每次喷洒的时间为30min，收集最终的蜗牛水洗液，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为3号蜗牛黏液。

S3中

在一些优选的实施方式中，所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为(1-4)：1；优选为(1-3)：1。

在一些优选的实施方式中，所述混合液体的pH为5.0-6.5；优选为5.20-5.60。

在一些优选的实施方式中，所得进行酶解反应需要一定的温度，本发明中通过水浴锅实现；优选地，所述温度为50-60℃，酶解时间为3.5-4.5h；进一步优选地，温度为55℃，时间为4h。

通过不同的收集方法得到的蜗牛黏液在性能上具有很大的不同，而且酿酒酵母发酵液中具有丰富的多肽、多种维生素、丰富的矿物质和酶类。本申请人发现，将酿酒菌母菌发酵滤液与多种收集方法收集得到的蜗牛黏液按照(1-4)：1的体积比进行混合，能够使蜗牛黏液与发酵液充分接触，更有利于发酵反应的进行。特别是当pH为5.0-6.5，温度为50-60℃时，微生物发酵滤液中的酶的反应活性高，菌体生长和代谢速率加快，而且能够合理调整细胞膜的带电荷状况，促进微生物对营养物质的吸收以及代谢产物的分泌，进而加快了发酵反应的速率，酶解3.5-4.5h则能够使发酵反应完全，而且保证大幅度提高蜗牛发酵滤液中的生物活性，起到抑制酪氨酸酶、DPPH·自由基清除、抗敏舒缓等效果，同时还能维持酿酒酵母对有害微生物生长的抑制作用，增加多活性物质的保存效果。

在一些优选的实施方式中，所述醇类助剂选自乙醇、1,2-己二醇、1,3-丁二醇、苯甲醇、乙基己基甘油、三氯叔丁醇中的至少一种；优选地，所述醇类助剂至少包括1,2-己二醇和乙基己基甘油。

在一些优选的实施方式中，所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为(35-60)：1；优选为(40-60)：1；进一步优选为40：1。

优选地，所述醇类助剂还可以包括1,3-丁二醇。

在一些优选的实施方式中，所述1,2-己二醇、乙基己基甘油和1,3-丁二醇的重量比为(90-100)：(50-65)：1；优选为100：60：1。

本发明第二方面提供了一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用。

在一些优选的实施方式中，所述护肤品包括精华水、乳叶、精华液、乳霜、面膜中的任意一种。

在一些优选的实施方式中，所述护肤品为乳霜时，按重量百分比计，其制备原料包括：含有蜗牛发酵滤液的组合物5-35％、乳化剂2-8％、肌肤调理剂1-7％、柔润剂0.5-5％、增稠剂0.5-3％、抗菌剂0.1-1％、甘油3-8％、水添加至100％。

在一些优选的实施方式中，所述乳化剂选自聚甘油-10肉豆蔻酸酯、PEG-100硬脂酸酯、肉豆蔻基葡糖苷、失水山梨醇聚氧乙烯醚脂肪酸、鲸蜡硬脂醇聚醚-33、聚甘油酯、硬脂酸甘油酯中的至少一种；优选为PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-33。

在一些优选的实施方式中，所述PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-33的重量比为(1-2.5)：(2-3)；优选为2：3。

在一些优选的实施方式中，所述肌肤调理剂选自霍霍巴籽油、牛油果树果脂、油橄榄果油、椰子油、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯、芒果籽脂、向日葵籽油、椰油酸癸酯、甜扁桃油中的至少一种；优选为牛油果树果脂和椰子油。

在一些优选的实施方式中，所述牛油果树果脂和椰子油的重量比为(3.5-4.5)：1；优选为4：1。

在一些优选的实施方式中，所述柔润剂选自聚二甲基硅氧烷、环聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、油菜甾醇类、碳酸二辛酯、己二酸二丁酯、环己硅氧烷、鲸蜡硬酸酯醇中的至少一种；优选为聚二甲基硅氧烷和油菜甾醇类。

在一些优选的实施方式中，所述聚二甲基硅氧烷和油菜甾醇类的重量比为(2-4)：1；优选为4：1。

在一些优选的实施方式中，所述增稠剂选自聚丙烯酰胺、卡波姆、黄原胶、阿拉伯胶、季戊四醇二硬脂酸酯、羟乙基纤维素、桂醇聚醚-7、二甲基硅油、C13-14异链烷烃中的至少一种；优选为聚丙烯酰胺和黄原胶。

在一些优选的实施方式中，所述聚丙烯酰胺和黄原胶的重量比为(12-16)：1；优选为15：1。

在一些优选的实施方式中，所述抗菌剂选自苯氧乙醇、氯苯甘醚、苯甲醇、羟苯丙酯、乙基己基甘油、丙二醇、辛甘醇、辛酰羟肟酸、对羟基苯乙酮；优选为苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇。

在一些优选的实施方式中，所述苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇的重量比为(2.8-4)：(0.5-1)：1；优选为3：1：1。

在一些优选的实施方式中，所述护肤品的制备方法，包括：

(1)将乳化剂、肌肤调理剂、柔润剂混合后加热至80-90℃，得到混合物A；将水和甘油混合加热至80-90℃，得到混合物B；

(2)将增稠剂进行低温溶胀后加热至80-90℃，转移至配置锅中与混合物A和混合物B混合，预乳化8-15min，然后降温至70-75℃均质乳化3-5min，真空降温至50-60℃，搅拌2-3min，随后再次真空降温至45-50℃，均质2-3min，得到混合物C；

(3)于混合物C中加入抗菌剂和含有蜗牛发酵滤液的组合物，脱气并冷却，降温到35-40℃，放置陈化24h以上，灌装。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中通过将蜗牛发酵滤液与醇类助剂和水复配混合，制备得到组合物，该组合物稳定性好，活性强，具有优异的酪氨酸酶抑制作用，同时能够很好地清除自由基，达到良好的美白抗氧化效果，同时其还表现出优异的抑制刺激、抗敏舒缓修复功效，将其用于护肤品中实现了产品同时具有良好的美白效果抗氧化功效和强效抑制舒缓刺激。

(2)本发明中通过将酿酒酵母发酵滤液与蜗牛黏液按比例混合后在一定的温度、时间下进行酶解反应，获得蜗牛发酵分泌滤液，能够最大程度的保留了蜗牛黏液中的活性成分，避免有机溶剂的引入，安全环保，不需要添加酶等外来物质，直接应用微生物发酵滤液中的酶对蜗牛黏液进行酶解，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现人量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。

(3)本发明中得到的蜗牛发酵分泌滤液与未发酵的蜗牛黏液相比，能够大大提高蜗牛黏液的生物活性，而且发酵滤液中杂质少，安全性好。

(4)本发明中含有蜗牛发酵液的组合物的适配性好，能够与多种助剂协同作用，保持蜗牛黏液中的高活性，在实现美白、抗氧化、舒缓修护的同时，稳定性好，用于制备得到精华水、精华乳、面霜、乳霜、面膜等多种护肤品。

附图说明

图1蜗牛黏液接种酿酒酵母菌不同发酵时间后所得的发酵滤液

图2蜗牛发酵滤液组合物的制备工艺流程图

图3酪氨酸酶抑制率测试结果

图4 DPPH自由基清除率测试结果

图5 1号、2号、3号蜗牛黏液使用前后的皮肤表皮失水量变化(舒缓刺激)

图6 1号、2号、3号蜗牛黏液使用前后的皮肤红值变化(舒缓刺激)

图7实施例所得产品使用前后皮肤表皮失水量变化(舒缓刺激)

图8实施例所得产品使用前后皮肤红值变化(舒缓刺激)

图9 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品舒缓刺激皮肤图像

图10 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品使用前后皮肤表皮失水量变化(抑制刺激)

图11 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品使用前后皮肤红值变化(抑制刺激)

图12 1号、2号、3号蜗牛黏液及实施例所得产品抑制刺激皮肤图像

具体实施方式

实施例1

1、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，按重量百分比计，制备原料包括：蜗牛发酵滤液20％、醇类助剂8.05％，去离子水添加余量。

所述蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：

S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在28±1℃，150rpm条件下培养20h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在28±1℃，200rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。

S2.制备蜗牛黏液：将收集到的蜗牛黏液经在4200rpm下离心10min并收集上清液，在冰箱中-4℃储存备用。

S3.制备蜗牛发酵滤液：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液混合，调节混合液体的pH，并进行酶解反应，随后在4200rpm下离心10min并收集上清液，即得。

S1中

所述菌种为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，来至韩国瑞帝安生物科技有限公司)。

所述菌悬液的浓度采用分光光度法测定，具体值为OD_600nm＝5.3。

所述培养基为YM培养基，具体配制方法为：将YM固体培养基取21.0g溶于1000mL去离子水中，调节pH至6.0-6.4，然后在121℃灭菌锅中灭菌15min，并在-4℃冰箱储存备用。

所述发酵液为MRS肉汤培养基，与培养基的营养物质相同，具体实施方式同培养基。

所述菌悬液与培养基的体积比为200μL：30mL。

所述种子液的浓度通过紫外吸收光度法测定得到。

所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.40。

所述种子液在接种到发酵液中时接种量为200μL/30mL。

所述发酵时间为24h。

所述离心的转速为4200rpm，时间为10min。

S2中

所述蜗牛黏液的收集方法为自然滴落收集。

所述自然滴落收集的具体操作为：将蜗牛(中国河南洛阳的的光亮大蜗牛)放入到清洗干净的容器中，使其自由爬行，然后收集器滴落的液体，即得，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为2号蜗牛黏液。

S3中

所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为3：1。

所述混合液体的pH为5.56。

所得进行酶解反应的温度为55℃，时间为4h。

所示蜗牛发酵滤液的制备方法具体如图2所示。

所述醇类助剂为1,2-己二醇、乙基己基甘油和1,3-丁二醇。

所述1,2-己二醇、乙基己基甘油和1,3-丁二醇的重量比为100：60：1。

实施例2

1、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例1的不同之处在于：

S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在28±1℃，150rpm条件下培养19h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在28±1℃，200rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。

所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.28。

所述发酵时间为48h。

S3中

所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为1：1。

所述混合液体的pH为5.44。

实施例3

所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.30。

所述发酵时间为48h。

S2中

所述蜗牛黏液的收集方法为水洗收集(3号蜗牛黏液)。

所述水洗收集的具体操作为：采用本司发明的多功能化妆品生产仪器，控制温度处于20-30℃，湿度为65-90％RH，每天喷洒温水两到三次，每次喷洒的时间为30min，收集最终的蜗牛水洗液，并将其收集得到的蜗牛黏液标记为3号蜗牛黏液。

S3中

所述混合液体的pH为5.38。

实施例4

S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在28±1℃，150rpm条件下培养21h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在28±1℃，200rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用。

所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.40。

所述发酵时间为72h。

S2中

所述蜗牛黏液的收集方法为水洗收集(3号蜗牛黏液)。

S3中

所述混合液体的pH为5.42。

实施例5

按重量百分比计，所述含有由上述制备方法得到的蜗牛发酵滤液的组合物，包括：蜗牛发酵滤液10％、醇类助剂2.05％，去离子水添加余量至100％。

所述醇类助剂为1,2-己二醇和乙基己基甘油。

所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为40：1。

实施例6

1、一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，与实施例3的不同之处在于：

所述醇类助剂为1,2-己二醇和乙基己基甘油。

所述1,2-己二醇和乙基己基甘油的重量比为40：1。

实施例7

1、一种含有蜗牛黏液的组合物，与实施例1的不同之处在于：

所述蜗牛发酵滤液替换为蜗牛黏液(2号蜗牛黏液)。

实施例8

1、一种含有蜗牛黏液的组合物，与实施例7的不同之处在于：

所述蜗牛发酵滤液替换为蜗牛黏液(3号蜗牛黏液)。

实施例9

一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用。

所述护肤品为乳霜，按重量百分比计，其制备原料包括：含有蜗牛发酵滤液的组合物20％、乳化剂5.0％、肌肤调理剂5.0％、柔润剂2.5％、增稠剂1.6％、抗菌剂0.5％、甘油5.0％、水添加至100％。

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例1中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

所述乳化剂为PEG-100硬脂酸酯(CAS号：9004-99-3)和鲸蜡硬脂醇聚醚-33(CAS号：68439-49-6)。

所述PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醇聚醚-33的重量比为2：3。

所述肌肤调理剂为牛油果树果脂和椰子油(阿胡斯卡尔斯油脂(上海)有限公司，AAK)。

所述牛油果树果脂和椰子油的重量比为4：1。

所述柔润剂为聚二甲基硅氧烷(CAS号：9006-65-9)和油菜甾醇类(CAS号：474-60-2)。

所述聚二甲基硅氧烷和油菜甾醇类的重量比为4：1。

所述增稠剂为聚丙烯酰胺(CAS号：9003-05-8)和黄原胶(CAS号：11138-66-2)。

所述聚丙烯酰胺和黄原胶的重量比为15：1。

所述抗菌剂为苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇。

所述苯氧乙醇、乙基己基甘油和丙二醇的重量为3：1：1。

(1)将乳化剂、肌肤调理剂、柔润剂混合后加热至85℃，得到混合物A；将水和甘油混合加热至85℃，得到混合物B；

(2)将增稠剂进行低温溶胀后加热至85℃，转移至配置锅中与混合物A和混合物B混合，预乳化10min，然后降温至75℃均质乳化3min，真空降温至60℃，搅拌3min，随后再次真空降温至45℃，均质3min，得到混合物C；

(3)于混合物C中加入抗菌剂和含有蜗牛发酵滤液的组合物，脱气并冷却，降温到3538℃，放置陈化24h以上，灌装。

实施例10

一种含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，与实施例9的不同之处在于：

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例2中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

实施例11

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例3中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

实施例12

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例4中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

实施例13

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例5中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

实施例14

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例6中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

实施例15

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例7中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

实施例16

所述含有蜗牛发酵滤液的组合物为实施例8中所述含有蜗牛发酵滤液的组合物。

性能测试

1、理化性能：通过对1号蜗牛黏液、2号蜗牛黏液、3号蜗牛黏液极性理化分析，具体结果见表1。

表1 1号、2号、3号蜗牛黏液的理化性能测试结果

注：+++较厚重；++厚重；+溶液较稀

由表可知，三种方式制备的蜗牛黏液其理化特性存在显著差异，其中经过水煮的光亮大蜗牛所制备的蜗牛黏液物质干重及其粘度最大。

2、酪氨酸酶抑制率测定：对1号、2号、3号蜗牛黏液、实施例1-4所得组合物、实施例9-12、实施例15-16进行测试。

用开水将待测样品按照1/50(w/v)混合搅拌3min，然后，超声处理10min并置于冰浴上5min。将悬浮液在4000×g下，离心20min，收集上清液用于检测。并按照表2样品添加进行检测，以0.2mg/mL曲酸作为阳性对照，在475nm处测定吸光度，并按照下式计算酪氨酸酶抑制率，具体结果见图3。

表2样品加液要求

由图3可知，与蜗牛黏液相比，经过微生物发酵后的蜗牛黏液其酪氨酸酶抑制活性显著提高，将实施例1所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中酪氨酸抑制率为25.0％，将实施例2所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中酪氨酸抑制率为16.7％，将实施例3所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中酪氨酸抑制率为25.0％，将实施例4所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中酪氨酸抑制率为25.0％。可以证明，将其用于护肤品能够制备成为具有良好美白效果的化妆品。

3、DPPH自由基清除率测定：对1号、2号、3号蜗牛黏液、实施例1-4所得组合物、实施例9-12、实施例15-16进行测试。

以无水乙醇作为空白对照，检测Ai：2mL样品+2mLDPPH试剂；Aj：2mL样品+2mL无水乙醇；Ac：2mL无水乙醇+2mLDPPH试剂；将反应溶液混匀后避光反应30min，在吸光度517nm下检测，并按照计算公式计算DPPH自由基清除率，具体结果见图4。

由图4可知，将实施例1所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中DPPH自由基清除率为22.45％，将实施例2所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中DPPH自由基清除率为20.35％，将实施例3所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中DPPH自由基清除率为18.78％，将实施例4所得蜗牛发酵滤液的组合物用于护肤品中DPPH自由基清除率为18.30％。经过微生物发酵后的蜗牛黏液其DPPH自由基清除率显著提高，通过蜗牛发酵滤液的成品添加，产品具有良好的自由基清除能力。

经过对蜗牛发酵滤液产品的酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除能力的测定，说明蜗牛发酵滤液具有美白功效。

4、抑制舒缓刺激评价：对1号、2号、3号蜗牛黏液、实施例5、6、9、实施例13-16进行测试。

(1)皮肤刺激损伤

为确保达到相同损伤效果，针对男女皮肤的差异性，前期对不同浓度的十二烷基硫酸钠(SLS)进行男性/女性刺激，最后女性受试者选择采用1％浓度的SLS，男性受试者选择5％浓度作为研究刺激性接触性皮炎的经典模型。

(2)斑贴实验

刺激前，测试手前臂内侧划定区域内皮肤酸碱度pH值，经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。对手前臂内侧划定区域用质量分数1％，5％的SLS溶液做封闭型斑贴实验24h诱导红斑。24h后去除手臂上的斑试器，6h后测量前臂斑贴位的皮肤参数。

(3)功效测试

A、舒缓刺激：在试验规定时间内，受试者在前臂刺激部位，早晚使用测试产品。分别在使用测试产品后不同时间段测试手前臂斑贴部位皮肤参数，包括皮肤经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。

由图5和6结果分析可知，在经过SLS刺激损伤后，皮肤表皮失水量显著升高，皮肤红色值显著升高。在47h时，3号蜗牛黏液作用的皮肤表皮失水量和红值开始改善，其中蜗牛黏液1号和2号开始起效时间为55h，说明与其他两种方式相比，水煮所制备的蜗牛黏液舒缓修复效果较好。

由图7和8可知，与未发酵蜗牛黏液相比，蜗牛发酵滤液组合物及产品对人体皮肤已经产生的刺激具备显著的舒缓修复效果，如图9所示，使用后，蜗牛发酵滤液产品使用的皮肤产生的红值及经皮失水率方面修护性良好。摘掉斑贴器后6h，皮肤出现红斑并伴有红肿出现，用药23h后，由于产品所产生的修复功效，皮肤逐渐退红，红肿减弱，47h后皮肤的红斑现象显著改善，皮肤颜色变黄，皮肤变亮，逐渐恢复为正常肤色状态，119h后皮肤状态与正常皮肤状态接近，改善效果最为显著。

B、抑制刺激：将检测样品与一定浓度的(SLS)按照1：1的比例混匀，对受试者进行24h封闭型斑贴实验，测试揭掉斑贴器6h，48h后的皮肤参数。分别在使用测试产品后在规定时间测试手前臂斑贴部位皮肤参数，包括皮肤经表皮失水量，皮肤红色素含量以及皮肤图像拍摄。

由图10和11可知，与未发酵蜗牛黏液相比，蜗牛发酵滤液组合物及产品，在受到刺激时可有效降低刺激带来的皮肤红值提升和经皮失水率升高的问题。揭掉斑贴器6h、48h后的表皮失水量以及红值进行分析比较，由图12结果显示，样品6h时，红值达到最大值，但是经过48h后，红值降低，其中蜗牛发酵滤液和蜗牛发酵滤液成品添加产品使用的皮肤，红值下降显著；皮肤肤色变浅，与正常肤色相近，说明蜗牛发酵滤液产品具有良好的抑制刺激的作用。

Claims

1.一种含有蜗牛发酵滤液的组合物，其特征在于，按重量百分比计，制备原料包括：蜗牛发酵滤液10-25%、醇类助剂2-9%，去离子水添加余量；

所述蜗牛发酵滤液的制备方法，包括：

S1.制备发酵滤液：将传代至第二代的菌种的菌悬液加入到培养基中，在25-37℃，100-200rpm条件下培养19-21h得到种子液，随后将种子液接种到发酵液中在25-37℃，100-230rpm条件下进行发酵、离心并收集上清液，在冰箱中储存备用；

S2.制备蜗牛黏液：将收集到的蜗牛黏液经在3500rpm-5500rpm下离心5-15min并收集上清液，在冰箱中储存备用；

S3.制备蜗牛发酵滤液：将S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液混合，调节混合液体的pH，并进行酶解反应，随后在3500rpm-5500rpm下离心5-15min并收集上清液，即得；

所述菌种为酿酒酵母菌；

所述混合时S1制备得到的发酵滤液与S2得到的蜗牛黏液的体积比为（1-4）：1；

所述混合液体的pH为5.0-6.5；

所述酶解反应的温度为50-60℃，酶解时间为3.5-4.5h；

所述醇类助剂选自1,2-己二醇、1,3-丁二醇、乙基己基甘油；

S1步骤中，所述培养基为YM培养基，具体配制方法为：将YM固体培养基取21.0g溶于1000mL去离子水中，调节pH至6.0-6.4，然后在121℃灭菌锅中灭菌15min，并在-4℃冰箱储存备用；所述发酵液为MRS肉汤培养基；所述菌悬液与培养基的体积比为(150～230)μL：30mL；所述种子液的浓度在600nm下检测吸光光度值为5.2-5.5；所述种子液在接种到发酵液中时需要按照一定的接种量进行，所述接种量为200μL/30mL；

所述发酵时间为24-72h。

2.一种根据权利要求1所述的含有蜗牛发酵滤液的组合物在护肤品中的应用，其特征在于，所述护肤品包括精华水、乳液、精华液、乳霜、面膜中的任意一种。