CN115191588B - 一种抗疲劳提取物、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗疲劳提取物、制备方法及应用。在发芽处理时先利用氯化钾或氯化镁溶液处理干花生，并控制较高的浸泡温度，使其在较短时间内能提高脂肪酶活性；之后发芽过程中同样控制较高的发芽温度以及向花生表面喷洒氯化钾或氯化镁溶液，进一步维持花生中脂肪酶的活性，使其在较短的发芽时间内能够分解足够多的脂肪，降低花生中的脂肪含量；之后再利用黑曲霉进行发酵，黑曲霉发酵产生纤维素酶、蛋白酶等各种酶系，既能分解花生芽细胞壁，释放白藜芦醇，又能分解蛋白形成花生肽；与现有技术相比，可以得到白藜芦醇和花生肽含量较高的抗疲劳提取物。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗疲劳提取物、制备方法及应用。
背景技术
花生中含有大量的脂质、蛋白质、糖类等基本的营养物质，同时含有多种维生素、无机盐等，营养十分丰富。最为重要的，花生中还含有白藜芦醇，其具有抗疲劳的功效，这在其他杂粮中是少见的。植物蛋白肽是从花生、燕麦、小麦、大豆、玉米等蛋白质含量较丰富的植物果实中提取的一种活性肽物质，研究表明，许多植物蛋白肽具有缓解疲劳、提高肌肉力量及运动能力的效果；花生肽作为植物蛋白肽的一种，其也具有抗疲劳、抗氧化等多种生理活性。
因此，从花生中同时提取出白藜芦醇和花生肽，并将其用于抗疲劳产品的制备，是十分具有前景的研究方向；但目前的研究通常是将白藜芦醇和花生肽分别提取，例如申请号为201410423469.9，发明名称为从花生中提取白藜芦醇的方法公布了将花生粉碎后，利用乙醇萃取花生中的白藜芦醇的方式，现有技术还有利用纤维素酶酶解提取花生中白藜芦醇的报道；而对于花生肽的提取，申请号为200810236500.X，发明名称为花生肽营养品及其制备方法公布了利用酸性蛋白酶酶解花生肽的技术手段，申请号为200910069087.7，发明名称为微生物发酵法制备花生蛋白多肽的方法公布了利用链霉菌培养发酵，提取花生肽的技术手段，却少见从花生中同时提取白藜芦醇和花生肽的现有技术报道；这是因为白藜芦醇存在于花生细胞内，所以对其提取一般利用有机溶剂萃取或者利用细胞壁降解酶（如纤维素酶等）降解细胞壁得到；而花生肽作为一种小分子肽，是通过对花生中的大分子蛋白质降解成小分子得到的，其提取机理不同；因而提取白藜芦醇和花生肽时，需要分别提取，这无疑增加了工艺步骤，且前段提取工艺也会对后段提取工艺提取的有效成分造成损失，使得提取率降低，工艺不可控，因而目前比较少见。
发明内容
基于上述公布的技术问题，本发明的第一目的是得到一种抗疲劳提取物，其通过黑曲霉发酵花生得到，其主要有效成分是白藜芦醇和花生肽，且含量较高；本发明的第二目的是得到上述抗疲劳提取物的制备方法，通过对花生进行处理，在经黑曲霉发酵，使白藜芦醇和花生肽能够同时提取得到，缩短了工艺步骤，提高提取率；本发明的第三目的是提出上述抗疲劳提取物在制备抗疲劳产品中的应用，使得到的产品具备抗疲劳功效。
本发明的第一个技术方案为：
一种抗疲劳提取物，所述提取物的提取步骤包含经氯化钾或氯化镁溶液浸泡处理、避光静置发芽处理、黑曲霉发酵处理步骤；
进一步的，所述浸泡温度为35-45℃，浸泡时间为20-24h；所述避光静置温度为35-45℃，静置时间为40-48h；所述发酵温度为25-35℃，发酵时间为8-10d。
本发明的第二个技术方案为：
一种抗疲劳提取物的制备方法，包括：
干花生发芽处理得到花生芽；
发酵花生芽得到发酵浆料；
发酵浆料料液分离取液体即为抗疲劳提取物；
进一步的，所述发芽处理包括将干花生利用浸泡液浸泡以及浸泡后的花生避光静置发芽两个步骤；所述发酵花生芽包括将花生芽破碎以及利用黑曲霉发酵破碎花生芽两个步骤；
进一步的，所述浸泡的浸泡液为氯化钾或氯化镁溶液；所述避光静置还包括每隔10h-12h向花生表面喷洒权利要求2所述浸泡液；所述发酵的黑曲霉添加量为干花生重量的2%-5%；
进一步的，所述浸泡温度为35-45℃，浸泡时间为20-24h；所述避光静置温度为35-45℃，浸泡时间为40-48℃；所述发酵温度为25-35℃，发酵时间为8-10d；
进一步的，所述浸泡液浓度为2×10-9mol /L至8×10-9mol /L；
进一步的，所述料液分离得到所述液体后还包括对所述液体进行灭菌处理。
本发明还得到了一种根据上述任一制备方法制备得到的抗疲劳提取物。
本发明还得到了一种上述抗疲劳提取物的应用，包括将所述抗疲劳提取物作为辅料添加于食品中，获得抗疲劳产品。
本发明具有如下有益效果：
本发明在发芽处理时先利用氯化钾或氯化镁溶液处理干花生，并控制较高的浸泡温度，使其在较短时间内能提高脂肪酶活性；之后发芽过程中同样控制较高的发芽温度以及向花生表面喷洒氯化钾或氯化镁溶液，进一步维持花生中脂肪酶的活性，使其在较短的发芽时间内能够分解足够多的脂肪，降低花生中的脂肪含量；之后再利用黑曲霉进行发酵，黑曲霉发酵产生纤维素酶、蛋白酶等各种酶系，既能分解花生芽细胞壁，释放白藜芦醇，又能分解蛋白形成花生肽；与现有技术相比，可以得到白藜芦醇和花生肽含量较高的抗疲劳提取物。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为本发明保护范围的限制。该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整。
本发明的第一个实施例提供了一种抗疲劳提取物，所述提取物的提取步骤包含经氯化钾或氯化镁溶液浸泡处理、避光静置发芽处理、黑曲霉发酵处理步骤；所述浸泡温度为35-45℃，浸泡时间为20-24h；所述避光静置温度为35-45℃，静置时间为40-48h；所述发酵温度为25-35℃，发酵时间为8-10d。
在本实施例中，采用氯化钾或氯化镁溶液处理的目的是活化花生中的脂肪酶；使后续避光静置发芽时能有更多的脂肪被分解；同时，温度的设置以及静置发芽时喷洒浸泡液也是为了使脂肪酶在发芽时保持活性，在此温度下，脂肪酶能保持较佳的活性，低于此温度范围，脂肪酶活性降低；另一方面，整个浸泡和发芽总时间不能超过72h，高于72h，这是因为花生中蛋白质分解成氨基酸是一个过程，大分子蛋白质会在发芽初期分解成多肽，之后再分解成小分子氨基酸；而本申请发芽的目的是尽可能多的得到多肽而非氨基酸，因为花生肽是由蛋白质分解成的小分子肽，而蛋白质先一步变成氨基酸则蛋白酶无法使氨基酸变成花生肽；多肽的分子量大于花生肽而小于蛋白质，使蛋白酶能快速酶解其成为花生肽，而发芽时间高于72h，花生发芽从准备阶段变为发芽阶段，会迅速分解蛋白质和多肽形成氨基酸，从而达不到生成花生肽的效果。
在本实施例中，采用黑曲霉发酵处理是因为黑曲霉发酵会产生纤维素酶、蛋白酶等丰富的酶系，可以同时满足酶解花生细胞壁得到白藜芦醇以及酶解蛋白质和多肽形成花生肽的要求，但是，黑曲霉一般用于酒类发酵和酱类发酵，作为酒类发酵原料的大麦、小麦的脂肪含量一般在2%-8%左右，作为酱类发酵原料的黄豆的脂肪含量也一般低于20%，而花生中脂肪含量达到了50%-55%，因而直接利用花生原料进行发酵会由于脂肪含量过高对黑曲霉的活性造成影响；另一方面，花生蛋白为大分子蛋白，黑曲霉发酵产生的蛋白酶难以将其酶解完全；因而本发明在花生发芽过程中采用浸泡液浸泡以及发芽处理分解花生中的脂肪以及使蛋白质分解成多肽的最终目的是为了给黑曲霉提供有利的发酵条件，同时尽可能使蛋白质分解成多肽有利于蛋白酶的酶解，增加提取物的提取率。
本发明的第二个实施例提供一种抗疲劳提取物的制备方法，包括：干花生发芽处理得到花生芽；发酵花生芽得到发酵浆料；发酵浆料料液分离取液体即为抗疲劳提取物；
在本实施例中，发芽步骤包括将干花生利用浸泡液浸泡以及浸泡后的花生避光静置发芽两个步骤；所述发酵花生芽包括将花生芽破碎以及利用黑曲霉发酵破碎花生芽两个步骤；所述浸泡的浸泡液为氯化钾或氯化镁溶液；所述避光静置还包括每隔10h-12h向花生表面喷洒权利要求2所述浸泡液。
其中，发芽处理的目的是为了降低花生中的脂肪含量以及分解部分蛋白质为多肽，为后续黑曲霉发酵提供条件；这是由于花生中脂肪含量达到了50%-55%，而在黑曲霉的一般发酵环境中，黑曲霉发发酵物料中脂肪含量不超过30%，因而，需要通过前期处理使花生中脂肪含量降低到30%以下，而现有技术中直接对花生进行发酵，其脂肪含量得到30%以下一般在发芽7d左右，但此时花生中的蛋白质大部分会被分解成氨基酸而并非多肽，从而降低花生肽的生成量；因此，本发明采用氯化钾或氯化镁溶液活化花生中的脂肪酶，并通过控制较高的发芽温度维持酶的活性，使得花生中脂肪在72h内降低至30%以下，此时花生中的蛋白质属于准备阶段，蛋白质大部分被分解成多肽，还未从多肽分解成氨基酸，因而，蛋白酶可以分解蛋白质或多肽形成花生肽，从而保证花生肽的提取率。
在本实施例中，所述浸泡液的量为能研磨干花生为宜。
在一些具体实施例中，所述发酵的黑曲霉添加量为干花生重量的2%-5%；黑曲霉为市售黑曲霉，本申请中所用的黑曲霉为黑曲霉3.4309。
本实施例中所述浸泡温度为35-45℃，浸泡时间为20-24h；所述避光静置温度为35-45℃，浸泡时间为40-48℃；所述发酵温度为25-35℃，发酵时间为8-10d；现有技术中一般不会明确规定花生芽的生长温度，按一般理解应为室温，但是现有技术所公布的花生芽发芽方式仅仅是为了花生发芽，而本申请主要是为了能够消耗更多的脂肪以及得到更多的多肽，同时防止多肽分解成氨基酸；因而，在此温度和时间下能使花生的脂肪含量达到30%以下；同时蛋白质的分解处于准备阶段，多肽的储备量增多，但还没有完全分解成小分子氨基酸。
在一些具体实施例中，所述浸泡液浓度为2×10-9mol /L至8×10-9mol /L；
在一些具体实施例中，所述料液分离得到所述液体后还包括对所述液体进行灭菌处理；所述灭菌处理为常规灭菌处理，例如巴氏杀菌、高压蒸汽灭菌等，由于白藜芦醇和花生肽均耐高温，因而常规灭菌处理不会对其成分造成影响。
本发明的第三个实施例提供了一种抗疲劳提取物的应用，包括将所述抗疲劳提取物作为辅料添加于食品中，获得抗疲劳产品。由于此抗疲劳提取物的状态为液体，因此，其可以很容易作为辅料添加与食品中，替代部分水做成饼干、糖果、饮料等即食食品，而由于其有效成分白藜芦醇和花生肽均较为稳定，因而，其作为加工辅料并不会影响提取物中有效成分的性质。
本发明的第四个实施例考查了花生发芽过程中不同处理方式对花生中脂肪、蛋白质、多肽、游离氨基酸含量的影响，拟为本申请发芽处理提供依据。
试验方法：设施实验组1，试验例1处理花生的方法为：将干花生置于浓度为4×10- 9mol /L的氯化钾溶液中，40℃浸泡22h，之后对花生进行避光静置处理，静置温度为40℃，静置时间为44h，期间每隔10h向花生表面喷洒浓度为4×10-9mol /L的氯化钾溶液，得到花生芽。
实验组2：处理方法同实验组1，只是将氯化钾溶替换为氯化镁溶液。
对照组1：处理方式同实验组1，只是利用清水浸泡。
对照组2：处理方式同实验组1，只是浸泡温度和静置温度均为25℃。
对照组3：处理方式同实验组1，只是浸泡时间为22h，静置时间为72h。
本试验中所采用的花生的品种为百日红。
测试项目：粗脂肪含量的测试采用索氏抽提法；粗蛋白的测试采用凯氏定氮法；游离氨基酸的测试采用茚三酮法；多肽的测试采用唐军涛在《发芽大豆多肽富集工艺及富肽豆乳开发研究》中的测试方法 ：取5.0g样品，以0.2mol/L 的磷酸缓冲液(pH 7.0)研磨并定容至50mL，静置2h后，10000r/min离心15min，取3mL无脂上清液，加3mL 10%的三氯乙酸(TCA)沉淀上清液中的蛋白质；涡旋混匀并静置10min后，离心(同前)；取3mL上清液，加2mL双缩脲试剂，涡旋混匀后静置10min，离心(同前)，以还原性谷胱甘肽为标准品，测定上清液的A540nm来计算多肽含量。实验重复3次，所得结果均以干基质量表示。
测试结果：见表1：花生芽中营养成分分析。
表1：花生中营养成分分析
。
根据测试结果可知，不利用浸泡液浸泡或者降低发芽温度，花生中脂肪含量在40%以上（对照组1、对照组2），此时花生中粗蛋白、游离氨基酸、多肽含量变化不大，延长发芽时间虽然脂肪含量进一步下降，但是游离氨基酸含量增多这表明延长发芽时间之后蛋白质转化为游离氨基酸的量增加，此时进行发酵，花生肽的提取率将会降低。
下面通过具体实施例验证本发明制得的抗疲劳提取物的含量及相关提取效果。
实施例1 制备抗疲劳提取物
1.采用百日红花生品种，取干花生浸泡于浓度为6×10-9mol /L的氯化钾溶液中，溶液没过干花生，于40℃浸泡22h，之后将花生捞出，避光静置44h，静置温度为40℃，其中，每镉10h向花生表面喷洒浓度为6×10-9mol /L的氯化钾溶液，得到花生芽；
2.将花生芽粉碎，向其中加入干花生重量3%的黑曲霉3.4309混合发酵，发酵温度为30℃发酵时间为9d，得到花生浆料；
3.将花生浆料料液分离后取液体进行高压蒸汽灭菌，得到抗疲劳提取物。
实施例2 制备抗疲劳提取物
1.采用百日红花生品种，取干花生浸泡于浓度为2×10-9mol /L的氯化镁溶液中，溶液没过干花生，于35℃浸泡20h，之后将花生捞出，避光静置40h，静置温度为35℃，其中，每隔10h向花生表面喷洒浓度为2×10-9mol /L的氯化镁溶液，得到花生芽；
2.将花生芽粉碎，向其中加入干花生重量2%的黑曲霉3.4309混合发酵，发酵温度为25℃发酵时间为8d，得到花生浆料；
3.将花生浆料料液分离后取液体进行高压蒸汽灭菌，得到抗疲劳提取物。
实施例3 制备抗疲劳提取物
1.采用百日红花生品种，取干花生浸泡于浓度为8×10-9mol /L的氯化镁溶液中，溶液没过干花生，于45℃浸泡24h，之后将花生捞出，避光静置48h，静置温度为45℃，其中，每隔12h向花生表面喷洒浓度为8×10-9mol /L的氯化镁溶液，得到花生芽；
2.将花生芽粉碎，向其中加入干花生重量5%的黑曲霉3.4309混合发酵，发酵温度为35℃发酵时间为10d，得到花生浆料；
3.将花生浆料料液分离后取液体进行高压蒸汽灭菌，得到抗疲劳提取物。
对比例1 制备抗疲劳提取物
制备方法同实施例1，不同之处在于，对比例1采用室温（25℃）对花生进行浸泡和避光静置处理。
对比例2 制备抗疲劳提取物
制备方法同实施例1，不同之处在于，对比例2用清水替代氯化钾溶液对干花生进行浸泡。
对比例3 制备抗疲劳提取物
制备方法同实施例1，不同之处在于，对比例3将花生芽超微粉碎过滤，得到抗疲劳提取物。
对比例4 制备抗疲劳提取物
制备方法同实施例1，不同之处在于，对比例1避光静置时间为72h。
试验例1 提取物中有效成分测定
本申请采用氯化钾或氯化镁溶液作为浸泡液浸泡花生，并进行发芽处理，并通过控制温度和时间，使花生中脂肪含量下降至30%以下，同时保证适量的多肽转化；之后再利用黑曲霉进行发酵，黑曲霉产生的纤维素酶和蛋白酶等多种酶系能同时酶解花生细胞壁以及分解蛋白质和多肽，从而同时获得白藜芦醇和花生肽两种抗疲劳物质。本试验例通过测试实施例1-3、对比例1-4中白藜芦醇和花生肽的含量，来分析不同处理方式对提取物中抗疲劳成分提取率的影响。
测试方法：白藜芦醇含量按《GB/T 24903-2010 粮油检验 花生中白藜芦醇的测定高效液相色谱法》测定，只是取消对花生预处理的操作步骤（本申请提取物为液体）。
花生肽按BCA法进行测定（按索莱宝生物科技有限公司BCA试剂盒说明书方法测定）：其测定原理是：碱性条件下，蛋白质可将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂（2,2－联喹啉－4,4－二甲酸二钠）形成紫色络合物，其在562 nm处有最大吸收。将待测样品的测定吸光度与标准蛋白（如牛血清白蛋白）的标准曲线相对比，可计算得到待测样品中花生短肽质量浓度。
测试结果：见表2。
结果分析：由表2可知，采用本申请公布的制备方法制备的抗疲劳提取物（实施例1-3）中白藜芦醇含量在160μg/100g左右，花生肽含量在38 mg/mL以上；实施例1与对比例1（室温浸泡和避光处理）相比，白藜芦醇和花生肽含量均有所下降，这是由于室温浸泡和避光处理条件下，发芽过程中花生脂肪酶的活性不如高温处理，因而发芽结束后花生中脂肪含量在30%以上，会抑制黑曲霉的发酵活力，从而影响黑曲霉产生代谢产物纤维素酶蛋白酶等的数量和活性，导致从花生中提取出的白藜芦醇和花生肽含量下降；实施例1与对比例2（用清水替代浸泡液）相比，白藜芦醇和花生肽含量下降明显，这也是由于清水对于花生中脂肪酶的促进作用不明显，导致发芽结束后花生中脂肪含量过高抑制黑曲霉发酵所致；实施例1与对比例3（将花生芽直接超微粉碎得到提取物）相比，又有没有经过黑曲霉发酵，花生芽中白藜芦醇和花生肽不能很好的溶出，因而含量较少；实施例1与对比例4（避光静置时间72h）相比，花生肽含量下降明显，这是由于发芽时间过长，花生中蛋白质酶解变成游离氨基酸的量增加，而游离氨基酸作为最小的分子不能再水解成蛋白肽，因而造成花生肽总量变少。
表2 有效成分测试结果
。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；例如本实施例中使用的花生品种为百日红，并不代表利用其他花生品种并不能达到本申请所述技术效果，尽管不同品种花生在营养物质上存在差异，但是那只是花生本身量的差异，并不代表不同品种的花生通过本申请技术方案后有效成分的变化趋势会存在差异；同理本申请实施例所利用的黑曲霉为黑曲霉3.4309，并不代表其他黑曲霉的变化趋势会存在差异。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (3)
1.一种抗疲劳提取物的制备方法，其特征在于，包括：
干花生发芽处理得到花生芽；
发酵花生芽得到发酵浆料；
发酵浆料料液分离取液体即为抗疲劳提取物；
所述发芽处理包括将干花生利用浸泡液浸泡以及浸泡后的花生避光静置发芽两个步骤；所述发酵花生芽包括将花生芽破碎以及利用黑曲霉发酵破碎花生芽两个步骤；
所述浸泡液为氯化钾或氯化镁溶液；所述避光静置还包括每隔10h-12h向花生表面喷洒浸泡液；所述黑曲霉的添加量为干花生重量的2%-5%；
所述浸泡温度为35-45℃，浸泡时间为20-24h；所述避光静置温度为35-45℃，静置时间为40-48h；所述发酵温度为25-35℃，发酵时间为8-10d；
所述浸泡液浓度为2×10-9mol/L至8×10-9mol/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述料液分离得到所述液体后还包括对所述液体进行灭菌处理。
3.一种根据权利要求1-2任一制备方法制备得到的抗疲劳提取物。
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