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CN115176010A - 用于调节cd73外显子7剪接的寡核苷酸 - Google Patents

用于调节cd73外显子7剪接的寡核苷酸 Download PDF

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CN115176010A
CN115176010A CN202180017413.9A CN202180017413A CN115176010A CN 115176010 A CN115176010 A CN 115176010A CN 202180017413 A CN202180017413 A CN 202180017413A CN 115176010 A CN115176010 A CN 115176010A
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dna
oligonucleotide
mammalian
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CN202180017413.9A
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M·A·延森
L·琼森
G·荔枝
J·维克萨
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Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明涉及与哺乳动物CD73(NT5E)前体mRNA互补的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸能够调节哺乳动物CD73前体mRNA外显子7的剪接。哺乳动物CD73外显子7的剪接调节有利于一系列医学病症，包括免疫肿瘤学领域的病症。

Description

用于调节CD73外显子7剪接的寡核苷酸
技术领域
本发明涉及与哺乳动物CD73(NT5E)前体mRNA互补的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸能够调节哺乳动物CD73前体mRNA外显子7的剪接。哺乳动物CD73外显子7的剪接调节有利于一系列医学病症，包括免疫肿瘤学领域的病症。
背景技术
CD73是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞外膜蛋白。其作为同二聚体发挥作用，并具有负责将一磷酸腺苷(AMP)水解为腺苷(Ado)和游离磷酸(Pi)的细胞外胞外5′-核苷酸酶活性。CD73在多种组织和细胞类型(包括免疫细胞、内皮细胞和癌细胞)中广泛表达(Resta等人，1993；Snider等人，2014)。高水平Ado的产生是与癌症免疫逃避相关的机制之一。快速增殖细胞的显著特征在于细胞凋亡频率增加，除其他事件外，这会导致肿瘤微环境(TME)中三磷酸腺苷(ATP)的释放(Silva-Vilches等人，2018)。TME中所发现的局部ATP浓度升高有助于产生促炎环境，其继而增强不同免疫细胞的抗癌功能。ATP向Ado的转化由CD39和CD73的连续活性催化。与由细胞外ATP活化的分子信号传导相反，由CD39/CD73轴产生的Ado引发对树突状细胞活化、细胞因子生产和T细胞增殖的抑制。Ado通过活化G蛋白偶联腺苷受体A2AR发挥其免疫抑制作用(Fredholm等人，2001；de Andrade Mello等人，2017)。此外，几种癌症类型的特征在于CD73表达上调，且这一特征与预后不良相关(Loi等人，2013；Leclerc等人，2016)。
先前的一项研究(Snider等人.2014)已报告缺乏外显子7的CD73同种型(CD73 Δ7)具有显性阴性功能。CD73二聚体-其中一个或两个亚基由CD73 Δ7组成-显示蛋白质稳定性显著降低。由CD73 Δ7诱导的蛋白酶体加速降解已被确定为驱动总体CD73蛋白水平降低的机制。此外，含有至少一个Δ7亚基的CD73二聚体已被证明是催化非活性的。
剪接转换寡核苷酸已被开发为用于治疗与异常前体mRNA剪接相关的疾病的治疗剂，如
Figure BDA0003818417890000021
一种2’-O-MOE反义寡核苷酸，其纠正SMN1前体mRNA致病等位基因中的外显子7剪接且经批准用于治疗脊髓性肌萎缩症。关于剪接转换反义寡核苷酸作为治疗药物的综述，参见Havens等人。
本发明人已鉴别出人CD73前体mRNA上的反义寡核苷酸靶位点，其使得CD73剪接调节能够引起CD73外显子7消除，并提供CD73 Δ7(即不包含CD73外显子7的CD73 mRNA)的有效产生，以用于治疗免疫肿瘤学领域的疾病。
发明目的
本发明鉴别新颖哺乳动物CD73前体mRNA靶位点和靶向所述靶位点的反义寡核苷酸(ASO)，其中反义寡核苷酸调节哺乳动物CD73前体mRNA的剪接。有利地，哺乳动物CD73前体mRNA剪接的调节导致产生外显子7缺失型CD73 mRNA(CD73 Δ7)，以及表达缺乏部分或全部CD73外显子7编码多肽的CD73多肽。
如本文所描述的反义寡核苷酸可用于治疗如本文所公开的免疫肿瘤学领域的病症，特别是选自以下项组成的组的疾病：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌(merkel-cell cancer)、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
发明内容
本发明提供与CD73核酸互补并且能够调节CD73核酸表达的反义寡核苷酸，及其在医药中的用途。
在一个方面，本文提供一种靶向哺乳动物CD73前体mRNA的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸调节所述哺乳动物CD73前体mRNA的剪接，并且包含至少10个核苷酸长度的与所述哺乳动物CD73前体mRNA具有至少90％互补性，如100％互补性的连续核苷酸序列。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够增强外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的表达。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够减少WT哺乳动物CD73 mRNA的表达。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够增强外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的表达且能够减少WT哺乳动物CD73 mRNA的表达。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的长度为10-40个，如10-25个、如15-20个核苷酸。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与SEQID NO：1互补，如完全互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与SEQ ID NO：6互补，如完全互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：93-174组成的组的序列互补，如完全互补。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸为或包含反义寡核苷酸混聚物(mixmer)或全聚物(totalmer)。在一个实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的长度为10-20个核苷酸。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸的所述连续核苷酸序列由选自SEQ ID NO：7-88中之任一个的序列组成或包含其。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸由本文提供的寡核苷酸组成或包含其，如选自由ASO ID NO：ASO-1-ASO-82中之任一个组成的组的反义寡核苷酸。
在一个方面，本文提供一种缀合物，其包含本发明的反义寡核苷酸和与所述反义寡核苷酸共价连接的至少一个缀合物部分。
在一个方面，本文提供一种本发明的反义寡核苷酸或缀合物的药用盐。
在一个方面，本文提供一种药物组合物，其包含本发明的反义寡核苷酸或缀合物以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
在一个方面，本文提供一种用于在表达哺乳动物CD73的靶细胞中调节哺乳动物CD73前体mRNA的剪接的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的本发明的反义寡核苷酸、或缀合物、或药用盐或药物组合物。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸的施用引起外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的增强表达。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸的施用引起WT哺乳动物CD73 mRNA的减少表达。在一个实施方案中，所述反义寡核苷酸的施用引起外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的增强表达及WT哺乳动物CD73 mRNA的减少表达。在一个实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞为人细胞。在一个实施方案中，哺乳动物CD73 mRNA为人CD73 mRNA。
在一个方面，本文提供一种用于治疗或预防癌症的方法，其包括向罹患或易患癌症的受试者施用治疗上或预防上有效量的本发明的反义寡核苷酸、或缀合物、或药用盐或药物组合物，所述癌症如选自由以下项组成的组的癌症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
在一个方面，本文提供本发明的反义寡核苷酸、或缀合物、或药用盐、或药物组合物，其用作药物。
在一个方面，本文提供本发明的反义寡核苷酸、或缀合物、或药用盐、或药物组合物，其用于治疗癌症，如选自由以下项组成的组的癌症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
在一个方面，本文提供本发明的反义寡核苷酸、或缀合物、或药用盐、或药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途，所述癌症如选自由以下项组成的组的癌症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
序列表
与本申请一起提交的序列表通过引用并入本文。如果序列表与本说明书或附图不一致，本说明书(包括附图)中所公开的信息应视为正确。应理解，关于靶核酸或靶序列或靶位点，本文公开的序列是指衍生自基因组的DNA序列或cDNA序列，并在体外或体内作为细胞中核酸的代表提供，其可例如为RNA分子(例如，在RNA靶序列中，尿嘧啶(U)代替所附DNA序列中所示的胸腺嘧啶(T)而存在)。如SEQ ID NO：6的靶区域或如SEQ ID NO：93-174的靶序列包括来自参考靶序列的RNA序列(如SEQ ID NO：1或其天然存在的变体)。
CD73参考序列
表1
Figure BDA0003818417890000051
本文提供的反义寡核苷酸拼接的靶CD73前体mRNA序列
SEQ ID NO：6(小写字母描绘内含子区域；大写字母描绘外显子7区域)：
gcattttctcaagctattttccttcttgcctcatctgtgactaccctcagGCACAATTACCTGGGAGAACCTGGCTGCTGTATTGCCCTTTGGAGGCACATTTGACCTAGTCCAGTTAAAAGGTTCCACCCTGAAGAAGGCCTTTGAGCATAGCGTGCACCGCTACGGCCAGTCCACTGGAGAGTTCCTGCAGGTGGGCGgtaagtcacccatcctgtagggctggcccatccaaagtgacatggcattt
人CD73前体mRNA的示例性外显子和内含子区域-如参考SEQ IDNO：1所示
表2
外显子 起始_SEQ ID NO：1 结束_SEQ ID NO：1
Ex_1 508 895
Ex_2 17477 17699
Ex_3 21654 21842
Ex_4 35652 35849
Ex_5 37752 37906
Ex_6 39911 40016
Ex_7 40925 41074
Ex_8 42394 42594
Ex_9 44258 46195
表3
内含子 起始_SEQ ID NO：1 结束_SEQ ID NO：1
Int_1 896 17476
Int_2 17700 21653
Int_3 21843 35651
Int_4 35850 37751
Int_5 37907 39910
Int_6 40017 40924
Int_7 41075 42393
Int_8 42595 44257
因此，CD73 Δ7 mRNA缺失外显子7区域，如SEQ ID NO：1中的核苷酸40925-41074或其至少一部分所例示。在一些实施方案中，整个外显子7在CD73 Δ7 mRNA中缺失，且因此在一些实施方案中，CD73 Δ7 mRNA的特征可在于具有跨外显子6和外显子8所形成的连续序列。在一些实施方案中，CD73 Δ7 mRNA包含外显子1至6、8和9，但缺失外显子7。
附图说明
图1A-B：筛选82个混聚物ASO的CD73外显子7跳跃活性。图1A：A549和Colo205细胞用5μM的反义ASO处理4天。图1B：A549和Colo205细胞用25μM的反义ASO处理4天。外显子7跳跃(exS)水平经指示为总CD73 mRNA的百分比。指示A549和Colo205细胞中ASO活性的皮尔逊相关系数(r)。空心圆代表靶向CD73 RNA的ASO，实心圆代表加扰控制ASO。
图2：ASO-52和ASO-15以剂量依赖性方式诱导CD73 Δ7。Colo205细胞用不同浓度的指定ASO处理4天(n＝2)。CD73 Δ7的水平经指示为总CD73 mRNA的百分比。
图3：ASO-52和ASO-15对CD73 Δ7的诱导以剂量依赖性方式降低细胞外5′胞外核苷酸酶活性。Colo205细胞用不同浓度的指定ASO处理4天。CD73的细胞外活性经测量为由AMP水解产生的游离磷酸盐(n＝2)。背景水平对应于在不存在AMP的情况下在经PBS处理的细胞中测量的游离磷酸盐水平。
图4A-B：ASO-52和ASO-15降低CD73蛋白水平。图4A：Colo205细胞用25μM的反义ASO处理4天。通过对全细胞裂解物进行免疫印迹来定量CD73蛋白水平。GAPDH水平用作内部标准化水平。图4B：对用25μM反义ASO处理4天的Colo205细胞进行光密度分析。(n＝3)。学生t检验*p＜0.05，且误差条指示±SD。
图5：剪接转换ASO(ASO-52和ASO-15)和现有技术的抗CD73缺口聚物(ASO-83和ASO-84)以相似的效力减少细胞外5′胞外核苷酸酶(n＝2)。
图6：剪接转换ASO(ASO-52和ASO-15)不诱导胱天蛋白酶3活化。处理Colo205细胞，并且在4天后测量胱天蛋白酶3活性和细胞活力，并将对照(未处理)样品的比率设为1(n＝3)。
图7A-B：剪接转换ASO(ASO-15和ASO-52)显示出优于现有技术的抗CD73缺口聚物(ASO-83和ASO-84)的靶特异性。图7A：如通过RNA测序测定的剪接转换ASO(ASO-15和ASO-52)和现有技术的抗CD73缺口聚物(ASO-83和ASO-84)与未处理细胞之间差异转录物水平的火山图(n＝3)。阴影区域包括经鉴别为在相应的经ASO处理的细胞与未处理细胞之间差异表达的基因。图7B：与未经处理的细胞相比，每个经ASO处理的细胞的显著脱靶转录扰动概要。
定义
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在实验室中制作，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。如本文所描述的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。如本文所描述的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，如2′糖修饰的核苷。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。在一个实施方案中，反义寡核苷酸是单链的。应当理解的是，如本文所描述的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双螺旋结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双螺旋)，只要其内部或相互间的自身互补程度小于寡核苷酸全长的50％。
有利的是，如本文所描述的单链反义寡核苷酸不含有RNA核苷，因为这将降低核酸酶抗性。
在一个实施方案中，如本文所描述的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，如2′糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换地使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，并且可任选地包含其他核苷酸，例如可用于将官能团连接至连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或可以不互补。应理解的是，该寡核苷酸的邻接核苷酸序列不能比寡核苷酸本身更长，并且该寡核苷酸不能比邻接核苷酸序列更短。
核苷酸
核苷酸为寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本文描述的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用，术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个实施方案中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分。术语“修饰的核苷”在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。
修饰的核苷间键
如技术人员通常所理解的，术语“经修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本文描述的寡核苷酸可包含经修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，经修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。经修饰的核苷间键合在稳定寡核苷酸以供体内使用方面特别有用，并且可用于保护本文所描述的寡核苷酸中的DNA或RNA核苷区域免受核酸酶裂解。
在一个实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，如一个或多个经修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键经修饰，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的如至少55％、如至少60％、如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％或如至少95％的核苷间键经修饰。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键经修饰。应当认识到的是，在一些实施方案中，将本文描述的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是核酸酶抗性核苷间键。
经修饰的核苷间键可选自由硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(diphosphorothioate)及硼烷磷酸酯(boranophosphate)组成的组。在一些实施方案中，经修饰的核苷间键与本文描述的寡核苷酸的核糖核酸酶H募集兼容，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯。
在一些实施方案中，所述核苷间键包含硫(S)，如硫代磷酸酯核苷间键。
硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施方案中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键为硫代磷酸酯，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的如至少55％、如至少60％、如至少65％、如至少70％、如至少75％、如至少80％、如至少85％、如至少90％或如至少95％的核苷间键为硫代磷酸酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。
在一些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个中性核苷间键，特别是选自由磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI、酰胺-3、甲缩醛和硫代甲缩醛组成的组的核苷间键。
其他的核苷间键公开于WO2009/124238中(以引用方式并入本文中)。在一个实施方案中，核苷间键选自公开于WO2007/031091(以引用方式并入本文中)中的接头。在一些实施方案中，核苷间键合可选自由以下项组成的组：-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、0-PO(OCH3)-0-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-O-CO-O-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、-O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CO-NRH-CH2-、-CH2-NRHCO-、-O-CH2-CH2-S-、-S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-SO2-CH2-、-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-CO-和-CH2-NCH3-O-CH2-，其中RH选自由氢和C1-4烷基组成的组。
在一个实施方案中，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键合均为硫代磷酸酯键合，或寡核苷酸的所有核苷间键合均为硫代磷酸酯键合。
应当认识到，如EP 2742135中所公开，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间键，其根据EP 2742135可以例如在其他DNA硫代磷酸酯间隔区域中耐受。
核碱基
如本文所用的术语“核碱基”包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。如本文所用，术语“核碱基”也涵盖经修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人，(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry增刊371.4.1中。
在一些实施方案中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，如经取代的嘌呤或经取代的嘧啶，如选自由以下项组成的组的核碱基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑并-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自由A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶组成的组。任选地，对于LNA寡核苷酸，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语“修饰的寡核苷酸”描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合寡核苷酸”是已在文献中用于描述具有经修饰核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
术语“互补性”或“互补”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。沃森-克里克碱基对为鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.371.4.1)。
如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸的比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过确定寡核苷酸序列和参考序列(其中执行对准，使参考序列处于5’-3’方向且寡核苷酸序列处于3’-5’方向)之间互补(来自沃森-克里克碱基对)的对准核碱基数目来计算互补性百分比，如下：X/Y分数×100，其中X是寡核苷酸序列和参考序列之间的互补核苷酸数，且其中Y是寡核苷酸中的核苷酸总数。
在这种比较中，未对准(即不形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和缺失。应当理解，在确定互补性时，只要保留了形成沃森-克里克碱基对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，认为5’-甲基胞嘧啶与用于计算同一性百分比目的的胞嘧啶相同)。
术语“完全互补”是指100％的互补性。
同二性
如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过确定寡核苷酸序列和参考序列(其中执行对准，使寡核苷酸序列和参考序列的方向相同)之间相同(匹配)的对准核碱基数目来计算同一性百分比，如下：X/Y分数×100，其中X是寡核苷酸序列和参考序列之间的相同核苷酸数，且其中Y是寡核苷酸中的核苷酸总数。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解，在确定同一性时，只要保留了形成沃森-克里克碱基对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，认为5-甲基胞嘧啶与用于计算同一性百分比目的的胞嘧啶相同)。
杂交
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体(例如寡核苷酸和靶核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(Tm)来描述，其定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm与亲和力并不严格成比例(Mergny and Lacroix，2003，Oligonucleotides 13：515-537)。标准状态的吉布斯自由能ΔG°更精确地表示结合亲和力，并且通过ΔG°＝-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关，其中R为气体常数，T为绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与水浓度为1M、pH为7、温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，而自发反应的ΔG°小于零。ΔG°可经由实验来测量，例如，利用如Hansen等人，1965，Chem.Commm.36-38，和Holdgate等人，2005，Drug Discov Today。技术人员将知道商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°还可以使用SantaLucia，1998，Proc Natl AcadSci USA.95：1460-1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995，Biochemistry34：11211-11216和McTigue等人，2004，Biochemistry 43：5388-5405描述的推导的热力学参数在数值上进行估计。为了使通过杂交调节其预期核酸靶标成为可能，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本文描述的寡核苷酸以低于-10kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。在一些实施方案中，对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可以低于-10kcal，如低于-15kcal、如低于-20kcal或如低于-25kcal的估计ΔG°值与靶核酸杂交。在一些实施方案中，寡核苷酸可以-10至-60kcal，如-12至-40kcal、如-15至-30kcal、如-16至-27kcal或如-18至-25kcal的估计ΔG°范围与靶核酸杂交。
靶标
如本文所用，术语“靶标”是指哺乳动物，例如人，分化簇73，在本文中称为CD73或NT5E，并且在本领域中也称为5′-核苷酸酶(5’-NT)、细胞外5′-核苷酸酶。CD73，GENE ID No4907，编码于人染色体6：85449584...85495791反向链(GRCh38.p13，NC_000006.12)上，前体mRNA在本文中例示为SEQ ID NO：1。人WT CD73 mRNA的实例在本文被提供为SEQ ID NO：2。人CD73 Δ7 mRNA的实例在本文被提供为SEQ ID NO：4。人WT CD73蛋白的实例在本文被提供为SEQ ID NO：3。人CD73 Δ7蛋白的实例在本文被提供为SEQ ID NO：5。在本发明的上下文中，包含由CD73外显子7编码的氨基酸序列的CD73蛋白被称为WT CD73。在本发明的上下文中，缺少由CD73外显子7编码的部分或全部氨基酸序列的CD73蛋白被称为CD73 Δ7。
靶核酸
根据本发明，靶核酸是哺乳动物CD73前体mRNA，例如本文中示为SEQ ID NO：1的人CD73前体mRNA，或其天然存在的变体。有利地，靶核酸包含CD73前体mRNA外显子7序列，如SEQ ID NO：1，或与SEQ ID NO：1至少98％互补的序列。
在一些实施方案中，靶核酸选自由SEQ ID NO：6和93至174中的任一个组成的组，或其天然存在的变体。
合适地，靶核酸编码CD73多肽，特别是人CD73多肽，其包含CD73外显子7，如SEQ IDNO：3。
CD73 Δ7变体是一种天然存在的CD73等位基因变体，其导致mRNA中外显子7的缺失(例如SEQ ID NO：4)，从而产生具有对应于由外显子7编码的氨基酸序列的缺失的多肽-在本文中称为“CD73 Δ7”或“外显子7缺陷型CD73”(参见例如SEQ ID NO：5，其代表缺乏由外显子7编码的氨基酸的示例性CD73多肽序列)。
合适地，靶核酸编码CD73多肽，特别是缺乏CD73外显子7的人CD73多肽，如SEQ IDNO：5。
本文描述的反义寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与CD73前体mRNA区域(SEQ IDNO：1)互补，如在整个反义寡核苷酸的长度上所测量，任选地，除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将反义寡核苷酸与任选的官能团(如缀合物)或其他非互补性末端核苷酸连接的基于核苷酸的接头区域(例如区域D’或D”)。在一些实施方案中，靶核酸可以是RNA或DNA，如mRNA，如成熟mRNA或前体mRNA。在一些实施方案中，靶核酸是编码哺乳动物CD73多肽，如人CD73多肽的RNA或DNA，例如人CD73 mRNA序列，如作为SEQ ID NO 1公开的靶核酸。表4提供了有关示例性靶核酸的其他信息。
表4.多个物种的CD73的基因组和装配信息。
Figure BDA0003818417890000151
“+”＝正向链。基因组坐标提供前体mRNA序列(基因组序列；SEQ ID NO：1)。Ensemble参考序列提供mRNA序列(cDNA序列)。
*)Ensembl是脊椎动物基因组的基因组浏览器，支持比较基因组学、进化、序列变异和转录调控方面的研究。其主页为www.ensembl.org。
WT CD73
WT CD73是指野生型CD73，本文中定义为CD73蛋白，其包含由CD73的外显子7编码的氨基酸序列。因此，WT CD73蛋白应该是由包含外显子7的CD73 mRNA编码的蛋白。在一些实施方案中，WT CD73蛋白由包含外显子1至9(如上表2中所提供)的CD73 mRNA编码。
CD73 Δ7
如本文所描述的反义寡核苷酸调节CD73前体mRNA的剪接，导致在由CD73前体mRNA外显子7编码的区域中缺乏一个或多个氨基酸的CD73多肽的表达或增强的表达。在一些实施方案中，由CD73外显子7编码的氨基酸区域在通过使用本文所描述的反义寡核苷酸产生的CD73多肽中不存在。缺少部分或全部外显子7的CD73前体mRNA在本文中称为“CD73 Δ7mRNA”或“外显子7缺失型CD73 mRNA”。因此，缺少部分或全部外显子7的CD73蛋白在本文中称为“CD73 Δ7蛋白”或“外显子7缺失型CD73蛋白”。在一些实施方案中，CD73 Δ7蛋白由包含外显子1至6、8和9(如上表2中所提供)的CD73 Δ7 mRNA编码。
可以通过比较mRNA水平或相应蛋白质产物的水平来测量不同转录产物(例如WTCD73相对于CD73 Δ7)的比率变化。抗CD73抗体可用于分析WT CD73和CD73 Δ7的蛋白质水平，如对WT CD73蛋白或CD73 Δ7蛋白具有特异性的单克隆或多克隆抗体。
靶序列
如本文所用的术语“靶序列”是指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本文描述的反义寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施方案中，靶序列由靶核酸上具有与本文描述的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施方案中，靶序列比单个反义寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表靶核酸的优选区域，其可以被本文描述的几种反义寡核苷酸靶向。
与反义寡核苷酸互补或杂交的靶序列通常包含具有至少10个核苷酸的连续核碱基序列。该连续核苷酸序列的长度为10至50个核苷酸，如12至30个、如14至20个、如15至18个连续核苷酸。
在-些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：6和93-174组成的组的靶序列互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：6组成的组的靶序列互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的靶序列互补：SEQ ID NO：93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109，110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173和174。
靶细胞
本文所用的术语“靶细胞”是指正在表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是哺乳动物细胞，诸如啮齿动物细胞，诸如小鼠细胞或大鼠细胞，或灵长类动物细胞，诸如猴细胞或人细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达人CD73靶核酸的转基因动物细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。
对于实验评估，可以使用表达靶核酸的靶细胞，所述靶核酸包含靶序列。对于体内评估以及为了分析反义寡核苷酸调节CD73前体mRNA剪接的能力，例如，靶细胞可以是A549细胞或Colo205细胞。
在一些实施方案中，靶细胞表达CD73 mRNA，如CD73前体mRNA或CD73成熟mRNA。对于反义寡核苷酸靶向作用，通常不考虑CD73mRNA的聚腺苷(poly A)尾部。
通常，靶细胞表达CD73前体mRNA，其在细胞中加工为成熟的CD73 mRNA，从而引起CD73蛋白(WT CD73)的表达。有利地，本发明的反义寡核苷酸调节CD73前体mRNA的剪接以产生缺乏CD73外显子7(或外显子7的一部分)的成熟CD73 mRNA，从而引起CD73 Δ7变体的表达。
在一些实施方案中，靶核酸是SEQ ID NO：1或其天然存在的变体。在一些实施方案中，靶核酸选自由SEQ ID NO：6和93-174组成的组或其天然存在的变体。
自然产生变体
术语“天然存在的变体(naturally occurring variant)”是指与靶核酸源自相同基因座但可有差异的CD73基因或转录物的变体，所述差异可例如是出于遗传密码的简并性造成多重密码子编码同一个氨基酸，或因前体mRNA的可变剪接，或多态性的存在，如单核苷酸多态性(SNP)，以及等位基因变体。基于与反义寡核苷酸足够互补的序列的存在，本文描述的反义寡核苷酸因此可以靶向靶核酸及其天然存在的变体。
在一些实施方案中，天然存在的变体与哺乳动物CD73靶核酸具有至少95％同源性，如与哺乳动物CD73靶核酸(如SEQ ID NO：1)至少98％或至少99％同源性。在一些实施例中，天然存在的变体与SEQ ID NO：1的人CD73靶核酸具有至少99％的同源性。在一些实施方案中，天然存在的变体是表5中所列的多态性。
表5：CD73基因中已知多种单核苷酸多态性，例如下表中公开的那些(人前体mRNA起始/参考序列是SEQ ID NO：2)
Figure BDA0003818417890000181
剪接调节
剪接调节可用于纠正隐蔽剪接、调节可变剪接、恢复开放阅读框和诱导蛋白质敲低。如本文所用，术语“剪接的调节”应理解为反义寡核苷酸调节CD73前体mRNA的剪接以导致CD73外显子7的消除和提供CD73 Δ7(即不包含CD73外显子7的CD73 mRNA)的有效产生的能力的总称。
可以通过参考对照实验来确定剪接的调节。如普遍所知，对照是以盐水组合物处理的单个或靶细胞，或是以非靶向寡核苷酸(模拟品)处理的单个或靶细胞。此外，可以通过RNA测序(RNA-Seq)分析剪接的调节，所述测序允许对前体mRNA的不同剪接产物进行定量评估。
减少WT CD73的表达
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸当存在于靶细胞中时，减少，即降低WTCD73的表达。如本文所用，术语“减少表达”应理解为，反义寡核苷酸减少靶细胞中WT CD73的数量或活性的能力的总称。在一些实施方案中，与对照细胞相比，数量或活性的减少为至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。可通过测量WT CD73 mRNA的水平或通过测量细胞中WT CD73多肽的水平或活性所测定，来测量活性的减少。因此，可以在体外或体内测定表达的减少。应理解剪接调节可导致细胞中WT CD73的表达减少。
通常，通过向靶细胞施用有效量的反义寡核苷酸后，测定经编码蛋白产物中所存在的靶核酸水平或经编码蛋白产物的活性，并将该水平与未施用反义寡核苷酸的靶细胞(对照实验)获得的参考水平或已知的参考水平(例如，在施用有效量的反义寡核苷酸之前的表达的水平，或预先确定的或以其他方式已知的表达水平)进行比较来确定表达的减少。
增强CD73 Δ7/CD73 Δ7增强子的表达
在一些实施方案中，当本发明的化合物存在于靶细胞中时，可以通过调节CD73前体mRNA中外显子7的剪接来增强CD73 Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的表达。外显子7剪接的调节可以通过测量用反义寡核苷酸处理的细胞和未处理的对照细胞中的CD73 Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的量来确定。因此，与对照细胞中的量相比，靶细胞中CD73 Δ7 mRNA或CD73Δ7蛋白的量应有所增加。在一些实施方案中，与对照细胞的量相比，CD73Δ7 mRNA或CD73Δ7蛋白的量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。在一些实施方案中，与对照细胞的量相比，CD73 Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的量增加至少100％。在一些实施方案中，与对照细胞的量相比，CD73 Δ7mRNA或CD73 Δ7蛋白的量增加至少150％。在一些实施方案中，与对照细胞的量相比，CD73Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的量增加至少200％。在一些实施方案中，与对照细胞的量相比，CD73 Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的量增加至少250％。
因此，本发明的反义寡核苷酸是CD73 Δ7增强子，即在向靶细胞施用有效量的反义寡核苷酸后导致CD73 Δ7mRNA或CD73 Δ7蛋白表达增强的反义寡核苷酸。
CD73 Δ7增强子可以通过测量与对照细胞相比CD73 Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的增强表达，或通过测量与WT CD73相比在mRNA或蛋白水平下的CD73 Δ7表达的增强比率来鉴别。如实例中所示，每个样品(经ASO处理的或未处理的)的CD73 Δ7 mRNA水平与总CD73mRNA水平相比的绝对百分比计算如下：
CD73 Δ7/(CD73 Δ7+WT CD73)
其中
·CD73 Δ7是CD73 Δ7 mRNA的水平
·WT CD73是WT CD73 mRNA的水平
因此，＞未处理对照水平的反应指示有效的CD73 Δ7增强子。有利地，CD73 Δ7增强子能够引发＞约1.5、或＞约2或＞约2.5的反应。
例如，可以在A549和/或Colo205中测定CD73 Δ7 mRNA或蛋白质表达的增强(例如，如实例中所示)。因此，可以如实例中所描述培养用本文所述的反义寡核苷酸处理的细胞和未处理的对照细胞，以评估CD73 Δ7 mRNA或CD73 Δ7蛋白的表达是否增强。
在一些实施方案中，本发明的化合物能够i)增强靶细胞中CD73 Δ7 mRNA或CD73Δ7蛋白的表达和ii)减少靶细胞中WT CD73 Δ7 mRNA和WT CD73 Δ7蛋白的表达。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是一种经修饰的核苷，当并入至反义寡核苷酸中时，可增强反义寡核苷酸对其互补靶的亲和力，例如以解链温度(Tm)所测量。本文所描述的高亲和力修饰的核苷使每一个修饰的核苷的解链温度增加+0.5℃至+12℃的范围，如+1.5℃至+10℃的范围和如+3℃至+8℃的范围。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213)。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时，本文描述的反义寡核苷酸可包含一种或多种具有经修饰的糖部分(动糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖糖部分修饰的核苷，主要目的为改善反义寡核苷酸的某些特性，如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括以下修饰，其中例如通过用以下取代而修饰核糖环结构：己糖环(HNA)或一般在核糖环上C2和C4碳之间具有双基桥的双环状环(LNA)或一般在C2碳和C3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2′-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2′、3′、4′或5′位置引入取代基。
2′糖修饰的核苷
2′糖修饰的核苷是一种核苷，其在2′位置具有除H或-OH以外的取代基(2′取代的核苷)或包含能够在2′碳与核糖环中的第二个碳之间形成桥的2′连接双基，诸如LNA(2′-4′双基桥连)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2′取代的核苷，并且发现许多2′取代的核苷并入反义寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2′修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对反义寡核苷酸的核酸酶抗性。2′取代的修饰的核苷的实例是2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些2′取代的修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0003818417890000221
在一个实施方案中，2′取代的糖修饰的核苷不包括如同LNA那样的2′桥连的核苷。
锁定核酸(LNA)
“LNA核苷”是一种2′-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2′和C4′的双基(也称为“2′-4′桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。当将LNA掺入互补RNA或DNA分子的反义寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可通过测量反义寡核苷酸/互补双链体的解链温度来常规确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12，73-76、Seth等人J.Org.Chem.2010，Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research2009，37(4)，1225-1238和Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016，59，9645-9667中。
其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。
方案1：
Figure BDA0003818417890000231
特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6′-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6′-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。
本文所描述的化合物可含有一个或多个非对称中心，并且可以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物如例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体的混合物的形式存在。
术语“不对称碳原子”意指具有四个不同取代基的碳原子。依据Cahn-Ingold-Prelog顺序规则，不对称碳原子可为“R”或“S”组态。
药用盐
根据本发明的化合物可以以其药用盐的形式存在。术语“药用盐”是指保留本文描述的反义寡核苷酸的生物学有效性和特性的常规酸加成盐或碱加成盐。
在另一方面，本发明提供反义寡核苷酸的药用盐，如药用钠盐、铵盐或钾盐。
保护基团
单独或组合使用的术语“保护基”表示选择性地封闭多官能化合物中反应位点，从而可以在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应的基团。保护基可以去除。示例性的保护基是氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。
核糖核酸酶H活性和募集
反义寡核苷酸的核糖核酸酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集核糖核酸酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNase H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNase H的能力。如果在向反义寡核苷酸提供互补靶核酸序列时具有以下初始速率(以pmol/l/min计所量测)，则一般认为其能够募集RNase H，该初始速率是使用WO01/23613(通过引用在此并入)的实例91-95提供的方法学，使用具有与所测试的经修饰的反义寡核苷酸相同的碱基序列但在反义寡核苷酸中的所有单体之间仅含有具有硫代磷酸酯键的DNA单体的反义寡核苷酸确定的初始速率的至少5％、至少10％或超过20％。已知DNA反义寡核苷酸可有效募集RNase H，间隔聚物寡核苷酸也是如此，其包含DNA核苷区域(通常至少5或6个连续的DNA核苷)，其5′和3′侧接包含2′糖修饰核苷(通常高亲和力2′糖修饰核苷，如2-O-MOE和/或LNA)的区域。对于剪接的有效调节，前体mRNA的降解是非所需的，且因此优选地，避免靶标的RNase H降解。因此，本发明的剪接调节反义寡核苷酸优选地不是间隔聚物寡核苷酸。可以通过限制反义寡核苷酸中连续DNA核苷酸的数量来避免RNase H募集—因此，对于有效的剪接调节，因此可以使用混聚物和全聚物设计。
全聚物
如本文所用，术语“全聚物”是单链寡聚物或其连续核苷酸序列，其不包含DNA或RNA核苷，并且因此仅包含核苷类似物核苷。寡聚物或其连续核苷酸序列可以是全聚物-实际上，各种全聚物设计都可以作为治疗性寡聚物非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时非常有效。
在一些实施方案中，全聚物包含至少一个XYX或YXY序列基序如重复序列XYX或YXY或由其组成，其中X是LNA并且Y是替代(即非LNA)核苷酸类似物，如2′-OMe RNA单元和2′-氟DNA单元。在一些实施方案中，以上序列基序可为例如XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些实施方案中，全聚物可包含长度为8个至20个核苷酸，如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸，如长度为12至18个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，全聚物的连续核苷酸序列包含至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％、诸如95％、诸如100％的LNA单元。剩余单元可选自本文中提及的非LNA核苷酸类似物，诸如选自由以下项组成的组中的那些：2′-O烷基-RNA单元、2′-OMe-RNA单元、2′-氨基-DNA单元、2′-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元和2′MOE RNA单元、或2′-OMe RNA单元和2′-氟DNA单元的组。
在一些实施方案中，全聚物由仅由LNA单元组成的连续核苷酸序列组成或包含仅由LNA单元组成的连续核苷酸序列。
混聚物
如本文所用，术语“混聚物”是指同时包含DNA核苷和糖修饰核苷的寡聚物，其中连续DNA核苷的长度不足以募集RNase H。合适的混聚物可包含多达1个、多达2个、多达3个或多达4个连续的DNA核苷。在一些实施方案中，混聚物或其连续核苷酸序列包含交替的糖修饰核苷区域和DNA核苷区域。通过并入反义寡核苷酸时与短DNA核苷区域形成RNA样(3’内式)构象的糖修饰核苷的交替区域，可以制备不募集RNase H的反义寡核苷酸。有利地，糖修饰的核苷是增强亲和力的糖修饰的核苷。
混聚物通常用于提供基于占据对靶基因(诸如剪接调节剂或微小RNA抑制剂)的调节作用。
在一些实施方案中，混聚物或其连续核苷酸序列中的糖修饰的核苷包含或全部是LNA核苷，诸如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施方案中，混聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，其可以全部是LNA核苷，或可以全部是2’O-MOE核苷。在一些实施方案中，混聚物的糖修饰的核苷可独立地选自LNA核苷和2′取代的核苷，如选自由以下项组成的组中的2′取代的核苷：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含LNA核苷和2′取代的核苷，如选自由以下项组成的组中的2′取代的核苷：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2′-氨基-DNA、2′-氟-RNA和2′-F-ANA核苷。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含LNA核苷和2’-O-MOE核苷。在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含(S)cETLNA核苷和2’-O-MOE核苷。
在一些实施方案中，混聚物或其连续核苷酸序列仅包含LNA和DNA核苷，此类LNA混聚物寡核苷酸的长度可为例如8-24个核苷(参见例如WO2007112754，其公开了微小RNA的LNA抗miR抑制剂)。
多种混聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。
在一些实施例中，混聚物包含以下基序
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在一些实施例中，混聚物可包含介于10个和24个核苷酸之间诸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的邻接核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，混聚物可包含介于12个和22个核苷酸之间，如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，混聚物可包含介于14个和20个核苷酸之间，如14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，混聚物可包含介于16个和18个核苷酸之间，如16、17或18个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。在一些实施方案中，混聚物可包含18个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，混聚物的连续核苷酸序列包含至少30％、如至少40％、如至少50％的LNA单元。
在一些实施例中，混聚物包含核苷酸类似物和天然存在的核苷酸重复模式的邻接核苷酸序列或一种类型的核苷酸类似物和第二类型的核苷酸类似物或由其组成。该重复模式可例如为：每个第二或每个第三核苷酸为核苷酸类似物诸如LNA，并且剩余核苷酸为天然存在的核苷酸诸如DNA，或可以为2′取代的核苷酸类似物，如本文所提及的2′氟类似物的2′MOE，或在一些实施例中，选自本文中提及的核苷酸类似物群组。应当认识到，核苷酸类似物如LNA单元的重复模式可与固定位置处(例如5’或3’末端)的核苷酸类似物组合。
在一些实施方案中，从3’末端计数，寡聚物的第一核苷酸为核苷酸类似物，如LNA核苷酸或2′-O-MOE核苷。
在可以相同或不同的一些实施例中，从3′末端计数，寡聚物的第二核苷酸为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2′-O-MOE核苷。
在可以相同或不同的一些实施例中，寡聚物的5′末端为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2′-O-MOE核苷。
在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少两个连续核苷酸类似物单元诸如至少两个连续LNA单元。
在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少三个连续核苷酸类似物单元诸如至少三个连续LNA单元。
缀合物
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价连接的反义寡核苷酸。缀合物部分可以与反义寡核苷酸共价连接，任选地经由连接基(诸如区域D′或D″)。
寡核苷酸缀合物及其合成也在Manoharan于Antisense Drug Technology，Principles，Strategies，and Applications，S.T.Crooke，ed.，Ch.16，Marcel Dekker，Inc.，2001 and Manoharan，Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2002，12，103)。
在一些实施例中，所述非核苷酸部分(缀合物部分)选自由碳水化合物(例如GalNAc)、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂性物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白质(例如衣壳)或其组合组成的组。
连接基
键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过连接部分(例如接头或系链)连接到反义寡核苷酸。接头用于将第三区域例如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，该第一区域例如与靶核酸互补的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。
在一些实施方案中，本文描述的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的反义寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
在一个实施方案中，区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的连接基经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。在一个实施方案中，核酸酶敏感性接头包含1-10个核苷，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷。在一个实施方案中，核酸酶敏感性接头包含2-6个核苷。在一个实施方案中，核酸酶敏感性接头包含2-4个连接的核苷，其包含至少两个连续的磷酸二酯键，如至少3或4或5个连续的磷酸二酯键。在一个实施方案中，核苷是DNA或RNA。包含磷酸二酯的可生物裂解的接头更加详细地描述于WO2014/076195(通过引用并入本文)中。
区域Y是指不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)与反义寡核苷酸(区域A或第一区域)共价连接的接头。区域Y连接基可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本文描述的反义寡核苷酸缀合物可以由以下区域元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施方案中，接头(区域Y)为氨基烷基(如C2-C36氨基烷基基团)，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在一个实施方案中，接头(区域Y)是C6氨基烷基基团。
治疗
如本文所用的术语“治疗”是指既存疾病(例如如本文所指的疾病或病症)的治疗或疾病的防止即预防。因此将认识到，在一些实施例中，本文所指的治疗可以是预防性的。
具体实施方式
本发明的反义寡核苷酸
本发明涉及能够诱导CD73剪接转换，如增强CD73 Δ7表达的反义寡核苷酸。剪接转换活性通过将反义寡核苷酸与编码CD73多肽的靶核酸杂交来实现。在一个实施方案中，靶核酸可以为哺乳动物CD73序列，如SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，靶核酸包含SEQ IDNO：6的靶序列。
在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向CD73前体mRNA(如SEQ ID NO：1)，且从而诱导CD73前体mRNA的剪接转换。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向CD73前体mRNA，从而产生外显子7缺失型CD73 mRNA(CD73 Δ7，如SEQ ID NO：4)，引起缺少部分或全部CD73外显子7的CD73多肽(如SEQ ID NO：5)的表达。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向CD73前体mRNA，从而减少WT CD73 mRNA(如SEQ ID NO：2)，引起WT CD73多肽(如SEQ ID NO：3)的表达减少。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向内含子区域或外显子区域(如表2和表3中所描述)。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向剪接位点，如外显子7的3′剪接位点。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向剪接位点，如外显子7的5′剪接位点。在一个实施方案中，反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO：6的靶区域。
在一些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸诱导CD73前体mRNA转化为外显子7缺失型CD73 mRNA(CD73 Δ7)。在一个实施方案中，与转化为CD73 Δ7的正常水平相比，反义寡核苷酸诱导转化为CD73 Δ7至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
在一些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸能够在将5μM反义寡核苷酸应用于A549细胞后，在体外诱导CD73前体mRNA转化为CD73 Δ7至少60％。在一些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸能够在将25μM反义寡核苷酸应用于Colo205细胞后，在体外诱导CD73前体mRNA转化为CD73 Δ7至少80％。
适合的是，实例提供了可用于测量CD73剪接转换活性的分析(例如实例2及实例3)。通过反义寡核苷酸的连续核苷酸序列与靶核酸之间的杂交触发剪接转换。在一些实施方案中，本文描述的反义寡核苷酸包含反义寡核苷酸和靶核酸之间的错配。尽管错配，与靶核酸的杂交仍可足以显示出向CD73 Δ7的所需转化。由错配导致降低的结合亲和力可以通过反义寡核苷酸中核苷酸数量的增加和/或能够提高与靶标的结合亲和力的修饰核苷数量的增加来补偿，所述修饰核苷如存在于反义寡核苷酸序列中的2′糖修饰的核苷，包括LNA。
本发明的一个方面涉及一种靶向哺乳动物CD73前体mRNA的反义寡核苷酸，其中反义寡核苷酸调节哺乳动物CD73前体mRNA的剪接，并且包含至少10个核苷酸长度的与哺乳动物CD73前体mRNA具有至少90％互补性，如100％互补性的连续核苷酸序列。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的连续序列，该序列与靶核酸的区域或靶序列至少90％互补，如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％或100％互补。在一个实施方案中，靶序列是SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，靶序列是SEQ ID NO：6。在一个实施方案中，靶序列选自由SEQ ID NO：93-174中的任一个组成的组。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与靶核酸的区域完全互补(100％互补)，或在一些实施方案中，可包含反义寡核苷酸与靶核酸之间的一个或两个错配。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸包含长度为10至30个核苷酸的与SEQ ID NO：1中所存在的靶核酸区域具有至少90％互补性，如完全(或100％)互补性的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，反义寡核苷酸序列与SEQ ID NO：1中所存在的对应靶核酸区域100％互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸序列与SEQ ID NO：6中所存在的对应靶核酸区域100％互补。在一些实施方案中，反义寡核苷酸序列与选自由SEQ ID NO：93-174组成的组的对应靶核酸区域100％互补。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够增强外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA(SEQ ID NO：4)的表达。在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够减少WT哺乳动物CD73 mRNA(SEQ ID NO：2)的表达。在一些实施方案中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够增强外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA(SEQ ID NO：4)的表达并且能够减少WT哺乳动物CD73 mRNA(SEQ ID NO：2)的表达。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含长度为10至35个的核苷酸，如长度为12至30个、如15至25个、如16至20个或如17至19个的连续核苷酸，或由其组成。在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度包含18个核苷酸或由其组成。
在一些实施例中，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列包含25个或更少的核苷酸(诸如22个或更少的核苷酸，诸如20个或更少的核苷酸，诸如19、18、17或16个核苷酸)或由其组成。应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。据此，如果称反义寡核苷酸包括10至30个核苷酸，则10个和30个核苷酸均包含在内。
在一些实施例中，所述连续核苷酸序列在长度上包含10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个连续核苷酸或由其组成。在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度包含18个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含一序列或由其组成，所述序列选自由表8(材料和方法章节)中所列序列组成的组。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，与SEQ ID NO：6的序列具有至少90％同一性，优选100％同一性。在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，与选自由SEQ ID NO：93至174组成的组的序列(参见表8中列出的RNA靶序列)具有至少90％同一性，优选100％同一性。在一些实施方案中，反义寡核苷酸或连续核苷酸序列包含长度为10至30个的核苷酸或由其组成，与SEQ ID NO：107或144的序列(参见表8中列出的RNA靶序列)具有至少90％同一性，优选100％同一性。
应理解的是，邻接核碱基序列(基序序列)可经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。
将经修饰的核苷(如高亲和力修饰的核苷)并入反义寡核苷酸序列中的模式通常称为反义寡核苷酸设计。
本发明的反义寡核苷酸经设计具有经修饰的核苷和DNA核苷。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含至少1个经修饰的核苷，如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个经修饰的核苷。在一实施方案中，反义寡核苷酸包含1至10个经修饰的核苷，如2至9个经修饰的核苷、如3至8个经修饰的核苷、如4至7个经修饰的核苷、如6或7个经修饰的核苷。合适的修饰在“定义”章节的“修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2′糖修饰”和“锁定的核酸(LNA)”下进行了描述。
在一实施方案中，反义寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，其独立地选自由以下项组成的群组：2′-O-烷基-RNA、2′-O-甲基-RNA、2′-烷氧基-RNA、2′-O-甲氧基乙基-RNA、2′-氨基-DNA、2′-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2′-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。
在另一个实施方案中，反义寡核苷酸包含至少一个经修饰的核苷间键。合适的核苷间修饰描述于“定义”章节的“修饰的核苷间键”下。如果连续核苷酸序列内的至少75％，如所有的核苷间键是硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯核苷间键，则是有利的。在一些实施方案中，反义寡核苷酸的连续序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸包含至少一个LNA核苷，如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA核苷，如2至6个LNA核苷，如3至7个LNA核苷、4至8个LNA核苷或3、4、5、6、7或8个LNA核苷。在一些实施方案中，反义寡核苷酸中至少75％的经修饰核苷是LNA核苷，如80％、如85％、如90％的经修饰核苷是LNA核苷。在另一实施方案中，反义寡核苷酸中所有经修饰的核苷均为LNA核苷。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸可同时包含β-D-氧基-LNA和以下LNA核苷中的一个或多个：硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、ScET和/或ENA，或呈β-D构型或呈α-L构型或其组合。在另一个实施例中，所有LNA胞嘧啶单元均为5-甲基胞嘧啶。对于反义寡核苷酸或连续核苷酸序列的核酸酶稳定性而言，优选的是在核苷酸序列的5’端具有至少1个LNA核苷并且在核苷酸序列的3’端具有至少2个LNA核苷。在一些实施方案中，反义寡核苷酸具有如表8中描述的序列和设计(寡核苷酸化合物(设计)列)。在一些实施方案中，反义寡核苷酸具有GtAAttGTgcCTgaGgGT的序列和设计。在一些实施方案中，反义寡核苷酸具有TggCcGtAgcGgtGcaCG的序列和设计。在一些实施方案中，大写字母表示β-D-氧基LNA核苷。在一些实施方案中，小写字母表示DNA核苷。在一些实施方案中，所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元均为5-甲基-胞嘧啶。
对于本发明的一些实施方案，反义寡核苷酸包含选自由SEQ ID NO：7-88组成的组的序列或由其组成。
对于本发明的某些实施方案，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：21或58或由其组成。
对于本发明的一些实施方案，反义寡核苷酸选自具有ASO ID NO：ASO-1至ASO-82的反义寡核苷酸化合物的组。
对于本发明的某些实施方案，反义寡核苷酸是ASO ID NO：ASO-15或ASO-52。
在本发明的另一实施方案中，反义寡核苷酸可以包含至少一个立体定义的核苷间键，如立体定义的硫代磷酸酯核苷间键。
产生立体定义的反义寡核苷酸变体的一个关键优势是能够增加序列基序的多样性，并选择立体定义的反义寡核苷酸，包括立体定义的反义寡核苷酸的子文库，其与亲本反义寡核苷酸相比，具有改进的药物化学特性。
对于体内或体外应用，本文所描述的反义寡核苷酸通常能够调节人CD73前体mRNA的外显子7的剪接，从而引起CD73 Δ7多肽的表达或增强的表达。
制造方法
在另一方面，本发明提供用于制造本文描述的反义寡核苷酸的方法，其包括使核苷酸单元反应并由此形成包含在反义寡核苷酸中的共价连接的连续核苷酸单元。优选地，所述方法使用亚磷酰胺化学物质(参见例如Caruthers等人)。在另一个实施例中，该方法进一步包括使连续核苷酸序列与缀合部分(配体)反应以将缀合物部分共价附着到反义寡核苷酸。在另一个方面，提供了一种用于制造本发明的组合物的方法，其包括将本发明的反义寡核苷酸或缀合寡核苷酸与药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂混合。
药用盐
根据本发明的反义寡核苷酸可以以其药用盐的形式存在。术语“药用盐”是指保留本发明的化合物的生物学有效性和特性的常规酸加成盐或碱加成盐。
在另一个方面，本发明提供核酸分子或其缀合物的药用盐，诸如药用钠盐、铵盐或钾盐。
药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物，其包含前述反义寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物或其盐以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂中的任一者。药用稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，反义寡核苷酸以50-300μM溶液的浓度在药用稀释剂中使用。
如本文所描述使用的合适制剂可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，第17版，1985中。对于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。WO 2007/031091(通过引用并入本文)提供了药用稀释剂、载体和佐剂的其他合适的和优选的实例。WO2007/031091中也提供了合适的剂量、制剂、施用途径、组合物、剂型、与其他治疗剂的组合、前药制剂。
如本文所描述的反义寡核苷酸或寡核苷酸缀合物可与药用活性或惰性物质混合，用以制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。固体形式的组合物也可以灵活的量包装在容器中，诸如在设计用于局部适用的乳膏或软膏的可挤压管中。
在一些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸或寡核苷酸缀合物是前药。在一个实施方案中，一旦前药被递送至作用位点例如靶细胞，缀合物部分就从反义寡核苷酸上裂解下来。
应用
本文描述的反义寡核苷酸可作为研究试剂使用，例如用于诊断、治疗和预防。
在研究中，此类反义寡核苷酸可用于特异性调节细胞(例如体外细胞培养物)和实验动物中CD73多肽的合成，从而有助于靶标的功能分析或对其作为治疗干预靶标的可用性的评估。通常，通过降解或抑制产生多肽的mRNA从而防止多肽形成，或通过降解或抑制产生多肽的基因或mRNA的调节剂来实现靶标调节。
如果在研究或诊断中采用本文描述的反义寡核苷酸，则靶核酸可以是cDNA或衍生自DNA或RNA的合成核酸。
本文描述了一种用于调节表达CD73的靶细胞中CD73前体mRNA剪接的体内或体外方法，所述方法包括以有效量向所述细胞施用本文所描述的反义寡核苷酸。
在一些实施方案中，靶细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，靶细胞是人细胞。靶细胞可以是形成哺乳动物组织的一部分的体外细胞培养物或体内细胞。在一个实施方案中，靶细胞存在于肿瘤中。在一个实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞。
在诊断中，反义寡核苷酸可用于通过northern印迹、原位杂交或类似技术检测并定量细胞和组织中的CD73剪接变体，如CD73 Δ7和/或WT CD73的表达。
对于治疗，可以将寡核苷酸施用于怀疑患有疾病或病症的动物或人，所述疾病或病症可以通过调节CD73前体mRNA的剪接来治疗。
本文提供用于治疗或预防疾病的方法，其包括向罹患或易患疾病的受试者施用治疗上或预防上有效量的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物，所述疾病如选自由以下项组成的组的疾病或病症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
本文提供如本文所定义用作药物的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物。
本文所描述的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物通常以有效量施用。
本文还提供反义寡核苷酸或寡核苷酸缀合物在制造用以治疗如本文所提及的病症的药物中的用途，或用于治疗如本文所提及的病症的方法中的用途。
如本文所提及的疾病或病症与CD73变体，如CD73 Δ7和WT CD73的表达相关。在一些实施方案中，所述疾病或病症可与CD73基因中的突变或其中基因的蛋白质产物与CD73变体相关或相互作用的所述基因相关。因此，在一些实施方案中，靶核酸是CD73序列的突变形式，并且在其他实施方案中，靶核酸是CD73序列的调节因子。
本文描述的方法优选用于治疗或预防由CD73变体(如CD73 Δ7和WT CD73)的异常水平和/或活性引起的疾病。
本文进一步提供了反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物在制造用于治疗CD73变体(如CD73 Δ7和WT CD73)的异常水平和/或活性的药物中的用途。
本文进一步提供用于治疗疾病或病症的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物，所述疾病或病症选自以下：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
施用
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物可以例如通过肠胃外途径，包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注来施用。在一些实施方案中，反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物经静脉内施用。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物经皮下施用。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物经口服或直肠施用。在一些实施方案中，口服或直肠施用反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物，以用于治疗结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
在一些实施方案中，本发明的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物以0.1-15mg/kg，如0.2-10mg/kg、如0.25-5mg/kg的剂量施用。施用可以是每周一次、每二周一次、每三周一次或甚至每月一次。
本发明还提供本发明的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物如所描述用于制造药物的用途，其中所述药物呈用于皮下施用的剂型。
组合疗法
在一些实施方案中，本文描述的反义寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或其药用盐或药物组合物是用以与另一治疗剂进行结合治疗。治疗剂可以例如是上述疾病或疾患的护理标准。在一个实施方案中，治疗剂是检查点抑制剂。在一个实施方案中，治疗剂靶向选自由CTLA4、PD-1和PD-L1组成的组的分子。在一个实施方案中，治疗剂选自由由以下项组成的组：伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和西米普利单抗(cemiplimab)。
实例
实例1-材料和方法
合成反义寡核苷酸ASO-1至ASO-84，并评估其调节CD73前体mRNA剪接以提高CD73Δ7 mRNA与WT CD73 mRNA相比的比率的能力。具体而言，评估反义寡核苷酸在经处理的细胞相对于未处理的细胞中是否增强CD73 Δ7 mRNA的表达和/或减少WT CD73 mRNA的表达。
Figure BDA0003818417890000401
Figure BDA0003818417890000411
Figure BDA0003818417890000421
Figure BDA0003818417890000431
细胞培养和ASO处理
将A549细胞在补充有10％FBS和25μg/ml庆大霉素的F12/K培养基中培养。将Colo205细胞在补充有10％FBS和1X pen/strep的RPMI培养基中培养。将A549或Colo205细胞以3,000个细胞/孔接种于96孔板格式中。12小时后，将细胞用最终浓度为5μM或25μM的反义寡核苷酸(ASO)化合物通过无辅助吸收来处理4天。作为阴性对照，实验中包括经PBS处理的细胞和经加扰ASO处理的细胞。
剪接转换活性测量
用PBS洗涤细胞，并使用
Figure BDA0003818417890000442
Mini试剂盒(Qiagen，74181)根据制造商的说明提取总RNA。使用iScriptTM Advanced cDNA合成试剂盒(#1725037，BioRad)按照制造商的说明制备cDNA。ddPCR三重分析用于定量：未跳跃的NT5E mRNA(外显子6+外显子7+外显子8)、跳跃的NT5E mRNA(外显子6+外显子8，Δex7)和HPRT1 mRNA(表9)。经PBS处理的样品的Δex7的基础表达水平经测定为未跳跃的NT5E mRNA和跳跃的NT5E之间的比率。随后使用其以计算经ASO处理的样品的剪接转换活性的绝对百分比(％)。ddPCR中使用的引物和探针示于下表9中。
表9.用于ddPCR分析的引物和探针列表。
Figure BDA0003818417890000441
细胞外5′-核苷酸酶活性测量
在最终浓度为25μM的ASO处理4天后，将Colo205细胞在酶活性缓冲液(20mMHEPES、2mM MgCl2、120mM NaCl、5mM KCl、10mM葡萄糖，pH 7.4)中洗涤两次。用一磷酸腺苷(AMP，最终浓度500μM)补充新鲜的酶活性缓冲液并添加到细胞中。在培育(37℃，5％CO2)1小时后，收集上清液并使用Malachite Green分析(#MAK307-1KT，Sigma)按照制造商的说明进行处理以用于游离磷酸盐定量。
免疫印迹分析
将Colo205细胞用最终浓度为25μM的ASO处理4天。将细胞在PBS中洗涤，并在补充有磷酸酶/蛋白酶抑制剂混合液(#78442，ThermoFisher Scientific)的RIPA缓冲液(#89900，ThermoFisher Scientific)中裂解。使用Wes(Simple Wes)在2-230kDa分离基质上解析和检测CD73和GAPDH蛋白。光密度分析用于定量蛋白质信号强度。使用兔抗CD73抗体(D7F9A，Cell Signaling)和小鼠抗GAPDH抗体(ab11035，Abcam)。
细胞活力和胱天蛋白酶3/7测量
将Colo205细胞以3,000个细胞/孔接种于96孔板格式中。12小时后，将细胞用增加浓度的ASO化合物通过无辅助吸收来处理4天。使用Cell Titer
Figure BDA0003818417890000451
(#G7571，Promega)和Caspase
Figure BDA0003818417890000452
3/7分析试剂盒(#G8090，Promega)按照制造商的说明，测量细胞活力和胱天蛋白酶3活性。未处理样品的胱天蛋白酶活性和细胞滴度测量值的比率用作标准化比率(＝1)。
RNA测序和差异基因表达分析
将Colo205细胞用剪接转换ASO-15和ASO-52以及现有技术的抗CD73间隔聚物ASO-83和ASO-84(10μM)处理4天或不处理(n＝3)。使用来自QIAGEN的
Figure BDA0003818417890000453
Plus Mini试剂盒提取总RNA。使用用于Illumina的KAPA mRNA HyperPrep试剂盒，按照制造商的说明制备链mRNA文库，并在Illumina NextSeq500上进行测序。每个样品大约有15000条读数经解复用。使用CLC基因组工作台对经测序读数进行QC测试、修剪和映射。显著差异表达的基因被定义为具有：-log10(p值)＞2且log2倍数变化＞1。
实例2-剪接转换活性测定
筛选反义寡核苷酸的剪接转换活性
82种LNA混聚物经设计、合成并针对如上文所描述的A549和Colo205细胞系中人CD73的剪接转换活性进行筛选。具有序列和相应外显子跳跃活性(exS)的反义寡核苷酸的列表描述于上表8中。已鉴别出靶向3′剪接位点或外显子区域的ASO诱导全长CD73 mRNA向Δex7同种型的高达60％(在A549中)和80％(在Colo205中)的转化。所测试化合物的剪接转换活性显示A549和Colo205细胞之间的r＝0.69(在5μM下)和r＝0.71(在25μM下)的相关性，表明在两种不同的生物系统中，反义寡核苷酸通过类似的作用方式产生外显子跳跃(图1A和1B)。
评估ASO-52和ASO-15的剪接转换活性
进一步在mRNA水平下针对外显子跳跃活性和在蛋白质水平下针对细胞外5’-核苷酸酶活性的酶抑制来评估最强效反义寡核苷酸(ASO-52和ASO-15)的分子效应。用ASO-52或ASO-15处理Colo205细胞诱导全长CD73 mRNA剂量依赖性地转化为Δex7同种型，而加扰ASO不会产生此类效应(图2)。类似地，将Colo205细胞用加扰ASO、ASO-52或ASO-15处理4天，并以由外部补充的AMP水解产生的游离磷酸盐来测量细胞外5′外核苷酸酶活性。ASO-52和ASO-15以剂量依赖性方式抑制CD73活性(图3)。为了表征ASO-52和ASO-15对靶蛋白水平的影响，通过免疫印迹分析来测量CD73总蛋白丰度。用ASO-52和ASO-15处理导致总CD73蛋白含量显著降低，证实Δex7的诱导引起总CD73蛋白去稳定化(图4A和4B)。
实例3-与现有技术间隔聚物(Gapmer)的比较(ASO-83和ASO-84)
剪接转换活性比较
为了进一步表征剪接转换ASO-52和ASO-15，合成Secarna(WO2018/065627)所描述的其中两种最强效的抗CD73间隔聚物(ASO-83和ASO-84)。由于间隔聚物和剪接转换ASO利用不同的分子机制来实现对CD73的抑制，因此通过对细胞外5′外核苷酶活性进行IC50测定来评估其效力。将Colo205细胞在不同浓度的ASO下处理4天。现有技术的抗CD73间隔聚物(ASO-83和ASO-84)和剪接转换ASO(ASO-52和ASO-15)对于CD73抑制都显示出相似的IC50值，证明剪接转换ASO诱导CD73外显子7跳跃是降低CD73活性的有效替代治疗方式。结果表现于图5和表10中。
表10.剪接转换ASO-15和ASO-52以及现有技术抗CD73间隔聚物ASO-83和ASO-84的IC50值
寡核苷酸# IC50(μM) Std.误差(±)
ASO-83 0.92 0.14
ASO-84 1.11 0.15
ASO-52 1.60 0.29
ASO-15 1.58 0.43
细胞毒性效应比较
此外，我们评估了剪接转换ASO-15和ASO-52与现有技术的抗CD73间隔聚物ASO-82和ASO-83的细胞毒性效应。将Colo205在增加浓度的ASO下处理4天。测量胱天蛋白酶3活化并针对细胞活力进行标准化(以考虑增殖和细胞数量效应，图6)。剪接转换ASO-15和ASO-52在任何所评估浓度(最大值＝25μM)下未显示对胱天蛋白酶3活性的显著诱导。相反，现有技术的间隔聚物(ASO-83和ASO-84)均以剂量依赖性方式引起细胞凋亡诱导的明显增加。这些数据表明，与现有技术的抗CD73间隔聚物相比，剪接转换ASO具有有利的体外安全性概况。
差异基因表达比较
为了表征由剪接转换ASO-15和ASO-52以及现有技术的抗CD73间隔聚物ASO-83和ASO-84进行处理引起的基因表达的全局扰动，我们进行了RNA-seq和差异基因表达分析。将Colo205细胞用不同的ASO在10μM下处理4天，或不处理(n＝3)。进行差异表达分析，从而将每个经ASO处理的样品与未处理的样品进行比较。每个基因的表达变化幅度和统计显著性水平以火山图表示。与ASO-83和ASO-84处理相比，用ASO-15和ASO-52处理与脱靶基因数目减少有关。还指示了差异表达基因的绝对数目(图7)。
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acccgagccc gcgcccggga tagtagtccc ggactgagag aggagccggg ctggaaaagc 960
agcggatggc agagtgtggc aagcctaggt ccagggcgcg gagagatgtg gggataaagt 1020
gagactccgg ccagtgtgcc agctggatgc atagaagtcc cttggacgat tcgtcttaaa 1080
cggacgttat tgcgccccca ctatgagatg ggagtattta gaggagcagg acccagtcct 1140
gcctgcgagg ggcttaaggt ggggtgcgta gaagcactga cagttatcca gagctaggga 1200
ctgaatcgga tccctcacgc agctctcatt tactgctaga tctttcaaag aatgctttat 1260
ctcaatctag atctttcgaa aaatgcttta tctcaatctt attgaaaggg aaaccgcgtc 1320
gaagaagctg aataaattaa caggcaccat ccccgcaaaa agggagacgt gataagaatg 1380
gacaccagat ctctttgacc ccggagcttg agagtaatta agctcacagc tttggggtag 1440
attctctgtt caattacctt ctatgtgacc ttgagcaagt tatttactct ttcttgcctc 1500
agttctatcc tgtataaaaa taaggattat aattgtacat agtgcacata gtgtggtctc 1560
tatattatta ccagacacat agtgtggtgt ctatatatgt tgttattacc agacactata 1620
atatagggtt aagaaaagga aagaaagaaa gaaagagaaa gaaagaaaga aacttcagag 1680
agagccaaaa tgtggaaaga cttgggtttc aaaggatttc aataaagtag gtttggcggc 1740
agagatttag gaagagtcca acttaagaga taatgggctc ttaaaacatg tgcaaaagtt 1800
tagttcaaag tcccaaatgt taggttaaag gtaatgcctt ttctattgca ctaaattcta 1860
gaaagggagc agaggtggtt gcacagtaat aaataagtac aaccaagatg tatatatggt 1920
ggttaaaaaa aaaataaaac caccacccaa atttaaccct gtgtaaaagc cttgagtaaa 1980
gggattcagc aagactgtgg agaaacttgg gagaagaaaa aagagctttg gaagaggaag 2040
aactgagaaa tctccagaga aacgtccaga gaaatctgtg aagtccacaa gtgtggaagg 2100
gaaagggaag tgtgattagg ctgggataca gaaggctaac agtacacttt atatgagaag 2160
agcttagagg tcaggagagc acaatgctga ggggtttgtt tggttttatt ttcccctctg 2220
gaaacttgga gaaaggagga caggaaaaga tgataagagg gcaccattgt ttggttttaa 2280
aggtccctcc ccaacccccc acaacaagaa agctcatttt aatgagatga gagaagggga 2340
gaaagctccc tccgttctga tgcttttgag cttatcaggg acaccctgca gcagaaattc 2400
cagctgatcc ttcagccttc agagttgatg aggtggggct cacacacatc tggatttgaa 2460
gaagaatcgt gggtttcaag aactctgtgg tctcttaagc attggtattc cacagctaca 2520
cttccctgat actttgcact cagtaatgac aaaataaata tttgtagaat tgagttgttg 2580
ctaccctgtg tctccacttc ctcccagaag ggtagaataa acttacatgt gtttgtttta 2640
ttttgcatat aaaccacgac tttgtaaact ttactttttg tgacactctt ttctccacaa 2700
ttgtgtgaac cctttttagt ggaaaaataa gaatgaagaa ttcctagttt tccctaataa 2760
tatttccctc ttgtaagtct agttgagctc ctggtgttaa tcatggtatc aaatgtttat 2820
gacaggacat ctaggtgagg cctgagtaaa ctgctgtaag ttacagccta tctcttctgt 2880
gtttgttcag aatccttttt gttggatgaa attactttct ttcaaatttt gctcaagaaa 2940
attgaattgg gttctgagga aaaataggct acttacgtaa tgttggcagg gggtaaagat 3000
tgggagcgga tcacatggca aggttagatg gctgtgtcct caggacttac tctgtgcagt 3060
ttgggggtgt gtcaaacatg atttgacgtg cataaaatcc cagttctgta gtgctaaagc 3120
atgtgctaaa gctctgctgt actccagtat tgcacagatg tttcactgtc aattgtttat 3180
attatactaa ccctcagaga atttattgct gttgtggtat aaacgttcct ccactgtaac 3240
cactcaccgc atattgattc ctaggacact ggggattcaa atcagggtgg aaaacagttg 3300
tggaggggca tctccagttt cctggagact ggacctagtt caaaggagcc acataaaagg 3360
actgaagcat atggaggaca aagaggaatt tcctagaatc cagctaaaac acaggagtcc 3420
cctcgagcag gaacttccaa ggaggtgtac actttctaga cctactggag taatcctgat 3480
tgctgtagag gacccagggc aatcctggag accccctgga accactacta ggcagaaaac 3540
tgggaagagg atggcaaaac tctccagtta gtgtagctgt ctcagtggaa ggactgttgt 3600
cccctgaggc acgaggaaga cagcatggaa gcactgacag tatgcgcttg gcctggttac 3660
tttctctgag cttcatgttc cttagctgta aaacaggagt gataaccccc atcttgcaga 3720
ggttttgtga ggaatacatg agataatccc tgctggtgct cactgaaagt gagtttcatg 3780
tgccctgggt ggggaggagg ggaattgtga ggaagggaag gtttgggttg tgcatcagat 3840
tatctgattc tcacagcctg gcacagtcta ccacctgcct gccctctacc atcttaccta 3900
agtaccattg cctaaactat ttttgctata gttactcatt gagcagactt atgaaatctc 3960
cccacagcac aaaactgaag gtatccacct ccagaggtga gattctcacc aagacaggct 4020
gtggggaagg tagctttgag caggtctcta gggtccccta gaaaggtgcc ttttctctgc 4080
ttggctgctg cttctgaggc cctggctgct gagcccactt cctgcccata aggctgcagc 4140
cttagcccta gccaattgct cctaaatggg ggaggcagca gccagggtgg gaaccatggc 4200
ccccgccttt aactcaccca ggggacaggt tagtcagata gatggtcctt tgttcgccac 4260
cctccacctc ccacatagac aacattctaa tgtgtttgat ggactgcata tagttttgtt 4320
tctacatgca ctttcaaaac ctttgtgtgc ttatatttta taatggcata cccagtcctg 4380
ttatttagcc ctttctgttt cttacttttg tcctgaactt attgttttta tgatttgtcc 4440
atgttgccct agatgccctt atacctatac atcactgtga attgtgctct gtgtatttta 4500
cccatctcca cgtattttac ccatctgctc cctggctgat gggtttggag atggcgtcta 4560
acaccctgcc tccacaaata atgctgctcc agatatcttc ctggatggtc tcaccagatg 4620
atttctaccc aggagcagaa ttgctggcca cagggcatac tttgagtact acaagactgg 4680
tttcctcaat gactgacatc ctccattctc ttccacctac tcccatcccc aaacaggaca 4740
tgtaaatttc tatattttac ctatatatca tggcagtatc cagctttatt gtaggtgtaa 4800
aatacacatt gctgctttat catgtacttt tctaataact agtgagtttg gacatttttt 4860
gatatgtttg ttaacttttt aagcttcctc ttctctaatt gcttattcat attctttggt 4920
attttttaaa ttgggttagc tttatatttt ttgactttca ggagttatag gttttgatct 4980
gtgatcaatt ttagacattg caaatatatt atgatgatat taggtctatt aattttgtcc 5040
atggtatctt tcattgaaca gaaattcttc atttcttgta attgaattaa tctttttttc 5100
cttgtggctt gtgcttttga aagtttgcct aatagtttgc taatttaaag cttatcacct 5160
ttaacactcc tcactggaaa ttcagagatc accacggttc tctctgcctt ttaagagata 5220
aatctacaat ctgtggctat gcaattcact tctcagcatc accagttcct catctataaa 5280
atagaagttt gaaccagctt acctctgagg tcccatacat atttgaacaa ctggagccct 5340
acagtgaaat gttttgattc agtgaaggga caggaggatg gggcaaaggt gtagaggcag 5400
gaatctacac aatggaccag gttggaccag agtgaggtag caggaatcat ggcagaagag 5460
gttgtgtaaa ctctaaaggc cacctgagaa gtttgagtta tgttgccatg ggcagccatg 5520
tggtttctgc gtagaagacc actgtggtat aataaaaaat aaatatttgg tccttgtccc 5580
cagtacctgt cacagagttc ctaaaaccct agaaatttcc taagtaatag aaatgtcctt 5640
tgtgattcat aataaacccc atgataatac ctgggtttat gctcctgcag acttagggtg 5700
agatccctag atagcttcaa gatggaacca gtcaccagca agtccaagag attaggggat 5760
caaagagttg gaactttcgg taccacccac caaagtccag gaaaggaggg tgggactgga 5820
gattcagctc tacaaaaact cttgaacaag atgtgaggag ctttttagtt gctgagcatt 5880
tggaggttcc tggagggtgc acacccaggt agggcatgaa agctccgcat tgcccccata 5940
tcttggccta tccattcttc acttggctgt tcatctatat cctttgtata gcctttataa 6000
taaaccaatg agtgagttct gtaagctgtc ctagcaagtt aattgaagcc aaggaggaag 6060
taatggaaac ccctgattta tagccattca gccagaagca caacctcagg cttgtgatca 6120
gcctgaagtc agggcagtct tgtaggattg agcccttaac ctatgggatc tgacaatgtc 6180
ttgagatagt atcagaattg aattcaatta taggacactc agtttgtgtt ttctggagta 6240
ctgtttggtg tctgggggaa atcccacaca catctggtca cagaagtatt ctgtgttcag 6300
tgtgacagta gaaaaagcag tttgtgtgta tgtgtgtgtt tgtgcttttg tatgctaatg 6360
agatgatcta tggctggggg cccttagata gcttcgggaa gggggctggt cgccagaaag 6420
actaatttat gactagaggg ttagaacttt cagccctacc tctcccactt ctagagggta 6480
gatgggctac agattgagtt cggtctccaa cagccagtga attaatcaat catgccttca 6540
cgataaacct tcatgaagac ccctaaacaa ccagattcag agagcttcca agttggtgaa 6600
catattgagg tgctgggaag gtggtgcaca tggagtgggc atggaagctt tgcccatcca 6660
ctcccatgcc ttgccctgtg catctcttca cttgcttgtt ccctagtcgt atgctttata 6720
ataagccagt aaagtgcttt ccaagttctg tgactcgttc tagccaatta tcaatcccaa 6780
ggatagggtc atgggaacct ccaatttata actagttggt tgggaataca ggtggcccag 6840
gactctcgac tggtgtctga agtgggggca gtcttgtgca tttgagcctt ctcacttgtg 6900
ggatctgatg ctaagtccag gtagagaatg tcagaatgca tctgaattgt tggacaccaa 6960
gttggtgtcc acacagaatt ggggaattgg ttgatgtgag gaaaaaccct cccagctaca 7020
tagggaaatc acggttttgg aagatgagca gaaaagggtg ggagggagaa gacaagagag 7080
aagagggtga ggaaagaggc caggcagcag tccaagtgtg agatgataac acctgaactc 7140
tggtaattga ggagaccaaa tccacgggaa ccagctgcaa aaggcattct gtctggtagg 7200
tatagggcta agggagtaaa cgtgggggtg agactgggat caagtcccct tcctaccact 7260
tagaatctgt ggactgggag caggttattt aatctcatga aacctccatt tccacatgtg 7320
tgaggtatgt gattgttgtc tccaccccta gggtgctgtg gggtttacaa gagatagtag 7380
tgcacataat gtgcttagca cagggccagc ccctagtaag tgccggctgt acttgccttc 7440
tctttgcagg ggtggctcag gagagggtgt aatcaaaaga tgattatgag ggttcaagca 7500
ccaggcaatg ggagagtcag caggttttaa tgcttccaca cagaggctgg attcttctac 7560
ttccgcttac cgctgacagc tgaggcctgc tacctcaagc cctgaaatgc agtctgaaga 7620
cttttcctgg acttactggg caccattgga ctgtacaggg ctgtggcaga caggagcagt 7680
ggaaagagat ttggatggga cgtcagaaca cccagatttt acttcttggc tcttccactt 7740
actagctgtg tgaatttggc agtggtttcc ttatctataa aatgggggaa ttggagaggg 7800
tggtctactg catgttactt ctcagcacct cagctcctcc ccacccctct ctcttgcttc 7860
taatctgcct acatcacttg gtttgtctct ggacaagtct aagtttgcat gacaactctc 7920
taatttctcc ttcacagtta tttatttatt ttttggcagc tatttccttg tggagagata 7980
gcgtaggtct ttcaggtgct tccatttggc cactgtttgc aggtgaagag gtttccagga 8040
tgctcgcggg atgttactct ggtagtaaca gaaatgatgg cctggggaat gggaagagta 8100
tgagcccagt tttgagcctg agtctttggg gctcatttat tcattcaatc tgcaaatctt 8160
cattcagcat tactacatgc caggctctct gctaagtgct gaggatagcg atcaggacct 8220
gctagggtga aaattactct tcagaagata gcagagtgga taatggccat tcgagttcct 8280
cttaactaca cagagggact gggtaagatc tataaaggag agaggttaaa cagcaaagca 8340
aaagtgactg aaattctaac acccatgcat ggggattctt gagctaaaga tctggtctgt 8400
agaagaagac acatcagacc ctcatattta gcatctaagc cgaaatcagc agtaagcatg 8460
tttcttctcc cataaaaact tgtccctaag aagagagaca agtgcttaca aggactctta 8520
tgttaaagga aactgtcaca attactttat cttcagtcat gaagcctttc ttgaggaaag 8580
aaaaattagc aatactagtt tgggaagctt gaaagagaga ttctgtttgc aatgacactt 8640
ttaaaaaggc aacaacaacc aaaaaagtaa ttattcctaa agctcaggtg tcagaagttg 8700
tgaatgtcta gggggttgtg gatccccaac ctcagagaca ggaacagcac cactcccatc 8760
ctggggctgt ggcctcaggc ctctgcttcc tctttttcag tctaaattcc agagcagaga 8820
ggtgctggat gaccagcttc aggcagggga gggaggaagt aaaggtagtt tctcagctca 8880
tcttgtcctc gtactattaa tagcatctgt tgttttctta actgaaaatt ggagagaacc 8940
aaacaaatca acatcatatt ggcggctttc tgcacatcac tcacaaatac atctgaatgc 9000
tctgtactct ccagtgttta ttttcctcag ccacataatc ggaatttgaa cattcttttg 9060
acacttcttt tccctcactt gaataattag ttctatatat aatccaaata ttagctggag 9120
ccctctagcc cctcagagat atagttgaac cttcctggac ctcaattagt tgggcagtta 9180
attctgaatg ttgatgtgcc tattttgcac gtatggagag tttgtacgtc ccccctcccc 9240
aaacaagtag aatgctgtct atttggtact tgctcattca tacattcttt caacaaccaa 9300
acccagttgc agctgggttg aaccccaggg tgtttcctgc tattcagtgt gatgccacat 9360
tcacctgctg tggccaacat tccttggccc aggactgcag ggatggaagc caacccaaca 9420
tcagaagtgg gcaacaatgc cagaaaccta tcaaccaaaa caaatgtaat ttgtaatcct 9480
ccctggatga tgttgagtga ttggcaactg agccccgtca tatagtaaat caggctgtct 9540
ctctttaaaa aagagagaca gagagagaga gagtctccca atgttgccta ggctggtctc 9600
aaactcctgg gctcaagcaa tcatcccttc ttgcctccca aaatgctggg attacaggca 9660
tgagccacca tgcccagcct aggctgtctc tttagctctt caattatagg gcttcctgca 9720
acctcagccc ttaacgaatg agctagcgtg taagtgacta gctaaataaa tgtgctgcaa 9780
acctctgaca aatggctttt tgacattatt aaaatttatt tatgtggaac aaaaaaattc 9840
ttttcttctg catcatgcat cctacactgc ttttaaagaa actctgctat cctttgtttt 9900
accgtctaac atttctttgt ttcccttctg acatgtttca gcctcttgtc atcacttgga 9960
acatttttac tgcctcatcc ctctagtttc catttcctag cctagcccag cccagtattt 10020
ttgaaaccca aatacctgga attttgcctg atgtttaaag ccaaaaccaa atgaaaatgt 10080
gaagaaccaa aggagatttt attcttctgt gactcaaaat cctgttgtta ttgttaaatg 10140
aaccctgtgg gatacagtct ggtattttta acaccttctg ggggtatttg tcaatattta 10200
catttgatgt ggatagctta taaaagtcca gtggctttgg gtaaaccctg ttcactaaga 10260
ataagaccca gaaggtcata tgaatcaacg atcaaagaat gaagatattc tgaatccaag 10320
tttcttgttt tgattattaa aaataccttg caattagtta ggcatgagag aaagcttgtg 10380
tataaagttt ggcttgtaat tcacatgaat tctctataca ggccaaaaac taccttccct 10440
ttgggaatat acaatgacct tatttggaaa ttacttcagg taattatgaa gtaataatat 10500
ctctattcat atgctaaaaa gaattcaaaa taacattcaa ttatcatctc ttagaaacta 10560
aattaaacgg gtactcaccc aagttgaaat gcaaacaaat gcatgatatc attatgtgac 10620
cctcccctag cccttaccct gtccatggca gatgctaaga aaaacttgtc cctaagaaga 10680
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attattttcc atcctgtact aatataataa taagcatgga atctatttat tggttttttc 10860
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gagggaagaa tccttctgac ttttctcttt atcacatttt acccacacac aatgtggatg 10980
gaatctgcaa ctgaatttag cagtcacact gaaactctgc tgcatgacca cactgtcctg 11040
aggccatgtg ccaacttcta tgtttttttt tcccaaagct cttccaagga agagctgcca 11100
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tgaatgaaag aaatcatgag aacactcctg gggtgagagc aagaggaatg aaaacacgtg 11220
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gatatcctgc ggtcttccat taaggcctct tactattctg gaacatttta tttttataga 11400
gaaatctccc acttcctgat ctccccagtt agaattgatt gatcaaagca gtccctctcc 11460
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ctaacacagg agaaatcttt ggtaaatatt tactgaatga atgaacaaat aaataattgg 11580
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gtgataactt tagcaggaaa ttgaaccaca aaaagcaagc gagccacaaa gccctgaagg 11880
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caggagcacc aaatcacctg gatgccatga gctgcttatg acacagttca aggtgtgaca 12900
tctttgaggt ctctccataa cacctctact gcagacgtct gtctctggtg tatcagctgt 12960
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gaccctatgt tctctgtgac accaggtgag ctctggcacc agtgcccagc agatgattac 13080
tgaatgatta ataaaactac tcactccacc tgctgctttt aaatgggctc cattttggta 13140
tgatttggtg cgtgaaccat taaaactttt cagaagtcag gatttgaaac aaacttggta 13200
aaaagtagtt aagcaatgtc ttcgttgtaa agtgagaaac caagttgctt ggaaacaggt 13260
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caattgccca ggttttcttg ttttcatttc tgtgttttaa tttacaagtt acctttatat 13380
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agttctcgta agtgcaatag aagaaaaact ggtagaagga agtcaaatga aaatacaagt 14280
ttctaaagaa aataagtatt tacaaaggaa tttgtctgca ttaatttctg tggaaaagtt 14340
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aggacgtgat ggtgagggag agggaagagg gtgggactcc accgcaccag ggcttctggc 15300
tttattgact gggtatatgg tggcatcctg ggccaagaca gtgagtcaca gggaagaggc 15360
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ccaaggagcg tggagggcag gaccagacca aaggaggcag cccttcctgg gaggaaaggt 43380
gctggcttct tctgtccctt ccgtgacaga agatggaagg gcaggcgtaa aagccccatg 43440
agacaaagag gctgatagcc atcagctgtc caccactcaa gcctagactg aaggatgtta 43500
gagagaggag ctcatgcaga aggctaagga agccctggac ctaagcgttc tcaacactgg 43560
ttatacatta gaatcacttc aggagcattt taaattaaat accaatggct cggccgcagc 43620
tcttaagaga ttctaagtta actggattgg ggctaaactc tttttcagtg attctagtgt 43680
acacccagag gtgaaaacca ctgaagagag aagggttctt aagtactgga gtgatatttt 43740
taaaataaaa ttctgttggg ttcccaacag aacatgggtt cccaacaaac atgggtttgt 43800
tgtagctata ggcaattagc atttatcctc tcctctcttt ggtaaaggaa atcccccaag 43860
tcccatcatc aattacatga aaataattat tgggcaggca aacaaaagga agccagtttt 43920
atctctcaac taattgctct tgacccagtt ccctaatgcc cttgttctgg agtggttcaa 43980
aggctatgat gtcaatgacc tctttctaga gtcatcacag agctgaggca actctacttc 44040
ccccaattac ccaatattga acaacagaca cattttacat ctggagcatg aaaaagcaat 44100
caaattcttt gtacttatga tcactagcgt tcttgtcttc tgtgacactt tacccctgct 44160
tatgaaattg cttccctttt ataattacaa aggactacct tactgttgat tgataattac 44220
cttttctgta gttaaaataa tgtatatgtt tttctaggtg accaagatat caacgtggtt 44280
tctacatata tctccaaaat gaaagtaatt tatccagcag ttgaaggtcg gatcaagttt 44340
tccacaggaa gtcactgcca tggaagcttt tctttaatat ttctttcact ttgggcagtg 44400
atctttgttt tataccaata gccaaaaatt ctccttgcct ttaatgtgtg aaactgcatt 44460
ttttcaagtg agattcaaat ctgcctttta ggacctggct ttgtgacagc aaaaaccatc 44520
tttacaggct cctagaagct gaaggttaga gcattataaa atgaagagac agacatgatt 44580
actcagggtc agcaacctag tgagttagaa aaaaaattaa catagggccc tataaggaga 44640
aagccaacta tgttaagttt acgtgtccaa attttaatga aattttacta acaattttaa 44700
accatatttt tcttcttcat atccatttct aatccatcaa acagcttatg tttacataaa 44760
attttatcat tcacaaggaa gttttaagca cactgtctca tttgatatcc acaacttatt 44820
tttggtagga aagagagatg tttttcccac ctgtcagatg aaaaaactga agctcaaaaa 44880
gggttgactt gaccatacag ctaatgctga cagatccaag acctagacct aggtcttttg 44940
aactcaagtc cagcattctc aactatatca agttactgtt cagaatactt aatatctcct 45000
ctcttcataa ttatcaatag ccccaagctc atggatgaca aatctctgct ttatttcttg 45060
tctctatttt ttcactttat agctcctgtt ataatagcaa gtttaatggt ataaacacag 45120
gataccatcc tctcttgcaa cacccatgtg cctttgatga gtcaggtagc aagctgtagt 45180
agataatgag aaaggccaga ggctgcaaaa gacagtcaaa ggacacgaga gaaaggaagg 45240
ggaagaacag gactccagga ctgttttata ttatagaaaa gcaagagcta aagagcattt 45300
acacatgtta aacagatact tgttaagcat agtgcctgac acacggcatt agctgttatt 45360
ttatgagatt ccatcagctc tgcctctgtc ctctttcttc taacatgaag gtatcatgag 45420
aagagaacct tctaacataa gctgtaattc taaacctgca cttgtccctc tccagcaaga 45480
ggctagcact gaattcattc tactcatact acacacccag ttatggaatg tccagagttc 45540
tcgaagaaaa taaatgactt taggaagagg tatacatttt ttaagtcgct ctgcctccaa 45600
atctgaacag tcactgtaaa tcattcttaa gcccagatat gagaacttct gctggaaagt 45660
gggaccctct gagtgggtgg tcagaaaata cccatgctga tgaaatgacc tatgcccaaa 45720
gaacaaatac ttaacgtggg agtggaacca catgagcctg ctcagctctg cataagtaat 45780
tcaagaaatg ggaggcttca ccttaaaaac agtgtgcaaa tggcagctag aggttttgat 45840
aggaagtatg tttgtttctt agtgtttaca aatattaagt actcttgata caaaatatac 45900
ttttaaactt cataaccttt ttataaaagt tgttgcagca aaataatagc ctcggttcta 45960
tgcatatatg gattagctat aaaaaatgtc aataagattg tacaaggaaa attagagaaa 46020
gtcacattta gggtttattt tttacacttg gccagtaaaa tagggtaaat cctattagaa 46080
ttttttaaag aacttttttt aagtttccta aatctgtgtg tgtattgtga agtggtataa 46140
gaaatgactt tgaaccactt tgcaattgta gattcccaac aataaaattg aagataagct 46200
ctttggtc 46208
<210> 2
<211> 1725
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 2
atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60
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gtggctcggc tcttcaccaa ggttcagcag atccgccgcg ccgaacccaa cgtgctgctg 240
ctggacgccg gcgaccagta ccagggcact atctggttca ccgtgtacaa gggcgccgag 300
gtggcgcact tcatgaacgc cctgcgctac gatgccatgg cactgggaaa tcatgaattt 360
gataatggtg tggaaggact gatcgagcca ctcctcaaag aggccaaatt tccaattctg 420
agtgcaaaca ttaaagcaaa ggggccacta gcatctcaaa tatcaggact ttatttgcca 480
tataaagttc ttcctgttgg tgatgaagtt gtgggaatcg ttggatacac ttccaaagaa 540
accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600
caacctgaag tagataagtt aaaaactcta aatgtgaaca aaattattgc actgggacat 660
tcgggttttg aaatggataa actcatcgct cagaaagtga ggggtgtgga cgtcgtggtg 720
ggaggacact ccaacacatt tctttacaca ggcaatccac cttccaaaga ggtgcctgct 780
gggaagtacc cattcatagt cacttctgat gatgggcgga aggttcctgt agtccaggcc 840
tatgcttttg gcaaatacct aggctatctg aagatcgagt ttgatgaaag aggaaacgtc 900
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cgcaacaatg gcacaattac ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca 1260
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<210> 3
<211> 574
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 3
Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu
20 25 30
His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr
85 90 95
Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala
100 105 110
Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile
115 120 125
Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr
165 170 175
Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val
180 185 190
Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys
195 200 205
Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu
210 215 220
Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys
245 250 255
Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly
260 265 270
Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His
290 295 300
Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile
305 310 315 320
Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met
355 360 365
Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val
370 375 380
Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Asn Gly Thr Ile Thr Trp Glu Asn Leu Ala Ala Val Leu Pro
405 410 415
Phe Gly Gly Thr Phe Asp Leu Val Gln Leu Lys Gly Ser Thr Leu Lys
420 425 430
Lys Ala Phe Glu His Ser Val His Arg Tyr Gly Gln Ser Thr Gly Glu
435 440 445
Phe Leu Gln Val Gly Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys
450 455 460
Pro Gly Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg
465 470 475 480
Val Pro Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile
485 490 495
Leu Pro Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys
500 505 510
Asp Glu Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val
515 520 525
Ser Thr Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly
530 535 540
Arg Ile Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu
545 550 555 560
Ile Phe Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln
565 570
<210> 4
<211> 1575
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 4
atgtgtcccc gagccgcgcg ggcgcccgcg acgctactcc tcgccctggg cgcggtgctg 60
tggcctgcgg ctggcgcctg ggagcttacg attttgcaca ccaacgacgt gcacagccgg 120
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accccttttc tctcaaatcc agggacaaat ttagtgtttg aagatgaaat cactgcatta 600
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tatatctcca aaatgaaagt aatttatcca gcagttgaag gtcggatcaa gttttccaca 1500
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<210> 5
<211> 524
<212> PRT
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 5
Met Cys Pro Arg Ala Ala Arg Ala Pro Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Val Leu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Trp Glu Leu Thr Ile Leu
20 25 30
His Thr Asn Asp Val His Ser Arg Leu Glu Gln Thr Ser Glu Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Cys Val Asn Ala Ser Arg Cys Met Gly Gly Val Ala Arg Leu
50 55 60
Phe Thr Lys Val Gln Gln Ile Arg Arg Ala Glu Pro Asn Val Leu Leu
65 70 75 80
Leu Asp Ala Gly Asp Gln Tyr Gln Gly Thr Ile Trp Phe Thr Val Tyr
85 90 95
Lys Gly Ala Glu Val Ala His Phe Met Asn Ala Leu Arg Tyr Asp Ala
100 105 110
Met Ala Leu Gly Asn His Glu Phe Asp Asn Gly Val Glu Gly Leu Ile
115 120 125
Glu Pro Leu Leu Lys Glu Ala Lys Phe Pro Ile Leu Ser Ala Asn Ile
130 135 140
Lys Ala Lys Gly Pro Leu Ala Ser Gln Ile Ser Gly Leu Tyr Leu Pro
145 150 155 160
Tyr Lys Val Leu Pro Val Gly Asp Glu Val Val Gly Ile Val Gly Tyr
165 170 175
Thr Ser Lys Glu Thr Pro Phe Leu Ser Asn Pro Gly Thr Asn Leu Val
180 185 190
Phe Glu Asp Glu Ile Thr Ala Leu Gln Pro Glu Val Asp Lys Leu Lys
195 200 205
Thr Leu Asn Val Asn Lys Ile Ile Ala Leu Gly His Ser Gly Phe Glu
210 215 220
Met Asp Lys Leu Ile Ala Gln Lys Val Arg Gly Val Asp Val Val Val
225 230 235 240
Gly Gly His Ser Asn Thr Phe Leu Tyr Thr Gly Asn Pro Pro Ser Lys
245 250 255
Glu Val Pro Ala Gly Lys Tyr Pro Phe Ile Val Thr Ser Asp Asp Gly
260 265 270
Arg Lys Val Pro Val Val Gln Ala Tyr Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Gly
275 280 285
Tyr Leu Lys Ile Glu Phe Asp Glu Arg Gly Asn Val Ile Ser Ser His
290 295 300
Gly Asn Pro Ile Leu Leu Asn Ser Ser Ile Pro Glu Asp Pro Ser Ile
305 310 315 320
Lys Ala Asp Ile Asn Lys Trp Arg Ile Lys Leu Asp Asn Tyr Ser Thr
325 330 335
Gln Glu Leu Gly Lys Thr Ile Val Tyr Leu Asp Gly Ser Ser Gln Ser
340 345 350
Cys Arg Phe Arg Glu Cys Asn Met Gly Asn Leu Ile Cys Asp Ala Met
355 360 365
Ile Asn Asn Asn Leu Arg His Thr Asp Glu Met Phe Trp Asn His Val
370 375 380
Ser Met Cys Ile Leu Asn Gly Gly Gly Ile Arg Ser Pro Ile Asp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Asn Gly Ile His Val Val Tyr Asp Leu Ser Arg Lys Pro Gly
405 410 415
Asp Arg Val Val Lys Leu Asp Val Leu Cys Thr Lys Cys Arg Val Pro
420 425 430
Ser Tyr Asp Pro Leu Lys Met Asp Glu Val Tyr Lys Val Ile Leu Pro
435 440 445
Asn Phe Leu Ala Asn Gly Gly Asp Gly Phe Gln Met Ile Lys Asp Glu
450 455 460
Leu Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Gln Asp Ile Asn Val Val Ser Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Ser Lys Met Lys Val Ile Tyr Pro Ala Val Glu Gly Arg Ile
485 490 495
Lys Phe Ser Thr Gly Ser His Cys His Gly Ser Phe Ser Leu Ile Phe
500 505 510
Leu Ser Leu Trp Ala Val Ile Phe Val Leu Tyr Gln
515 520
<210> 6
<211> 250
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 6
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ctgggagaac ctggctgctg tattgccctt tggaggcaca tttgacctag tccagttaaa 120
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
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aatagcttga gaaaatgc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 8
gaaaatagct tgagaaaa 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 9
aaggaaaata gcttgaga 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 10
aagaaggaaa atagcttg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 11
ggcaagaagg aaaatagc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 12
tgaggcaaga aggaaaat 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 13
agatgaggca agaaggaa 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 14
cacagatgag gcaagaag 18
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 15
agtcacagat gaggcaag 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 16
ggtagtcaca gatgaggc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 17
gagggtagtc acagatga 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 18
cctgagggta gtcacaga 18
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 19
gtgcctgagg gtagtcac 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 20
attgtgcctg agggtagt 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 21
gtaattgtgc ctgagggt 18
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 22
caggtaattg tgcctgag 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 23
tcccaggtaa ttgtgcct 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 24
ttctcccagg taattgtg 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 25
aggttctccc aggtaatt 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 26
gccaggttct cccaggta 18
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 27
gcagccaggt tctcccag 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 28
acagcagcca ggttctcc 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 29
aatacagcag ccaggttc 18
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 30
ggcaatacag cagccagg 18
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 31
aagggcaata cagcagcc 18
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 32
ccaaagggca atacagca 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 33
cctccaaagg gcaataca 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 34
gtgcctccaa agggcaat 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 35
aatgtgcctc caaagggc 18
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 36
tcaaatgtgc ctccaaag 18
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 37
aggtcaaatg tgcctcca 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 38
actaggtcaa atgtgcct 18
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 39
tggactaggt caaatgtg 18
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 40
aactggacta ggtcaaat 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 41
tttaactgga ctaggtca 18
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 42
ccttttaact ggactagg 18
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 43
gaacctttta actggact 18
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 44
gtggaacctt ttaactgg 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 45
agggtggaac cttttaac 18
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 46
ttcagggtgg aacctttt 18
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 47
ttcttcaggg tggaacct 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 48
gccttcttca gggtggaa 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 49
aaggccttct tcagggtg 18
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 50
tcaaaggcct tcttcagg 18
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 51
tgctcaaagg ccttcttc 18
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 52
ctatgctcaa aggccttc 18
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 53
acgctatgct caaaggcc 18
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 54
tgcacgctat gctcaaag 18
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 55
cggtgcacgc tatgctca 18
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 56
tagcggtgca cgctatgc 18
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 57
ccgtagcggt gcacgcta 18
<210> 58
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 58
tggccgtagc ggtgcacg 18
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 59
gactggccgt agcggtgc 18
<210> 60
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 60
gtggactggc cgtagcgg 18
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 61
ccagtggact ggccgtag 18
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 62
tctccagtgg actggccg 18
<210> 63
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 63
aactctccag tggactgg 18
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 64
aggaactctc cagtggac 18
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 65
tgcaggaact ctccagtg 18
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 66
acctgcagga actctcca 18
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 67
cccacctgca ggaactct 18
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 68
ccgcccacct gcaggaac 18
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 69
ttaccgccca cctgcagg 18
<210> 70
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 70
gacttaccgc ccacctgc 18
<210> 71
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 71
ggtgacttac cgcccacc 18
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 72
atgggtgact taccgccc 18
<210> 73
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 73
aggatgggtg acttaccg 18
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 74
tacaggatgg gtgactta 18
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 75
ccctacagga tgggtgac 18
<210> 76
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 76
cagccctaca ggatgggt 18
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 77
ggccagccct acaggatg 18
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 78
atgggccagc cctacagg 18
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 79
tggatgggcc agccctac 18
<210> 80
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 80
ctttggatgg gccagccc 18
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 81
tcactttgga tgggccag 18
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 82
atgtcacttt ggatgggc 18
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 83
gccatgtcac tttggatg 18
<210> 84
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 84
aatgccatgt cactttgg 18
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 85
ccaggtaatt gtgcctgagg 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 86
cccaggtaat tgtgcctgag 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 87
tcccaggtaa ttgtgcctga 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 88
ctcccaggta attgtgcctg 20
<210> 89
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 89
gatttcccag tgccat 16
<210> 90
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 90
gcactcgaca cttggt 16
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 91
gtacatccac ttattcaa 18
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 寡核苷酸核碱基序列
<400> 92
ccaaatctta taataactac 20
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 93
gcattttctc aagctatt 18
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 94
ttttctcaag ctattttc 18
<210> 95
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 95
tctcaagcta ttttcctt 18
<210> 96
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 96
caagctattt tccttctt 18
<210> 97
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 97
gctattttcc ttcttgcc 18
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 98
attttccttc ttgcctca 18
<210> 99
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 99
ttccttcttg cctcatct 18
<210> 100
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 100
cttcttgcct catctgtg 18
<210> 101
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 101
cttgcctcat ctgtgact 18
<210> 102
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 102
gcctcatctg tgactacc 18
<210> 103
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 103
tcatctgtga ctaccctc 18
<210> 104
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 104
tctgtgacta ccctcagg 18
<210> 105
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 105
gtgactaccc tcaggcac 18
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 106
actaccctca ggcacaat 18
<210> 107
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 107
accctcaggc acaattac 18
<210> 108
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 108
ctcaggcaca attacctg 18
<210> 109
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 109
aggcacaatt acctggga 18
<210> 110
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 110
cacaattacc tgggagaa 18
<210> 111
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 111
aattacctgg gagaacct 18
<210> 112
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 112
tacctgggag aacctggc 18
<210> 113
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 113
ctgggagaac ctggctgc 18
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 114
ggagaacctg gctgctgt 18
<210> 115
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 115
gaacctggct gctgtatt 18
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 116
cctggctgct gtattgcc 18
<210> 117
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 117
ggctgctgta ttgccctt 18
<210> 118
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 118
tgctgtattg ccctttgg 18
<210> 119
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 119
tgtattgccc tttggagg 18
<210> 120
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 120
attgcccttt ggaggcac 18
<210> 121
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 121
gccctttgga ggcacatt 18
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 122
ctttggaggc acatttga 18
<210> 123
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 123
tggaggcaca tttgacct 18
<210> 124
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 124
aggcacattt gacctagt 18
<210> 125
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 125
cacatttgac ctagtcca 18
<210> 126
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 126
atttgaccta gtccagtt 18
<210> 127
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 127
tgacctagtc cagttaaa 18
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 128
cctagtccag ttaaaagg 18
<210> 129
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 129
agtccagtta aaaggttc 18
<210> 130
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 130
ccagttaaaa ggttccac 18
<210> 131
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 131
gttaaaaggt tccaccct 18
<210> 132
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 132
aaaaggttcc accctgaa 18
<210> 133
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 133
aggttccacc ctgaagaa 18
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 134
ttccaccctg aagaaggc 18
<210> 135
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 135
caccctgaag aaggcctt 18
<210> 136
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 136
cctgaagaag gcctttga 18
<210> 137
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 137
gaagaaggcc tttgagca 18
<210> 138
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 138
gaaggccttt gagcatag 18
<210> 139
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 139
ggcctttgag catagcgt 18
<210> 140
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 140
ctttgagcat agcgtgca 18
<210> 141
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 141
tgagcatagc gtgcaccg 18
<210> 142
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 142
gcatagcgtg caccgcta 18
<210> 143
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 143
tagcgtgcac cgctacgg 18
<210> 144
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 144
cgtgcaccgc tacggcca 18
<210> 145
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 145
gcaccgctac ggccagtc 18
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 146
ccgctacggc cagtccac 18
<210> 147
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 147
ctacggccag tccactgg 18
<210> 148
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 148
cggccagtcc actggaga 18
<210> 149
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 149
ccagtccact ggagagtt 18
<210> 150
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 150
gtccactgga gagttcct 18
<210> 151
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 151
cactggagag ttcctgca 18
<210> 152
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 152
tggagagttc ctgcaggt 18
<210> 153
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 153
agagttcctg caggtggg 18
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 154
gttcctgcag gtgggcgg 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 155
cctgcaggtg ggcggtaa 18
<210> 156
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 156
gcaggtgggc ggtaagtc 18
<210> 157
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 157
ggtgggcggt aagtcacc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 158
gggcggtaag tcacccat 18
<210> 159
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 159
cggtaagtca cccatcct 18
<210> 160
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 160
taagtcaccc atcctgta 18
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 161
gtcacccatc ctgtaggg 18
<210> 162
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 162
acccatcctg tagggctg 18
<210> 163
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 163
catcctgtag ggctggcc 18
<210> 164
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 164
cctgtagggc tggcccat 18
<210> 165
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 165
gtagggctgg cccatcca 18
<210> 166
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 166
gggctggccc atccaaag 18
<210> 167
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 167
ctggcccatc caaagtga 18
<210> 168
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 168
gcccatccaa agtgacat 18
<210> 169
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 169
catccaaagt gacatggc 18
<210> 170
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 170
ccaaagtgac atggcatt 18
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 171
cctcaggcac aattacctgg 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 172
ctcaggcaca attacctggg 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 173
tcaggcacaa ttacctggga 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 174
caggcacaat tacctgggag 20
<210> 175
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 175
atggcactgg gaaatc 16
<210> 176
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 176
accaagtgtc gagtgc 16
<210> 177
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 177
ttgaataagt ggatgtac 18
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人 (homo sapiens)
<400> 178
gtagttatta taagatttgg 20
<210> 179
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 179
ggaggtggta tccggtc 17
<210> 180
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 180
ccgaaaacct ggagacag 18
<210> 181
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 181
aacgcaacaa tggaatccat gtggtg 26
<210> 182
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 182
aacgcaacaa tggcacaatt acct 24
<210> 183
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 183
gcgatgtcaa taggactcca g 21
<210> 184
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 184
ttgttgtagg atatgccctt ga 22
<210> 185
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 185
agcctaagat gagagttcaa gttgagtttg g 31
<210> 186
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 186
agcctaagat gagagttcaa gttgagtttg g 31

Claims (26)

1.一种靶向哺乳动物CD73前体mRNA的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸调节所述哺乳动物CD73前体mRNA的剪接，并且包含长度为至少10个核苷酸的连续核苷酸序列，所述连续核苷酸序列与所述哺乳动物CD73前体mRNA具有至少90％互补性，诸如100％互补性。
2.根据权利要求1所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够增强外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的表达。
3.根据权利要求1或2所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够减少WT哺乳动物CD73 mRNA的表达。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列能够增强外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的表达且能够减少WT哺乳动物CD73 mRNA的表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的长度为10-40个，诸如10-25个、诸如15–20个核苷酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与SEQ ID NO:1互补，诸如完全互补。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与SEQ ID NO:6互补，诸如完全互补。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:93–174组成的组的序列互补，诸如完全互补。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸为或包含反义寡核苷酸混聚物或全聚物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列的长度为10–20个核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸的所述连续核苷酸序列由选自SEQ ID NO:7–88中之任一个的序列组成或包含所述序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸由本文提供的寡核苷酸组成或包含所述寡核苷酸，所述寡核苷酸诸如选自由ASO ID NOASO-1–ASO-82中之任一个组成的组的反义寡核苷酸。
13.一种缀合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸，以及共价连接至所述反义寡核苷酸的至少一个缀合物部分。
14.一种根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13所述的缀合物的药用盐。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸或根据权利要求13所述的缀合物以及药用稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。
16.一种用于在表达哺乳动物CD73的靶细胞中调节哺乳动物CD73前体mRNA的剪接的体内或体外方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1-12中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求13所述的缀合物、或根据权利要求14所述的药用盐、或根据权利要求15所述的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的所述施用引起外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的增强表达。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的所述施用引起WT哺乳动物CD73 mRNA的减少表达。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的所述施用引起外显子7缺失型哺乳动物CD73 mRNA的增强表达及WT哺乳动物CD73 mRNA的减少表达。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述哺乳动物细胞为人细胞。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物CD73 mRNA为人CD73mRNA。
23.一种用于治疗或预防癌症的方法，其包括向罹患或易患癌症的受试者施用治疗上或预防上有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求13所述的缀合物、或根据权利要求14所述的药用盐、或根据权利要求15所述的药物组合物，所述癌症为诸如选自由以下项组成的组的癌症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
24.根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求13所述的缀合物、或根据权利要求14所述的药用盐、或根据权利要求15所述的药物组合物，其用作药物。
25.根据权利要求1至12中任一项所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求13所述的缀合物、或根据权利要求14所述的药用盐、或根据权利要求15所述的药物组合物，其用于治疗癌症，诸如选自由以下项组成的组的癌症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
26.一种根据权利要求1至12所述的反义寡核苷酸、或根据权利要求13所述的缀合物、或根据权利要求14所述的药用盐、或根据权利要求15所述的药物组合物在制备用于治疗或预防癌症的药物的用途，所述癌症为诸如选自由以下项组成的组的癌症：结肠直肠癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、默克尔细胞癌、间皮瘤癌、子宫内膜癌、卵巢癌、葡萄膜癌、肾上腺皮质癌、生殖细胞癌、食管胃癌、皮肤鳞状细胞癌、肛门癌、黑色素瘤癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肉瘤、肝细胞癌、前列腺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。
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