CN115175991A - 工程化肌肉靶向组合物 - Google Patents
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Abstract
本文描述了能够特异性靶向肌细胞并且可包含n‑mer基序的靶向部分。在一些实施方案中,所述n‑mer基序含有RGD基序。本文还描述了可编码和/或含有一个或多个靶向部分的载体系统、粒子、多肽。本文还描述了使用本文所述的一个或多个靶向部分将货物递送至细胞诸如肌细胞的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以下的权益和优先权:提交于2019年10月16日名称为“工程化腺相关病毒衣壳(Engineered Adeno-Associated Virus Capsids)”的美国临时专利申请号62/916,207;提交于2019年10月16日名称为“工程化腺相关病毒衣壳(Engineered Adeno-Associated Virus Capsids)”的62/916,221;提交于2020年4月30日名称为“工程化腺相关病毒衣壳(Engineered Adeno-Associated Virus Capsids)”的63/018,454;以及提交于2020年7月22日名称为“工程化肌肉靶向组合物(Engineered Muscle TargetingCompositions)”的63/055,252,所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请含有以电子形式提交的序列表,所述序列表为ASCII.txt文件,名称为BROD-5005WP.txt,创建于2020年10月16日,并且具有1,800,000字节的大小。序列表的内容以其整体并入本文。
技术领域
本文公开的主题通常涉及肌肉靶向组合物,其包括但不限于重组腺相关病毒(AAV)载体及其系统、组合物及其用途。
背景技术
重组AAV(rAAV)是基因治疗和基因编辑最常用的递送媒介物。尽管如此,含有天然衣壳变体的rAAV具有受限的细胞趋向性。事实上,今天使用的rAAV在全身递送之后主要感染肝脏。此外,这些具有天然衣壳变体的常规rAAV在其他细胞类型、组织和器官中转导常规rAAV的效率是受限的。因此,对于影响肝脏以外的细胞、组织和器官(例如神经系统、骨骼肌和心肌)的疾病,AAV介导的多核苷酸递送通常需要注射大剂量的病毒(通常约为1x 1014vg/kg),这通常会导致肝毒性。此外,因为在使用常规rAAV时需要大剂量,所以制造向成年患者给药所需的足够量的治疗性rAAV是极具挑战性的。另外,由于基因表达和生理学的差异,小鼠和灵长类动物模型对病毒衣壳的反应不同。不同病毒粒子的转导效率在不同物种之间存在差异,因此,小鼠的临床前研究通常不能准确反映灵长类动物(包括人类)的结果。因此,需要用于治疗各种遗传疾病的改进的rAAV。
发明内容
在本文的某些示例性实施方案中描述了包含有效靶向肌细胞的靶向部分的组合物,其中靶向部分包含n-mer基序;以及货物,其中货物与靶向部分偶联或以其他方式缔合。
在某些示例性实施方案中,n-mer基序包含RGD基序或非RGD n-mer基序。
在某些示例性实施方案中,RGD基序具有式XmRGDXn,其中m为0-4个氨基酸,其中n为0-15个氨基酸,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
在某些示例性实施方案中,RGD基序具有式RGDXn,其中n为4或5,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
在某些示例性实施方案中,n-mer基序是SEQ ID NO:13-50、1277-2493、3737-4979、6647-8313、8314-8502或8692-8889中任一者。
在某些示例性实施方案中,靶向部分包含多肽、多核苷酸、脂质、聚合物、糖或其组合。
在某些示例性实施方案中,靶向部分包含病毒蛋白。
在某些示例性实施方案中,病毒蛋白是衣壳蛋白。
在某些示例性实施方案中,病毒蛋白是腺相关病毒(AAV)蛋白。
在某些示例性实施方案中,n-mer基序位于病毒蛋白的两个氨基酸之间,使得n-mer基序在病毒衣壳的外部,所述病毒衣壳蛋白是病毒衣壳的一部分。
在某些示例性实施方案中,n-mer基序插入在AAV9衣壳多肽中或在AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸262-269之间、327-332之间、382-386之间、452-460之间、488-505之间、527-539之间、545-558之间、581-593之间、704-714之间或其任何组合的任何两个连续氨基酸之间。
在某些示例性实施方案中,n-mer基序插入在AAV9衣壳多肽中或在AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸588与589之间。
在某些示例性实施方案中,组合物是工程化病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,工程化病毒粒子是工程化AAV病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,AAV病毒粒子是工程化AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74或AAV rh.10病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,货物能够治疗或预防肌肉疾病或病症。
在某些示例性实施方案中,肌肉疾病或病症是
a.自身免疫疾病;
b.癌症;
c.肌营养不良;
d.神经肌肉疾病;
e.糖或糖原贮积病;
f.扩增重复疾病;
g.显性负效应疾病;
h.心肌病;
i.病毒性疾病;
j.早衰病;或
k.其任何组合。
在某些示例性实施方案中,货物是
a.吗啉代;
b.肽连接的吗啉代;
c.反义寡核苷酸;
d.治疗性转基因PMO;
e.编码治疗性多肽或肽的多核苷酸;
f.PPMO;
g.一种或多种肽或多肽;
h.一种或多种编码CRISPR-Cas蛋白、引导RNA或两者的多核苷酸;
i.核糖核蛋白,其中核糖核蛋白包含CRISPR-Cas系统分子;
j.治疗性转基因RNA或其他基因修饰或治疗性RNA和/或蛋白质;或
k.其任何组合。
在某些示例性实施方案中,货物能够诱导基因中的外显子跳跃。
在某些示例性实施方案中,货物能够诱导肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃。
在某些示例性实施方案中,货物是小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因。
在某些示例性实施方案中,小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复1、1'、2、3、16、17、20、21、22、23、24或其任何组合,以及任选nNOS结构域、肌动蛋白结合结构域、一个或多个铰链区、肌营养不良蛋白聚糖结合结构域或其任何组合。
在某些示例性实施方案中,货物与肌肉特异性启动子可操作地偶联。
在某些示例性实施方案中,扩增重复疾病是亨廷顿病(Huntington’s disease)、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在某些示例性实施方案中,肌营养不良是杜兴氏肌营养不良(Duchene musculardystrophy)、贝克氏肌营养不良(Becker Muscular dystrophy)、肢带型肌营养不良(Limb-Girdle muscular dystrophy)、埃默里-德赖弗斯肌营养不良(Emery Dreifuss musculardystrophy)、强直性肌营养不良或FSHD。
在某些示例性实施方案中,强直性肌营养不良是1型或2型强直性肌营养不良。
在某些示例性实施方案中,心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、杜兴氏肌营养不良相关心肌病或达农病(Dannon disease)。
在某些示例性实施方案中,糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病(Pompedisease)。
在某些示例性实施方案中,MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。
在某些示例性实施方案中,神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)或弗里德赖希共济失调(Friedreich’s Ataxia)。
在某些示例性实施方案中,组合物具有增加的肌细胞效能、肌细胞特异性、降低的免疫原性或其任何组合。
在本文的某些示例性实施方案中描述了包含载体的载体系统,所述载体包含:一个或多个各自编码有效靶向肌细胞的一个或多个靶向部分的全部或部分的多核苷酸,其中每个靶向部分包含一个或多个n-mer基序,其中每个n-mer基序RGD基序或非RGD n-mer基序,并且其中每个多核苷酸至少编码一个或多个n-mer基序中的一个或多个;以及任选地,调节元件,其与一个或多个多核苷酸中的一个或多个可操作地偶联。
在某些示例性实施方案中,RGD基序具有式XmRGDXn,其中m为0-4个氨基酸,其中n为0-15个氨基酸,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
在某些示例性实施方案中,RGD基序具有式RGDXn,其中n为4或5,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
在某些示例性实施方案中,n-mer基序是SEQ ID NO:13-50、1277-2493、3737-4979、6647-8313、8314-8502或8692-8889中任一者。
在某些示例性实施方案中,载体系统还包含货物。
在某些示例性实施方案中,货物是货物多核苷酸并且任选与编码靶向部分、调节元件或两者的一个或多个多核苷酸中的一个或多个偶联。
在某些示例性实施方案中,货物多核苷酸与编码靶向部分的一个或多个多核苷酸存在于相同的载体或不同的载体上。
在某些示例性实施方案中,载体系统能够产生含有货物的病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,载体系统能够产生包含一个或多个靶向部分的病毒衣壳多肽。
在某些示例性实施方案中,载体系统能够产生AAV病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,AAV病毒粒子是工程化AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74或AAV rh.10病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,衣壳多肽是工程化AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74、AAV rh.10衣壳多肽。
在某些示例性实施方案中,其中将编码一个或多个n-mer基序的一个或多个多核苷酸中的至少一个插入在对应于病毒蛋白的两个氨基酸的两个密码子之间,使得n-mer基序中的至少一个在病毒衣壳的外部。
在某些示例性实施方案中,两个密码子对应于AAV9衣壳多肽中或在AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸262-269之间、327-332之间、382-386之间、452-460之间、488-505之间、527-539之间、545-558之间、581-593之间、704-714之间或其任何组合的任何两个连续氨基酸。
在某些示例性实施方案中,两个密码子对应于AAV9衣壳多核苷酸中或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸588和589。
在某些示例性实施方案中,包含各自编码一个或多个靶向部分的全部或部分的一个或多个多核苷酸的载体不包含剪接调节元件。
在某些示例性实施方案中,载体系统还包含编码病毒rep蛋白的多核苷酸。
在某些示例性实施方案中,病毒rep蛋白是AAV rep蛋白。
在某些示例性实施方案中,编码病毒rep蛋白的多核苷酸与各自编码一个或多个靶向部分的全部或部分的一个或多个多核苷酸在相同的载体或不同的载体上。
在某些示例性实施方案中,病毒rep蛋白与调节元件可操作地偶联。
在本文的某些示例性实施方案中描述了通过表达如本文(例如像在段落[0038]-[0057]中任一者中)所述的载体系统产生的多肽。
在某些示例性实施方案中,多肽是病毒多肽。
在某些示例性实施方案中,病毒多肽是AAV多肽。
在本文的某些示例性实施方案中描述了通过表达如本文(例如像在段落[0038]-[0057]中任一者中)所述的载体系统产生的粒子。
在某些示例性实施方案中,粒子是病毒粒子。
在某些示例性实施方案中,病毒粒子是腺相关病毒(AAV)粒子。
在某些示例性实施方案中,病毒粒子具有肌肉特异性趋向性。
在某些示例性实施方案中描述了如本文(例如像在段落[0038]-[0057]中任一者中)所述的载体系统、如本文(例如像在段落[0058]-[0060]中任一者中)所述的多肽或如本文(例如像在段落[0061]-[0064]中任一者中)所述的粒子,货物能够治疗或预防肌肉疾病或病症。
在某些示例性实施方案中,肌肉疾病或病症是
a.自身免疫疾病;
b.癌症;
c.肌营养不良;
d.神经肌肉疾病;
e.糖或糖原贮积病;
f.扩增重复疾病;
g.显性负效应疾病;
h.心肌病;
i.病毒性疾病;
j.早衰病;或
k.其任何组合。
在某些示例性实施方案中,货物是
a.吗啉代;
b.肽连接的吗啉代;
c.反义寡核苷酸;
d.治疗性转基因PMO;
e.编码治疗性多肽或肽的多核苷酸;
f.PPMO;
g.一种或多种肽或多肽;
h.一种或多种编码CRISPR-Cas蛋白、引导RNA或两者的多核苷酸;
i.核糖核蛋白,其中核糖核蛋白包含CRISPR-Cas系统分子;
j.治疗性转基因RNA或其他基因修饰或治疗性RNA和/或蛋白质;或
k.其任何组合。
在某些示例性实施方案中,货物能够诱导基因中的外显子跳跃。
在某些示例性实施方案中,货物能够诱导肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃。
在某些示例性实施方案中,货物是小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因。
在某些示例性实施方案中,小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复1、1'、2、3、16、17、20、21、22、23、24或其任何组合,以及任选nNOS结构域、肌动蛋白结合结构域、一个或多个铰链区、肌营养不良蛋白聚糖结合结构域或其任何组合。
在某些示例性实施方案中,扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在某些示例性实施方案中,肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。
在某些示例性实施方案中,强直性肌营养不良是1型或2型。
在某些示例性实施方案中,心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、DMD相关心肌病或达农病。
在某些示例性实施方案中,糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。
在某些示例性实施方案中,MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。
在某些示例性实施方案中,神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
在某些示例性实施方案中,多肽、粒子或两者具有增加的肌细胞效能、肌细胞特异性、降低的免疫原性或其任何组合。
一种细胞,其包含:
a.如本文(例如像段落[0007]-[0037]中任一者中)所述的组合物;
b.如本文(例如像段落[0038]-[0057]或[0065]-[0078]中任一者中)所述的载体系统;
c.如本文(例如像段落[0058]-[0060]或[0065]-[0079]中任一者中)所述的多肽;
d.如本文(例如像段落[0061]-[0079]中任一者中)所述的粒子;或
e.其组合。
在某些示例性实施方案中,其中细胞是原核的。
在某些示例性实施方案中,其中细胞是真核的。
一种药物制剂,其包含:
a.如本文(例如像段落[0007]-[0037]中任一者中)所述的组合物;
b.如本文(例如像段落[0038]-[0057]或[0065]-[0078]中任一者中)所述的载体系统;
c.如本文(例如像段落[0058]-[0060]或[0065]-[0079]中任一者中)所述的多肽;
d.如本文(例如像段落[0061]-[0079]中任一者中)所述的粒子;
e.如本文(例如像段落[0080]-[0082]中任一者中)所述的细胞;或
f.其组合;以及
药学上可接受的载剂。
一种方法,其包括:
向有需要的受试者施用
a.如本文(例如像段落[0007]-[0037]中任一者中)所述的组合物;
b.如本文(例如像段落[0038]-[0057]或[0065]-[0078]中任一者中)所述的载体系统;
c.如本文(例如像段落[0058]-[0060]或[0065]-[0079]中任一者中)所述的多肽;
d.如本文(例如像段落[0061]-[0079]中任一者中)所述的粒子;
e.如本文(例如像段落[0080]-[0082]中任一者中)所述的细胞;
f.如本文(例如像段落[0083]中)所述的药物制剂;或
g.其组合。
在某些示例性实施方案中,有需要的受试者患有肌肉疾病或病症。
在某些示例性实施方案中,肌肉疾病或病症是
a.自身免疫疾病;
b.癌症;
c.肌营养不良;
d.神经肌肉疾病;
e.糖或糖原贮积病;
f.扩增重复疾病;
g.显性负效应疾病;
h.心肌病;
i.病毒性疾病;
j.早衰病;或
k.其任何组合。
在某些示例性实施方案中,扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
在某些示例性实施方案中,肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。
在某些示例性实施方案中,强直性肌营养不良是1型或2型。
在某些示例性实施方案中,心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、DMD相关心肌病或达农病。
在某些示例性实施方案中,糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。
在某些示例性实施方案中,MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。
在某些示例性实施方案中,神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
本领域普通技术人员在考虑所示出示例性实施方案的以下详细说明后,示例性实施方案的这些和其他实施方案、目标、特征和优点将变得显而易见。
附图说明
本发明的特征和优势的理解通过参考阐明利用本发明原则的例示性实施方案的以下详细说明和其附图来获得:
图1证明了导致由转基因产生mRNA的腺相关病毒(AAV)转导机制。
图2示出了可证明基于mRNA的AAV变体选择可比基于DNA的选择更严格的图表。病毒库在CMV启动子的控制下表达。
图3A-图3B示出了可证明病毒库与肝脏中的载体基因组DNA(图3A)和mRNA(图3B)之间的相关性的图表。
图4A-图4F示出了可证明在不同组织中以DNA水平呈现并以鉴定的mRNA水平表达的衣壳变体的图表。对于此实验,病毒库在CMV启动子的控制下经表达。
图5A-图5C示出了可证明在细胞类型特异性启动子控制下的不同组织中的衣壳mRNA表达(如x轴上所指出的)的图表。CMV包括为示例性组成型启动子。CK8是肌肉特异性启动子。MHCK7是肌肉特异性启动子。hSyn是神经元特异性启动子。细胞类型特异性启动子的表达水平已针对每种组织中组成型CMV启动子的表达水平进行了标准化。
图6示出了证明产生和选择用于跨物种组织特异性基因递送的衣壳变体的方法的实施方案的示意图。
图7示出了证明生成AAV衣壳变体库、特别是将随机n-mer(n=3-15个氨基酸)插入野生型AAV例如AAV9的实施方案的示意图。
图8示出了证明生成AAV衣壳变体库、特别是变体AAV粒子产生的实施方案的示意图。每种衣壳变体都将其自身的编码序列封装为载体基因组。
图9示出了可用于AAV载体系统以生成AAV衣壳变体库的代表性AAV衣壳质粒库载体(参见例如图8)的载体图谱的示意图。
图10示出了可证明由含有不同组成型和细胞类型特异性哺乳动物启动子的构建体产生的病毒滴度(按AAV9载体基因组/15cm培养皿来计算)的图表。
图11A-图11F示出了可证明在使用在MHCK7肌肉特异性启动子的控制下表达的衣壳库在C57BL/6小鼠中进行第一轮选择之后获得的结果的图表。
图12A-图12D示出了可证明在使用在MHCK7肌肉特异性启动子的控制下表达的衣壳库在C57BL/6小鼠中进行的第二轮选择之后获得的结果的图表。
图13A-图13B示出了可证明由同义密码子编码的变体的丰度之间的相关性的图表。
图14示出了可证明在两种不同肌肉特异性启动子(MHCK7和CK8)控制下表达的相同变体的丰度之间的相关性的图表。
图15示出了可证明产生具有与野生型AAV9衣壳类似的滴度的rAAV的肌肉趋向性衣壳变体的图表。
图16示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图17示出了一组可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-G之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图18示出了一组可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GF之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图19示出了选择用于跨物种肌肉定向基因递送的有效衣壳变体的示意图。
图20A-图20C示出了可证明在不同的小鼠品系中进行的选择确定了与顶部肌肉趋向性相同的变体的表格。
图21示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠肌肉转导的比较的图像。
图22示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图23示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的载体基因组生物分布的比较的图表。
图24A-图24B示出了可证明与AAV9和AAV8相比MyoAAV在肌肉中的体内基因表达动力学更快的图像。
图25可证明与AAV9-CRISPR相比MyoAAV-CRISPR在模型mdx小鼠中的DMD突变校正的机制。
图26A-图26C可证明与AAV9-CRISPR相比用MyoAAV-CRISPR校正模型mdx小鼠中的DMD突变。
图27可证明MyoAAV使用整合素异二聚体作为受体以进入细胞。
图28示出了可证明myoAAV转导小鼠和人原代肌管两者可比AAV9有效50-100倍的图表。
图29A-图29B可证明整合素αV小分子抑制剂抑制MyoAAV对人原代肌管的转导。
本文中的图仅用于说明目的,并且不一定按比例绘制。
具体实施方式
一般定义
除非另外定义,否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的意义。分子生物学中常用术语和技术的定义可见于以下中:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989)(Sambrook,Fritsch,和Maniatis);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)(Green和Sambrook);Current Protocols in Molecular Biology(1987)(F.M.Ausubel等人编辑);the seriesMethods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(1995)(M.J.MacPherson,B.D.Hames,和G.R.Taylor编辑):Antibodies,A Laboratory Manual(1988)(Harlow和Lane,编辑):Antibodies A Laboraotry Manual,第2版2013(E.A.Greenfield编辑);Animal Cell Culture(1987)(R.I.Freshney,编辑);BenjaminLewin,Genes IX,由Jones和Bartlet出版,2008(ISBN0763752223);Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,由Blackwell Science Ltd.出版,1994(ISBN0632021829);Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN9780471185710);Singleton等人,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology第2版,J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994),March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第4版,John Wiley&Sons(New York,N.Y.1992);以及Marten H.Hofker和Jan van Deursen,Transgenic Mouse Methods and Protocols,第2版(2011)。
除非上下文另外明确指出,否则如本文所用,单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括单个对象和复数个对象两者。
术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、情况或取代者可或可不发生,并且所述描述包括其中所述事件或情况发生的情况以及其中所述事件或情况未发生的情况。
通过端点列举的数值范围包括包容在相应范围内的所有数字和分数,以及所列举的端点。还应当理解,范围中的每一个的端值相对于另一端值以及独立于另一端值都是有意义的。还应理解,本文公开了多个值,并且每个值除所述值本身之外在本文中还公开为“约”所述特定值。例如,如果公开了值“10”,则还公开了“约10”。可在本文中将范围表达为从“约”一个特定值和/或至“约”另一特定值。类似地,当通过使用先行词“约”将值表达为近似值时,将理解的是特定值形成了另外实施方案。例如,如果公开了值“约10”,则还公开了“10”。
应理解,这种范围格式是为了方便和简洁而使用,并且因此应灵活地解释为不仅包括范围的限制所明确列举的数值,而且被解释为包括所述范围内所涵盖的单独数值或子范围,好像每个数值和子范围都得到明确列举一样。为了说明,“约0.1%至5%”的数值范围应解释为不仅包括明确列举的约0.1%至约5%的值,而且包括在指定范围内的单独值(例如,约1%、约2%、约3%和约4%)和子范围(例如,约0.5%至约1.1%;约5%至约2.4%;约0.5%至约3.2%和约0.5%至约4.4%以及其他可能的子范围)。在表述这类范围的情况下,另一个实施方案包括从一个特定值和/或至另一个特定值。
在提供值的范围的情况下,应理解在那个范围的上限与下限之间的每个中介值(intervening value)(除非上下文另外清楚地指出,否则直至下限的单位的十分之一)以及那个陈述的范围内的任何其他陈述值或中介值都涵盖在公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中,并且也涵盖在本公开内,属于陈述的范围内的任何明确排除的极限。在陈述的范围包括一个或两个极限的情况下,排除那些包括的极限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中。例如,在陈述的范围包括极限中的一个或两个的情况下,排除那些包括的极限中的任一个或两个的范围也包括在本公开中,例如短语“x至y”包括从‘x’至‘y’的范围以及大于‘x’和小于‘y’的范围。范围也可表述为上限,例如‘约x、y、z或更小’,并且应该解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的特定范围以及‘小于x’、‘小于y’和‘小于z’的范围。同样地,短语‘约x、y、z或更大’应解释为包括‘约x’、‘约y’和‘约z’的特定范围以及‘大于x’、‘大于y’和‘大于z’的范围。此外,在‘x’和‘y’是数值的情况下,短语“约‘x’至‘y’”包括“约‘x’至约‘y’”。
如本文所用的术语“约”或“大约”当提及诸如参数、量、时距等的可测量值时,意在涵盖指定值的变化以及从指定值的变化,诸如指定值的+/-10%或更少、+/-5%或更少、+/-1%或更少以及+/-0.1%或更少的变化以及从指定值的+/-10%或更少、+/-5%或更少、+/-1%或更少以及+/-0.1%或更少的变化,只要此类变化适合在所公开的发明中执行。应当理解,修饰语“约”或“大约”所指的值本身也是具体且优选地公开的。如本文所用,术语“约”、“大约”、“在或约”和“基本上”可意指所讨论的量或值可以是精确值或提供如在权利要求中所列举或在本文中所教导的等效结果或效果的值。也就是说,应理解,量、大小、配方、参数和其他数量和特性不是且不必是确切的,而是可以是近似值和/或根据需要更大或更小,以反映容差、转化因子、四舍五入、测量误差等和本领域技术人员已知的其他因素,从而获得等效的结果或效果。在一些情况下,无法合理确定提供等效结果或效果的值。一般来说,量、大小、配方、参数或其他数量或特性为“约”、“大约”或“在或约”,无论是否进行此类明确表述。应了解,除非另外特别说明,否则在“约”、“大约”或“在或约”用在定量值之前的情况下,参数还包括特定的定量值本身。
如本文所用,“生物样品”可含有全细胞和/或活细胞和/或细胞碎片。生物样品可含有(或来源于)“体液”。本发明涵盖其中体液选自羊水、房水、玻璃体液、胆汁、血清、母乳、脑脊液、耵聍(耳垢)、乳糜、食糜、内淋巴、外淋巴、渗出液、粪便、女性精液(femaleejaculate)、胃酸、胃液、淋巴液、粘液(包括鼻腔引流液和痰)、心包液、腹膜液、胸膜液、脓液、发炎性分泌物、唾液、皮脂(皮肤油)、精液、痰液、滑液、汗液、泪液、尿液、阴道分泌物、呕吐物及其一种或多种的混合物的实施方案。生物样品包括细胞培养物、体液、来自体液的细胞培养物。体液可以例如通过穿刺或其他收集或取样程序从哺乳动物有机体中获得。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用以指代脊椎动物,优选哺乳动物,更优选人类。哺乳动物包括但不限于鼠科动物、猿、人类、家畜、野生动物(sportanimals)和宠物。还涵盖在体内获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
下文描述了各种实施方案。应注意,特定实施方案并不旨在作为详尽的说明或作为对本文讨论的更广泛实施方案的限制。结合特定实施方案描述的一个实施方案不一定限于所述实施方案并且可以与任何其他实施方案一起实施。在整个本说明书中,提到“一个实施方案(one embodiment)”、“实施方案(an embodiment)”、“示例性实施方案(an exampleembodiment)”时,意指与所述实施方案有关的所描述的具体特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此,在整个本说明书中各处出现短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”、“在一实施方案中(in an embodiment)”或“示例性实施方案(anexample embodiment)”时,不一定都是指同一个实施方案,但可指同一个实施方案。此外,如本领域技术人员从本公开中将明白的,特定特征、结构或特性可在一个或多个实施方案中以任何合适方式经组合。此外,尽管本文所述的一些实施方案包括其它实施方案中所包括的一些特征而非其它特征,但是不同实施方案的特征的组合意在落入本发明的范围内。例如,在所附权利要求中,所要求保护的实施方案中任一者可以任何组合方式使用。
参考美国临时申请号62/899,453和国际申请号PCT/US20/50534。
本文所引用的所有公开、公开的专利文献、以及专利申请特此通过引用并入,其引用程度就如同具体地并且各别地指示每一单个公开、公开的专利文献、或专利申请是通过引用并入。
概述
本文公开的实施方案提供了可与货物偶联或以其他方式缔合的肌肉特异性靶向部分。本文公开的实施方案提供了可掺入一种或多种肌肉特异性靶向部分的多肽和粒子。多肽和/或粒子可与货物偶联、附接至货物、封装货物或以其他方式掺入货物,从而使货物与靶向部分缔合。
本文公开的实施方案提供了肌肉特异性靶向部分,其可含有如本文进一步描述的n-mer基序、如本文进一步描述的RGD基序或两者中的一者或多者。在一些实施方案中,n-mer基序和/或RGD基序可赋予靶向部分的肌肉特异性。
本文公开的实施方案提供了工程化腺相关病毒(AAV)衣壳,其可经工程化以赋予工程化AAV粒子细胞特异性和/或物种特异性趋向性。
本文公开的实施方案还提供了生成具有工程化衣壳的rAAV的方法,所述方法可涉及系统地指导生成具有修饰的表面结构的变体(诸如变体衣壳蛋白)的不同库。生成具有工程化衣壳的rAAV的方法的实施方案还可包括严格选择能够靶向特定细胞、组织和/或器官类型的衣壳变体。生成具有工程化衣壳的rAAV的方法的实施方案可包括严格选择能够在至少两个或多个物种中进行有效和/或均质转导的衣壳变体。
本文公开的实施方案提供了能够产生本文所述的工程化AAV的载体及其系统。
本文公开的实施方案提供了能够产生本文所述的工程化AAV粒子的细胞。在一些实施方案中,细胞包含本文所述的一种或多种载体或其系统。
本文公开的实施方案提供了可包含本文所述的工程化衣壳的工程化AAV。在一些实施方案中,工程化AAV可包含待递送至细胞的货物多核苷酸。在一些实施方案中,货物多核苷酸是基因修饰多核苷酸。
本文公开的实施方案提供了制剂,所述制剂可含有工程化AAV载体或其系统、工程化AAV衣壳、包含本文所述的工程化AAV衣壳的工程化AAV粒子以及/或者含有工程化AAV衣壳和/或工程化AAV载体或其系统的本文所述的工程化细胞。在一些实施方案中,制剂还可包含药学上可接受的载剂。本文所述的制剂可经递送至有需要的受试者或细胞。
本文公开的实施方案还提供了药盒,所述药盒含有以下中的一种或多种:一种或多种多肽、多核苷酸、载体、工程化AAV衣壳、工程化AAV粒子、细胞或本文所述的其他组分及其组合以及本文所述的药物制剂。在实施方案中,本文所述的一种或多种多肽、多核苷酸、载体、工程化AAV衣壳、工程化AAV粒子、细胞及其组合可作为组合药盒提供。
本文公开的实施方案提供了使用具有本文所述的细胞特异性趋向性的工程化AAV以将例如治疗性多核苷酸递送至细胞的方法。这样,本文所述的工程化AAV可用于治疗和/或预防有需要的受试者的疾病。本文公开的实施方案还提供了递送工程化AAV衣壳、工程化AAV病毒粒子、工程化AAV载体或其系统和/或其制剂至细胞的方法。本文还提供了通过递送工程化AAV粒子、工程化AAV衣壳、工程化AAV衣壳载体或其系统、工程化细胞和/或其制剂至有需要的受试者来治疗受试者的方法。
本文还描述了工程化AAV的实施方案的其他特征和优势以及制造和使用工程化AAV的方法。
肌肉特异性靶向部分及其组合物
本文描述了能够特异性靶向、结合、缔合肌细胞或以其他方式与肌细胞特异性相互作用的靶向部分。N-mer基序是短肽基序,所述基序可赋予细胞和/或组织类型靶向另一分子(诸如货物)的能力,所述基序掺入分子、与分子偶联、附接至分子或以其他方式与分子缔合。在一个示例性实施方案中,n-mer基序经掺入病毒衣壳,使得它在衣壳表面上表达并赋予病毒粒子组织特异性靶向能力以促进病毒粒子和其中所含任何任选货物的组织特异性递送。在某些示例性实施方案中,n-mer基序是约1-20个氨基酸,诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长。术语n-mer基序涵盖具有RGD基序的n-mer基序和不具有RGD基序的n-mer基序(本文称为“非RGD n-mer基序”)两者。在一些示例性实施方案中,n-mer基序赋予肌肉细胞/组织特异性。在一些示例性实施方案中,赋予肌肉细胞/组织特异性的n-mer基序是RGD基序。在一些示例性实施方案中,赋予肌肉细胞/组织特异性的n-mer基序是非RGD n-mer基序。
在一些实施方案中,靶向部分是或包含一个或多个n-mer基序,其中一个或多个n-mer基序中的每一者独立地选自RGD基序或非RGD n-mer基序。N-mer基序、RGD基序和非RGDn-mer基序在本文别处更详细地描述。在一些实施方案中,靶向部分包含多于一个n-mer基序,其中多于一个n-mer基序中的每一者独立地选自RGD基序或非RGD n-mer基序。在一些实施方案中,靶向部分可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个n-mer基序,其中每个n-mer基序独立地选自RGD基序或非RGD n-mer基序。在一些实施方案中,包含在靶向部分中的所有n-mer基序可以是相同的(即具有相同的氨基酸序列)。在其中包含多于一个n-mer基序的一些实施方案中,至少两个n-mer基序彼此不同(即具有不同的氨基酸序列)。在其中包含多于一个n-mer基序的一些实施方案中,所有n-mer基序彼此不同。在一些实施方案中,包括在靶向部分中的每个n-mer基序可以是表1-表6和表8-表9中任一者中列出的那些中的任一者,其对应于SEQ ID NO:13-50、1277-2493、3737-4979、6647-8313、8314-8502或8692-8889。
在一些实施方案中,n-mer基序是或包含“RGD”基序。“RGD”基序是指具有氨基酸R、G、D的存在的n-mer基序并且三个连续氨基酸的顺序为n-mer基序的顺序。在一些实施方案中,RGD基序可具有通式XmRGDXn,其中m可为0-4个氨基酸,n可为0-15个氨基酸,并且其中X为任何氨基酸,其中存在的每个氨基酸可各自独立地选择彼此不同的氨基酸并且可选自任何氨基酸的组。将理解,当m=0或n=0时,这意指在RGD基序中,“RGD”之前没有氨基酸和/或在RGD基序中,“RGD”之后没有氨基酸。在一些实施方案中,当m=0时,RGD是RGD基序的前三个氨基酸。在一些实施方案中,当n=0时,RGD是RGD基序的最后三个氨基酸。在一些实施方案中,当m=0且n=0时,RGD基序仅含有氨基酸RGD。示例性RGD基序示出在例如表1-表6和表8-表9中。
在一些示例性实施方案中,RGD基序是X1RGDX2(SEQ ID NO:9100)、X1RGDX2X3(SEQID NO:9101)、X1RGDX2X3X4(SEQ ID NO:9102)、X1RGDX2X3X4X5(SEQ ID NO:9103)、X1RGDX2X3X4X5X6(SEQ ID NO:9104)、X1RGDX2X3X4X5X6X7(SEQ ID NO:9105)、X1RGDX2X3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO:9106)、X1RGDX2X3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO:9107)、X1RGDX2X3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:9108)、X1RGDX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:9109)或X1RGDX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO:9110)。
在一些示例性实施方案中,RGD基序是X1X2RGDX3(SEQ ID NO:9111)、X1X2RGDX3X4(SEQ ID NO:9112)、X1X2RGDX3X4X5(SEQ ID NO:9113)、X1X2RGDX3X4X5X6(SEQ ID NO:9114)、X1X2RGDX3X4X5X6X7(SEQ ID NO:9115)、X1X2RGDX3X4X5X6X7X8(SEQ ID NO:9116)、X1X2RGDX3X4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO:9117)、X1X2RGDX3X4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:9118)、X1X2RGDX3X4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:9119)或X1X2RGDX3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO:9120)。
在一些示例性实施方案中,RGD基序是X1X2X3RGDX4(SEQ ID NO:9121)、X1X2X3RGDX4X5(SEQ ID NO:9122)、X1X2X3RGDX4X5X6(SEQ ID NO:9123)、X1X2X3RGDX4X5X6X7(SEQID NO:9124)、X1X2X3RGDX4X5X6X7X8(SEQ ID NO:9125)、X1X2X3RGDX4X5X6X7X8X9(SEQ ID NO:9126)、X1X2X3RGDX4X5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:9127)、X1X2X3RGDX4X5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:9128)或X1X2X3RGDX4X5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO:9129)。
在一些示例性实施方案中,RGD基序是X1X2X3X4RGDX5(SEQ ID NO:9130)、X1X2X3X4RGDX5X6(SEQ ID NO:9131)、X1X2X3X4RGDX5X6X7(SEQ ID NO:9132)、X1X2X3X4RGDX5X6X7X8(SEQ ID NO:9133)、X1X2X3X4RGDX5X6X7X8X9(SEQ ID NO:9134)、X1X2X3X4RGDX5X6X7X8X9X10(SEQ ID NO:9135)、X1X2X3X4RGDX5X6X7X8X9X10X11(SEQ ID NO:9136)或X1X2X3X4RGDX5X6X7X8X9X10X11X12(SEQ ID NO:9137)。
在一些实施方案中,RGD基序具有氨基酸RGD作为n-mer基序的前三个连续氨基酸(即m=0)。在一些示例性实施方案中,n-mer可具有RGD或RGDXn序列,其中n可以是1-15个氨基酸并且X可以是任何氨基酸,其中存在的每个氨基酸可各自独立地选择彼此不同的氨基酸并且可选自任何氨基酸的组。在一些实施方案中,n-mer基序可以是RGD(3-mer)、RGDX1(4-mer)、RGDX1X2(5-mer)(SEQ ID NO:2)、RGDX1X2X3(6-mer)(SEQ ID NO:3)、RGDX1X2X3X4(7mer)(SEQ ID NO:4)、RGDX1X2X3X4X5(8mer)(SEQ ID NO:5)、RGDX1X2X3X4X5X6(9-mer)(SEQID NO:6)、RGD1X2X3X4X5X6X7(10-mer)(SEQ ID NO:7)、RGD1X2X3X4X5X6X7X8(11-mer)(SEQ IDNO:8)、RGDX1X2X3X4X5X6X7X8X9(12-mer)(SEQ ID NO:9)、RGDX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(13-mer)(SEQ ID NO:10)、RGDX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(14-mer)(SEQ ID NO:11)或RGDX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12(15-mer)(SEQ ID NO:12),其中X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X9、X10、X11、X12各自独立地选自任何氨基酸。在一些实施方案中,X1是L、T、A、M、V、Q或M。在一些实施方案中,X2是T、M、S、N、L、A或I。在一些实施方案中,X3是T、E、N、O、S、Q、Y、A或D。在一些实施方案中,X4是P、Y、K、L、H、T或S。在一些实施方案中,包含RGD基序的n-mer基序包含在肌肉特异性工程化AAV衣壳中。
在一些实施方案中,n-mer基序可在表1-表6中任一者中。在一些实施方案中,表1-表6和表8-表9中任一者中的n-mer基序可包括在肌肉特异性工程化衣壳中。
在一些实施方案中,n-mer基序可在表4-表6中任一者中。在一些实施方案中,表4-表6和表8-表9中任一者中的n-mer基序可包括在肌肉特异性工程化衣壳中。
肌肉特异性靶向部分可与货物偶联或以其他方式与货物缔合。在一些实施方案中,本文所述的一种或多种肌肉特异性靶向部分直接地附接至货物。在一些实施方案中,本文所述的一种或多种肌肉特异性靶向部分诸如通过接头分子间接地与货物偶联。在一些实施方案中,本文所述的一种或多种一种或多种肌肉特异性靶向部分与多肽或其他粒子偶联缔合,所述多肽或其他粒子与货物偶联、附接、封装有货物以及/或者含有货物。
示例性粒子包括但不限于病毒粒子(例如病毒衣壳,其包括噬菌体衣壳)、多核糖体、脂质体、纳米粒子、微粒、外来体、微胶粒等。如本文所用,术语“纳米粒子”包括均质或异质材料的纳米级沉积物。纳米粒子的形状可以是规则的或不规则的,并且可以由形成复合纳米级粒子的多个共沉积粒子形成。纳米粒子的形状通常可以是球形或具有由多个通常球形的共沉积粒子形成的复合形状。纳米粒子的示例性形状包括但不限于球形、棒形、椭圆形、圆柱形、盘形等。在一些实施方案中,纳米粒子具有大体上球形的形状。
如本文所用,术语“特异性”当用于描述两个部分之间的相互作用时,指代第一和第二部分的非共价物理缔合,其中第一和第二部分之间的缔合为任一部分与结合发生的环境中存在的大多数或全部其他部分的缔合的至少2倍强、至少5倍强、至少10倍强、至少50倍强、至少100倍强或更强。如果在所采用的条件下(例如,在生理条件(诸如在细胞内或符合细胞生存的条件)下)平衡解离常数Kd为10-3M或更小、10-4M或更小、10-5M或更小、10-6M或更小、10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小或10-12M或更小,则可以认为两个或更多个实体的结合是特异性的。在一些实施方案中,特异性结合可通过多个较弱的相互作用(例如,多个单独的相互作用,其中每个单独的相互作用的特征在于大于10-3M的Kd)来实现。在一些实施方案中,可称为“分子识别”的特异性结合是两个实体之间的饱和结合相互作用,其取决于每个实体上官能团的互补取向。具体相互作用的实例包括引物-多核苷酸相互作用、适体-适体靶相互作用、抗体-抗原相互作用、抗生物素蛋白-生物素相互作用、配体-受体相互作用、金属-螯合物相互作用、互补核酸之间的杂交等。
在一些实施方案中,除了一个或多个n-mer基序之外,靶向部分还可包含多肽、多核苷酸、脂质、聚合物、糖或其组合。
工程化肌肉靶向病毒衣壳
在一些实施方案中,将肌肉工程化肌肉特异性靶向部分掺入病毒衣壳蛋白中,所述病毒衣壳蛋白又可以掺入工程化病毒粒子的工程化病毒衣壳中,从而提供肌肉特异性病毒粒子。肌肉特异性工程化病毒粒子可用于将货物递送至肌细胞。在一些实施方案中,靶向部分经掺入病毒蛋白,诸如衣壳蛋白,包括但不限于慢病毒、腺病毒、AAV、噬菌体、逆转录病毒蛋白。在一些实施方案中,一个或多个n-mer基序(诸如RGD或非RGD n-mer基序)位于病毒蛋白的两个氨基酸之间,使得一个或多个n-mer基序中的一个或多个在病毒衣壳的外部(即呈现在其表面上)。
在一些实施方案中,含有一种或多种本文所述的肌肉特异性靶向部分的组合物具有增加的肌细胞效能、肌细胞特异性、降低的免疫原性或其任何组合。
货物包括能够与本文所述的肌肉特异性靶向部分偶联或与其缔合的任何分子。货物包括但不限于核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、氨基酸、肽、多肽、核糖蛋白、脂质、糖、药物活性剂(例如药物、显像和其他诊断剂等)、化合物及其组合。在一些实施方案中,货物是或包括DNA、RNA、氨基酸、肽、多肽、抗体、适体、核酶、抑制必需的肿瘤蛋白和基因的翻译或转录的核酶引导序列、激素、免疫调节剂、退热药、抗焦虑药、抗精神病药、镇痛药、解痉药、抗炎药、抗组胺剂、抗感染剂、放射增敏剂、化学治疗剂、放射性化合物、显像剂、遗传修饰剂及其组合。
在一些实施方案中,货物能够治疗或预防肌肉疾病或病症。在一些实施方案中,肌肉疾病或病症是(a)自身免疫疾病;(b)癌症;(c)肌营养不良;(d)神经肌肉疾病;(e)糖或糖原贮积病;(f)扩增重复疾病;(g)显性负效应疾病;(h)心肌病;(i)病毒性疾病;(j)早衰病;或(k)其任何组合。在一些实施方案中,扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。在一些实施方案中,肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。在一些实施方案中,强直性肌营养不良是1型或2型。在一些实施方案中,糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。在一些实施方案中,MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。在一些实施方案中,神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
在一些实施方案中,货物是吗啉代、肽连接的吗啉代、反义寡核苷酸、PMO、治疗性转基因、编码治疗性多肽或肽的多核苷酸、PPMO、一种或多种肽、一种或多种编码CRISPR-Cas蛋白、引导RNA或两者的多核苷酸、核糖核蛋白(其中核糖核蛋白包含CRISPR-Cas系统分子)、治疗性转基因RNA或其他基因修饰或治疗性RNA和/或蛋白质,或其任何组合。
在一些实施方案中,货物能够诱导基因中的外显子跳跃。
在一些实施方案中,货物能够诱导肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃。
在一些实施方案中,货物是小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因。在一些实施方案中,小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复1、2、3、16、17和24,以及任选nNOS结构域。
工程化肌肉靶向AAV衣壳和AAV
在一些实施方案中,工程化肌肉特异性靶向部分掺入腺相关病毒(AAV)衣壳。本文描述了可经工程化以赋予工程化AAV粒子细胞特异性趋向性的工程化AAV衣壳的各种实施方案。工程化衣壳可包含在工程化病毒粒子中,并且可赋予工程化AAV粒子细胞特异性趋向性、降低的免疫原性或两者。本文所述的工程化AAV衣壳可包含一个或多个本文所述的工程化AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中,AAV衣壳蛋白包含一个或多个n-mer基序。在一些实施方案中,n-mer基序中的一个或多个含有或是RGD基序或非RGD n-mer基序。此类基序在本文别处更详细地定义和描述。在一些实施方案中,经掺入一个或多个AAV衣壳蛋白中的一个或多个n-mer基序中的一个或多个可赋予具有带有一个或多个n-mer基序的工程化衣壳的AAV病毒粒子肌肉特异性。
工程化AAV衣壳和/或衣壳蛋白可由一个或多个工程化AAV衣壳多核苷酸编码。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳多核苷酸可包含3'多腺苷酸化信号。多腺苷酸化信号可是SV40多腺苷酸化信号。
工程化AAV衣壳可是野生型AAV衣壳的变体。在一些实施方案中,野生型AAV衣壳可由VP1、VP2、VP3衣壳蛋白或其组合构成。换言之,工程化AAV衣壳可包含野生型VP1、野生型VP2和/或野生型VP3衣壳蛋白的一个或多个变体。在一些实施方案中,参考野生型AAV衣壳的血清型可是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10,或其任何组合。在一些实施方案中,野生型AAV衣壳的血清型可是AAV-9。工程化AAV衣壳可具有与参考野生型AAV衣壳不同的趋向性。
工程化AAV衣壳可含有1-60个工程化衣壳蛋白。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59至/或60个工程化衣壳蛋白。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳可含有0-59个野生型AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳可含有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58至/或59个野生型AAV衣壳蛋白。
在一些实施方案中,工程化AAV衣壳蛋白具有n-mer氨基酸基序,其中n可是至少3个氨基酸。在一些实施方案中,n可是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳可具有6-mer或7-mer氨基酸基序。在一些实施方案中,n-mer氨基酸基序插入在野生型病毒蛋白(VP)(或衣壳蛋白)中的两个氨基酸之间。在一些实施方案中,n-mer基序可插入在AAV衣壳蛋白中的可变氨基酸区中的两个氨基酸之间。每个野生型AAV病毒蛋白的核心包含在自主细小病毒衣壳中保守的八链β桶基序(βB至βI)和α螺旋(αA)(参见例如DiMattia等人2012.J.Virol.86(12):6947-6958)。结构可变区(VR)出现在连接β链的表面环中,所述β链聚集以在衣壳表面产生局部变化。AAV具有12个可变区(也称为高变区)(参见例如Weitzman和Linden.2011.“Adeno-Associated Virus Biology.”InSnyder,R.O.,Moullier,P.(编辑)Totowa,NJ:Humana Press)。在一些实施方案中,一个或多个n-mer基序插入在野生型AVV衣壳蛋白中的12个可变区中的一个或多个中的两个氨基酸之间。在一些实施方案中,一个或多个n-mer基序各自插入在VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-III、VR-IX、VR-X、VR-XI、VR-XII或其组合中的两个氨基酸之间。在一些实施方案中,n-mer经插入在衣壳蛋白的VR-III中的两个氨基酸之间。在一些实施方案中,工程化衣壳可具有插入在AAV9病毒蛋白的氨基酸262与269之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸327与332之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸382与386之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸452与460之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸488与505之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸545与558之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸581与593之间的任何两个连续氨基酸之间、氨基酸704与714之间的任何两个连续氨基酸之间的n-mer。在一些实施方案中,工程化衣壳可具有插入在AAV9病毒蛋白的氨基酸588与589之间的n-mer。在一些实施方案中,工程化衣壳可具有插入在AAV9病毒蛋白的氨基酸588与589之间的7-mer基序。SEQ ID NO:1是至少参考上文讨论的插入位点的参考AAV9衣壳序列。应理解,n-mer可插入在其他血清型的AAV病毒蛋白中的类似位置中。在如先前讨论的一些实施方案中,n-mer可插入在AAV病毒蛋白内的任何两个连续氨基酸之间,并且在一些实施方案中,插入是在可变区中进行的。
SEQ ID NO:1AAV9衣壳参考序列。
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
在一些实施方案中,n-mer基序可是如表1-表3中所示或由如其中所示的核酸编码的任何氨基酸基序。在一些实施方案中,在AAV衣壳中插入n-mer基序可产生细胞、组织、器官特异性工程化AAV衣壳。在一些实施方案中,工程化衣壳对肌细胞具有特异性(或趋向性)。在一些实施方案中,工程化衣壳可对以下具有特异性:骨组织和/或细胞、肺组织和/或细胞、肝组织和/或细胞、膀胱组织和/或细胞、肾组织和/或细胞、心脏组织和/或细胞、骨骼肌组织和/或细胞、平滑肌和/或细胞、神经元组织和/或细胞、肠组织和/或细胞、胰腺组织和/或细胞、肾上腺组织和/或细胞、脑组织和/或细胞、肌腱组织或细胞、皮肤组织和/或细胞、脾组织和/或细胞、眼组织和/或细胞、血细胞、滑液细胞、免疫细胞(包括对特定类型免疫细胞的特异性)及其组合。
在一些实施方案中,AAV衣壳是肌肉特异性的。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳的肌肉特异性由掺入在工程化AAV衣壳中的肌肉特异性n-mer基序赋予。尽管不旨在受理论束缚,但据信n-mer基序赋予工程化AAV衣壳的结构域或区域或者其内部3D结构,使得含有工程化AAV衣壳的工程化AAV与细胞表面受体和/或在肌细胞表面上的其他分子的相互作用增加或改善(例如增加的亲和力)。在一些实施方案中,细胞表面受体是AAV受体(AAVR)。在一些实施方案中,细胞表面受体是肌细胞特异性AAV受体。在一些实施方案中,在肌细胞中,含有肌肉特异性衣壳的肌肉特异性工程化AAV与不含有本文所述的肌肉特异性工程化AAV衣壳的其他细胞类型和/或其他AAV相比可具有增加的转导率、效率、量或其组合。
生成肌肉特异性靶向部分的方法
本文还提供了生成工程化AAV衣壳的方法。工程化AAV衣壳变体可是野生型AAV衣壳的变体。图6-8可说明能够生成本文所述的工程化AAV衣壳的方法的各种实施方案。一般地,AAV衣壳库可通过表达各自含有先前在适当AAV生产细胞系中描述的工程化AAV衣壳多核苷酸的工程化衣壳载体来生成。参见例如图8。应理解,尽管图8示出了AAV粒子产生的辅助依赖性方法,但应理解,这也可通过无辅助方法来完成。这可生成AAV衣壳库,其可再多含有一个所需细胞特异性工程化AAV衣壳变体。如图6所示,AAV衣壳库可经施用于各种非人动物,以进行第一轮基于mRNA的选择。如图1所示,AAV和相关载体的转导过程可导致产生反映转导细胞的病毒基因组的mRNA分子。如至少在本文的实施例中所证明的,对于确定病毒粒子能够在功能上转导细胞,基于mRNA的选择可更具特异性和有效性,因为是基于产生的功能性产物而不是仅仅通过测量病毒DNA的存在来检测病毒粒子的存在。
在第一轮施用之后,具有所需衣壳变体的一个或多个工程化AAV病毒粒子可接着用于形成经筛选的AAV衣壳库。可通过测量衣壳变体的mRNA表达并确定与非所需细胞类型相比哪些变体在所需细胞类型中高度表达来鉴定所需AAV病毒粒子。那些在所需细胞、组织和/或器官类型中高度表达的变体是所需AAV衣壳变体粒子。在一些实施方案中,编码AAV衣壳变体的多核苷酸在组织特异性启动子的控制下,所述组织特异性启动子在所需细胞、组织或器官中具有选择性活性。
第一轮鉴定的工程化AAV衣壳变体粒子可接着经施用于各种非人动物。在一些实施方案中,用于第二轮选择和鉴定的动物与用于第一轮选择和鉴定的那些动物不同。与第1轮类似,在施用在所需细胞、组织和/或器官类型中的顶部表达变体之后,可通过测量细胞中的病毒mRNA表达来鉴定。在第二轮之后鉴定的顶部变体可接着任选经条形码化并任选经合并。在一些实施方案中,来自第二轮的顶部变体可接着经施用于非人灵长类动物以鉴定顶部细胞特异性变体,特别是如果顶部变体最终用于人类。每一轮的施用可是全身的。
在一些实施方案中,生成AAV衣壳变体的方法可包括以下步骤:(a)在细胞中表达本文所述的含有工程化AAV衣壳多核苷酸的载体系统以产生工程化AAV病毒粒子衣壳变体;(b)收获在步骤(a)中产生的工程化AAV病毒粒子衣壳变体;(c)向一个或多个第一受试者施用工程化AAV病毒粒子衣壳变体,其中通过在细胞中表达工程化AAV衣壳变体载体或其系统并收获由细胞产生的工程化AAV病毒粒子衣壳变体来产生工程化AAV病毒粒子衣壳变体;以及(d)鉴定由一个或多个第一受试者中的一个或多个特异性细胞或特异性细胞类型以显著高水平产生的一个或多个工程化AAV衣壳变体。在这种情况下,“显著高”可指代可在每15cm培养皿约2x1011至约6x1012个载体基因组之间的范围内的滴度。
方法还可包括以下步骤:(e)施用一些或全部在步骤(d)中鉴定的工程化AAV病毒粒子衣壳变体于一个或多个第二受试者;以及(f)鉴定在一个或多个第二受试者中的一个或多个特异性细胞或特异性细胞类型中以显著高水平产生的一个或多个工程化AAV病毒粒子衣壳变体。步骤(a)中的细胞可是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中,步骤(c)、步骤(e)或两者中的施用是全身的。在一些实施方案中,一个或多个第一受试者、一个或多个第二受试者或两者是非人哺乳动物。在一些实施方案中,一个或多个第一受试者、一个或多个第二受试者或两者各自独立地选自由以下组成的组:野生型非人哺乳动物、人源化非人哺乳动物、疾病特异性非人哺乳动物模型和非人灵长类动物。
开发肌肉特异性靶向部分的其他方法和细节在例如美国临时申请序列号62/899,453、62/916,207、63/018,454、63/055,252和62/916,221以及国际申请号PCT/US20/50534中描述。
编码多核苷酸、载体和载体系统的工程化肌肉特异性靶向部分
本文描述的是编码一个或多个肌肉特异性工程化靶向部分的多核苷酸和载体及/或其载体系统。在一些实施方案中,编码多核苷酸、载体和/或载体系统可用于表达和/或产生工程化肌肉特异性靶向部分,使工程化肌肉特异性靶向部分与一个或多个其他多肽偶联,和/或产生粒子,诸如任选含有货物的病毒粒子,其包含一个或多个本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分。如本文所用,术语“工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸”是指编码工程化肌肉特异性靶向部分的多核苷酸。如本文所用,术语“编码”是指DNA可转录成RNA的原理,所述RNA可接着翻译成可形成蛋白质的氨基酸序列。因此,所述编码随后的多核苷酸(诸如RNA种类)或蛋白质的多核苷酸也可称为编码多核苷酸并且是指随后经转录和/或翻译的DNA分子以及经翻译的RNA分子。
本文还提供了可含有一种或多种本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)的载体和载体系统。如在此上下文中使用的,工程化AAV衣壳多核苷酸是指本文所述的能够编码如本文别处描述的工程化AAV衣壳的任一种或多种多核苷酸和/或能够编码本文别处描述的一种或多种工程化AAV衣壳蛋白的多核苷酸。此外,在载体包含本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)的情况下,载体也可称为并被认为是工程化载体或其系统,尽管没有特别指出如此。在实施方案中,载体可含有一种或多种多核苷酸,所述多核苷酸编码本文所述的工程化病毒衣壳(诸如AAV衣壳)的一种或多种元件。载体及其系统可用于产生可表达肌肉特异性靶向部分的细菌、真菌、酵母、植物细胞、动物细胞和转基因动物或本文所述的含有肌肉特异性靶向部分的组合物。在一些实施方案中,载体及其系统可用于产生可表达本文所述的工程化AAV衣壳的一种或多种组分的细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、植物细胞、动物细胞或转基因生物体(例如植物、动物)。在本公开的范围内的是含有一种或多种本文所述的多核苷酸序列的载体。作为本文所述的工程化AAV衣壳及其系统的一部分的一种或多种多核苷酸可包含在载体或载体系统中。
载体和/或载体系统可用于例如在细胞诸如生产细胞中表达一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸),以产生本文别处描述的含有工程化病毒衣壳的工程化病毒粒子(例如,含有工程化AAV衣壳的AAV)。本文所述的载体和载体系统的其他用途也在本公开的范围内。一般而言,并且贯穿本说明书,术语是允许或促进将实体从一个环境转移到另一个环境的工具。在本领域普通技术人员将理解的一些上下文中,“载体”可以是一个术语,指代能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子。载体可以是复制子,诸如质粒、噬菌体或粘粒,其中可插入另一个DNA片段以引起插入片段的复制。通常,当与适当的控制元件缔合时,载体能够复制。
载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子;包含一个或多个游离端、没有游离端(例如环状)的核酸分子;包含DNA、RNA或两者的核酸分子;和本领域已知的其他种类的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”,其指代环状双链DNA环,其中可诸如通过标准分子克隆技术插入额外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体,其中病毒衍生的DNA或RNA序列存在于载体中以包装到病毒(例如逆转录病毒、复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒(AAV))中。病毒载体还包括由病毒携带以转染到宿主细胞中的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如,非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中,从而与宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导它们所可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。通常,在重组DNA技术中使用的表达载体经常呈质粒的形式。
重组表达载体可以由本发明的核酸(例如多核苷酸)以适合于在宿主细胞中表达核酸的形式构成,这意指重组表达载体包含一个或多个调节元件,其可基于待用于表达的宿主细胞选择,所述调节元件与待表达的核酸序列可操作地连接。在重组表达载体内,“可操作地连接(operably linked)”和“可操作地连接(operatively-linked)”在本文中可互换使用并且在本文别处进一步定义。在载体的上下文中,术语“可操作地连接”旨在意指以允许核苷酸序列的表达的方式(例如,在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞中时在宿主细胞中)与调节元件连接的感兴趣的核苷酸序列。有利的载体包括腺相关病毒,并且还可选择此类载体的类型以靶向特定类型的细胞,诸如那些含有工程化AAV衣壳多核苷酸的工程化AAV载体,所述多核苷酸具有所需细胞特异性趋向性,诸如肌肉特异性趋向性。载体和载体系统的这些和其他实施方案在本文别处描述。
在一些实施方案中,载体可是双顺反子载体。在一些实施方案中,双顺反子载体可用于表达本文所述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)系统。在一些实施方案中,本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)的表达可由合适的组成型或组织特异性启动子驱动。此类实施方案对于生成肌肉特异性靶向部分可是有利的,这在本文别处更详细地描述。在工程化AAV衣壳系统的元件是RNA的情况下,其表达可由Pol III启动子驱动,诸如U6启动子。在一些实施方案中,两者经组合。
基于细胞的载体扩增和表达
载体可被设计用于在合适的宿主细胞中表达本文所述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)或包含一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)的系统或其产物(例如核酸转录物、蛋白质、酶及其组合)。在一些实施方案中,合适的宿主细胞是原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。载体可是基于病毒的或非基于病毒的。在一些实施方案中,合适的宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中,合适的宿主细胞是合适的细菌细胞。合适的细菌细胞包括但不限于来自大肠杆菌种的细菌的细菌细胞。本领域已知许多合适的大肠杆菌菌株用于表达载体。这些包括但不限于Pir1、Stbl2、Stbl3、Stbl4、TOP10、XL1 Blue和XL10 Gold。在一些实施方案中,宿主细胞是合适的昆虫细胞。合适的昆虫细胞包括来自草地贪夜蛾的那些。合适的草地贪夜蛾细胞菌株包括但不限于Sf9和Sf21。在一些实施方案中,宿主细胞是合适的酵母细胞。在一些实施方案中,酵母细胞可来自酿酒酵母。在一些实施方案中,宿主细胞是合适的哺乳动物细胞。已经开发了许多类型的哺乳动物细胞来表达载体。合适的哺乳动物细胞包括但不限于HEK293、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤细胞、HeLa、U2OS、A549、HT1080、CAD、P19、NIH3T3、L929、N2a、MCF-7、Y79、SO-Rb50、HepG G2、DIKX-X11、J558L、幼仓鼠肾细胞(BHK)和鸡胚成纤维细胞(CEF)。合适的宿主细胞进一步在Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)中讨论。
在一些实施方案中,载体可是酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari,等人,1987.EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kuijan和Herskowitz,1982.Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz等人,1987.Gene 54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)和picZ(InVitrogen Corp,San Diego,Calif.)。如本文所用,“酵母表达载体”是指含有一种或多种编码RNA和/或多肽的序列并且还可含有控制核酸表达的任何所需元件,以及使得表达载体能够在酵母细胞内复制和维持的任何元件的核酸。许多合适的酵母表达载体及其特征在本领域中是已知的;例如,各种载体和技术在Yeast Protocols,第2版,Xiao,W.,编辑(Humana Press,New York,2007)以及Buckholz,R.G.和Gleeson,M.A.(1991)Biotechnology(NY)9(11):1067-72中说明。酵母载体可含有但不限于着丝粒(CEN)序列、自主复制序列(ARS)、启动子(诸如与感兴趣的序列或基因可操作地连接的RNA聚合酶III启动子)、终止子(诸如RNA聚合酶III终止子)、复制起点和标记基因(例如营养缺陷型、抗生素或其他可选择标记)。用于酵母的表达载体的实例可包括质粒、酵母人工染色体、2μ质粒、酵母整合型质粒、酵母复制型质粒、穿梭载体和游离型质粒。
在一些实施方案中,载体是杆状病毒载体或表达载体并且可适用于昆虫细胞中的多核苷酸和/或蛋白质的表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如,SF9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith,等人,1983.Mol.Cell.Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers,1989.Virology 170:31-39)。rAAV(重组腺相关病毒)载体优选在无血清悬浮培养中生长的昆虫细胞(例如,草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞)中产生。无血清昆虫细胞可购自商业供应商,例如Sigma Aldrich(EX-CELL 405)。
在一些实施方案中,载体是哺乳动物表达载体。在一些实施方案中,哺乳动物表达载体能够在哺乳动物细胞中表达一个或多个多核苷酸和/或多肽。哺乳动物表达载体的实例包括但不限于pCDM8(Seed,1987.Nature 329:840)和pMT2PC(Kaufman,等人,1987.EMBOJ.6:187-195)。哺乳动物表达载体可包含能够在哺乳动物细胞中控制一个或多个多核苷酸和/或蛋白质表达的一个或多个合适的调节元件。例如,常用的启动子来源于多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40以及本文公开的和本领域已知的其他启动子。关于合适的调节元件的更多细节在本文别处描述。
对于原核细胞和真核细胞两者的其他合适的表达载体和载体系统,参见例如Sambrook,等人,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL.第2版,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989的第16和17章。
在一些实施方案中,重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如,使用组织特异性调节元件来表达核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性;Pinkert,等人,1987.Genes Dev.1:268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton,1988.Adv.Immunol.43:235-275)、特别地T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore,1989.EMBO J.8:729-733)和免疫球蛋白(Baneiji,等人,1983.Cell 33:729-740;Queen和Baltimore,1983.Cell 33:741-748)、神经元特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle,1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund,等人,1985.Science 230:912-916)以及乳腺特异性启动子(例如,乳清启动子;美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。发育调节启动子也涵盖在内,例如鼠科动物hox启动子(Kessel和Gruss,1990.Science 249:374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman,1989.Genes Dev.3:537-546)。关于这些原核载体和真核载体,提及美国专利6,750,059,所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。其他实施方案可利用病毒载体,关于其提及美国专利申请13/092,085,所述专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。组织特异性调节元件在本领域中是已知的,并且在这方面,提及美国专利7,776,321,所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中,调节元件可与一个或多个工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)和/或包含一个或多个工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)的系统的一个或多个元件或其产物可操作地连接或偶联,以驱动本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)或其系统的一个或多个元件的表达。
可以在原核生物或原核细胞中引入并繁殖载体。在一些实施方案中,原核生物用于扩增待引入真核细胞中的载体的拷贝,或作为产生待引入真核细胞中的载体的中间载体(例如,扩增作为病毒载体包装系统的一部分的质粒)。在一些实施方案中,原核生物用于扩增载体的拷贝并表达一种或多种核酸,诸如以提供递送至宿主细胞或宿主生物体的一种或多种蛋白质的来源。
在一些实施方案中,载体可是融合载体或融合表达载体。在一些实施方案中,融合载体向其中编码的蛋白质中添加多个氨基酸,诸如向重组蛋白的氨基末端、羧基末端或两者中添加。此类融合载体可用于一种或多种目的,诸如:(i)增加重组蛋白的表达;(ii)增加重组蛋白的溶解度;以及(iii)通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化重组蛋白。在一些实施方案中,多核苷酸(诸如非编码多核苷酸)和蛋白质在原核生物中的表达可以在大肠杆菌中进行,载体含有指导融合或非融合多核苷酸和/或蛋白质表达的组成型或诱导型启动子。在一些实施方案中,融合表达载体可包含蛋白水解切割位点,该位点可被引入在融合载体骨架或其他融合部分与重组多核苷酸或蛋白质的连接处,以使重组多核苷酸或蛋白质能够在融合多核苷酸或蛋白质纯化之后与融合载体骨架或其他融合部分分离。此类酶及其关联识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。示例性融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc;Smith和Johnson,1988.Gene 67:31-40)、pMAL(New England Biolabs,Beverly,Mass.)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,N.J.),其分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A到目标重组蛋白。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等人,(1988)Gene 69:301-315)和pET 11d(Studier等人,GENEEXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)60-89)。
在一些实施方案中,驱动本文所述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)、载体和/或其载体系统表达的一种或多种载体被引入宿主细胞,使得本文所述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸(包括但不限于工程化AAV衣壳多核苷酸)、载体和/或载体系统的表达指导本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分和/或组合物或包含一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分的工程化肌肉特异性递送系统的形成。在一些实施方案中,工程化肌肉特异性递送系统是病毒粒子(诸如工程化AAV粒子),其含有工程化衣壳,所述衣壳含有本文别处描述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分。例如,工程化肌肉特异性递送系统的不同元件可各自与在相同或单独载体上的单独调节元件可操作地连接。本文所述的可包含一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分的工程化肌肉特异性递送系统的不同元件的RNA可被递送至动物或哺乳动物或其细胞以产生组成性、诱导性或有条件地表达本文所述的工程化肌肉特异性递送系统的不同元件,或含有掺有和/或表达本文所述的工程化肌肉特异性递送系统的一种或多种元件的一种或多种细胞的动物或哺乳动物或其细胞。
在一些实施方案中,从相同或不同调节元件表达的元件中的两个或更多个可与一个或多个额外的载体一起组合在单个载体中,所述额外的载体提供不包含在第一载体中的系统的任何组分。组合在单个载体中的工程化肌肉特异性递送系统多核苷酸(包括但不限于工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸)可以任何合适的取向排列,诸如一个元件相对于第二元件位于5’(“上游”)或3’(“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相反的链上,并且定向在相同或相反的方向上。在一些实施方案中,单个启动子驱动编码一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸的转录物的表达,所述转录物嵌入一个或多个内含子序列(例如,每个在不同的内含子中,两个或更多个在至少一个内含子中,或全部在单个内含子中)。在一些实施方案中,两个或更多个工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸可与相同启动子可操作地连接并且从相同启动子表达。
载体特征
载体可包括可赋予载体、待递送多核苷酸、由其产生的病毒粒子或由其表达的多肽一种或多种功能的额外的特征。此类特征包括但不限于调节元件、可选择标记、分子标识符(例如分子条形码)、稳定元件等。本领域技术人员将理解,表达载体的设计和包括的额外的特征可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所需的表达水平等因素。
调节元件
在实施方案中,本文所述的多核苷酸和/或其载体(诸如本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸)可包含一种或多种可与多核苷酸可操作地连接的调节元件。术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如,转录终止信号,诸如多腺苷酸化信号和poly-U序列)。此类调节元件描述在例如Goeddel,GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY 185,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)中。调节元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型表达的调节元件,以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列的表达的调节元件(例如,组织特异性调节序列)。组织特异性启动子可主要在感兴趣的所需组织诸如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定器官(例如,肝脏、胰腺)或特定细胞类型(例如,淋巴细胞)中指导表达。调节元件还可以时间依赖性方式诸如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式指导表达,所述调节元件还可或可不为组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中,载体包含一个或多个pol III启动子(例如,1、2、3、4、5个或更多个pol III启动子)、一个或多个pol II启动子(例如,1、2、3、4、5个或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如,1、2、3、4、5个或更多个pol I启动子)或其组合。pol III启动子的实例包括但不限于U6和H1启动子。polII启动子的实例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)(RSV)LTR启动子(任选具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选具有CMV增强子)(参见例如,Boshart等人,Cell,41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。术语“调节元件”还涵盖增强子元件,诸如WPRE;CMV增强子;HTLV-I的LTR中的R-U5’片段(Mol.Cell.Biol.,卷8(1),第466页-472页,1988);SV40增强子;以及兔β-珠蛋白外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,卷78(3),第1527页-31页,1981)。
在一些实施方案中,调节序列可是美国专利号7,776,321、美国专利公开号2011/0027239和PCT公开WO 2011/028929中描述的调节序列,所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中,载体可含有最小启动子。在一些实施方案中,最小启动子是Mecp2启动子、tRNA启动子或U6。在进一步实施方案中,最小启动子是组织特异性的。在一些实施方案中,载体多核苷酸最小启动子和多核苷酸序列的长度小于4.4Kb。
为了表达多核苷酸,载体可包含在细胞中指导基因的转录和/或所编码蛋白质的翻译的一个或多个转录和/或翻译起始调节序列,例如启动子。在一些实施方案中,可采用组成型启动子。适用于哺乳动物细胞的组成型启动子通常是本领域已知的并且包括但不限于SV40、CAG、CMV、EF-1α、β-肌动蛋白、RSV和PGK。适用于细菌细胞、酵母细胞和真菌细胞的组成型启动子通常是本领域已知的,诸如用于细菌表达的T-7启动子和用于酵母中表达的醇脱氢酶启动子。
在一些实施方案中,调节元件可是受调节的启动子。“受调节的启动子”是指非组成性地、但以时间和/或空间调节方式指导基因表达的启动子并且包括组织特异性、组织偏好和诱导型启动子。在一些实施方案中,受调节的启动子是如先前在本文别处讨论的组织特异性启动子。受调节的启动子包括条件启动子和诱导型启动子。在一些实施方案中,条件启动子可用于在特定细胞类型中、在某些环境条件下和/或在特定发育状态期间指导多核苷酸的表达。合适的组织特异性启动子可包括但不限于肝脏特异性启动子(例如APOA2、SERPIN A1(hAAT)、CYP3A4和MIR122)、胰腺细胞启动子(例如INS、IRS2、Pdx1、Alx3、Ppy)、心脏特异性启动子(例如Myh6(αMHC)、MYL2(MLC-2v)、TNI3(cTnl)、NPPA(ANF)、Slc8a1(Ncx1))、中枢神经系统细胞启动子(SYN1、GFAP、INA、NES、MOBP、MBP、TH、FOXA2(HNF3β))、皮肤细胞特异性启动子(例如FLG、K14、TGM3)、免疫细胞特异性启动子(例如ITGAM、CD43启动子、CD14启动子、CD45启动子、CD68启动子)、泌尿生殖细胞特异性启动子(例如Pbsn、Upk2、Sbp、Fer1l4)、内皮细胞特异性启动子(例如ENG)、多能和胚胎生殖层细胞特异性启动子(例如Oct4、NANOG、合成Oct4、T短尾突变型(brachyury)、NES、SOX17、FOXA2、MIR122)和肌细胞特异性启动子(例如肌间线蛋白)。其他组织和/或细胞特异性启动子在本文别处讨论并且可是本领域通常已知的并且在本公开的范围内。
诱导型/条件启动子可是正诱导型/条件启动子(例如,在与活化的活化物或诱导物(化合物、环境条件或其他刺激物)适当相互作用后活化多核苷酸的转录的启动子)或负/条件诱导型启动子(例如受抑制(例如由阻遏物结合)直至启动子的阻遏物条件经移除的启动子)(例如,诱导物结合与启动子结合的阻遏物,刺激启动子被阻遏物释放或化学阻遏物从启动子环境移除)。诱导物可是化合物、环境条件或其他刺激物。因此,诱导型/条件启动子可响应任何合适的刺激,诸如化学、生物或其他分子剂、温度、光和/或pH。合适的诱导型/条件启动子包括但不限于Tet-On、Tet-Off、Lac启动子、pBad、AlcA、LexA、Hsp70启动子、Hsp90启动子、pDawn、XVE/OlexA、GVG和pOp/LhGR。
在需要在植物细胞中表达的情况下,本文所述的工程化AAV衣壳系统的组分通常置于植物启动子(即在植物细胞中可操作的启动子)的控制下。设想使用不同类型的启动子。在一些实施方案中,在植物中包含工程化AAV衣壳系统载体可是为了AAV载体产生目的。
组成型植物启动子是能够在植物的所有或几乎所有发育阶段期间在所有或几乎所有植物组织中表达(称为“组成型表达”)其控制的开放阅读框(ORF)的启动子。组成型启动子的一个非限制性实例是花椰菜花叶病毒35S启动子。不同的启动子可指导基因在不同组织或细胞类型中,或在不同发育阶段,或响应不同环境条件进行表达。在特定的实施方案中,一种或多种工程化AAV衣壳系统组分在组成型启动子的控制下表达,诸如花椰菜花叶病毒35S启动子问题优选的启动子可用于特定植物组织内的某些细胞类型中(例如叶子或根中的维管细胞或种子的特定细胞中)的目标增强表达。用于工程化AAV衣壳系统的特定启动子的实例见于Kawamata等人,(1997)Plant Cell Physiol 38:792-803;Yamamoto等人,(1997)Plant J 12:255-65;Hire等人,(1992)Plant Mol Biol 20:207-18;Kuster等人,(1995)Plant Mol Biol 29:759-72以及Capana等人,(1994)Plant Mol Biol 25:681-91。
诱导型的且可允许对基因编辑或基因表达进行时空控制的启动子的实例可使用某种形式的能量。能量的形式可包括但不限于声能、电磁辐射、化学能和/或热能。诱导型系统的实例包括四环素诱导型启动子(Tet-On或Tet-Off)、小分子双杂交转录活化系统(FKBP、ABA等)或光诱导型系统(光敏色素、LOV结构域或隐花色素),诸如以序列特异性方式指导转录活性变化的光诱导型转录效应子(LITE)。光诱导型系统的组分可包括本文所述的工程化肌肉特异性递送系统的一种或多种元件、光响应性细胞色素异二聚体(例如来自拟南芥)和转录活化/抑制结构域。在一些实施方案中,载体可包括在PCT公开WO 2014/018423和美国公开2015/0291966、2017/0166903、2019/0203212中提供的一种或多种诱导型DNA结合蛋白,所述文献描述了例如诱导型DNA结合蛋白和使用方法的实施方案且可适用于本发明。
在一些实施方案中,瞬时或诱导型表达可通过包含例如化学调节的启动子来实现(即外源化学物质的应用由此诱导基因表达)。基因表达的调节也可通过包含化学阻抑型启动子来获得,其中化学物质的应用抑制基因表达。化学诱导型启动子包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂活化的玉米ln2-2启动子(De Veylder等人,(1997)Plant Cell Physiol38:568-77)、由用作芽前除草剂的疏水亲电化合物活化的玉米GST启动子(GST-ll-27,WO93/01294)和由水杨酸活化的烟草PR-1a启动子(Ono等人,(2004)Biosci BiotechnolBiochem 68:803-7)。由抗生素调节的启动子,诸如四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(Gatz等人,(1991)Mol Gen Genet 227:229-37;美国专利号5,814,618和5,789,156)也可用于本文。
在一些实施方案中,载体或其系统可包含一种或多种能够易位和/或表达工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸到特定的细胞组分或细胞器中/能够在特定的细胞组分或细胞器中易位和/或表达工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸的元件。此类细胞器可包括但不限于细胞核、核糖体、内质网、高尔基体、叶绿体、线粒体、液泡、溶酶体、细胞骨架、质膜、细胞壁、过氧化物酶体、中心粒等。
可选择标记和标签
一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸可经可操作地连接、经融合或以其他方式经修饰以包含编码或是可选择标记或标签(其可是多核苷酸或多肽)的多核苷酸。在一些实施方案中,编码多肽可选择标记的多核苷酸经掺入工程化肌肉特异性递送系统多核苷酸中,使得可选择标记多核苷酸当翻译时经插入在工程化肌肉特异性靶向部分多肽(包括但不限于工程化AAV衣壳多肽)的N端与C端之间或工程化肌肉特异性靶向部分多肽(包括但不限于工程化AAV衣壳多肽)的N端和/或C端处的两个氨基酸之间。在一些实施方案中,可选择标记或标签是多核苷酸条形码或独特分子标识符(UMI)。
如本文所用,术语“条形码”是指用作相关分子(诸如靶分子和/或靶核酸)的标识符的短核苷酸序列(例如,DNA或RNA),或用作相关分子来源(诸如细胞来源)的标识符。条形码还可指代任何独特的、非天然存在的核酸序列,其可用于识别核酸片段的起源。尽管不必了解发明的机制,但据信条形码序列提供了与单个细胞、病毒载体、标记配体(例如,适体)、蛋白质、shRNA、sgRNA或cDNA相关的条形码的高质量个体读数,使得多个物种可一起测序。
可基于专利公开WO 2014047561 A1,Compositions and methods for labelingof agents(以其整体并入本文)中公开的组合物或方法中任一者进行条形码化。在某些实施方案中,条形码化使用纠错方案(T.K.Moon,Error Correction Coding:MathematicalMethods and Algorithms(Wiley,New York,第1版,2005))。不受理论束缚,来自单个细胞的扩增序列可一起测序,并基于与每个细胞相关的条形码进行解析。
在优选实施方案中,使用独特分子标识符(UMI)进行测序。如本文所用,术语“独特分子标识符”(UMI)是指在使用分子标签来检测和量化独特扩增产物的方法中使用的测序接头或核酸条形码亚型。UMI用于区分单个克隆和多个克隆的效果。如本文所用,术语“克隆”可指代单个mRNA或待测序的靶核酸。UMI还可用于测定产生扩增产物的转录物的数量,或在如本文所述的目标条形码的情况下,测定结合事件的数量。在优选实施方案中,扩增是通过PCR或多重置换扩增(MDA)。
应理解,编码此类可选择标记或标签的多核苷酸可以适当的方式经掺入编码本文所述的工程化肌肉特异性递送系统的一种或多种组分的多核苷酸中,以允许可选择标记或标签的表达。此类技术和方法在本文别处描述并且鉴于本公开将立即被本领域普通技术人员理解。许多此类可选择标记和标签在本领域中通常是已知的并且旨在落入本公开的范围内。
合适的可选择标记和标签包括但不限于亲和标签诸如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多(His)标签;溶解标签诸如硫氧还蛋白(TRX)和多(NANP)、MBP和GST;色谱标签诸如由聚阴离子氨基酸组成的标签,诸如FLAG-标签;表位标签诸如V5-标签、Myc-标签、HA-标签和NE-标签;可允许特定酶促修饰(诸如通过生物素连接酶进行生物素化)或化学修饰(诸如与FlAsH-EDT2反应以进行荧光成像)的蛋白质标签;含有限制性内切酶或其他酶切位点的DNA和/或RNA片段;编码针对其他有毒化合物(包括抗生素,诸如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、草铵膦(Basta)、新霉素磷酸转移酶II(NEO)、潮霉素磷酸转移酶(HPT))提供抗性的产物的DNA片段;编码受体细胞中亦缺乏的产物的DNA和/或RNA片段(例如,tRNA基因、营养缺陷型标记);编码易于识别的产物的DNA和/或RNA片段(例如,表型标记诸如β-半乳糖苷酶、GUS;荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)、青色(CFP)、黄色(YFP)、红色(RFP)、荧光素酶和细胞表面蛋白);可生成一个或多个用于PCR的新引物位点的多核苷酸(例如,两个先前未并列的DNA序列的并列);未受或受限制性内切核酸酶或其他DNA修饰酶、化学物质等作用的DNA序列;表位标签(例如GFP、FLAG-标签和His-标签),以及制作分子条形码或独特分子标识符(UMI)的DNA序列,允许其识别的特定修饰(例如,甲基化)所需的DNA序列。本领域技术人员将理解其他合适的标记。
可选择标记和标签可通过合适的接头与本文所述的工程化AAV衣壳系统的一种或多种组分可操作地连接,诸如和GS或GG一样短的甘氨酸或甘氨酸丝氨酸接头,其短至(GGGGG)3(SEQ ID NO:51)或(GGGGS)3(SEQ ID NO:56)。其他合适的接头在本文别处描述。
载体或载体系统可包含一种或多种编码本文别处描述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分的多核苷酸。在一些实施方案中,编码多核苷酸的靶向部分可包含在载体或载体系统(诸如病毒载体系统)中,使得它们在产生的病毒粒子内和/或在其上表达,使得病毒粒子可经靶向至特定细胞、组织、器官等。在一些实施方案中,一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分编码多核苷酸包括在载体或载体系统中,使得工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸和/或由其表达的产物包含靶向部分并且可靶向特定细胞、组织、器官等,诸如肌细胞、肌肉组织或含有肌肉的器官(例如,心脏)。在诸如非病毒载剂的一些实施方案中,靶向部分可附接至载剂(例如聚合物、脂质、无机分子等)并且能够使载剂和任何附接的或缔合的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸靶向特定细胞、组织、器官等,诸如诸如肌细胞、肌肉组织或含有肌肉的器官(例如心脏)。
无细胞载体和多核苷酸表达
在一些实施方案中,多核苷酸编码的含有一种或多种本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分的工程化肌肉特异性递送系统的一个或多个特征在无细胞体外系统中由载体或合适的多核苷酸表达。换言之,多核苷酸可在体外转录并任选翻译。体外转录/翻译系统和适当的载体通常是本领域已知的并且可商购获得。通常,体外转录和体外翻译系统分别在细胞环境之外重复RNA和蛋白质合成的过程。用于体外转录的载体和合适的多核苷酸可包含T7、SP6、T3、启动子调节序列,它们可被适当的聚合酶识别和作用以转录多核苷酸或载体。
体外翻译可以是独立的(例如纯化的多核糖核苷酸的翻译)或与转录连接/偶联。在一些实施方案中,无细胞(或体外)翻译系统可包含来自兔网织红细胞、小麦胚芽和/或大肠杆菌的提取物。提取物可包含翻译外源RNA所需的各种大分子组分(例如70S或80S核糖体、tRNA、氨酰-tRNA、合成酶、起始因子、延伸因子、终止因子等)。在翻译反应期间可包含或添加其他组分,包括但不限于氨基酸、能量源(ATP、GTP)、能量再生系统(磷酸肌酸和肌酸磷酸激酶(真核系统))(用于细菌系统的磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶)和其他辅助因子(Mg2+、K+等。)。如前所述,体外翻译可基于RNA或DNA起始材料。一些翻译系统可利用RNA模板作为起始材料(例如网织红细胞裂解物和小麦胚芽提取物)。一些翻译系统可利用DNA模板作为起始材料(例如基于大肠杆菌的系统)。在这些系统中,转录和翻译是偶联的,并且DNA首先被转录成RNA,所述RNA随后被翻译。合适的标准和偶联的无细胞翻译系统在本领域中通常是已知的并且可商购获得。
载体多核苷酸的密码子优化
如本文别处所述,编码本文所述的一个或多个实施方案的工程化肌肉特异性递送系统的多核苷酸是密码子优化的。在一些实施方案中,除了任选密码子优化的编码本文所述的实施方案的工程化肌肉特异性递送系统的多核苷酸之外,一种或多种包含在本文所述的载体中的多核苷酸(“载体多核苷酸”)可是密码子优化的。一般而言,密码子优化是指通过用在感兴趣的宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如,约或多于约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)来修饰核酸序列以获得所述宿主细胞中增强的表达同时维持天然氨基酸序列的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关,而信使RNA的翻译效率又据信取决于被翻译的密码子的性质和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性等。选定tRNA在细胞中的优势通常反映了肽合成中最频繁使用的密码子。因此,可基于密码子优化来剪裁基因以在给定生物体中实现最佳基因表达。密码子使用表容易获得(例如,在于www.kazusa.orjp/codon/可获得的“密码子使用数据库”)并且这些表可以多种方式进行调整。参见Nakamura,Y.,等人“Codon usagetabulated from the international DNA sequence databases:status for the year2000”Nucl.Acids Res.28:292(2000)。用于针对在特定宿主细胞中的表达对特定序列进行密码子优化的计算机算法也是可获得的,诸如Gene Forge(Aptagen;Jacobus,PA)也是可获得的。在一些实施方案中,编码DNA/RNA-靶向Cas蛋白的序列中的一个或多个密码子(例如,1、2、3、4、5、10、15、20、25、50个或更多个或全部密码子)对应于特定氨基酸最频繁使用的密码子。关于酵母中的密码子使用,请参考可在http://www.yeastgenome.org/community/codon_usage.shtml获得的在线酵母基因组数据库,或Codon selection in yeast,Bennetzen和Hall,JBiol Chem.1982Mar 25;257(6):3026-31。关于包括藻类的植物中的密码子使用,请参考Codon usage in higher plants,green algae,and cyanobacteria,Campbell和Gowri,Plant Physiol.1990年1月;92(1):1–11.;以及Codon usage in plantgenes,Murray等人,Nucleic Acids Res.1989年1月25日;17(2):477-98;或Selection onthe codon bias of chloroplast and cyanelle genes in different plant and algallineages,Morton BR,J Mol Evol.1998年4月;46(4):449-59。
载体多核苷酸可针对在特定细胞类型、组织类型、器官类型和/或受试者类型中的表达经密码子优化。在一些实施方案中,密码子优化的序列是针对真核生物例如人中的表达经优化的(即人或人细胞中的表达经优化的),或针对如在本文别处描述的另一种真核生物诸如另一种动物(例如哺乳动物或鸟类)经优化的序列。鉴于本文的描述,此类密码子优化的序列在普通技术人员的范围内。在一些实施方案中,多核苷酸针对特定细胞类型进行了密码子优化。此类细胞类型可包括但不限于上皮细胞(包括皮肤细胞、胃肠道内衬细胞、其他中空器官内衬细胞)、神经细胞(神经、脑细胞、脊柱细胞、神经支持细胞(例如星形胶质细胞、神经胶质细胞、雪旺细胞(Schwann cells)等))、肌细胞(例如心肌、平滑肌细胞和骨骼肌细胞)、结缔组织细胞(脂肪和其他软组织填充细胞、骨细胞、肌腱细胞、软骨细胞)、血细胞、干细胞和其他祖细胞、免疫系统细胞、生殖细胞及其组合。鉴于本文的描述,此类密码子优化的序列在普通技术人员的范围内。在一些实施方案中,多核苷酸针对特定组织类型进行了密码子优化。此类组织类型可包括但不限于肌肉组织、结缔组织、结缔组织、神经组织和上皮组织。鉴于本文的描述,此类密码子优化的序列在普通技术人员的范围内。在一些实施方案中,多核苷酸针对特定器官进行了密码子优化。此类器官包括但不限于肌肉、皮肤、肠、肝脏、脾脏、脑、肺、胃、心脏、肾脏、胆囊、胰腺、膀胱、甲状腺、骨、血管、血液及其组合。鉴于本文的描述,此类密码子优化的序列在普通技术人员的范围内。
在一些实施方案中,载体多核苷酸针对特定细胞诸如原核细胞或真核细胞中的表达进行了密码子优化。真核细胞可是或可是来源于特定生物体(诸如植物或哺乳动物,包括但不限于如本文讨论的人或非人真核生物或动物或哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔、狗、牲畜或非人哺乳动物或灵长类动物)的细胞。
非病毒载体
在一些实施方案中,载体是非病毒载体或载剂。在一些实施方案中,非病毒载体可具有以下优势:与病毒载体相比降低的毒性和/或免疫原性和/或增加的生物安全性。本领域术语“非病毒载体和载剂”以及如本文在此上下文中使用的,是指不基于病毒或病毒基因组的一种或多种组分(不包含待由非病毒载体递送和/或表达的任何核苷酸),能够与本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸附接、结合、偶联和/或以其他方式相互作用并且能够将多核苷酸运送至细胞和/或表达多核苷酸的分子和/或组合物。应理解,这不排除包含待递送的基于病毒的多核苷酸。例如,如果待递送gRNA是针对病毒组分的,并且它经插入其他非病毒载体或载剂或以其他方式与其他非病毒载体或载剂偶联,这不会使所述载体成为“病毒载体”。非病毒载体和载剂包括裸多核苷酸、基于化学的载剂、基于多核苷酸(非病毒)的载体和基于粒子的载剂。应理解,在非病毒载体和载剂的上下文中使用的术语“载体”是指多核苷酸载体,并且在此上下文中使用的“载剂”是指与待递送多核苷酸诸如本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸附接或以其他方式相互作用的非核酸或多核苷酸分子或组合物。
裸多核苷酸
在一些实施方案中,本文别处描述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸可包含在裸多核苷酸中。如本文所用的术语“裸多核苷酸”是指不与另一分子(例如蛋白质、脂质和/或其他分子)缔合(这通常可帮助保护它免受环境因素的影响和/或降解)的多核苷酸。如本文所用,缔合包括但不限于连接、粘附、吸附、封闭在其中、封闭在其中或其内、混合等。包含一种或多种本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸的裸多核苷酸可直接地经递送至宿主细胞并任选在其中表达。裸多核苷酸可具有任何合适的二维和三维构型。作为非限制性实例,裸多核苷酸可是单链分子、双链分子、环状分子(例如质粒和人工染色体)、含有单链部分和双链部分的分子(例如核酶)等。在一些实施方案中,裸多核苷酸仅含有本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸。在一些实施方案中,裸多核苷酸可含有除本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸之外的其他核酸和/或多核苷酸。裸多核苷酸可包含转座子系统的一种或多种元件。本文别处更详细地描述了转座子及其系统。
非病毒多核苷酸载体
在一些实施方案中,一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸可包含在非病毒多核苷酸载体中。合适的非病毒多核苷酸载体包括但不限于转座子载体和载体系统、质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、无AR(抗生素抗性)质粒和微质粒、环状共价闭合载体(例如微环、微载体、微结(miniknots))、线性共价闭合载体(“哑铃形”)、MIDGE(极简化免疫定义基因表达)载体、MiLV(微链载体)载体、微串(Ministrings)、微基因内质粒、PSK系统(分离后杀伤系统)、ORT(操作子阻遏物滴定)质粒等。参见例如Hardee等人2017.Genes.8(2):65。
在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可具有条件复制起点。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可是ORT质粒。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可具有极简化免疫定义基因表达。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可具有一种或多种分离后杀伤系统基因。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体是无AR的。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体是微载体。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体包含核定位信号。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可包含一个或多个CpG基序。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可包含一个或多个支架/基质附着区(S/MAR)。参见例如Mirkovitch等人1984.Cell.39:223-232,Wong等人2015。Adv.Genet.89:113-152,其技术和载体可适用于本发明。S/MAR是富含AT的序列,通过DNA环碱基附着至核基质,在染色体的空间组织中发挥作用。S/MAR经常发现靠近调节元件诸如启动子、增强子和DNA复制起点。包含一个或S/MAR可促进每个细胞周期一次的复制,以将非病毒多核苷酸载体维持为子细胞中的游离基因。在实施方案中,S/MAR序列位于包含在非病毒多核苷酸载体中的主动转录多核苷酸(例如本发明的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸)的下游。在一些实施方案中,S/MAR可是来自β-干扰素基因簇的S/MAR。参见例如Verghese等人2014.Nucleic AcidRes.42:e53;Xu等人2016.Sci.China Life Sci.59:1024-1033;Jin等人2016.8:702-711;Koirala等人2014.Adv.Exp.Med.Biol.801:703-709;以及Nehlsen等人2006.GeneTher.Mol.Biol.10:233-244,其技术和载体可适用于本发明。
在一些实施方案中,非病毒载体是转座子载体或其系统。如本文所用,“转座子”(也称为转座因子)是指能够在基因组中移动位置至另一位置的多核苷酸序列。存在若干类转座子。转座子包括逆转录转座子和DNA转座子。逆转录转座子需要转录被移动(或转座)的多核苷酸,以便将多核苷酸转座至新的基因组或多核苷酸。DNA转座子是不需要逆转录移动(或转座)的多核苷酸以便将多核苷酸转座至新的基因组或多核苷酸的那些转座子。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可是逆转录转座子载体。在一些实施方案中,逆转录转座子载体包含长末端重复。在一些实施方案中,逆转录转座子载体不包含长末端重复。在一些实施方案中,非病毒多核苷酸载体可是DNA转座子载体。DNA转座子载体可包含编码转座酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中,转座子载体被配置为非自主转座子载体,这意味着转座不会自行发生。在这些实施方案中的一些中,转座子载体缺少一种或多种编码转座所需蛋白质的多核苷酸序列。在一些实施方案中,非自主转座子载体缺少一个或多个Ac元件。
在一些实施方案中,非病毒多核苷酸转座子载体系统可包含第一多核苷酸载体,其包含在5’和3’末端侧翼有转座子末端反向重复序列(TIR)的本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸以及第二多核苷酸载体,其包含能够编码与启动子偶联以驱动转座酶表达的转座酶的多核苷酸。当两者都在同一细胞中表达时,转座酶可由第二载体表达,并且可在第一载体(例如本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸)上的TIR之间转座材料并将其整合到宿主细胞的基因组中的一个或多个位置中。在一些实施方案中,转座子载体或其系统可被配置为基因捕获。在一些实施方案中,TIR可被配置为侧接强剪接接纳体位点,随后是报道基因和/或其他基因(例如,一种或多种本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸)以及强多聚腺苷酸尾。当在使用此载体或其系统时发生转座时,转座子可插入基因的内含子中,并且插入的报道基因或其他基因可引发错误剪接过程并因此使捕获的基因失活。
可使用任何合适的转座子系统。合适的转座子及其系统可包括睡美人转座子系统(Tc1/mariner超家族)(参见例如Ivics等人1997.Cell.91(4):501-510)、piggyBac(piggyBac超家族)(参见例如Li等人2013 110(25):E2279-E2287和Yusa等人2011.PNAS.108(4):1531-1536)、Tol2(超家族hAT)、青蛙王子(Tc1/mariner超家族)(参见例如Miskey等人2003Nucleic Acid Res.31(23):6873-6881)及其变体。
病毒载体
在一些实施方案中,载体是病毒载体。术语“病毒载体”和如本文在此上下文中使用的,是指基于多核苷酸的载体,其含有来自或基于病毒的一种或多种元件的一种或多种元件,所述载体当单独使用或与一种或多种其他病毒载体一起使用(诸如在病毒载体系统中)时能够表达和包装多核苷酸(诸如本发明的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸)到病毒粒子中并产生所述病毒粒子。病毒载体及其系统可用于产生病毒粒子,用于递送和/或表达本文所述的工程化肌肉特异性系统的一种或多种组分。病毒载体可是涉及多个载体的病毒载体系统的一部分。在一些实施方案中,掺有多种病毒载体的系统可增加这些系统的安全性。合适的病毒载体可包括基于腺病毒的载体、腺相关载体、辅助依赖性腺病毒(HdAd)载体、杂合腺病毒载体等。病毒载体和由其产生的病毒粒子的其他实施方案在本文别处描述。在一些实施方案中,病毒载体被配置以产生复制缺陷型病毒粒子,以提高这些系统的安全性。
腺病毒载体、辅助依赖性腺病毒载体和杂合腺病毒载体
在一些实施方案中,载体可是腺病毒载体。因此,本发明适用于腺病毒科(familyAdenoviridae)内的病毒,诸如腺病毒属(Atadenovirus)(例如,绵羊腺病毒D(Ovineatadenovirus D))、禽类腺病毒属(Aviadenovirus)(例如,禽腺病毒A(Fowlaviadenovirus A))、鱼类腺病毒属(Ichtadenovirus)(例如,鲟鱼腺病毒A(Sturgeonichtadenovirus A))、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)(其包括诸如所有人腺病毒的腺病毒)(例如,人哺乳动物腺病毒C(Human mastadenovirus C))和唾液腺病毒属(Siadenovirus)(例如,青蛙唾液腺病毒A(Frog siadenovirus A))。因此,腺病毒科内的病毒被考虑在本发明内,本文讨论了适用于其他科成员的腺病毒。在一些实施方案中,腺病毒载体可包含使得使用载体或其系统产生的病毒粒子可是血清型2、5或9的元件。在一些实施方案中,待通过腺病毒粒子递送的多核苷酸可高达约8kB。因此,在一些实施方案中,腺病毒载体可包含待递送的DNA多核苷酸,其大小范围可为约0.001kb至约8kb。腺病毒载体已在若干种情况下成功使用(参见例如Teramato等人2000.Lancet.355:1911-1912;Lai等人2002.DNA Cell.Biol.21:895-913;Flotte等人,1996.Hum.Gene.Ther.7:1145-1159;和Kay等人2000.Nat.Genet.24:257-261。工程化肌肉特异性靶向部分可包含在腺病毒载体中以产生含有所述工程化AAV衣壳的腺病毒粒子,所述衣壳含有工程化肌肉特异性靶向部分。
在一些实施方案中,载体可是辅助依赖性腺病毒载体或其系统。这些在本领域也称为“空壳(gutless)”或“空壳的(gutted)”载体,并且是腺病毒载体的改良代(参见例如Thrasher等人2006.Nature.443:E5-7)。在辅助依赖性腺病毒载体系统的实施方案中,一个载体(辅助)可含有复制所需的所有病毒基因,但在包装结构域中含有条件基因缺陷。系统的第二载体可仅含有病毒基因组的末端、一种或多种工程化AAV衣壳多核苷酸和天然包装识别信号,其可以允许从细胞中选择性包装释放(参见例如Cideciyan等人2009.N Engl JMed.361:725-727)。辅助依赖性腺病毒载体系统已在若干种情况下成功用于基因递送(参见例如Simonelli等人2010.J Am Soc Gene Ther.18:643-650;Cideciyan等人2009.NEngl J Med.361:725-727;Crane等人2012.Gene Ther.19(4):443-452;Alba等人2005.Gene Ther.12:18-S27;Croyle等人2005.Gene Ther.12:579-587;Amalfitano等人1998.J.Virol.72:926-933;和Morral等人1999.PNAS.96:12816-12821)。这些公开中描述的技术和载体可适用于包含本文所述的工程化AAV衣壳多核苷酸。在一些实施方案中,含有工程化肌肉特异性靶向部分或编码多核苷酸的病毒粒子由辅助依赖性腺病毒载体或其系统产生,所述病毒粒子可高达约38kb。因此,在一些实施方案中,腺病毒载体的大小范围可为约0.001kb至约37kb(参见例如Rosewell等人2011.J.Genet.Syndr.Gene Ther.Suppl.5:001)。
在一些实施方案中,载体是杂合腺病毒载体或其系统。杂合腺病毒载体由基因缺失腺病毒载体的高转导效率和腺相关、逆转录病毒、慢病毒和基于转座子的基因转移的长期基因组整合潜力构成。在一些实施方案中,此类杂合载体系统可导致稳定的转导和有限的整合位点。参见例如Balague等人2000.Blood.95:820-828;Morral等人1998.Hum.GeneTher.9:2709-2716;Kubo和Mitani.2003.J.Virol.77(5):2964-2971;Zhang等人2013.PloSOne.8(10)e76771;和Cooney等人2015.Mol.Ther.23(4):667-674),其中描述的其技术和载体可被修改和调整以用于本发明的工程化AAV肌肉特异性递送系统。在一些实施方案中,杂合腺病毒载体可包含逆转录病毒和/或腺相关病毒的一个或多个特征。在一些实施方案中,杂合腺病毒载体可包含泡沫(spuma)逆转录病毒或泡沫(foamy)病毒(FV)的一个或多个特征。参见例如Ehrhardt等人2007.Mol.Ther.15:146-156和Liu等人2007.Mol.Ther.15:1834-1841,其中描述的其技术和载体可被修改和调整以用于本发明的工程化AAV衣壳系统。在杂合腺病毒载体或其系统中使用来自FV的一个或多个特征的优势可包括由其产生的病毒粒子感染广泛细胞的能力、与其他逆转录病毒相比大的包装容量,以及在休眠(非分裂)细胞中持续存在的能力。还参见例如Ehrhardt等人2007.Mol.Ther.156:146-156和Shuji等人2011.Mol.Ther.19:76-82,其中描述的其技术和载体可被修改和调整以用于本发明的工程化AAV衣壳系统。
腺相关载体
在一实施方案中,工程化载体或其系统可是腺相关载体(AAV)。参见例如,West等人,Virology 160:38-47(1987);美国专利号4,797,368;WO 93/24641;Kotin,Human GeneTherapy 5:793-801(1994);和Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。尽管在其特征中的一些中与腺病毒载体类似,但AAV在其复制和/或致病性方面具有一些缺陷,并且因此可比腺病毒载体更安全。在一些实施方案中,AAV可整合到人细胞19号染色体上的特定位点中,而没有可观察到的副作用。在一些实施方案中,AAV载体、其系统和/或AAV粒子的容量可高达约4.7kb。AAV载体或其系统可包含一种或多种本文所述的工程化衣壳多核苷酸。
AAV载体或其系统可包含一种或多种调节分子。在一些实施方案中,调节分子可是启动子、增强子、阻遏物等,它们在本文别处更详细地描述。在一些实施方案中,AAV载体或其系统可包含一种或多种可编码一种或多种调节蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中,一种或多种调节蛋白可选自Rep78、Rep68、Rep52、Rep40其变体及其组合。在一些实施方案中,启动子可是如先前讨论的组织特异性启动子。在一些实施方案中,组织特异性启动子可驱动本文所述的工程化衣壳AAV衣壳多核苷酸的表达。这诸如对于确定如先前所述和如在62/899,453、62/916,207、63/018,454、63/055,252和62/916,221以及国际申请号PCT/US20/50534中所阐述的肌肉特异性靶向部分可是有利的。
AAV载体或其系统可包含一种或多种多核苷酸,所述多核苷酸可编码一种或多种衣壳蛋白,诸如本文别处描述的工程化AAV衣壳蛋白。工程化衣壳蛋白能够组装到AAV病毒粒子的蛋白质外鞘(工程化衣壳)中。工程化衣壳可具有细胞、组织和/或器官特异性趋向性。在一些实施方案中,AAV衣壳蛋白可包含一种或多种本文别处描述的工程化肌肉特异性靶向部分。在一些实施方案中,包含在AAV衣壳中的一种或多种肌肉特异性靶向部分包含如本文别处更详细描述的RGD基序。
在一些实施方案中,AAV载体或其系统可包含一种或多种腺病毒辅助因子或可编码一种或多种腺病毒辅助因子的多核苷酸。此类腺病毒辅助因子可包括但不限于E1A、E1B、E2A、E4ORF6和VA RNA。在一些实施方案中,生产宿主细胞系表达一种或多种腺病毒辅助因子。
AAV载体或其系统可被配置以产生具有特定血清型的AAV粒子。在一些实施方案中,血清型可是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74、AAV rh.10或其任何组合。在一些实施方案中,AAV可是AAV1、AAV-2、AAV-5、AAV-9或其任何组合。可针对待靶向的细胞选择AAV的AAV;例如,可选择AAV血清型1、2、5、9或杂合衣壳AAV-1、AAV-2、AAV-5、AAV-9或其任何组合以靶向脑和/或神经元细胞;并且可选择AAV-4以靶向心脏组织;并且可选择AAV-8以递送至肝脏。因此,在一些实施方案中,能够产生能够靶向脑和/或神经元细胞的AAV粒子的AAV载体或其系统可被配置以生成具有血清型1、2、5或杂合衣壳AAV-1、AAV-2、AAV-5或其任何组合的AAV粒子。在一些实施方案中,能够产生能够靶向心脏组织的AAV粒子的AAV载体或其系统可被配置以生成具有AAV-4血清型的AAV粒子。在一些实施方案中,能够产生能够靶向肝脏的AAV粒子的AAV载体或其系统可被配置以生成具有AAV-8血清型的AAV。还参见Srivastava.2017.Curr.Opin.Virol.21:75-80。
应理解,尽管不同的血清型可提供一定水平的细胞、组织和/或器官特异性,每种血清型仍然是多趋向性的,并且因此如果使用该血清型靶向该血清型转导效率较低的组织,则可导致组织毒性。因此,除了通过选择特定血清型的AAV来实现一些组织靶向能力之外,应理解,AAV血清型的趋向性可通过本文所述的工程化AAV衣壳来改变。如本文别处所述,任何血清型的野生型AAV变体可通过本文所述方法生成并确定具有特定细胞特异性趋向性,其可与参考野生型AAV血清型的细胞特异性趋向性相同或不同。在一些实施方案中,可增强野生型血清型的细胞、组织和/或特异性(例如使血清型对其已经偏向的特定细胞类型更具选择性或特异性)。例如,野生型AAV-9偏向于人的肌肉和脑(参见例如Srivastava.2017.Curr.Opin.Virol.21:75-80.)。通过包含如本文所述的野生型AAV-9的工程化AAV衣壳和/或衣壳蛋白变体,可减少或消除对例如脑的偏向和/或增加肌肉腐败性(septicity),使得相比之下脑特异性似乎降低,从而与野生型AAV-9相比增强对肌肉的特异性。如前所述,包含野生型AAV血清型的工程化衣壳和/或衣壳蛋白变体可具有与野生型参考AAV血清型不同的趋向性。例如,AAV-9的工程化AAV衣壳和/或衣壳蛋白变体可对人肌肉或大脑之外的组织具有特异性。
在一些实施方案中,AAV载体是杂合AAV载体或其系统。杂合AAV是包含具有来自一种血清型的元件的基因组的AAV,所述元件被包装到来源于至少一种不同血清型的衣壳中。例如,如果它是待产生的rAAV2/5,并且如果产生方法是基于上文讨论的无辅助瞬时转染方法,则第一质粒和第三质粒(腺辅助质粒)将与rAAV2产生中讨论的相同。然而,第二质粒pRepCap将有所不同。在此称为pRep2/Cap5的质粒中,Rep基因仍然来源于AAV2,而Cap基因则来源于AAV5。产生方案与上述产生AAV2的方法相同。生成的rAAV称为rAAV2/5,其中基因组基于重组AAV2,而衣壳基于AAV5。假定由此AAV2/5杂合病毒显示的细胞或组织趋向性应与AAV5相同。应理解,野生型杂合AAV粒子遭受与先前讨论的非杂合野生型血清型相同的特异性问题。
基于野生型的杂合AAV系统实现的优势可与可使用工程化AAV衣壳实现的增加的和可定制的细胞特异性组合,可通过生成可包含本文别处描述的工程化AAV衣壳的杂合AAV来组合。应理解,杂合AAV可含有工程化AAV衣壳,所述衣壳含有具有来自与参考野生型血清型不同的血清型的元件的基因组,所述工程化AAV衣壳是参考野生型血清型的变体。例如,可产生包含工程化AAV衣壳的杂合AAV,所述衣壳是用于包装基因组的AAV-9血清型的变体,所述基因组含有来自AAV-2血清型的组分(例如rep元件)。与先前讨论的基于野生型的杂合AAV一样,所得的AAV粒子的趋向性将是工程化AAV衣壳的趋向性。
关于这些细胞的某些野生型AAV血清型的列表可见于Grimm,D.等人,J.Virol.82:5887-5911(2008),转载如下表7。更多趋向性细节可见于如先前讨论的Srivastava.2017.Curr.Opin.Virol.21:75-80。
在一些实施方案中,AAV载体或其系统是AAV rh.74或AAV rh.10。
在一些实施方案中,AAV载体或其系统被配置为“空壳”载体,类似于结合逆转录病毒载体描述的那些。在一些实施方案中,“空壳”AAV载体或其系统可具有参与基因组扩增和包装的顺式作用病毒DNA元件,其与感兴趣的异源序列(例如工程化AAV衣壳多核苷酸)连接。
逆转录病毒和慢病毒载体
在一些实施方案中,工程化肌肉特异性递送系统或其组分是或经掺入逆转录病毒或慢病毒载体中。逆转录病毒载体可由具有高达6-10kb外来序列的包装容量的顺式作用长末端重复序列构成。最小顺式LTR足以复制和包装载体,接着将其用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久转基因表达。适用于CRISPR-Cas系统的逆转录病毒载体可包括基于以下的载体:鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合(参见例如,Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann等人,J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommnerfelt等人,Virol.176:58-59(1990);Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller等人,J.Virol.65:2220-2224(1991);PCT/US94/05700)。因此,逆转录病毒基因转移系统的选择可取决于靶组织。
逆转录病毒的趋向性可通过掺入外来包膜蛋白、扩增靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞的逆转录病毒载体并且在本文别处更详细地描述。逆转录病毒还可经工程改造以允许插入的转基因有条件地表达,使得仅某些细胞类型会被慢病毒感染。在最终产物是肌肉特异性病毒粒子的一些实施方案中,趋向性至少部分由本文所述的肌肉特异性靶向部分的存在定义,诸如掺入逆转录病毒或慢病毒粒子的衣壳蛋白和/或衣壳内。
慢病毒是复杂的逆转录病毒,其能够感染有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞两者并在有丝分裂细胞和有丝分裂后细胞两者中表达其基因。使用慢病毒方法的优势可包括转导或感染非分裂细胞的能力以及它们通常产生高病毒滴度的能力,这可以提高产生和递送的效率或功效。合适的慢病毒载体包括但不限于基于人类免疫缺陷病毒(HIV)的慢病毒载体、基于猫免疫缺陷病毒(FIV)的慢病毒载体、基于猴免疫缺陷病毒(SIV)的慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、基于维斯娜梅迪(Visna.maedi)病毒(VMV)的慢病毒载体、基于山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)的慢病毒载体、基于牛免疫缺陷病毒(BIV)的慢病毒载体和基于马传染性贫血(EIAV)的慢病毒载体。在一些实施方案中,可使用基于HIV的慢病毒载体系统。在一些实施方案中,可使用基于FIV的慢病毒载体系统。
在一些实施方案中,慢病毒载体是基于EIAV的慢病毒载体或载体系统。EIAV载体已被用于在其他情况下介导表达、包装和/或递送,诸如用于眼部基因治疗(参见例如,Balagaan,J Gene Med 2006;8:275–285)。在另一实施方案中,(参见例如,Binley等人,HUMAN GENE THERAPY 23:980–991(2012年9月))描述了这是一种基于马传染性贫血病毒的慢病毒基因治疗载体,其表达血管抑制蛋白内皮抑素和血管抑素,所述载体通过视网膜下注射递送用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性。这些公开中描述的这些载体中任一种都可针对本文描述的工程化肌肉特异性递送系统的元件进行修改。
在一些实施方案中,慢病毒载体或其载体系统可是第一代慢病毒载体或其载体系统。第一代慢病毒载体可含有大部分慢病毒基因组,包括gag和pol基因、其他额外的病毒蛋白(例如VSV-G)和其他附属基因(例如vif、vprm vpu、nef及其组合)、调节基因(例如tat和/或rev)以及LTR之间的感兴趣的基因。第一代慢病毒载体可产生能够在体内复制的病毒粒子,这可能不适合某些情况或应用。
在一些实施方案中,慢病毒载体或其载体系统可是第二代慢病毒载体或其载体系统。第二代慢病毒载体不含有一种或多种附属毒力因子,并且不包含在同一慢病毒载体上产生病毒粒子所必需的所有组分。这可导致产生复制缺陷型病毒粒子,并且因此提高这些系统相对于第一代慢病毒载体的安全性。在一些实施方案中,第二代载体缺乏一种或多种附属毒力因子(例如vif、vprm、vpu、nef及其组合)。与第一代慢病毒载体不同,单个第二代慢病毒载体不包含表达多核苷酸并将其包装到病毒粒子中所必需的所有特征。在一些实施方案中,包膜和包装组分在两个不同的载体之间分开,其中gag、pol、rev和tat基因包含在一个载体上,而包膜蛋白(例如VSV-G)包含在第二载体上。感兴趣的基因、其启动子和LTR可包含在第三载体上,所述第三载体可与其他两个载体(包装载体和包膜载体)结合使用,以生成复制缺陷型病毒粒子。
在一些实施方案中,慢病毒载体或其载体系统可是第三代慢病毒载体或其载体系统。第三代慢病毒载体及其载体系统比第一代和第二代慢病毒载体及其系统具有增加的安全性,因为例如病毒基因组的各种组分在两个或更多个不同的载体之间分开,但在体外一起用于制造病毒粒子时,它们可缺少tat基因(当组成型活性启动子包含在LTR的上游时),并且它们可在3’LTR中包含一个或多个缺失以产生具有破坏的LTR的启动子/增强子活性的自失活(SIN)载体。在一些实施方案中,第三代慢病毒载体系统可包含(i)载体质粒,其含有感兴趣的多核苷酸和侧接5'和3'LTR的上游启动子,所述质粒可任选包含存在于LTR的一者或两者中以致使载体自失活的一个或多个缺失;(ii)“包装载体”,其可含有参与将多核苷酸包装到由系统产生的病毒粒子中的一个或多个基因(例如gag、pol和rev)和驱动包装载体上存在的特征的表达的上游调节序列(例如启动子);以及(iii)“包膜载体”,其含有一个或多个包膜蛋白基因和上游启动子。在某些实施方案中,第三代慢病毒载体系统可包含至少两种包装载体,其中gag-pol存在于与rev基因不同的载体上。
在一些实施方案中,具有靶向HIV tat/rev(核仁定位TAR诱饵)共享的共同外显子的siRNA和抗CCR5特异性锤头核酶的自失活慢病毒载体(参见例如,DiGiusto等人(2010)Sci Transl Med2:36ra43)可用于和/或适用于本发明的CRISPR-Cas系统。
在一些实施方案中,可通过改变包含在慢病毒载体或其系统中的包膜蛋白的类型来调节慢病毒粒子的假型和感染性或趋向性。如本文所用,“包膜蛋白”或“外层蛋白”意指暴露在病毒粒子表面的不是衣壳蛋白的蛋白质。例如,包膜或外层蛋白通常包括嵌入病毒包膜中的蛋白质。在一些实施方案中,慢病毒载体或其载体系统可包含VSV-G包膜蛋白。VSV-G介导病毒附着至宿主细胞上存在的LDL受体(LDLR)或LDLR家族成员,这触发宿主细胞对病毒粒子的内吞作用。因为LDLR由多种细胞表达,所以表达VSV-G包膜蛋白的病毒粒子可感染或转导多种细胞类型。其他合适的包膜蛋白可基于使用者希望被由本文所述的慢病毒载体或其系统产生的病毒粒子感染的宿主细胞掺入,并且可包括但不限于猫内源病毒包膜蛋白(RD114)(参见例如Hanawa等人Molec.Ther.2002 5(3)242-251),修饰的辛德毕斯(Sindbis)病毒包膜蛋白(参见例如Morizono等人2010.J.Virol.84(14)6923-6934;Morizono等人2001.J.Virol.75:8016-8020;Morizono等人2009.J.Gene Med.11:549-558;Morizono等人2006Virology355:71-81;Morizono等人J.Gene Med.11:655-663,Morizono等人2005Nat.Med.11:346-352)、狒狒逆转录病毒包膜蛋白(参见例如Girard-Gagnepain等人2014.Blood.124:1221-1231);树鼩副粘病毒糖蛋白(参见例如Enkirch T.等人,2013.Gene Ther.20:16-23);麻疹病毒糖蛋白(参见例如Funke等人2008.Molec.Ther.16(8):1427-1436)、狂犬病病毒包膜蛋白、MLV包膜蛋白、埃博拉病毒包膜蛋白、杆状病毒包膜蛋白、丝状病毒包膜蛋白、E1和E2肝炎包膜蛋白、HIV的gp41和gp120、血凝素、神经氨酸酶、流感病毒M2蛋白及其组合。
在一些实施方案中,所得的慢病毒粒子的趋向性可通过将细胞靶向肽掺入慢病毒载体中,使得细胞靶向肽在所得的慢病毒粒子表面上表达来调节。在一些实施方案中,慢病毒载体可含有与细胞靶向蛋白融合的包膜蛋白(参见例如Buchholz等人2015.TrendsBiotechnol.33:777-790;Bender等人2016.PLoS Pathog.12(e1005461);和Friedrich等人2013.Mol.Ther.2013.21:849-859)。
在一些实施方案中,可使用将慢病毒粒子靶向特定细胞类型的分裂内含肽介导的方法(参见例如Chamoun-Emaneulli等人2015.Biotechnol.Bioeng.112:2611-2617,Ramirez等人2013.Protein.Eng.Des.Sel.26:215-233)。在这些实施方案中,慢病毒载体可含有与细胞靶向肽融合的来自点状念珠藻的天然分裂内含肽的剪接缺陷型变体的一半,并且相同或不同的慢病毒载体可含有与包膜蛋白诸如结合缺陷型、融合胜任型病毒包膜蛋白融合的分裂内含肽的另一半。这可导致由包含分裂内含肽的慢病毒载体或载体系统产生病毒粒子,所述内含肽可充当分子维可牢尼龙搭扣接头(Velcro linker)以将细胞结合蛋白与假型慢病毒粒子连接。对于在表面不相容性可限制例如细胞靶向肽的使用的情况下使用这种方法可是有利的。
在一些实施方案中,可将形成共价键的蛋白质-肽对掺入本文所述的一种或多种慢病毒载体中以将细胞靶向肽与病毒粒子缀合(参见例如Kasaraneni等人2018.Sci.Reports(8)No.10990)。在一些实施方案中,慢病毒载体可包含InaD蛋白(PDZ1)的N末端PDZ结构域及其来自NorpA的五肽配体(TEFCA),其可通过共价键(例如二硫键)将细胞靶向肽与病毒粒子缀合。在一些实施方案中,PDZ1蛋白可与包膜蛋白融合(所述包膜蛋白可任选是结合缺陷型和/或融合胜任型病毒包膜蛋白)并包含在慢病毒载体中。在一些实施方案中,TEFCA可与细胞靶向肽融合,并且TEFCA-CPT融合构建体可与PDZ1-包膜蛋白构建体掺入相同或不同的慢病毒载体中。在病毒产生期间,PDZ1与TEFCA之间的特异性相互作用促进产生与细胞靶向肽共价功能化的病毒粒子,并且因此能够基于细胞靶向肽与表达其结合伴侣的细胞之间的特异性相互作用靶向特定细胞类型。对于在表面不相容性可限制例如细胞靶向肽的使用的情况下使用这种方法可是有利的。
慢病毒载体已被公开用于治疗帕金森病(Parkinson’sDisease),参见例如美国专利公开号20120295960以及美国专利号7303910和7351585。慢病毒载体也已公开用于治疗眼部疾病,参见例如美国专利公开号20060281180、20090007284、US20110117189;US20090017543;US20070054961、US20100317109。慢病毒载体也已公开用于递送至脑,参见例如美国专利公开号US20110293571;US20110293571、US20040013648、US20070025970、US20090111106和美国专利号US7259015。这些系统或其变体中任一者都可用于将工程化肌肉特异性多核苷酸递送至细胞和/或将本文所述的用于肌肉特异性递送的肌肉特异性靶向部分掺入细胞中。
在一些实施方案中,慢病毒载体系统可包含一种或多种转移质粒。转移质粒可由各种其他载体骨架生成,并且可包含一个或多个可与系统中的其他逆转录病毒和/或慢病毒载体一起发挥作用的特征,所述特征可例如提高载体和/或载体系统的安全性、增加病毒滴度和/或增加或以其他方式增强待表达和/或包装到病毒粒子中的所需插入片段的表达。可包含在转移质粒中的合适的特征可包括但不限于5’LTR、3’LTR、SIN/LTR、复制起点(Ori)、可选择标记基因(例如抗生素抗性基因)、Psi(Ψ)、RRE(rev反应元件)、cPPT(中央多嘌呤束)、启动子、WPRE(土拨鼠肝炎转录后调节元件)、SV40多腺苷酸化信号、pUC起点、SV40起点、F1起点及其组合。
在另一实施方案中,考虑了科卡尔(Cocal)水泡病毒包膜假型逆转录病毒或慢病毒载体粒子(参见例如,转让给福瑞德哈金森癌症研究中心(Fred Hutchinson CancerResearch Center)的美国专利公开号20120164118)。科卡尔病毒属于水泡病毒属(Vesiculovirus genus),并且是哺乳动物水泡性口炎的病原体。科卡尔病毒最初是从特立尼达(Trinidad)的螨虫中分离出来的(Jonkers等人,Am.J.Vet.Res.25:236-242(1964)),并在特立尼达、巴西和阿根廷发现了来自昆虫、牛和马的感染。许多感染哺乳动物的水泡病毒是从自然感染的节肢动物中分离出来的,这表明它们是媒介传播的。水泡病毒抗体在农村地区的人们中很常见,其中病毒是地方性的和实验室获得的;人感染通常会导致流感样症状。科卡尔病毒包膜糖蛋白在氨基酸水平上与VSV-G印第安纳(VSV-G Indiana)具有71.5%的同一性,并且水泡病毒包膜基因的系统发育比较表明在水泡病毒中,科卡尔病毒在血清学上与VSV-G印第安纳株不同但最密切相关。Jonkers等人,Am.J.Vet.Res.25:236-242(1964)和Travassos da Rosa等人,Am.J.Tropical Med.&Hygiene 33:999-1006(1984)。科卡尔水泡病毒包膜假型逆转录病毒载体粒子可包括例如慢病毒、α逆转录病毒、β逆转录病毒、γ逆转录病毒、δ逆转录病毒和ε逆转录病毒载体粒子,其可包含逆转录病毒Gag、Pol和/或一种或多种辅助蛋白和科卡尔水泡病毒包膜蛋白。在这些实施方案的某些实施方案中,Gag、Pol和辅助蛋白是慢病毒的和/或γ逆转录病毒的。在一些实施方案中,逆转录病毒载体可含有一种或多种科卡尔水泡病毒包膜蛋白的编码多肽,使得所得的病毒或假病毒粒子是科卡尔水泡病毒包膜假型的。
单纯疱疹病毒载体
在一些实施方案中,载体可是基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体或其系统。HSV系统可包含失能感染单拷贝(DISC)病毒,其由糖蛋白H缺陷型突变体HSV基因组构成。当缺陷型HSV在互补细胞中繁殖时,可生成能够感染后续细胞的病毒粒子,所述细胞永久复制它们自己的基因组但不能够产生更多感染性粒子。参见例如2009.Trobridge.Exp.Opin.Biol.Ther.9:1427-1436,其中描述的其技术和载体可被修改和调整以用于本发明的CRISPR-Cas系统。在其中使用HSV载体或其系统的一些实施方案中,宿主细胞可是互补细胞。在一些实施方案中,HSV载体或其系统能够产生能够递送高达150kb的多核苷酸货物的病毒粒子。因此,在一些实施方案中,包含在基于HSV的病毒载体或其系统中的工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸的总和可为约0.001至约150kb。基于HSV的载体及其系统已成功用于若干种情况,包括各种神经系统疾病模型。参见例如Cockrell等人2007.Mol.Biotechnol.36:184-204;Kafri T.2004.Mol.Biol.246:367-390;Balaggan和Ali.2012.Gene Ther.19:145-153;Wong等人2006.Hum.Gen.Ther.2002.17:1-9;Azzouz等人J.Neruosci.22L10302-10312;以及Betchen和Kaplitt.2003.Curr.Opin.Neurol.16:487-493。这些系统或其变体中任一者都可用于将工程化肌肉特异性多核苷酸递送至细胞和/或将本文所述的用于肌肉特异性递送的肌肉特异性靶向部分掺入细胞中。
痘病毒载体
在一些实施方案中,载体可是痘病毒载体或其系统。在一些实施方案中,痘病毒载体可导致一种或多种可由本发明的此种病毒包装的货物的细胞质表达。在一些实施方案中,痘病毒载体或其系统的容量可是约25kb或更多。在一些实施方案中,痘病毒载体或其系统可包含本文所述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸和/或肌肉特异性靶向部分、工程化衣壳蛋白和/或衣壳。
用于递送至植物的病毒载体
可使用病毒媒介物将系统和组合物递送至植物细胞。植物细胞可经工程改造以表达可含有肌肉特异性靶向部分的组合物(诸如蛋白质),所述组合物可随后经收获并视情况使用,诸如用于人或非人动物的疗法。在特定实施方案中,可使用植物病毒载体将组合物和系统引入植物细胞中(例如像描述于Scholthof等人1996,Annu Rev Phytopathol.1996;34:299-323)。这种病毒载体可是来自以下DNA病毒的载体:例如双生病毒(例如,卷心菜卷叶病毒、豆黄矮病毒、小麦矮缩病毒、番茄曲叶病毒、玉米条纹病毒、烟草曲叶病毒或番茄金色花叶病毒)或纳米病毒(例如,蚕豆坏死黄病毒)。病毒载体可是来自以下RNA病毒的载体:例如烟草病毒(例如,烟草脆裂病毒、烟草花叶病毒)、马铃薯X病毒(例如,马铃薯病毒X)或大麦病毒(例如,大麦条纹花叶病毒)。植物病毒的复制基因组可是非整合载体。
载体构建
本文所述的载体可使用任何合适的方法或技术来构建。在一些实施方案中,一种或多种合适的重组和/或克隆方法或技术可用于本文所述的载体。合适的重组和/或克隆技术和/或方法可包括但不限于在美国申请公开号US 2004-0171156 A1中描述的那些。其他合适的方法和技术在本文别处描述。
重组AAV载体的构建在许多公开中进行了描述,包括美国专利号5,173,414;Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984);和Samulski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)。技术和/或方法中任一者可用于和/或适用于构建AAV或本文所述的其他载体。AAV载体在本文别处讨论。
在一些实施方案中,载体可具有一个或多个插入位点,诸如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中,一个或多个插入位点(例如,约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。
用于表达本文所述的工程化AAV衣壳系统的一种或多种元件的递送媒介物、载体、粒子、纳米粒子、制剂及其组分如在前述文献诸如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中使用并在本文中更详细地讨论。
由病毒载体产生病毒粒子
AAV粒子产生
由诸如本文所述的那些AAV载体及其系统产生AAV粒子有两种主要策略,这取决于如何提供腺病毒辅助因子(辅助或无辅助)。在一些实施方案中,由AAV载体及其系统产生AAV粒子的方法可包括腺病毒感染到稳定地具有AAV复制和衣壳编码多核苷酸,以及含有待由所得的AAV粒子包装和递送的多核苷酸(例如工程化AAV衣壳多核苷酸)的AAV载体的细胞系中。在一些实施方案中,由AAV载体及其系统产生AAV粒子的方法可是“无辅助”方法,其包括将合适的生产细胞系与以下三种载体(例如质粒载体)共转染:(1)在2个ITR之间含有感兴趣的多核苷酸(例如工程化AAV衣壳多核苷酸)的AAV载体;(2)携带AAV Rep-Cap编码多核苷酸的载体;以及(辅助多核苷酸。本领域技术人员将理解各种方法及其变体(辅助和无辅助)以及每种系统的不同优势。
本文所述的工程化AAV载体及其系统可通过这些方法中的任一种产生。
逆转录病毒产生
在一些实施方案中,一种或多种病毒载体和/或其系统可被递送至合适的细胞系,用于产生含有待递送至宿主细胞的多核苷酸或其他有效载荷的病毒粒子。用于由本文所述的病毒载体及其系统产生病毒的合适的宿主细胞是本领域已知的并且可商购获得。例如,合适的宿主细胞包括HEK 293细胞及其变体(HEK 293T和HEK 293TN细胞)。在一些实施方案中,用于由本文所述的病毒载体及其系统产生病毒的合适的宿主细胞可稳定地表达一种或多种参与包装的基因(例如pol、gag和/或VSV-G)和/或其他支持基因。
在一些实施方案中,在将一种或多种病毒载体递送至合适的宿主细胞以由病毒载体及其系统产生病毒之后,细胞经孵育适当的时间长度以允许由载体表达病毒基因,包装待递送的多核苷酸或其他货物(例如CRISPR-Cas系统多核苷酸),以及病毒粒子组装,以及成熟病毒粒子分泌到培养基中。各种其他方法和技术通常是本领域普通技术人员已知的。
可通过合适的方法从培养基中收集成熟的病毒粒子。在一些实施方案中,这可涉及离心以浓缩病毒。可使用合适的方法获得含有收集的病毒粒子的组合物的滴度。此类方法可包括转导合适的细胞系(例如NIH 3T3细胞)并通过合适的方法确定所述细胞系中的转导效率、感染性。合适的方法包括基于PCR的方法、流式细胞术和基于抗生素选择的方法。各种其他方法和技术通常是本领域普通技术人员已知的。病毒粒子浓度可根据需要进行调整。在一些实施方案中,所得的含有病毒粒子的组合物可含有1X101-1X 1020个粒子/mL。
慢病毒可由本文所述的任何慢病毒载体或载体系统制备。在一个示例性实施方案中,在克隆pCasES10(其含有慢病毒转移质粒骨架)之后,低传代(p=5)的HEK293FT可接种在T-75培养瓶中的具有10%胎牛血清且不具有抗生素的DMEM中,在转染前一天达50%汇合度。20小时之后,可将培养基更换为OptiMEM(无血清)培养基,并且慢病毒载体的转染可在4小时后进行。细胞可用10μg慢病毒转移质粒(pCasES10)和适当的包装质粒(例如,5μgpMD2.G(VSV-g假型),以及7.5ug psPAX2(gag/pol/rev/tat))转染。可在具有阳离子脂质递送剂(50uL Lipofectamine 2000和100ul Plus试剂)的4mL OptiMEM中进行转染。6小时之后,可将培养基更换为具有10%胎牛血清的无抗生素DMEM。这些方法可在细胞培养期间使用血清,但优选无血清方法。
在转染并使生产细胞(也称为包装细胞)以包装并产生具有包装货物的病毒粒子后,可纯化慢病毒粒子。在一示例性实施方案中,可在48小时之后收获含有病毒的上清液。收集的含病毒上清液可首先清除碎片并通过0.45um低蛋白结合(PVDF)过滤器过滤。接着可将它们在超速离心机中在24,000rpm下旋转2小时。所得的含病毒沉淀可在4摄氏度下在50ul DMEM中重悬过夜。接着将它们等分并立即使用或立即在-80摄氏度下冷冻存储。
载体和病毒粒子递送
本文所述的载体(包括非病毒载剂)可经引入宿主细胞,从而产生转录物、蛋白质或肽,包括由如本文所述的核酸编码的融合蛋白或肽(例如,工程化AAV衣壳系统转录物、蛋白质、酶、其突变体形式、其融合蛋白等)和病毒粒子(诸如来自病毒载体及其系统)。
一种或多种工程化AAV衣壳多核苷酸可使用以下来递送:如先前所述的腺相关病毒(AAV)、腺病毒或其他质粒或病毒载体类型,特别是来自例如美国专利号8,454,972(腺病毒的制剂、剂量)、8,404,658(AAV的制剂、剂量)和5,846,946(DNA质粒的制剂、剂量)以及来自涉及慢病毒、AAV和腺病毒的临床试验和关于所述临床试验的公开的制剂和剂量。例如,对于AAV,施用途径、制剂和剂量可以如美国专利号8,454,972中和如涉及AAV的临床试验中那样。对于腺病毒,施用途径、制剂和剂量可以如美国专利号8,404,658中和如涉及腺病毒的临床试验中那样。
对于质粒递送,施用途径、制剂和剂量可以如美国专利号5,846,946中和如涉及质粒的临床研究中那样。在一些实施方案中,剂量可基于或外推至平均70kg个体(例如成年男性),并且可针对不同重量和物种的患者、受试者、哺乳动物进行调整。施用频率在医疗或兽医从业者(例如,医生、兽医)的范围内,这取决于通常的因素,包括年龄、性别、一般健康状况、患者或受试者的其他病状以及正在解决的特定病状或症状。可将病毒载体注射到或以其他方式递送至感兴趣的组织或细胞。
就体内递送而言,AAV优于其他病毒载体有几个原因,诸如低毒性(这可能是由于纯化方法不需要对可活化免疫反应的细胞粒子进行超离心)和导致插入突变发生的低可能性(因为它没有整合到宿主基因组中)。
本文所述的载体和病毒粒子可在体外、体内和/或离体递送到宿主细胞中。可通过任何合适的方法进行递送,包括但不限于物理方法、化学方法和生物学方法。物理递送方法是那些采用物理力来抵消细胞的膜屏障以促进载体的细胞内递送的方法。合适的物理方法包括但不限于针头(例如注射)、弹道多核苷酸(例如粒子轰击、微射弹基因转移和基因枪)、电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔和机械按摩。化学方法是那些采用化学物质引起细胞膜通透性或其他特性变化以促进载体进入细胞的方法。例如,可改变环境pH,这可引起细胞膜通透性的变化。生物学方法是那些依赖和利用宿主细胞的生物学过程或生物学特性来促进将载体(有或没有载剂)转运到细胞中的方法。例如,载体和/或其载剂可刺激细胞中的内吞作用或类似过程,以促进摄取载体到细胞中。
通过粒子递送工程化AAV衣壳系统组分(例如编码工程化AAV衣壳和/或衣壳蛋白的多核苷酸)至细胞。如本文所用,术语“粒子”是指用于递送本文所述的工程化AAV衣壳系统组分的任何合适大小的粒子。合适的大小包括宏观、微观和纳米大小的粒子。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳系统组分(例如本文所述的多肽、多核苷酸、载体及其组合)中任一者可与如本文所述的一种或多种粒子或其组分附接、偶联、整合或以其他方式缔合。本文所述的粒子可接着通过适当的途径和/或技术经施用至细胞或生物体。在一些实施方案中,粒子递送可经选择并有利于多核苷酸或载体组分的递送。应理解,在实施方案中,粒子递送还可有利于本文别处描述的其他工程化衣壳系统分子和制剂。
工程化病毒粒子
本文还描述了可含有工程化肌肉特异性衣壳的工程化病毒粒子(本文也称为“工程化病毒粒子”)(例如含有具有本文别处详细描述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分的一种或多种工程化衣壳多肽的衣壳)。本文还描述了病毒粒子,其含有本文别处描述的一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸作为货物。
应理解,工程化病毒粒子可是基于慢病毒、基于逆转录病毒、基于痘病毒、基于疱疹病毒、基于腺病毒的粒子、基于辅助腺病毒的粒子、基于AAV的粒子或基于杂合腺病毒的粒子,其含有至少一种如先前所述的工程化衣壳蛋白。工程化病毒衣壳是含有一种或多种工程化衣壳蛋白的病毒衣壳,所述衣壳蛋白含有一种或多种如本文别处描述的肌肉特异性靶向部分。在一些实施方案中,工程化病毒衣壳是工程化AAV衣壳。
在一些实施方案中,工程化AAV粒子可包含1-60个本文所述的工程化AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中,工程化AAV粒子可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个工程化衣壳蛋白。在一些实施方案中,工程化AAV粒子可含有0-59个野生型AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中,工程化AAV粒子可含有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58或59个野生型AAV衣壳蛋白。工程化AAV粒子可因此包含一个或多个如先前所述的n-mer基序。在一些实施方案中,n-mer是RGD基序。
工程化病毒粒子可各自包含一种或多种货物多核苷酸。货物多核苷酸在本文别处更详细地讨论。由病毒和非病毒载体制备工程化AAV粒子的方法在本文别处描述。本文别处描述了含有工程化病毒粒子的制剂。
工程化非载体递送媒介物
在一些实施方案中,肌肉特异性靶向部分经掺入非载体递送媒介物。在一些实施方案中,肌肉特异性靶向部分与非载体递送媒介物可操作地偶联或以其他方式附接。如本文所用,“附接”可指代两个或更多个分子之间的共价或非共价相互作用。非共价相互作用可包括离子键、静电相互作用、范德华力、偶极-偶极相互作用、偶极诱导偶极相互作用、伦敦色散力、氢键、卤素键、电磁相互作用、π-π相互作用、阳离子-π相互作用、阴离子-π相互作用、极性π相互作用和疏水效应。在一些实施方案中,肌肉特异性靶向部分经掺入组合物(诸如蛋白质或多核苷酸),所述组合物与非载体递送媒介物可操作地偶联或以其他方式附接。在一些实施方案中,工程化肌肉特异性靶向部分经可操作地偶联或以其他方式附接,使得肌肉特异性靶向部分在非载体递送媒介物的表面上。递送媒介物可包含非病毒载体。一般而言,能够递送核酸和/或蛋白质的方法和媒介物可用于递送本文中的系统组合物。非病毒媒介物的实例包括脂质纳米粒子、细胞穿透肽(CPP)、DNA纳米线团(nanoclew)、金属纳米粒子、链球菌溶血素O、多功能包膜型纳米器件(MEND)、脂质包覆的介孔二氧化硅粒子和其他无机纳米粒子。
脂质粒子
递送媒介物可包含脂质粒子,例如脂质纳米粒子(LNP)和脂质体。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787;和4,897,355中并且脂质转染试剂在商业上出售(例如,TransfectamTM和LipofectinTM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner,国际专利公开号WO 91/17424和WO 91/16024的那些。脂质的制备:核酸复合物(包括靶向的脂质体诸如免疫脂质复合物)为本领域技术人员所熟知(参见例如,Crystal,Science270:404-410(1995);Blaese等人,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr等人,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy等人,BioconjugateChem.5:647-654(1994);Gao等人,Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad等人,CancerRes.52:4817-4820(1992);美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。
脂质纳米粒子(LNP)
LNP可将核酸封装在阳离子脂质粒子(例如,脂质体)内并且可相对容易地经递送至细胞。在一些实例中,脂质纳米粒子不含任何病毒组分,这有助于最大限度地减少安全和免疫原性问题。脂质粒子可用于体外、离体和体内递送。脂质粒子可用于各种规模的细胞群体。
在一些实施方案中,LNP可用于递送DNA分子(例如,包含Cas和/或gRNA的编码序列的那些)和/或RNA分子(例如,Cas、gRNA的mRNA)。在某些情况下,LNP可用于递送Cas/gRNA的RNP复合物。
LNP中的组分可包括阳离子脂质1,2-二亚油基-3-二甲基铵-丙烷(DLinDAP)、l,2-二亚油基氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、l,2-二亚油基氧基酮-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinK-DMA)、l,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[01,3]-二氧戊环(DLinKC2-DMA)、(3-o-[2"-(甲氧基聚乙二醇2000)琥珀酰基]-l,2-二肉豆蔻酰基-sn-乙二醇(PEG-S-DMG)、R-3-[(ro-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-l,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)及其任何组合。LNP的制备和封装可根据Rosin等人,Molecular Therapy,第19卷,第12期,第1286页-2200页,2011年12月。
在一些实施方案中,LNP递送媒介物可用于递送含有CRISPR-Cas系统和/或其组分的病毒粒子。在一些实施方案中,病毒粒子可诸如通过静电相互作用经吸附至脂质粒子和/或可通过接头与脂质体附接。
在一些实施方案中,LNP含有核酸,其中核酸骨架磷酸盐与阳离子脂质氮原子的电荷比为约1:1.5-7或约1:4。
在一些实施方案中,LNP还包含屏蔽化合物,其在体内条件下可从脂质组合物中移除。在一些实施方案中,屏蔽化合物是生物惰性化合物。在一些实施方案中,屏蔽化合物在其表面或分子本身上不携带任何电荷。在一些实施方案中,屏蔽化合物是聚乙二醇(PEG)、基于羟乙基葡萄糖(HEG)的聚合物、聚羟乙基淀粉(聚HES)和聚丙烯。在一些实施方案中,PEG、HEG、聚HES和聚丙烯重量在约500至10,000Da之间或在约2000至5000Da之间。在一些实施方案中,屏蔽化合物是PEG2000或PEG5000。
在一些实施方案中,LNP可包含一种或多种辅助脂质。在一些实施方案中,辅助脂质可是磷脂质或类固醇。在一些实施方案中,辅助脂质是在组合物的总脂质含量的约20mol%至80mol%之间。在一些实施方案中,辅助脂质组分是在LNP的总脂质含量的约35mol%至65mol%之间。在一些实施方案中,LNP包含占LNP的总脂质含量的50mol%的脂质和占50mol%的辅助脂质。
其他非限制性示例性LNP递送媒介物描述于美国专利公开号US 20160174546、US20140301951、US 20150105538、US 20150250725、Wang等人,J.Control Release,2017年1月31日pii:S0168-3659(17)30038-X.doi:10.1016/j.jconrel.2017.01.037.[印刷版之前的电子版];等人,Biomater Sci.,4(12):1773-80,2016年11月15日;Wang等人,PNAS,113(11):2868-73 2016年3月15日;Wang等人,PloS One,10(11):e0141860.doi:10.1371/journal.pone.0141860.eCollection 2015,2015年11月3日;Takeda等人,NeuralRegen Res.10(5):689-90,2015年5月;Wang等人,Adv.Healthc Mater.,3(9):1398-403,2014年9月;以及Wang等人,Agnew Chem Int Ed Engl.,53(11):2893-8,2014年3月10日;James E.Dahlman和Carmen Barnes等人Nature Nanotechnology(2014)2014年5月11日在线公开,doi:10.1038/nnano.2014.84;Coelho等人,N Engl J Med 2013;369:819-29;Aleku等人,Cancer Res.,68(23):9788-98(2008年12月1日),Strumberg等人,Int.J.Clin.Pharmacol.Ther.,50(1):76-8(2012年1月),Schultheis等人,J.Clin.Oncol.,32(36):4141-48(2014年12月20日),以及Fehring等人,Mol.Ther.,22(4):811-20(2014年4月22日);Novobrantseva,Molecular Therapy–Nucleic Acids(2012)1,e4;doi:10.1038/mtna.2011.3;WO2012135025;US 20140348900;US 20140328759;US20140308304;WO 2005/105152;WO 2006/069782;WO 2007/121947;US 2015/082080;US20120251618;7,982,027;7,799,565;8,058,069;8,283,333;7,901,708;7,745,651;7,803,397;8,101,741;8,188,263;7,915,399;8,236,943和7,838,658以及欧洲专利号1766035;1519714;1781593以及1664316。
脂质体
在一些实施方案中,脂质粒子可是脂质体。脂质体是球形囊泡结构,由围绕内部水性隔室的单层或多层脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。在一些实施方案中,脂质体是生物相容的、无毒的,可递送亲水性和亲脂性药物分子,保护它们的货物免于被血浆酶降解,并且转运它们的负载穿过生物膜和血脑屏障(BBB)。
脂质体可由若干种不同类型的脂质(例如磷脂)制成。脂质体可包含天然磷脂和脂质,诸如l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DSPC)、鞘磷脂、卵磷脂酰胆碱、单唾液酸神经节苷脂或其任何组合。
可将若干种其他添加剂添加到脂质体中以便改变它们的结构和性质。例如,脂质体可进一步包含胆固醇、鞘磷脂和/或l,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE),例如以增加稳定性和/或以防止脂质体内部货物的泄漏。
在一些实施方案中,脂质体递送媒介物可用于递送含有CRISPR-Cas系统和/或其组分的病毒粒子。在一些实施方案中,病毒粒子可诸如通过静电相互作用经吸附至脂质体和/或可通过接头与脂质体附接。
在一些实施方案中,脂质体可是特洛伊木马脂质体(Trojan Horse liposome)(在本领域中也称为分子特洛伊木马),参见例如http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long,其教义可应用和/或调整以生成和/或递送本文所述的CRISPR-Cas系统。
其他非限制性示例性脂质体可是如在以下中阐述的那些:Wang等人,ACSSynthetic Biology,1,403-07(2012);Wang等人,PNAS,113(11)2868-2873(2016);Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery,卷2011,Article ID 469679,12页,2011.doi:10.1155/2011/469679;WO 2008/042973;美国专利号8,071,082;WO 2014/186366;20160257951;US20160129120;US 20160244761;20120251618;WO2013/093648;脂质体(DOTMA和DOPE的组合)、脂质酶(Lipofectase)、LIPOFECTAMINE.RTM.(例如,LIPOFECTAMINE.RTM.2000、LIPOFECTAMINE.RTM.3000、LIPOFECTAMINE.RTM.RNAiMAX、LIPOFECTAMINE.RTM.LTX)、SAINT-RED(Synvolux Therapeutics,GroningenNetherlands)、DOPE、细胞转染素(Gilead Sciences,Foster City,Calif.)和Eufectins(JBL,San Luis Obispo,Calif.)。
稳定的核酸-脂质粒子(SNALP)
在一些实施方案中,脂质粒子可是稳定的核酸脂质粒子(SNALP)。SNALP可包含可离子化的脂质(DLinDMA)(例如,在低pH下的阳离子)、中性辅助脂质、胆固醇、可扩散的聚乙二醇(PEG)-脂质或其任何组合。在一些实例中,SNALP可包含合成胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱、3-N-[(w-甲氧基聚乙二醇)2000)氨基甲酰基]-l,2-肉豆蔻酰氧基丙胺和阳离子l,2-二亚油基氧基-3-N,N二甲基氨基丙烷。在一些实例中,SNALP可包含合成胆固醇、l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、PEG-cDMA和l,2-二亚油基氧基-3-(N;N-二甲基)氨基丙烷(DLinDMAo)。
可用于递送本文所述的CRISPR-Cas系统的其他非限制性示例性SNALP可是如以下中描述的任何此类SNALP:Morrissey等人,Nature Biotechnology,第23卷,第8期,2005年8月,Zimmerman等人,Nature Letters,第441卷,2006年5月4日;Geisbert等人,Lancet2010;375:1896-905;Judge,J.Clin.Invest.119:661-673(2009);和Semple等人,NatureNiotechnology,第28卷第2期2010年2月,第172页-177页。
其他脂质
脂质粒子还可包含一种或多种其他类型的脂质,例如阳离子脂质,诸如氨基脂质2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、DLin-KC2-DMA4、C12-200和colipids二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-DMG。
在一些实施方案中,递送媒介物可是或包含类脂质(lipidoid),诸如在例如US20110293703中阐述的那些中任一者。
在一些实施方案中,递送媒介物可是或包含氨基脂质,诸如在例如Jayaraman,Angew.Chem.Int.2012版,51,8529–8533中阐述的那些中任一者。
在一些实施方案中,递送媒介物可是或包含脂质包膜,诸如在例如Korman等人,2011.Nat.Biotech.29:154-157中阐述的那些中任一者。
脂质复合物(Lipoplex)/多聚复合物(polyplex)
在一些实施方案中,递送媒介物包含脂质复合物和/或多聚复合物。脂质复合物可与带负电荷的细胞膜结合并诱导细胞中的内吞作用。脂质复合物的实例可是包含脂质和非脂质组分的复合物。脂质复合物和多聚复合物的实例包括FuGENE-6试剂、含有脂质和其他组分的非脂质体溶液、两性离子氨基脂质(ZAL)、(例如,形成DNA/Ca2+微复合物)、聚乙烯亚胺(PEI)(例如,支链PEI)和聚(L-赖氨酸)(PLL)。
糖基粒子
在一些实施方案中,递送媒介物可是糖基粒子。在一些实施方案中,糖基粒子可是或包含GalNAc,诸如在以下中描述的那些中任一者:WO2014118272;US 20020150626;Nair,JK等人,2014,Journal of the American Chemical Society 136(49),16958-16961;等人,Bioconjugate Chem.,2015,26(8),第1451页–1455页;
细胞穿透肽
在一些实施方案中,递送媒介物包含细胞穿透肽(CPP)。CPP是促进细胞摄取各种分子货物(例如,从纳米大小的粒子到小的化学分子和大的DNA片段)的短肽。
CPP可具有不同的大小、氨基酸序列和电荷。在一些实例中,CPP可转移质膜并促进递送各种分子货物至细胞质或细胞器。CPP可通过不同的机制例如直接穿透膜、内吞作用介导的进入和通过形成暂时结构的易位经引入细胞。
CPP可具有以下氨基酸组成,其含有高相对丰度的带正电荷的氨基酸诸如赖氨酸或精氨酸,或者具有含有交替模式的极性/带电荷氨基酸和非极性疏水氨基酸的序列。这两种类型的结构分别称为聚阳离子结构或两性分子结构。第三类CPP是疏水肽,仅含有非极性残基,具有低净电荷,或具有对细胞摄取至关重要的疏水氨基酸基团。另一种类型的CPP是来自人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)的反式活化转录活化物(Tat)。CPP的实例包括穿膜肽(Penetratin)、Tat(48-60)、Transportan和(R-AhX-R4)(Ahx指代氨基己酰基)、卡波西成纤维细胞生长因子(FGF)信号肽序列、整合素β3信号肽序列、聚精氨酸肽参数(Args)序列、富含鸟嘌呤的分子转运蛋白和甜箭肽。CPP和相关应用的实例还包括在美国专利8,372,951中描述的那些。
CPP可以很容易地用于在体外和离体发挥作用,并且通常需要对每种货物和细胞类型进行广泛优化。在一些实例中,CPP可直接与Cas蛋白共价附接,所述CPP接着与gRNA复合并经递送至细胞。在一些实例中,可将CPP-Cas和CPP-gRNA单独递送至多个细胞。CPP也可用于递送RNP。
CPP可用于将组合物和系统递送至植物。在一些实例中,CPP可用于将组分递送至植物原生质体,所述组分接着再生至植物细胞并进一步再生至植物。
DNA纳米线团
在一些实施方案中,递送媒介物包含DNA纳米线团。DNA纳米线团是指DNA的球形结构(例如,具有纱线球的形状)。纳米线团可通过用有助于结构的自组装的回文序列进行滚环放大合成。球体可接着经加载有效载荷。DNA纳米线团的实例在以下中描述:Sun W等人,JAm Chem Soc.2014年10月22日;136(42):14722-5;和Sun W等人,Angew Chem Int EdEngl.2015年10月5日;54(41):12029-33。DNA纳米线团可具有与在Cas:gRNA核糖核蛋白复合物内的gRNA部分互补的回文序列。DNA纳米线团可经包覆,例如用PEI包覆以诱导内体逃逸。
金属纳米粒子
在一些实施方案中,递送媒介物包含金纳米粒子(也称为AuNP或胶体金)。金纳米粒子可与货物例如Cas:gRNA RNP形成复合物。金纳米粒子可经包覆,例如包覆在硅酸盐和内体破坏性聚合物PAsp(DET)中。金纳米粒子的实例包括AuraSense Therapeutics'Spherical Nucleic Acid(SNATM)构建体,以及在Mout R,等人(2017).ACS Nano 11:2452–8;Lee K,等人(2017).Nat Biomed Eng 1:889–901中描述的那些。其他金属纳米粒子也可与货物复合。此类金属粒子包括钨、钯、铑、铂和铱粒子。其他非限制性示例性金属纳米粒子描述于US 20100129793中。
iTOP
在一些实施方案中,递送媒介物包含iTOP。iTOP是指独立于任何转导肽驱动天然蛋白的高效细胞内递送的小分子的组合。iTOP可用于通过渗透作用和丙烷甜菜碱诱导转导,使用NaCl介导的高渗性与转导化合物(丙烷甜菜碱)一起触发胞外大分子细胞的巨胞饮摄取。iTOP方法和试剂的实例包括在D'Astolfo DS,Pagliero RJ,Pras A,等人(2015).Cell 161:674–690中描述的那些。
聚合物基粒子
在一些实施方案中,递送媒介物可包含聚合物基粒子(例如,纳米粒子)。在一些实施方案中,聚合物基粒子可模拟病毒膜融合机制。聚合物基粒子可是流感病毒机器的合成拷贝,并且可与细胞通过内吞途径摄取的各种类型的核酸(siRNA、miRNA、质粒DNA或shRNA、mRNA)形成转染复合物,这一过程涉及形成酸性隔室。晚期内体中的低pH充当化学开关,其致使粒子表面疏水并促进膜穿过。一旦进入胞质溶胶,粒子就会释放其有效载荷以进行细胞作用。因为这种活性内体逃逸技术使用的是自然摄取途径,所以它是安全的并且可最大限度地提高转染效率。在一些实施方案中,聚合物基粒子可包含烷基化和羧烷基化支链聚乙烯亚胺。在一些实例中,聚合物基粒子是VIROMER,例如VIROMER RNAi、VIROMER RED、VIROMERmRNA、VIROMER CRISPR。递送本文中的系统和组合物的示例性方法包括在以下中描述的那些:Bawage SS等人,Synthetic mRNA expressed Cas13a mitigates RNA virusinfections,www.biorxiv.org/content/10.1101/370460v1.full doi:doi.org/10.1101/370460,RED,a powerful tool for transfectionof keratinocytes.doi:10.13140/RG.2.2.16993.61281,Transfection-Factbook 2018:technology,product overview,users'data.,doi:10.13140/RG.2.2.23912.16642。其他示例性和非限制性聚合物粒子在以下中描述:US 20170079916、US 20160367686、US 20110212179、US20130302401、6,007,845、5,855,913、5,985,309、5,543,158、WO2012135025、US20130252281、US 20130245107、US 20130244279;US 20050019923、20080267903。
链球菌溶血素O(SLO)
递送媒介物可是链球菌溶血素O(SLO)。SLO是由A组链球菌产生的毒素,其通过在哺乳动物细胞膜中产生孔而发挥作用。SLO可以可逆方式发挥作用,这允许将蛋白质(例如,高达100kDa)递送至细胞的胞质溶胶,而不会损害整体活力。SLO的实例包括在以下中描述的那些:Sierig G,等人(2003).Infect Immun 71:446–55;Walev I,等人(2001).ProcNatl Acad Sci U S A 98:3185–90;Teng KW,等人(2017).Elife 6:e25460。
多功能包膜型纳米器件(MEND)
递送媒介物可包含多功能包膜型纳米器件(MEND)。MEND可包含浓缩质粒DNA、PLL核心和脂质膜壳。MEND可进一步包含细胞穿透肽(例如,硬脂基八精氨酸)。细胞穿透肽可在脂质壳中。脂质包膜可用一种或多种功能组分修饰,例如以下中的一种或多种:聚乙二醇(例如,以增加血管循环时间)、用于靶向特定组织/细胞的配体、额外的细胞穿透肽(例如,用于更大的细胞递送)、增强内体逃逸的脂质以及核递送标签。在一些实例中,MEND可是四层MEND(T-MEND),其可靶向细胞核和线粒体。在某些实例中,MEND可是PEG-肽-DOPE-缀合的MEND(PPD-MEND),其可靶向膀胱癌细胞。MEND的实例包括在Kogure K,等人(2004).JControl Release 98:317–23;Nakamura T,等人(2012).Acc Chem Res 45:1113–21中描述的那些。
货物多核苷酸
工程化肌肉特异性递送系统多核苷酸、病毒衣壳多核苷酸、其他AAV多核苷酸、和/或载体多核苷酸、病毒粒子、和/或非载体递送媒介物可含有一种或多种货物多核苷酸。在一些实施方案中,一种或多种货物多核苷酸与工程化肌肉特异性递送系统多核苷酸可操作地连接,并且在一些实施方案中,是本发明的工程化病毒系统的工程化病毒基因组的一部分。可将货物多核苷酸包装到工程化病毒粒子中,所述病毒粒子可经递送至例如细胞。在一些实施方案中,货物多核苷酸能够修饰其经递送至的细胞的多核苷酸(例如基因或转录物)。在一些实施方案中,货物是编码替代多肽以校正缺陷型多肽的多核苷酸。如本文所用,“基因”可指代对应于DNA序列的遗传单位,所述DNA序列占据染色体上的特定位置并且含有生物体中特性或性状的遗传指令。术语基因可指代基因组的翻译区和/或非翻译区。“基因”可指代被转录成RNA转录物的DNA的特定序列,所述RNA转录物可被翻译成多肽或者是催化性RNA分子,所述RNA转录物包括但不限于tRNA、siRNA、piRNA、miRNA、长链非编码RNA和shRNA。多核苷酸、基因、转录物等修饰包括所有遗传工程技术,包括但不限于基因编辑以及常规重组基因修饰技术(例如全部或部分基因插入、缺失和诱变(例如插入和缺失的诱变)技术)。
在一些实施方案中,货物分子是作为疫苗或可编码疫苗的多核苷酸。在一些实施方案中,疫苗可刺激针对癌症的免疫反应。在一些实施方案中,疫苗可刺激针对结直肠癌或胰腺癌的免疫反应。在一些实施方案中,疫苗可为产生hCG的细胞诸如产生hCG的癌细胞创造不稳定的环境。
在一些实施方案中,货物是多核苷酸,其本身或其产物可有效治疗肌肉疾病或其症状。
基因修饰货物多核苷酸
在一些实施方案中,货物分子可是多核苷酸或多肽,其可单独或当作为系统的一部分经递送时(无论是否与系统的其他组分一起经递送)用于修饰基因组、表观基因组和/或所述多核苷酸或多肽经递送至的细胞的转录组。此类系统包括但不限于CRISPR-Cas系统。其他基因修饰系统,例如TALEN、锌指核酸酶、Cre-Lox、吗啉代等是基因修饰系统的其他非限制性实例,所述系统的一种或多种组分可通过本文所述的工程化AAV粒子经递送。
在一些实施方案中,货物分子是基因编辑系统或其组分。在一些实施方案中,货物分子是CRISPR-Cas系统分子或其组分。在一些实施方案中,货物分子是编码基因修饰系统(诸如CRISPR-Cas系统)的一种或多种组分的多核苷酸。在一些实施方案中,货物分子是gRNA。
在一些实施方案中,货物分子可是多核苷酸或多肽,其可单独或当作为系统的一部分经递送时(无论是否与系统的其他组分一起经递送)用于修饰基因组、表观基因组和/或所述多核苷酸或多肽经递送至的细胞的转录组,是这样的:所述多核苷酸或多肽治疗或预防肌肉或骨骼病症、神经系统疾病或病症和/或病毒(诸如单链RNA病毒)的疾病、病症或其症状。在一些实施方案中,货物分子(无论是否与系统的其他组分一起经递送)用于修饰基因组、表观基因组和/或所述货物分子经递送至的细胞的转录组是这样的:所述货物分子治疗或预防早衰病(例如早衰样核纤层蛋白病)、糖原贮积病、免疫紊乱(诸如自身免疫疾病)、癌症、杜兴氏肌营养不良(DMD)、6肢带型肌营养不良病(LGMD)、恰克-马利-杜斯氏病(CMT)、MPS IIIA、庞贝病或其他CNS相关疾病诸如亨廷顿病和其他扩增重复疾病。
在一些实施方案中,货物分子(无论是否与系统的其他组分一起经递送)用于修饰基因组、表观基因组和/或所述货物分子经递送至的细胞的转录组是这样的:可修饰GAA基因诸如美国专利申请公开20190284555中描述的那些中任一者,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。
在一些实施方案中,货物分子包含与MHCK7、CK8或其他肌肉特异性启动子偶联的寡核苷酸。
在一些实施方案中,货物分子是微肌营养不良蛋白寡核苷酸,其仅含有针对蛋白质功能优化的肌营养不良蛋白基因的选定区域。在一些实施方案中,选定区域包括血影蛋白样重复1、2、3和24。参见例如Harper SQ,Hauser MA,DelloRusso C,等人Modularflexibility of dystrophin:implications for gene therapy of Duchenne musculardystrophy.Nat Med.2002;8(3):253-261。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白寡核苷酸由称为AAVrh74.MHCK7微肌营养不良蛋白基因的rAAV剂或SRP-9001递送,所述rAAV剂或SRP-9001经受临床试验NCT03375164和NCT03769116。这种微肌营养不良蛋白基因构建体包含NT-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因包含ABD-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因包含代表铰链区的H。England SB,等人Nature.1990;343(6254):180-182;Wells DJ,等人Hum MolGenet.1995;4(8):1245-1250,Salva MZ,等人Mol Ther.2007;15(2):320-329;MendellJR,等人Neurosci Lett.2012;527(2):90-99;Rodino-Klapac LR,等人Hum MolGenet.2013;22(24):4929-4937;Velazquez VM,等人Mol Ther Methods Clin Dev.2017;4:159-168;Harper SQ,等人Nat Med.2002;8(3):253-261;Nelson DM,等人Hum MolGenet.2018;27(12):2090-2100。在一些实施方案中,选定区域至少包含血影蛋白样重复2和3。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因含有nNOS结构域。在一些实施方案中,nNOS结构域由血影蛋白样重复16和/或17构成。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复16和17。在一些实施方案中,nNOS结构域由血影蛋白样重复R1、R16、R17、R23和R24构成。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因与肌肉特异性启动子偶联。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白寡核苷酸与MHCK7、CK8、SNP18、SP0033、SP0051、SP0173、tmCK或另一肌肉特异性启动子偶联。
在一些实施方案中,货物微肌营养不良蛋白包含ABD(肌动蛋白结合结构域)、一个或多个铰链区(例如H1、H2、H3、H4)和一个或多个血影蛋白样重复(例如R1、R1'、R2、R3、R16、R17、R20、R21、R22、R23、R24、R24')以及任选肌营养不良蛋白聚糖结合结构域(DBD)。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白由ABD-H1-R1-R16-R17-R23-R24-H4-DBD构成。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白由ABD-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR构成。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因包含ABD-H1-R1-R2-R3-H2-R24-H4-CR-CT。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因包含ABD-H1-R1’-R24’-H4-CR-CT。
在一些实施方案中,货物分子是可编码微肌营养不良蛋白基因的多核苷酸,其中微肌营养不良蛋白基因含有血影蛋白样重复R1、R16、R17、R23和R24。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因含有铰链区(H)4和/或H1。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因含有N端肌动蛋白结合结构域。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因含有人全长肌营养不良蛋白的C端肌营养不良蛋白聚糖结合结构域。微肌营养不良蛋白基因可含有nNOS结构域。在一些实施方案中,nNOS结构域由血影蛋白样重复16和/或17构成。在一些实施方案中,微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复16和17。微肌营养不良蛋白基因可如WO2019118806A1和WO2016/115543中所述,这些文献通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。在一些实施方案中,货物多核苷酸可编码5-重复微肌营养不良蛋白,其从N端至C端含有N端肌动蛋白结合结构域、铰链区1(Hl)、血影蛋白样重复Rl、R16、R17、R23和R24、铰链区4(H4)和人全长肌营养不良蛋白的C端肌营养不良蛋白聚糖结合结构域。这种5-重复微肌营养不良蛋白的蛋白质序列和相关肌营养不良蛋白小基因在WO2016/115543中描述。在一些实施方案中,货物多核苷酸可对应于微肌营养不良蛋白基因,所述基因是目前在临床试验中称为SGT001的剂的一部分,其鉴别编码为NCT03368742。
在一些实施方案中,货物分子是微小肌营养不良蛋白(minidys)基因或载体。在一些实施方案中,微小肌营养不良蛋白基因或载体可由ABD-H1-R1-R2-R3-R16-R17-H3-R20-R21;ABD-H1-R1-R2-R3-R16-R17-H3-R20-R21-R22-R23-R24-H4-CR;或H3-R20-R21-R22-R23-R24-H4-CR-CT构成。
在一些实施方案中,货物分子是SCGB cDNA。在一些实施方案中,SGCB cDNA与MHCK7、CK8启动子、SNP18启动子、SP0033启动子、SP0051、SP0173启动子、tmCK启动子或另一肌肉特异性启动子偶联。在一些实施方案中,货物分子是β-肌聚糖cDNA、α-肌聚糖cDNA、肌失养蛋白(dysferlin)cDNA、γ-肌聚糖cDNA、钙蛋白酶-3(Calpin-3)cDNA、SGSH cDNA(例如,LYS-SAF302)、神经妥乐平3(neurtropin 3)cDNA、钙激活氯通道蛋白-5(anoctamin-5)cDNA或其任何组合。
在一些实施方案中,货物分子(无论是否与系统的其他组分一起经递送)用于修饰基因组、表观基因组和/或所述货物分子经递送至的细胞的转录组是这样的:治疗、预防和/或修饰与诸如以下的扩增重复疾病相关联的基因或基因产物:亨廷顿病、在美国专利申请公开20190100755、美国专利10066228中描述的那些,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。
在一些实施方案中,货物分子是反义寡聚物或RNA分子,诸如在以下中描述的那些:美国专利申请公开US20160251398、US20150267202、US20190015440、US20140287983、US20180216111、WO/2017/062835、US20190177723、US20170051278、US20180271893、WO/2016/14965、美国专利10076536、WO/2018/00580、WO/2018/11866、WO/2019/059973,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。
在一些实施方案中,货物分子(无论是否与系统的其他组分一起经递送)用于修饰基因组、表观基因组和/或所述货物分子经递送至的细胞的转录组是这样的:所述货物分子治疗或预防单链RNA病毒,诸如流感、西尼罗河病毒(West Nile Virus)、SARS、丙型肝炎、登革热、埃博拉病毒、马尔堡病毒和/或杯状病毒。在一些实施方案中,货物分子可是反义抗病毒化合物诸如在US8703735B2中描述的那些中任一者,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。
另外,示例性遗传和基因相关疾病和能够由本文所述的货物分子修饰的基因列于本文别处,参见例如表A-B。
在一些实施方案中,货物分子可添加或修饰GALGT2基因。GALGT2基因疗法并没有采取行动来补充缺失的肌营养不良蛋白,而是通过增加在疾病中未突变或丢失的蛋白质的表达,以补偿肌营养不良蛋白缺乏的方式增强肌肉的结构完整性。GALGT2提供了与特定的肌营养不良蛋白突变无关并且在其他肌营养不良症中也具有实用性的治疗DMD的潜力。
在一些实施方案中,货物分子是吗啉代,诸如在US20180161359、US20190054113中,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。在一些实施方案中,吗啉代是吗啉代寡聚物(PMO)或肽连接的吗啉代PPMO。基于PMO的平台可用于通过改变mRNA转录来治疗遗传疾病。PMO是仿照RNA的天然框架的合成化学结构。尽管PMO具有与RNA中发现的相同的核酸碱基,但它们与六边吗啉环而不是五边核糖环结合。此外,吗啉环通过磷酸二酰胺化物键联而不是RNA中发现的磷酸二酯键联相互连接。PMO和PPMO可用于外显子跳跃和翻译抑制。
在一些实施方案中,货物分子可是肽-寡聚物,如在例如WO2017106304A1中描述的缀合物,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。
在一些实施方案中,吗啉代是在依特立生(Eteplirsen)中发现的吗啉代,其可有效靶向肌营养不良蛋白mRNA的外显子51。在一些实施方案中,货物分子可在DMD的背景下生成外显子跳跃,诸如在例如US20140315977A1、US2018010581中描述的那些,所述文献的内容通过引用就好像以其整体在本文中表述一样并入并且可适用于本发明。
外显子跳跃
在一些实施方案中,核苷酸序列可编码能够诱导外显子跳跃的核酸。此类编码的核酸可是反义寡核苷酸或反义核苷酸系统。如本文所用,术语“外显子跳跃”是指通过靶向具有一个或多个互补反义寡核苷酸(AON)的前mRNA内的剪接供体和/或受体位点来修饰前mRNA剪接。通过阻止剪接体接近一个或多个剪接供体或受体位点,AON可防止剪接反应,从而导致一个或多个外显子从完全加工的mRNA中缺失。在前mRNA的成熟过程中,可在细胞核中实现外显子跳跃。在一些实例中,外显子跳跃可包括通过使用与前mRNA内的剪接供体序列互补的反义寡核苷酸(AON)来掩蔽参与靶向的外显子剪接的关键序列。
在一些实施方案中,核苷酸序列编码能够在肌营养不良蛋白mRNA中诱导外显子跳跃的反义寡核苷酸或反义核苷酸系统。例如,肌营养不良蛋白基因的外显子x内的无义或移码突变会产生羧基端截短的非功能性肌营养不良蛋白。所述成熟mRNA转录物的表达可产生功能性肌营养不良蛋白,所述蛋白在外显子x编码的氨基酸中缺失,但包含那些缺失氨基酸的N端和C端的肌营养不良蛋白氨基酸。
核苷酸序列可编码能够在以下位置处诱导外显子跳跃的反义寡核苷酸或反义核苷酸系统:外显子1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、45、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或其任何组合。在一些实施方案中,核苷酸序列可编码能够在外显子43、44、50、51、52、55或其任何组合处诱导外显子跳跃的反义寡核苷酸或反义核苷酸系统。
CRISPR-Cas系统货物分子
一般而言,本文和文献诸如WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中使用的CRISPR-Cas或CRISPR系统,统指参与表达CRISPR相关(“Cas”)基因或指导其活性的转录物和其他元件,包括编码Cas基因的序列、tracr(反式活化CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-伴侣序列(在内源CRISPR系统的情况下涵盖“直接重复”和tracrRNA处理的部分直接重复)、引导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也称为“间隔序列”)或如本文所用的术语“RNA”(例如,引导Cas诸如Cas9的RNA,例如CRISPR RNA和反式激活(tracr)RNA或单引导RNA(sgRNA)(嵌合RNA))或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。一般而言,CRISPR系统的特征在于促进在靶序列位点形成CRISPR复合物的元件(在内源CRISPR系统的上下文中也称为前间隔序列)。参见例如Shmakov等人(2015)“Discovery and FunctionalCharacterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems”,Molecular Cell,DOI:dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008。
1类系统
本文提供的方法、系统和工具可设计用于与1类CRISPR蛋白一起使用。在某些示例性实施方案中,1类系统可是如以下中所述的I型、III型或IV型Cas蛋白:Makarova等人“Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems:a burst of class 2andderived variants”Nature Reviews Microbiology,18:67-81(2020年2月).(通过引用以其整体并入本文)并且具体地如图1,第326页中所述。1类系统通常使用多蛋白效应复合物,在一些实施方案中,其可包括从属蛋白(ancillary protein)诸如复合物中的一种或多种蛋白(称为用于抗病毒防御的CRISPR相关复合物(Cascade))、一种或多种适应蛋白(例如Cas1、Cas2、RNA核酸酶)和/或一种或多种辅助蛋白(例如Cas 4、DNA核酸酶)、含有蛋白质的CRISPR相关罗斯曼折叠(CARF)结构域和/或RNA转录酶。尽管1类系统具有有限的序列相似性,但1类系统蛋白可通过其类似的结构来识别,所述结构包括一种或多种重复相关神秘蛋白(RAMP)家族亚基,例如Cas 5、Cas6、Cas7。RAMP蛋白的特征在于具有一个或多个RNA识别基序结构域。大亚基(例如cas8或cas10)和小亚基(例如cas11)也是1类系统的典型特征。参见例如,图1和图2。Koonin EV,Makarova KS.2019Origins and evolution of CRISPR-Cassystems.Phil.Trans.R.Soc.B 374:20180087,DOI:10.1098/rstb.2018.0087。在一个方面中,1类系统的特征在于特征蛋白(signature protein)Cas3。在特定1类蛋白中的Cascade可包含多个Cas蛋白的专用复合物,所述Cas蛋白结合前crRNA并募集额外的Cas蛋白例如Cas6或Cas5,这是直接负责加工前crRNA的核酸酶。在一个方面中,I型CRISPR蛋白包含包含一个或多个Cas5亚基和两个或更多个Cas7亚基的效应复合物。1类亚型包括I-A型、I-B型、I-C型、I-U型、I-D型、I-E型和I-F型、IV-A型和IV-B型、以及III-A型、III-D型、III-C型和III-B型。1类系统还包含CRISPR-Cas变体,包括I-A型、I-B型、I-E型、I-F型和I-U型变体,所述系统可包含由转座子和质粒携带的变体,包括由一大类Tn7样转座子和较小组的Tn7样转座子编码的I-F亚型版本,所述转座子编码类似退化的I-B亚型系统。Peters等人,PNAS 114(35)(2017);DOI:10.1073/pnas.1709035114;还参见,Makarova等人,the CRISPRJournal,第1卷,第5期,图5。
2类系统
本文别处更详细描述的组合物、系统和方法可经设计并调整以用于与2类CRISPR-Cas系统一起使用。因此,在一些实施方案中,CRISPR-Cas系统是2类CRISPR-Cas系统。2类系统与1类系统的区别在于它们具有单个、大的、多结构域效应蛋白。在某些示例性实施方案中,2类系统可是II型、V型或VI型系统,所述系统在以下中描述:Makarova等人“Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems:a burst of class 2andderived variants”Nature Reviews Microbiology,18:67-81(2020年2月)(通过引用并入本文)。每种类型的2类系统进一步分为亚型。参见Markova等人2020,特别地在图2。2类II型系统可分为4个亚型:II-A、II-B、II-C1和II-C2。2类V型系统可分为17个亚型:V-A、V-B1、V-B2、V-C、V-D、V-E、V-F1、V-F1(V-U3)、V-F2、V-F3、V-G、V-H、V-I、V-K(V-U5)、V-U1、V-U2和V-U4。2类IV型系统可分为5个亚型:VI-A、VI-B1、VI-B2、VI-C和VI-D。
这些类型的区别性特征是它们的效应复合物由单个、大的、多结构域蛋白组成。V型系统不同于II型效应子(例如Cas9),所述效应子含有两个核结构域,所述结构域各自负责切割靶DNA的一条链,其中HNH核酸酶经插入到RuvC样核酸酶结构域序列内。V型系统(例如,Cas12)仅含有切割两条链的RuvC样核酸酶结构域。VI型(Cas13)与II型和V型系统的效应子无关,并且含有两个HEPN结构域和靶RNA。Cas13蛋白还表现出由目标识别触发的附带活性。还发现一些具有两条单链DNA的V型系统在体外环境中拥有这种附带活性。
在一些实施方案中,2类系统是II型系统。在一些实施方案中,II型CRISPR-Cas系统是II-A CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,II型CRISPR-Cas系统是II-B CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,II型CRISPR-Cas系统是II-C1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,II型CRISPR-Cas系统是II-C2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,II型系统是Cas9系统。在一些实施方案中,II型系统包含Cas9。
在一些实施方案中,2类系统是V型系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-A CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-B1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-B2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-C CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-DCRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-E CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-F1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-F1(V-U3)CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-F2CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-F3CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-GCRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-HCRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-ICRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-K(V-U5)CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-U1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-U2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统是V-U4 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,V型CRISPR-Cas系统包括Cas12a(Cpf1)、Cas12b(C2c1)、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas14和/或CasΦ。
在一些实施方案中,2类系统是VI型系统。在一些实施方案中,VI型CRISPR-Cas系统是VI-A CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,VI型CRISPR-Cas系统是VI-B1 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,VI型CRISPR-Cas系统是VI-B2 CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,VI型CRISPR-Cas系统是VI-C CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,VI型CRISPR-Cas系统是VI-D CRISPR-Cas系统。在一些实施方案中,VI型CRISPR-Cas系统包括Cas13a(C2c2)、Cas13b(29/30组)、Cas13c和/或Cas13d。
Cas分子
在一些实施方案中,货物分子可是或包含Cas多肽和/或可编码Cas多肽或其片段的多核苷酸。任何Cas分子都可是货物分子。在一些实施方案中,货物分子是I类CRISPR-Cas系统Cas多肽。在一些实施方案中,货物分子是II类CRISPR-Cas系统Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是I型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是II型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是III型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是IV型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是V型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是VI型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是VII型Cas多肽。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cas 12、Cas 12a、Cas 13a、Cas13b、Cas 13c、Cas 13d、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、其同系物或其修饰的版本。可作为货物包含在内的其他合适的Cas蛋白或编码多核苷酸在本文别处描述,诸如与CRISPR-Cas系统相关的讨论。
基于Cas的专用系统
在一些实施方案中,系统是能够执行专用功能或具有专用活性的基于Cas的系统。例如,Cas蛋白可与一个或多个功能结构域融合、可操作地偶联或以其他方式缔合。在某些示例性实施方案中,Cas蛋白可是催化死亡Cas蛋白(“dCas”)和/或具有切口酶活性。切口酶是仅切割双链靶标的一条链的Cas蛋白。在此类实施方案中,dCas或切口酶提供序列特异性靶向功能,其将功能结构域递送至或接近靶序列。可与Cas蛋白融合、可操作地偶联或以其他方式缔合的示例性功能结构域可是或包括但不限于核定位信号(NLS)结构域、核输出信号(NES)结构域、翻译活化结构域,转录活化结构域(例如VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA和SET7/9)、翻译起始结构域、转录抑制结构域(例如,KRAB结构域、NuE结构域、NcoR结构域和SID结构域诸如SID4X结构域)、核酸酶结构域(例如,FokI)、组蛋白修饰结构域(例如,组蛋白乙酰转移酶)、光诱导型/光控型结构域、化学诱导型/化控型结构域、转座酶结构域、同源重组机制结构域、重组酶结构域、整合酶结构域及其组合。用于生成以下的方法是本领域已知的并且通过引用并入本文:催化死亡Cas9或切口酶Cas9(国际专利公开号WO2014/204725,Ran等人Cell.2013年9月12日;154(6):1380-1389)、Cas12(Liu等人NatureCommunications,8,2095(2017))和Cas13(国际专利公开号WO 2019/005884和WO2019/060746)。
在一些实施方案中,功能结构域可具有以下活性中的一种或多种:甲基化酶活性、去甲基化酶活性、翻译活化活性、翻译起始活性、翻译抑制活性、转录活化活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、核酸酶活性、单链RNA切割活性、双链RNA切割活性、单链DNA切割活性、双链DNA切割活性、分子开关活性、化学诱导性、光诱导性和核酸结合活性。在一些实施方案中,一种或多种功能结构域可包含表位标签或报道基因。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报道基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和包括蓝色荧光蛋白(BFP)的自发荧光蛋白。
一个或多个功能结构域可位于、靠近和/或接近效应蛋白(例如,Cas蛋白)的末端。在具有两个或更多个功能结构域的实施方案中,两个功能结构域中的每一者可位于或靠近或接近效应蛋白(例如,Cas蛋白)的末端。在一些实施方案(诸如那些其中功能结构域与效应蛋白可操作地偶联)中,一个或多个功能结构域可通过合适的接头(包括但不限于GlySer接头)拴系或连接至效应蛋白(例如,Cas蛋白)。当存在多于一个功能结构域时,功能结构域可是相同或不同的。在一些实施方案中,所有功能结构域都是相同的。在一些实施方案中,所有功能结构域彼此不同。在一些实施方案中,至少两个功能结构域彼此不同。在一些实施方案中,至少两个功能结构域彼此相同。
其他合适的功能结构域可见于例如国际专利公开号WO2019/018423。
分裂CRISPR-Cas系统
在一些实施方案中,CRISPR-Cas系统是分裂CRISPR-Cas系统。参见例如,Zetche等人,2015.Nat.Biotechnol.33(2):139-142和国际专利公开WO 2019/018423,所述文献的组合物和技术可用于和/或适用于本发明。分裂CRISPR-Cas蛋白在本文和通过引用并入本文的文献中更详细地在本文中阐述。在某些实施方案中,分裂CRISPR蛋白的每个部分与特异性结合对的成员附接,并且当彼此结合时,特异性结合对的成员保持CRISPR蛋白的部分在邻近。在某些实施方案中,分裂CRISPR蛋白的每个部分与诱导型结合对缔合。诱导型结合对是能够通过与诱导型结合对的两个成员结合的蛋白质或小分子“开启”或“关闭”的结合对。在一些实施方案中,CRISPR蛋白可优选在结构域之间分裂,使结构域保持完整。在特定实施方案中,所述Cas分裂结构域(例如,在Cas9的情况下为RuvC和HNH结构域)可同时或依次经引入细胞中,使得所述分裂Cas结构域处理藻类细胞中的靶核酸序列。与野生型Cas相比,分裂Cas降低的大小允许将系统递送至细胞的其他方法,诸如使用如本文所述的细胞穿透肽。
DNA和RNA碱基编辑
在一些实施方案中,本文别处描述的本发明的多核苷酸可使用碱基编辑系统进行修饰。在一些实施方案中,Cas蛋白与核苷酸脱氨酶连接或融合。因此,在一些实施方案中,基于Cas的系统可是碱基编辑系统。如本文所用,“碱基编辑”通常是指不包括切除核苷酸以进行修饰的通过基于CRISPR-Cas或基于Cas的系统进行的多核苷酸修饰过程。碱基编辑可在精确位置转换碱基对,而不会生成使用传统CRISPR-Cas系统可制造出的多余非所需编辑副产物。
在某些示例性实施方案中,核苷酸脱氨酶可是与DNA结合Cas蛋白组合使用的DNA碱基编辑器,诸如但不限于2类II型和V型系统。通常已知两类DNA碱基编辑器:胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)。CBE转换C·G碱基对成为T·A碱基对(Komor等人2016.Nature.533:420-424;Nishida等人2016.Science.353;和Li等人Nat.Biotech.36:324-327)以及ABE转换A·T碱基对到G·C碱基对。总的来说,CBE和ABE可介导所有四种可能的转位突变(C到T、A到G、T到C和G到A)。Rees和Liu.2018.Nat.Rev.Genet.19(12):770-788,特别地在图1b、图2a-图2c、图3a-图3f和表1。在一些实施方案中,碱基编辑系统包含CBE和/或ABE。在一些实施方案中,本文别处描述的本发明的多核苷酸可使用碱基编辑系统进行修饰。Rees和Liu.2018.Nat.Rev.Gent.19(12):770-788。碱基编辑器通常也不需要DNA供体模板和/或依赖同源定向修复。Komor等人2016.Nature.533:420-424;Nishida等人2016.Science.353;和Gaudeli等人2017.Nature.551:464-471。在与DNA中的靶基因座结合后,系统引导RNA和靶DNA链之间的碱基配对导致“R环”中的一小段ssDNA发生置换。Nishimasu等人Cell.156:935-949。ssDNA气泡内的DNA碱基由酶组分(诸如脱氨酶)修饰。在一些系统中,催化失效的Cas蛋白可是变体或修饰Cas,所述变体或修饰Cas可具有切口酶功能并且可在非编辑DNA链中生成切口以诱导细胞使用编辑链作为模板修复非编辑链。Komor等人2016.Nature.533:420-424;Nishida等人2016.Science.353;和Gaudeli等人2017.Nature.551:464-471。
其他示例性V型碱基编辑系统在以下中描述:国际专利公开号WO 2018/213708、WO2018/213726和国际专利申请号PCT/US2018/067207、PCT/US2018/067225和PCT/US2018/067307,所述文献中的每一者都通过引用并入本文。
在某些示例性实施方案中,碱基编辑系统可是RNA碱基编辑系统。与DNA碱基编辑器一样,能够转换核苷酸碱基的核苷酸脱氨酶可与Cas蛋白融合。然而,在这些实施方案中,Cas蛋白将需要能够结合RNA。示例性RNA结合Cas蛋白包括但不限于RNA结合Cas9,诸如新弗朗西斯菌(Francisella novicida)Cas9(“FnCas9”)和2类VI型Cas系统。核苷酸脱氨酶可是胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶,或经工程改造以具有胞苷脱氨酶活性的腺苷脱氨酶。在某些示例性实施方案中,RNA碱基编辑器可用于在表达的mRNA中删除或引入翻译后修饰位点。与DNA碱基编辑器(其编辑在修饰的细胞中是永久性的)相比,RNA碱基编辑器可在可能需要更精细、时间控制的地方(例如在调节特定免疫反应方面)提供编辑。示例性VI型RNA碱基编辑系统在以下中描述:Cox等人2017.Science 358:1019-1027、国际专利公开号WO 2019/005884、WO 2019/005886和WO 2019/071048以及国际专利申请号PCT/US20018/05179和PCT/US2018/067207,所述文献通过引用并入本文。可适用于RNA碱基编辑目的的示例性FnCas9系统在国际专利公开号WO 2016/106236中描述,所述文献通过引用并入本文。
递送碱基编辑系统的示例性方法(包括使用分裂内含子方法将CBE和ABE分成可重构的两半)描述在Levy等人Nature Biomedical Engineering doi.org/10.1038/s41441-019-0505-5(2019)中,所述文献通过引用并入本文。
先导编辑器
在一些实施方案中,本文别处描述的本发明的多核苷酸可使用先导编辑系统进行修饰。参见例如Anzalone等人2019.Nature.576:149-157。与碱基编辑系统一样,先导编辑系统能够靶向修饰多核苷酸而不生成双链断裂并且不需要供体模板。进一步的先导编辑系统能够进行所有12种可能的组合交换。先导编辑可通过“搜索和置换”方法学进行操作,并且可介导靶向的插入、缺失、所有12种可能的碱基到碱基转换及其组合。通常,以PE1、PE2和PE3(Id.)为例的先导编辑系统可包含与RNA可编程切口酶融合或以其他方式偶联或缔合的逆转录酶和先导编辑扩展引导RNA(pegRNA)以便于将遗传信息从pegRNA上的延伸直接复制到靶多核苷酸中。可与本发明一起使用的实施方案包括这些及其变体。与传统CRISPR-Cas系统相比,先导编辑的优势在于比传统CRIPSR-Cas系统更低的脱靶活性、副产物少并且效率更高或类似。
在一些实施方案中,先导编辑引导分子可指定靶多核苷酸信息(例如,序列)并含有置换靶多核苷酸的新多核苷酸货物。为了启动从引导分子到靶多核苷酸的转移,PE系统可在靶侧切开靶多核苷酸以暴露3'羟基,这可引发引导分子(例如先导编辑引导分子或peg引导分子)的编辑编码延伸区的逆转录直接进入靶多核苷酸中的靶位点。参见例如Anzalone等人2019.Nature.576:149-157,特别地在图1b、图1c、相关讨论和补充讨论上。
在一些实施方案中,先导编辑系统可由具有切口酶活性、逆转录酶和引导分子的Cas多肽构成。Cas多肽可缺乏核酸酶活性。引导分子可包含靶结合序列以及引物结合序列和含有编辑多核苷酸序列的模板。引导分子、Cas多肽和/或逆转录酶可偶联在一起或以其他方式彼此缔合以形成效应复合物并编辑靶序列。在一些实施方案中,Cas多肽是2类V型Cas多肽。在一些实施方案中,Cas多肽是Cas9多肽(例如是Cas9切口酶)。在一些实施方案中,Cas多肽与逆转录酶融合。在一些实施方案中,Cas多肽与逆转录酶连接。
在一些实施方案中,先导编辑系统可是PE1系统或其变体、PE2系统或其变体或PE3(例如PE3、PE3b)系统。参见例如,Anzalone等人2019.Nature.576:149-157,特别地在第2页-3页、图2a、图3a-图3f、图4a-图4b、扩展数据图3a-图3b和图4。
PEG引导分子的长度可是约10至约200个或更多个核苷酸,诸如10至/或11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200个或更多个核苷酸。peg引导分子的优化可如Anzalone等人2019.Nature.576:149-157中所述完成,特别地在第3页、图2a-图2b和扩展数据图5a-图5c。
CRISPR相关转座酶(CAST)系统
在一些实施方案中,本文别处描述的本发明的多核苷酸可使用CRISPR相关转座酶(“CAST”)系统进行修饰。CAST系统可包含催化失活或经工程改造具有催化活性的Cas蛋白,并且进一步包含催化RNA引导的DNA转座的转座酶(或其亚基)。此类系统能够在DNA分子中的靶位点插入DNA序列,而无需依赖宿主细胞修复机制。CAST系统可是1类或2类CAST系统。示例性1类系统描述在Klompe等人Nature,doi:10.1038/s41586-019-1323中,所述文献通过引用并入本文。示例性2类系统描述在Strecker等人Science.10/1126/science.aax9181(2019)和PCT/US2019/066835中,所述文献通过引用并入本文。
引导序列
在一些实施方案中,货物是或包含一种或多种用于CRISPR-Cas系统的引导分子。术语引导分子、引导序列和引导多核苷酸是指能够将Cas引导至靶基因组基因座的多核苷酸,并且如在先前引用的文献诸如国际专利公开号WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中可互换使用。一般而言,引导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。引导分子可是多核苷酸。
引导序列(在核酸靶向引导RNA内)指导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的能力可通过任何合适的测定来评估。例如,足以形成核酸靶向复合物的核酸靶向CRISPR系统的组分(包括待测试的引导序列)可提供给具有对应靶核酸序列的宿主细胞,诸如通过用编码核酸靶向复合物的组分的载体转染,随后评估靶核酸序列内的优先靶向(例如,切割),诸如通过Surveyor测定(Qui等人2004.BioTechniques.36(4)702-707)。类似地,可通过提供靶核酸序列、核酸靶向复合物的组分,包括待测试的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列并且比较测试和对照引导序列反应之间靶序列的结合或切割速率在试管中评价靶核酸序列的切割。其他测定是可能的并且本领域技术人员会想到。
在一些实施方案中,引导分子是RNA。包括在基于CRISPR-Cas或Cas的系统中的引导分子(在本文中也可互换地称为引导多核苷酸和引导序列)可是与靶核酸序列具有足够互补性以与靶核酸序列杂交并且指导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中,当使用合适的比对算法进行最佳比对时,互补程度可是约或大于约50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或更大。可使用用于比对序列的任何合适的算法来确定最佳比对,所述算法的非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如,Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W,Clustal X,BLAT,Novoalign(NovocraftTechnologies;在www.novocraft.com可获得)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(在soap.genomics.org.cn可获得)和Maq(在maq.sourceforge.net可获得)。
可选择引导序列以及之后的核酸靶向引导分子以靶向任何靶核酸序列。靶序列可是DNA。靶序列可是任何RNA序列。在一些实施方案中,靶序列可是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列:信使RNA(mRNA)、前mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、双链RNA(dsRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和细胞质小RNA(scRNA)。在一些优选实施方案中,靶序列可是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列:mRNA、前mRNA和rRNA。在一些优选实施方案中,靶序列可是选自ncRNA和lncRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些更优选实施方案中,靶序列可是mRNA分子或前mRNA分子内的序列。
在一些实施方案中,选择核酸靶向引导分子以降低核酸靶向引导内的二级结构程度。在一些实施方案中,当最佳折叠时,核酸靶向引导的核苷酸中的约或少于约75%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%或更少参与自互补碱基配对。最佳折叠可通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序基于计算最小吉布斯(Gibbs)自由能。一个这样的算法的实例是mFold,如由Zuker和Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)所述。另一示例性折叠算法是在线网络服务器RNAfold,它在维也纳大学理论化学研究所(Institute for Theoretical Chemistry at the University of Vienna)开发,使用质心结构预测算法(参见例如,A.R.Gruber等人,2008,Cell 106(1):23-24;以及PA Carr和GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62)。
在某些实施方案中,引导RNA或crRNA可包含正向重复(DR)序列和引导序列或间隔序列、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中,引导RNA或crRNA可包含与引导序列或间隔序列融合或连接的正向重复序列、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中,正向重复序列可位于引导序列或间隔序列的上游(即,5’)。在其他实施方案中,正向重复序列可位于引导序列或间隔序列的下游(即,3’)。
在某些实施方案中,crRNA包含茎环,优选单个茎环。在某些实施方案中,正向重复序列形成茎环,优选单个茎环。
在某些实施方案中,引导RNA的间隔区长度为15至35nt。在某些实施方案中,引导RNA的间隔区长度为至少15个核苷酸。在某些实施方案中,间隔区长度为15至17nt(例如15、16或17nt)、17至20nt(例如,17、18、19或20nt)、20至24nt(例如,20、21、22、23或24nt)、23至25nt(例如,23、24或25nt)、24至27nt(例如,24、25、26或27nt)、27至30nt(例如,27、28、29或30nt)、30至35nt(例如,30、31、32、33、34或35nt)或35nt或更长。
“tracrRNA”序列或类似术语包含与crRNA序列具有足够互补性以进行杂交的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中,当最佳比对时,tracrRNA序列与crRNA序列之间沿着两者中较短者的长度的互补程度为约或大于约25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%或更大。在一些实施方案中,tracr序列的长度为约或大于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个或更多个核苷酸。在一些实施方案中,tracr序列和crRNA序列包含在单个转录物内,使得两者之间的杂交产生具有二级结构诸如发夹的转录物。
一般来说,互补程度是关于sca序列和tracr序列沿着两个序列中较短者的长度的最佳比对。最佳比对可通过任何合适的比对算法确定,并且可进一步考虑二级结构,诸如sca序列或tracr序列内的自互补性。在一些实施方案中,当最佳比对时,tracr序列与sca序列之间沿着两者中较短者的长度的互补程度为约或大于约25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%或更高。
在一些实施方案中,引导序列与其对应的靶序列之间的互补程度可是约或大于约50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%或100%;引导或RNA或sgRNA的长度可是约或大于约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75个或更多个核苷酸;或引导或RNA或sgRNA的长度可小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12个或更少个核苷酸;并且tracr RNA的长度可是30或50个核苷酸。在一些实施方案中,引导序列与其对应的靶序列之间的互补程度大于94.5%或95%或95.5%或96%或96.5%或97%或97.5%或98%或98.5%或99%或99.5%或99.9%或100%。脱靶为少于100%或99.9%或99.5%或99%或99%或98.5%或98%或97.5%或97%或96.5%或96%或95.5%或95%或94.5%或94%或93%或92%或91%或90%或89%或88%或87%或86%或85%或84%或83%或82%或81%或80%的序列与引导之间的互补性,其中有利的是脱靶为100%或99.9%或99.5%或99%或99%或98.5%或98%或97.5%或97%或96.5%或96%或95.5%或95%或94.5%的序列与引导之间的互补性。
在根据本发明的一些实施方案中,引导RNA(能够将Cas引导至靶基因座)可包含(1)能够与真核细胞中的基因组靶基因座杂交的引导序列;(2)tracr序列;以及(3)tracr伴侣序列。所有(1)至(3)可存在于单个RNA中,即sgRNA(以5’至3’方向排列)或tracr RNA可是与含有引导和tracr序列的RNA不同的RNA。tracr与tracr伴侣序列杂交并指导CRISPR/Cas与靶序列复合。当tracr RNA在与含有引导和tracr序列的RNA不同的RNA上时,可优化每个RNA的长度以自它们各自的天然长度缩短,并且可独立地对每个RNA进行化学修饰以防止被细胞核糖核酸酶降解或以其他方式增加稳定性。
对引导序列的许多修饰是本领域已知的并且在本发明的上下文内经进一步考虑。可使用各种修饰来增加与靶序列结合的特异性和/或增加Cas蛋白的活性和/或减少脱靶效应。示例性引导序列修饰描述在国际专利申请号PCT US2019/045582,特别是段落[0178]-[0333]中,所述文献通过引用并入本文。
靶序列、PAM和PFS
靶序列
在CRISPR复合物形成的上下文中,“靶序列”是指引导序列经设计成与其具有互补性的序列,其中靶序列和引导序列之间的杂交促进了CRISPR复合物的形成。靶序列可包含RNA多核苷酸。术语“靶RNA”是指作为或包含靶序列的RNA多核苷酸。换言之,靶多核苷酸可是多核苷酸或多核苷酸的一部分,引导序列的一部分经设计成与所述多核苷酸或多核苷酸的一部分具有互补性,并且由包含CRISPR效应蛋白和引导分子的复合物介导的效应功能待经所述多核苷酸或多核苷酸的一部分指导。在一些实施方案中,靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。
引导序列可特异性结合靶多核苷酸中的靶序列。靶多核苷酸可是DNA。靶多核苷酸可是RNA。靶多核苷酸可具有一个或多个(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等或更多个)靶序列。靶多核苷酸可在载体上。靶多核苷酸可是基因组DNA。靶多核苷酸可是游离型的。其他形式的靶多核苷酸在本文别处描述。
靶序列可是DNA。靶序列可是任何RNA序列。在一些实施方案中,靶序列可是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列:信使RNA(mRNA)、前mRNA、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、双链RNA(dsRNA)、非编码RNA(ncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)和细胞质小RNA(scRNA)。在一些优选实施方案中,靶序列(在本文中也称为靶多核苷酸)可是选自由以下组成的组的RNA分子内的序列:mRNA、前mRNA和rRNA。在一些优选实施方案中,靶序列可是选自ncRNA和lncRNA组成的组的RNA分子内的序列。在一些更优选实施方案中,靶序列可是mRNA分子或前mRNA分子内的序列。
PAM和PFS元件
PAM元件是可由Cas蛋白识别和结合的序列。Cas蛋白/效应复合物可接着在与PAM元件相邻的位置解开dsDNA。应理解,Cas蛋白和包含它们(所述靶RNA)的系统不需要PAM序列(Marraffini等人2010.Nature.463:568-571)。相反,许多Cas蛋白和包含它们的系统依赖于PFS,这在本文别处进行了讨论。在某些实施方案中,靶序列应与PAM(前间隔序列相邻基序)或PFS(前间隔序列侧翼序列或位点)(即由CRISPR复合物识别的短序列)缔合。根据CRISPR-Cas蛋白的性质,应选择靶序列,以使其在DNA双链体中的互补序列(本文也称为非靶序列)位于PAM的上游或下游。在实施方案中,靶序列的互补序列为PAM的下游或3’或PAM的上游或5’。PAM的精确序列和长度要求因使用的Cas蛋白而异,但PAM通常是与前间隔序列(即靶序列)相邻的2-5个碱基对序列。下文提供了不同Cas蛋白的天然PAM序列的实例,并且技术人员将能够鉴定用于给定Cas蛋白的其他PAM序列。
识别不同PAM序列的能力取决于系统中包含的Cas多肽。参见例如,Gleditzsch等人2019.RNA Biology.16(4):504-517。以下表10(来自Gleditzsch等人2019)示出了若干种Cas多肽及它们识别的PAM序列。
在优选实施方案中,CRISPR效应蛋白可识别3’PAM。在某些实施方案中,CRISPR效应蛋白可识别为5’H的3’PAM,其中H是A、C或U。
此外,Cas蛋白上PAM相互作用(PI)结构域的工程化可允许PAM特异性编程,提高靶位点识别保真度,并增加CRISPR-Cas蛋白的多功能性,例如像在Kleintiver BP等人Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities.Nature.2015Jul 23;523(7561):481-5.doi:10.1038/nature14592中对于Cas9描述的。如本文进一步详述,技术人员将理解Cas13蛋白可经类似地修饰。Gao等人,“Engineered Cpf1 Enzymeswith Altered PAM Specificities,”bioRxiv 091611;doi:http://dx.doi.org/10.1101/091611(2016年12月4日)。Doench等人创建了sgRNA库,将一组六个内源小鼠和三个内源人类基因的所有可能靶位点平铺,并通过抗体染色和流式细胞术定量评估它们产生它们的靶基因无效等位基因的能力。作者表明,PAM的优化提高了活性,并且还为设计sgRNA提供了在线工具。
可使用适当的设计工具在多核苷酸中鉴定PAM序列,这些工具是可商购获得的以及在线的。此类免费可获得的工具包括但不限于CRISPRFinder和CRISPRTarget。Mojica等人2009.Microbiol.155(Pt.3):733-740;Atschul等人1990.J.Mol.Biol.215:403-410;Biswass等人2013 RNA Biol.10:817-827;和Grissa等人2007.Nucleic Acid Res.35:W52-57。PAM鉴定的实验方法可包括但不限于质粒消耗测定(Jiang等人2013.Nat.Biotechnol.31:233-239;Esvelt等人2013.Nat.Methods.10:1116-1121;Kleinstiver等人2015.Nature.523:481-485)、通过称为PAM-SCNAR的高通量体内模型筛选(Pattanayak等人2013.Nat.Biotechnol.31:839-843和Leenay等人2016.Mol.Cell.16:253)和阴性筛查(Zetsche等人2015.Cell.163:759-771)。
如前所述,靶RNA的CRISPR-Cas系统通常不依赖PAM序列。相反,此类系统通常识别前间隔序列侧翼位点(PFS)而不是PAM。因此,VI型CRISPR-Cas系统通常识别前间隔序列侧翼位点(PFS)而不是PAM。PFS代表针对RNA靶标的PAM类似物。VI型CRISPR-Cas系统采用Cas13。迄今为止分析的一些Cas13蛋白,诸如从Leptotrichia shahii(LShCAs13a)中鉴定的Cas13a(C2c2)在靶RNA的3’端具有针对G的特异性区分。在对应的crRNA重复位点存在C可表明在此位置的核苷酸配对被拒绝。然而,一些Cas13蛋白(例如,LwaCAs13a和PspCas13b)似乎不具有PFS偏好。参见例如,Gleditzsch等人2019.RNA Biology.16(4):504-517。
一些VI型蛋白诸如B亚型具有D(G、T、A)的5′-识别和NAN或NNA的3′-基序要求。一个实例是在动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)中鉴定的Cas13b蛋白(BzCas13b)。参见例如,Gleditzsch等人2019.RNA Biology.16(4):504-517。
总体而言,VI型CRISPR-Cas系统对底物(例如,靶序列)识别的限制性规则似乎比靶向DNA(例如,V型和II型)的那些更少。
与核靶向和转运相关的序列
在一些实施方案中,用于工程化细胞的组合物中的一种或多种组分(例如,Cas蛋白和/或脱氨酶)可包含一种或多种与细胞核靶向和转运相关的序列。这样的序列可促进组合物中的一种或多种组分以靶向细胞内的序列。为了促进本公开的方法中使用的CRISPR-Cas蛋白和/或核苷酸脱氨酶蛋白或其催化结构域靶向细胞核,则向这些组分中的一种或两种提供一种或多种核定位序列(NLS)可是有利的。
在一些实施方案中,在本公开的上下文中使用的NLS对于蛋白质是异源的。NLS的非限制性实例包括NLS序列,其来源于:SV40病毒大T抗原NLS,其具有氨基酸序列PKKKRKV(SEQ ID NO:52)或PKKKRKVEAS(SEQ ID NO:53);来自核质蛋白的NLS(例如,具有序列KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO:54)的核质蛋白二分NLS);具有氨基酸序列PAAKRVKLD(SEQID NO:55)或RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:57)的c-myc NLS;具有序列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO:58)的hRNPA1 M9 NLS;来自输入蛋白-α的IBB结构域的序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO:59);肌瘤T蛋白的序列VSRKRPRP(SEQ ID NO:9088)和PPKKARED(SEQ ID NO:9089);人p53的序列PQPKKKPL(SEQ IDNO:9090);小鼠c-abl IV的序列SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO:9091);流感病毒NS1的序列DRLRR(SEQ ID NO:9092)和PKQKKRK(SEQ ID NO:9093);肝炎病毒δ抗原的序列RKLKKKIKKL(SEQ ID NO:9094);小鼠Mx1蛋白的序列REKKKFLKRR(SEQ ID NO:9095);人聚(ADP-核糖)聚合酶的序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO:9096);以及类固醇激素受体(人)糖皮质激素的序列RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO:9097)。通常,一种或多种NLS具有足够的强度以驱动可检测量的DNA靶向Cas蛋白在真核细胞的细胞核中积聚。一般来说,核定位活性的强度可来源于CRISPR-Cas蛋白、使用的特定NLS或这些因素的组合中NLS的数量。可通过任何合适的技术来检测细胞核中的积聚。例如,可检测的标记可与核酸靶向蛋白融合,从而可观察细胞内的位置,诸如与用于检测细胞核位置的手段(例如,对细胞核特异的染色剂诸如DAPI)组合。细胞核也可从细胞中分离出来,接着可通过任何合适的检测蛋白质的方法(诸如免疫组织化学、蛋白质印迹或酶活性测定)来分析细胞核的内容物。也可间接确定细胞核中的积聚,诸如通过测定靶序列处核酸靶向复合物形成的影响(例如,脱氨酶活性测定),或测定受DNA靶向复合物形成和/或DNA靶向影响的改变的基因表达活性(如与未暴露于CRISPR-Cas蛋白和脱氨酶蛋白或者暴露于缺乏一种或多种NLS的CRISPR-Cas和/或脱氨酶蛋白的对照相比)。
CRISPR-Cas和/或核苷酸脱氨酶蛋白可经提供1个或多个,诸如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个异源NLS。在一些实施方案中,蛋白质包含在或靠近氨基端的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个NLS、在或靠近羧基端的约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS或这些的组合(例如,在氨基端的零个或至少一个或多个NLS以及在羧基端的零个或至少一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时,每个NLS可独立于其他进行选择,这样单个NLS可存在于多于一个拷贝中以及/或者与一个或多个拷贝中存在的一个或多个其他NLS组合。在一些实施方案中,当NLS沿多肽链从N端或C端的最近氨基酸在约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50个或更多个氨基酸内时,NLS被认为靠近N端或C端。在CRISPR-Cas蛋白的优选实施方案中,NLS与蛋白质的C端附接。
在某些实施方案中,CRISPR-Cas蛋白和脱氨酶蛋白经递送至细胞或在细胞内作为单独的蛋白表达。在这些实施方案中,CRISPR-Cas和脱氨酶蛋白中的每一者可提供有如本文所述的一个或多个NLS。在某些实施方案中,CRISPR-Cas和脱氨酶蛋白经递送至细胞或在细胞内作为融合蛋白表达。在这些实施方案中,CRISPR-Cas和脱氨酶蛋白中的一者或两者提供有一个或多个NLS。当核苷酸脱氨酶与如上所述的衔接蛋白(诸如MS2)融合时,可在衔接蛋白上提供一个或多个NLS,前提是这不干扰适体结合。在特定实施方案中,一个或多个NLS序列也可充当核苷酸脱氨酶与CRISPR-Cas蛋白之间的接头序列。
在某些实施方案中,本公开的引导包含衔接蛋白的特异性结合位点(例如适体),其可与核苷酸脱氨酶或其催化结构域连接或融合。当这样的引导形成CRISPR复合物(例如,CRISPR-Cas蛋白与引导和靶标结合)时,衔接蛋白结合并且与衔接蛋白缔合的核苷酸脱氨酶或其催化结构域定位在有利于归因功能有效的空间方向。
技术人员将理解允许衔接子+核苷酸脱氨酶的结合,但衔接子+核苷酸脱氨酶的位置不恰当(例如,由于CRISPR复合物的三维结构内的空间位阻)的对引导的修饰是非预期的修饰。如本文所述,一个或多个修饰的引导可在四环、茎环1、茎环2或茎环3处,优选在四环或茎环2处,并且在一些情况下在四环和茎环2两处经修饰。
在一些实施方案中,系统中的组分(例如,死亡Cas蛋白、核苷酸脱氨酶蛋白或其催化结构域或其组合)可包含一种或多种核输出信号(NES)、一种或多种核定位信号(NLS)或其任何组合。在一些情况下,NES可是HIV Rev NES。在某些情况下,NES可是MAPK NES。当组分是蛋白质时,NES或NLS可在组分的C端。替代地或另外地,NES或NLS可在组分的N端。在一些实例中,Cas蛋白和任选所述核苷酸脱氨酶蛋白或其催化结构域包含一种或多种异源核输出信号(NES)或核定位信号(NLS),优选HIV Rev NES或MAPK NES,优选C端。
模板
在一些实施方案中,用于工程化细胞的组合物包含模板,例如重组模板。模板可是如本文所述的另一载体的组分、包含在单独的载体中、或作为单独的多核苷酸经提供。在一些实施方案中,重组模板经设计用作同源重组中的模板,诸如在由作为核酸靶向复合物的一部分的核酸靶向效应蛋白切开或切割的靶序列内或靠近所述靶序列。
在一实施方案中,模板核酸改变靶位置的序列。在一实施方案中,模板核酸导致修饰的或非天然存在的碱基掺入靶核酸中。
模板序列可经历断裂介导的或催化的与靶序列的重组。在一实施方案中,模板核酸可包含对应于在由Cas蛋白介导的切割事件切割的靶序列上的位点的序列。在一实施方案中,模板核酸可包含对应于在第一Cas蛋白介导的事件中切割的靶序列上的第一位点和在第二Cas蛋白介导的事件中切割的靶序列上的第二位点两者的序列。
在某些实施方案中,模板核酸可包含导致翻译序列的编码序列改变的序列,例如导致蛋白产物中一种氨基酸取代为另一种的序列,例如将突变体等位基因转化为野生型等位基因、将野生型等位基因转化为突变体等位基因以及/或者引入终止密码子、插入氨基酸残基、删除氨基酸残基或无义突变。在某些实施方案中,模板核酸可包含导致非编码序列改变(例如,外显子中或5'或3'非翻译或非转录区中的改变)的序列。此类改变包括控制元件例如启动子、增强子的改变以及顺式作用或反式作用控制元件的改变。
与靶基因中的靶位置具有同源性的模板核酸可用于改变靶序列的结构。模板序列可用于改变不需要的结构,例如不需要的或突变体核苷酸。模板核酸可包括这样的序列,当整合时,导致降低阳性控制元件的活性;增加阳性控制元件的活性;降低阴性控制元件的活性;增加阴性控制元件的活性;降低基因的表达;增加基因的表达;增加对病症或疾病的抵抗力;增加对病毒进入的抵抗力;纠正突变或改变不需要的氨基酸残基,从而赋予、增加、消除或降低基因产物的生物学性质,例如,增加酶的酶活性或增加基因产物与另一分子相互作用的能力。
模板核酸可包含导致靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个核苷酸的序列变化的序列。
模板多核苷酸可具有任何合适的长度,诸如约或多于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000个或更多个核苷酸长度。在一实施方案中,模板核酸的长度可是20+/-10、30+/-10、40+/-10、50+/-10、60+/-10、70+/-10、80+/-10、90+/-10、100+/-10、110+/-10、120+/-10、130+/-10、140+/-10、150+/-10、160+/-10、170+/-10、180+/-10、190+/-10、200+/-10、210+/-10或220+/-10个核苷酸。在一实施方案中,模板核酸的长度可是30+/-20、40+/-20、50+/-20、60+/-20、70+/-20、80+/-20、90+/-20、100+/-20、110+/-20、120+/-20、130+/-20、140+/-20、I 50+/-20、160+/-20、170+/-20、180+/-20、190+/-20、200+/-20、210+/-20或220+/-20个核苷酸。在一实施方案中,模板核酸的长度是10至1,000、20至900、30至800、40至700、50至600、50至500、50至400、50至300、50至200或50至100个核苷酸。
在一些实施方案中,模板多核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的一部分互补。当进行最佳比对时,模板多核苷酸可与靶序列的一个或多个核苷酸(例如约或多于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个核苷酸)重叠。在一些实施方案中,当模板序列和包含靶序列的多核苷酸经最佳比对时,模板多核苷酸的最近核苷酸自靶序列在约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000个或更多个核苷酸内。
外源多核苷酸模板包含待整合的序列(例如,突变的基因)。用于整合的序列可是细胞内源或外源的序列。待整合的序列的实例包括编码蛋白质的多核苷酸或非编码RNA(例如,微小RNA)。因此,用于整合的序列可与一个或多个适当的控制序列可操作地连接。替代地,待整合的序列可提供调节功能。
上游或下游序列可包含约20bp至约2500bp,例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中,示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp或更具体地约700bp至约1000。
上游或下游序列可包含约20bp至约2500bp,例如约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400或2500bp。在一些方法中,示例性上游或下游序列具有约200bp至约2000bp、约600bp至约1000bp或更具体地约700bp至约1000。
在某些实施方案中,可缩短一个或两个同源臂以避免包含某些序列重复元件。例如,可缩短5'同源臂以避免序列重复元件。在其他实施方案中,可缩短3'同源臂以避免序列重复元件。在一些实施方案中,可缩短5'和3'同源臂以避免包含某些序列重复元件。
在一些方法中,外源多核苷酸模板还可包含标记。这样的标记可使筛选靶向的整合变得容易。合适的标记的实例包括限制性位点、荧光蛋白或可选择标记。本公开的外源多核苷酸模板可使用重组技术构建(参见例如,Sambrook等人,2001和Ausubel等人,1996)。
在某些实施方案中,可设计用于校正突变的模板核酸以用作单链寡核苷酸。当使用单链寡核苷酸时,5'和3'同源臂的长度的范围可高达约200个碱基对(bp),例如至少25、50、75、100、125、150、175或200bp。
Suzuki等人描述了通过CRISPR/Cas9介导的同源独立靶向的整合进行的体内基因组编辑(2016,Nature 540:144–149),其通过引用并入本文并且可适用于本发明。
TALE核酸酶
在一些实施方案中,TALE核酸酶或TALE核酸酶系统可用于修饰多核苷酸。在一些实施方案中,本文提供的方法使用分离的、非天然存在的、重组或工程化DNA结合蛋白,其包含TALE单体或TALE单体或半单体作为它们的组织结构的一部分,所述组织结构能够以提高的效率和扩展的特异性靶向核酸序列。
天然存在的TALE或“野生型TALE”是由多种变形菌门(proteobacteria)的物种分泌的核酸结合蛋白。TALE多肽含有由高度保守的单体多肽的串联重复构成的核酸结合结构域,所述单体多肽的长度主要为33、34或35个氨基酸,并且主要在氨基酸位置12和13处彼此不同。在有利实施方案中,核酸为DNA。如本文所用,术语“多肽单体”、“TALE单体”或“单体”将用于指代TALE核酸结合结构域内的高度保守的重复多肽序列和术语“重复可变二残基”或“RVD”将用于指代多肽单体的位置12和13处的高度可变氨基酸。如整个公开所提供的,RVD的氨基酸残基使用IUPAC氨基酸单字母代码来描述。包含在DNA结合结构域内的TALE单体的一般表示为X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35,其中下标表示氨基酸位置,并且X表示任何氨基酸。X12X13表示RVD。在一些多肽单体中,在位置13的可变氨基酸缺失或不存在,并且在此类单体中,RVD由单个氨基酸组成。在此类情况下,RVD可替代地表示为X*,其中X表示X12并且(*)表示X13不存在。DNA结合结构域包含若干个TALE单体重复并且这可表示为(X1-11-(X12X13)-X14-33或34或35)z,其中在有利实施方案中,z至少是5至40。在另一个有利实施方案中,z至少是10至26。
TALE单体可具有核苷酸结合亲和力,所述亲和力由其RVD中氨基酸的身份确定。例如,具有NI的RVD的多肽单体可优先与腺嘌呤(A)结合、具有NG的RVD的单体可优先与胸腺嘧啶(T)结合、具有HD的RVD的单体可优先与胞嘧啶(C)结合并且具有NN的RVD的单体可优先与腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)两者结合。在一些实施方案中,具有IG的RVD的单体可优先与T结合。因此,TALE的核酸结合结构域中多肽单体重复的数量和顺序决定了其核酸靶标特异性。在一些实施方案中,具有NS的RVD的单体可识别所有四个碱基对并且可与A、T、G或C结合。TALE的结构和功能在例如以下中进一步描述:Moscou等人,Science 326:1501(2009);Boch等人,Science 326:1509-1512(2009);和Zhang等人,Nature Biotechnology29:149-153(2011)。
本发明的方法中使用的多肽可是分离的、非天然存在的、重组或工程化核酸结合蛋白,其具有核酸或DNA结合区,所述结合区含有经设计以靶向特定核酸序列的多肽单体重复。
如本文所述,具有HN或NH的RVD的多肽单体优先与鸟嘌呤结合,并且从而允许生成对含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在一些实施方案中,具有RN、NN、NK、SN、NH、KN、HN、NQ、HH、RG、KH、RH和SS的RVD的多肽单体可优先与鸟嘌呤结合。在一些实施方案中,具有RN、NK、NQ、HH、KH、RH、SS和SN的RVD的多肽单体可优先与鸟嘌呤结合,并且可因此允许生成对含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在一些实施方案中,具有HH、KH、NH、NK、NQ、RH、RN和SS的RVD的多肽单体可优先与鸟嘌呤结合,并且从而允许生成对含鸟嘌呤的靶核酸序列具有高结合特异性的TALE多肽。在一些实施方案中,对鸟嘌呤具有高结合特异性的RVD是RN、NH、RH和KH。此外,具有NV的RVD的多肽单体可优先与腺嘌呤和鸟嘌呤结合。在一些实施方案中,具有H*、HA、KA、N*、NA、NC、NS、RA和S*的RVD的单体以相当的亲和力与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶结合。
核酸或DNA结合结构域的一种或多种多肽单体的预定N端至C端顺序决定了本发明多肽将结合的对应预定靶核酸序列。如本文所用,单体和至少一种或多种半单体经“特定排序以靶向”感兴趣的基因组基因座或基因。在植物基因组中,天然TALE结合位点总是以胸腺嘧啶(T)开始,这可由TALE多肽的非重复N端内的神秘信号指定;在一些情况下,此区域可称为重复0。在动物基因组中,TALE结合位点不一定必须以胸腺嘧啶(T)开始,并且本发明的多肽可靶向以T、A、G或C开始的DNA序列。TALE单体的串联重复总是以半长重复或一段序列结束,所述重复或序列可仅与重复全长TALE单体的前20个氨基酸共享同一性,并且此半重复可称为半单体。因此,结果就是靶向的核酸或DNA的长度等于完整单体的数量加二。
如在Zhang等人,Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述,可通过将来自天然存在的TALE的DNA结合区的直接N端或C端的“加帽区”的氨基酸序列包含在工程化TALE DNA结合区的N端或C端位置处的工程化TALE中来提高TALE多肽结合效率。因此,在某些实施方案中,本文所述的TALE多肽还包含N端加帽区和/或C端加帽区。
N端加帽区的示例性氨基酸序列是:
M D P I R S R T P S P A R E L L S G P Q P D G V Q P T A D R G V S P PA G G P L D G L P A R R T M S R T R L P S P P A P S P A F S A D S F S D L L RQ F D P S L F N T S L F D S L P P F G A H H T E A A T G E W D E V Q S G L R AA D A P P P T M R V A V T A A R P P R A K P A P R R R A A Q P S D A S P A A QV D L R T L G Y S Q Q Q Q E K I K P K V R S T V A Q H H E A L V G H G F T H AH I V A L S Q H P A A L G T V A V K Y Q D M I A A L P E A T H E A I V G V G KQ W S G A R A L E A L L T V A G E L R G P P L Q L D T G Q L L K I A K R G G VT A V E A V H A W R N A L T G A P L N (SEQ ID NO:9098)
C端加帽区的示例性氨基酸序列是:
R P A L E S I V A Q L S R P D P A L A A L T N D H L V A L A C L G G RP A L D A V K K G L P H A P A L I K R T N R R I P E R T S H R V A D H A Q V VR V L G F F Q C H S H P A Q A F D D A M T Q F G M S R H G L L Q L F R R V G VT E L E A R S G T L P P A S Q R W D R I L Q A S G M K R A K P S P T S T Q T PD Q A S L H A F A D S L E R D L D A P S P M H E G D Q T R A S(SEQ ID NO:9099)
如本文所用,N端加帽区、包含重复TALE单体的DNA结合结构域和C端加帽区的预定“N端”至“C端”方向为在本发明的d-TALE或多肽中组织不同结构域提供了结构基础。
整个N端和/或C端加帽区对于增强DNA结合区的结合活性不是必需的。因此,在某些实施方案中,N端和/或C端加帽区的片段包含在本文所述的TALE多肽中。
在某些实施方案中,本文所述的TALE多肽含有N端加帽区片段,其包含N端加帽区的至少10、20、30、40、50、54、60、70、80、87、90、94、100、102、110、117、120、130、140、147、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260或270个氨基酸。在某些实施方案中,N端加帽区片段氨基酸位于N端加帽区的C端(DNA结合区近端)。如在Zhang等人,NatureBiotechnology 29:149-153(2011)中所述,包含C端240个氨基酸的N端加帽区片段增强了与全长加帽区相同的结合活性,而包含C端147个氨基酸的片段保留了超过80%的全长加帽区功效并且包含C端117个氨基酸的片段保留了超过50%的全长加帽区活性。
在一些实施方案中,本文所述的TALE多肽含有C端加帽区片段,其包含C端加帽区的至少6、10、20、30、37、40、50、60、68、70、80、90、100、110、120、127、130、140、150、155、160、170、180个氨基酸。在某些实施方案中,C端加帽区片段氨基酸位于C端加帽区的N端(DNA结合区近端)。如在Zhang等人,Nature Biotechnology 29:149-153(2011)中所述,包含C端68个氨基酸的C端加帽区片段增强了与全长加帽区相同的结合活性,而包含C端20个氨基酸的片段保留了超过50%的全长加帽区功效。
在某些实施方案中,本文所述的TALE多肽的加帽区不需要具有与本文提供的加帽区序列相同的序列。因此,在一些实施方案中,本文所述的TALE多肽的加帽区具有与本文提供的加帽区氨基酸序列至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同或共享同一性的序列。序列同一性与序列同源性有关。同源性比较可以通过肉眼进行,或者更通常地是借助容易获得的序列比较程序进行。这些可商购获得的计算机程序可计算两个或更多个序列之间的百分比(%)同源性,并且也可计算由两个或更多个氨基酸或核酸序列共享的序列同一性。在一些优选实施方案中,本文所述的TALE多肽的加帽区具有与本文提供的加帽区氨基酸序列至少95%相同或共享同一性的序列。
序列同源性可通过本领域已知的许多计算机程序中任一种生成,所述程序包括但不限于BLAST或FASTA。也可使用像GCG Wisconsin Bestfit程序包那样的适用于进行比对的计算机程序。一旦软件产生了最佳比对,就有可能计算%同源性,优选%序列同一性。软件通常将此作为序列比较的一部分并生成数字结果。
在本文所述的一些实施方案中,本发明的TALE多肽包含与一个或多个效应结构域连接的核酸结合结构域。术语“效应结构域”或“调节和功能结构域”是指具有除与由核酸结合结构域识别的核酸序列结合之外的活性的多肽序列。通过将核酸结合结构域与一个或多个效应结构域组合,本发明的多肽可用于将由效应结构域介导的一种或多种功能或活性靶向核酸结合结构域特异性结合的特定靶DNA序列。
在本文所述的TALE多肽的一些实施方案中,由效应结构域介导的活性是生物活性。例如,在一些实施方案中,效应结构域是转录抑制剂(即,阻遏物结构域),诸如mSin相互作用结构域(SID)。SID4X结构域或Krüppel相关框(KRAB)或KRAB结构域的片段。在一些实施方案中,效应结构域是转录增强子(即,活化结构域),诸如VP16、VP64或p65活化结构域。在一些实施方案中,核酸结合是例如与包括但不限于以下的效应结构域连接:转座酶、整合酶、重组酶、解离酶、转化酶、蛋白酶、DNA甲基转移酶、DNA去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶、组蛋白去乙酰化酶、核酸酶、转录阻遏物、转录活化物、转录因子募集、蛋白核定位信号或细胞摄取信号。
在一些实施方案中,效应结构域是表现出活性的蛋白结构域,所述活性包括但不限于转座酶活性、整合酶活性、重组酶活性、解离酶活性、转化酶活性、蛋白酶活性、DNA甲基转移酶活性、DNA去甲基化酶活性、组蛋白乙酰化酶活性、组蛋白去乙酰化酶活性、核酸酶活性、核定位信号活性、转录阻遏物活性、转录活化物活性、转录因子募集活性或细胞摄取信号活性。本发明的其他优选实施方案可包括本文所述的活性的任何组合。
大范围核酸酶
在一些实施方案中,大范围核酸酶或其系统可用于修饰多核苷酸。大范围核酸酶,其是特征在于大的识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)的内切脱氧核糖核酸酶。使用大范围核酸酶的示例性方法可见于美国专利号8,163,514、8,133,697、8,021,867、8,119,361、8,119,381、8,124,369和8,129,134,所述文献通过引用具体并入本文。
RNAi
在某些实施方案中,遗传修饰剂是RNAi(例如,shRNA)。如本文所用,关于RNAi分子(例如siRNA或miRNA)的活性的“基因沉默”或“基因沉默的”是指细胞中靶基因的mRNA水平降低在不存在miRNA或RNA干扰分子的情况下细胞中发现的mRNA水平的至少约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、约99%、约100%。在一个优选实施方案中,mRNA水平降低至少约70%、约80%、约90%、约95%、约99%、约100%。
如本文所用,术语“RNAi”是指任何类型的干扰RNA,包括但不限于siRNAi、shRNAi、内源微小RNA和人工微小RNA。例如,它包括先前被鉴定为siRNA的序列,无论RNA的下游加工机制如何(即,尽管siRNA被认为具有导致mRNA切割的体内加工的特定方法,但可在本文所述的侧翼序列的情况下将此类序列掺入载体中)。术语“RNAi”可包括基因沉默RNAi分子并且还包括活化基因表达的RNAi效应分子。
如本文所用,“siRNA”是指形成双链RNA的核酸,所述双链RNA在siRNA存在或表达在与靶基因相同的细胞中时具有降低或抑制基因或靶基因表达的能力。双链RNA siRNA可由互补链形成。在一个实施方案中,siRNA是指可形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可对应于全长靶基因或其子序列。通常,siRNA的长度为至少约15-50个核苷酸(例如,双链siRNA的每个互补序列的长度为约15-50个核苷酸,并且双链siRNA的长度为约15-50个碱基对,优选约19-30个碱基核苷酸,优选约20-25个核苷酸长度,例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度)。
如本文所用,“shRNA”或“小发夹RNA”(也称为茎环)是一种siRNA。在一个实施方案中,这些shRNA由以下构成:短(例如约19至约25个核苷酸)反义链、随后是约5至约9个核苷酸的核苷酸环和类似的有义链。替代地,有义链可在核苷酸环结构之前,并且反义链可在之后。
在本文中可互换使用的术语“微小RNA”或“miRNA”是内源RNA,其中一些已知在转录后水平调节蛋白编码基因的表达。内源微小RNA是天然存在于基因组中的小RNA,其能够调节mRNA的生产性利用。术语人工微小RNA包括除内源微小RNA之外的任何类型的RNA序列,其能够调节mRNA的生产性利用。微小RNA序列已在诸如以下公开中描述:Lim,等人,Genes&Development,17,第991页-1008页(2003);Lim等人Science 299,1540(2003);Lee和AmbrosScience,294,862(2001);Lau等人,Science 294,858-861(2001);Lagos-Quintana等人,Current Biology,12,735-739(2002);Lagos Quintana等人,Science 294,853-857(2001);以及Lagos-Quintana等人,RNA,9,175-179(2003),所述文献通过引用并入本文。多个微小RNA也可掺入前体分子中。此外,miRNA样茎环可在细胞中表达,作为递送人工miRNA和短干扰RNA(siRNA)的媒介物,目的是通过miRNA和或RNAi途径调节内源基因的表达。
如本文所用,“双链RNA”或“dsRNA”是指由两条链构成的RNA分子。双链分子包括由单个RNA分子构成的那些,所述单个RNA分子自身加倍以形成双链结构。例如,单链miRNA源自的祖分子的茎环结构(称为前miRNA)(Bartel等人2004.Cell 1 16:281-297)包含dsRNA分子。
工程化细胞和生物体
本文描述的是工程化细胞,其可包含一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸、多肽、载体和/或载体系统。在一些实施方案中,一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸可在工程化细胞中表达。在一些实施方案中,工程化细胞能够产生本文别处描述的工程化肌肉特异性病毒衣壳蛋白和/或工程化肌肉特异性病毒粒子。本文还描述了可包含本文所述的一种或多种工程化细胞的修饰或工程化生物体。工程化细胞可经工程化以表达货物分子(例如货物多核苷酸),其依赖或独立于如本文别处描述的工程化肌肉特异性病毒衣壳多核苷酸。
多种动物、植物、藻类、真菌、酵母等和动物、植物、藻类、真菌、酵母细胞或组织系统可使用本文别处提到的各种转化方法经工程化以表达本文所述的工程化肌肉特异性递送系统的一种或多种核酸构建体。这可产生可产生工程化肌肉特异性靶向部分或其组合物(诸如用于生产目的、工程化肌肉特异性病毒衣壳设计和/或生成)的生物体和/或模型生物体。在一些实施方案中,编码本文所述的工程化病毒衣壳系统的一种或多种组分的多核苷酸可稳定或瞬时掺入植物、动物、藻类、真菌和/或酵母或组织系统的一个或多个细胞中。在一些实施方案中,一种或多种工程化病毒衣壳系统多核苷酸在基因组上掺入植物、动物、藻类、真菌和/或酵母或组织系统的一个或多个细胞中。修饰生物体和系统的其他实施方案在本文别处描述。在一些实施方案中,本文所述的工程化病毒衣壳系统的一种或多种组分在植物、动物、藻类、真菌、酵母或组织系统的一个或多个细胞中表达。
工程化细胞
本文描述了工程化细胞的各种实施方案,所述细胞可包含本文别处描述的工程化肌肉特异性靶向部分、其组合物和/或其递送系统、多核苷酸、多肽、载体和/或载体系统中的一种或多种。在一些实施方案中,细胞可表达一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分多核苷酸并且可产生一种或多种工程化肌肉特异性病毒粒子,这些在本文中更详细地描述。此类细胞在本文中也称为“生产细胞”。应理解,这些工程化细胞不同于本文别处描述的“修饰细胞”,因为修饰细胞不一定是生产细胞(即它们不制造工程化肌肉特异性递送粒子(即可以由本文所述的肌肉特异性靶向部分引导的肌肉特异性方式将货物递送至细胞的粒子),除非它们包含本文所述的工程化病毒衣壳多核苷酸、工程化病毒衣壳载体或其他载体中的一种或多种,致使细胞能够产生工程化病毒粒子或经修饰以产生包含一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分的组合物(诸如蛋白质)。
修饰细胞可是通过包含一种或多种工程化肌肉特异性靶向部分的递送媒介物(例如病毒、载体或非载体递送媒介物)递送的货物的受体细胞并且在一些实施方案中,可由递送媒介物和/或经递送至受体细胞的货物多核苷酸修饰。修饰细胞在本文别处更详细地讨论。术语修饰可与不依赖于作为受体细胞的细胞的修饰结合使用。例如,可在接受本文所述的工程化递送媒介物之前修饰分离的细胞。
在一实施方案中,本发明提供了非人真核生物体;例如,多细胞真核生物体,包括真核宿主细胞,所述宿主细胞含有根据任何所述的实施方案的本文所述的工程化肌肉特异性递送系统的一种或多种组分。在其他实施方案中,本发明提供了真核生物体;优选多细胞真核生物体,其包含真核宿主细胞,所述宿主细胞含有根据任何所述的实施方案的本文所述的工程化递送系统的一种或多种组分。在一些实施方案中,生物体是AAV的宿主。
在特定实施方案中,所获得的植物、藻类、真菌、酵母等细胞或部分是转基因植物,其包含掺入到细胞的全部或部分基因组中的外源DNA序列。
工程化细胞可是原核细胞。原核细胞可是细菌细胞。原核细胞可是古生菌细胞。细菌细胞可是任何合适的细菌细胞。合适的细菌细胞可来自大肠杆菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、罗德杆菌属(Rodhobacter)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechoystis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、假交替单胞菌属(Psedoaltermonas)、窄食单胞菌属(Stenotrophamonas)和链霉菌属(Streptomyces)。合适的细菌细胞包括但不限于大肠杆菌细胞、新月茎杆菌细胞、类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)细胞、游海假交替单胞菌(Psedoaltermonashaloplanktis)细胞。合适的细菌菌株包括但不限于BL21(DE3)、DL21(DE3)-pLysS、BL21Star-pLysS、BL21-SI、BL21-AI、Tuner、Tuner pLysS、Origami、Origami B pLysS、Rosetta、Rosetta pLysS、Rosetta-gami-pLysS、BL21 CodonPlus、AD494、BL2trxB、HMS174、NovaBlue(DE3)、BLR、C41(DE3)、C43(DE3)、Lemo21(DE3)、Shuffle T7、ArcticExpress和ArticExpress(DE3)。
工程化细胞可是真核细胞。真核细胞可是或来源于特定生物体的那些,诸如植物或哺乳动物,包括但不限于本文讨论的人或非人真核生物或动物或哺乳动物,例如小鼠、大鼠、兔、狗、牲畜或非人哺乳动物或灵长类动物。在一些实施方案中,工程化细胞可是细胞系。细胞系的实例包括但不限于C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI-231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1猴肾上皮细胞、BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5人胎儿成纤维细胞;10.1小鼠成纤维细胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1细胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr-/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY细胞、K562细胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCKII、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT细胞系、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2细胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1细胞系、U373、U87、U937、VCaP、Vero细胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR和其转基因变体。细胞系可从本领域技术人员已知的多种来源(参见例如,美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)(ATCC)(Manassas,Va.))获得。
在一些实施方案中,工程化或修饰细胞是肌细胞(例如心肌、骨骼肌和/或平滑肌)、骨细胞、血细胞、免疫细胞(包括但不限于B细胞、巨噬细胞、T细胞、CAR-T细胞等)、肾细胞、膀胱细胞、肺细胞、心脏细胞、肝脏细胞、脑细胞、神经元、皮肤细胞、胃细胞、神经元支持细胞、肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、干细胞或其他祖细胞、肾上腺细胞、软骨细胞及其组合。
在一些实施方案中,工程化细胞可是真菌细胞。如本文所用,“真菌细胞”是指真菌界(kingdom of fungi)内的任何类型的真核细胞。真菌界内的门包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、芽枝霉门(Blastocladiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、微孢子门(Microsporidia)和新丽鞭毛菌门(Neocallimastigomycota)。真菌细胞可包括酵母、霉菌和丝状真菌。在一些实施方案中,真菌细胞是酵母细胞。
如本文所用,术语“酵母细胞”是指子囊菌门和担子菌门内的任何真菌细胞。酵母细胞可包括出芽酵母细胞、裂殖酵母细胞和霉菌细胞。不限于这些生物体,实验室和工业环境中使用的许多类型的酵母是子囊菌门的一部分。在一些实施方案中,酵母细胞是酿酒酵母、马克斯克鲁维酵母或东方伊萨酵母细胞。其他酵母细胞可包括但不限于念珠菌属(Candida spp.)(例如,白色念珠菌)、耶氏酵母属(Yarrowia spp.)(例如,解脂耶氏酵母)、毕赤酵母属(Pichia spp.)(例如,巴斯德毕赤酵母)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces spp.)(例如,乳酸克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母)、脉孢菌属(Neurospora spp.)(例如,粗糙脉孢菌)、镰刀菌属(Fusarium spp.)(例如,尖孢镰刀菌)和伊萨酵母属(Issatchenkia spp.)(例如,东方伊萨酵母,又名毕赤酵母和耐热酵母)。在一些实施方案中,真菌细胞是丝状真菌细胞。如本文所用,术语“丝状真菌细胞”是指在细丝(即,菌丝或菌丝体)中生长的任何类型的真菌细胞。丝状真菌细胞的实例可包括但不限于曲霉菌属(Aspergillus spp.)(例如,黑曲霉)、木霉属(Trichoderma spp.)(例如,里氏木霉)、根霉属(Rhizopus spp.)(例如,米根霉)和被孢霉属(Mortierella spp.)(例如,深黄被孢霉)。
在一些实施方案中,真菌细胞是工业菌株。如本文所用,“工业菌株”是指在工业过程(例如以商业或工业规模生产产品)中使用或从工业过程中分离的任何真菌细胞菌株。工业菌株可指代通常用于工业过程的真菌物种,或者它可指代也可用于非工业目的(例如,实验室研究)的真菌物种的分离物。工业过程的实例可包括发酵(例如,在食品或饮料产品的生产中)、蒸馏、生物燃料生产、化合物的生产和多肽的生产。工业菌株的实例可包括但不限于JAY270和ATCC4124。
在一些实施方案中,真菌细胞是多倍体细胞。如本文所用,“多倍体”细胞可指代其基因组以多于一个拷贝存在的任何细胞。多倍体细胞可指代天然以多倍体状态存在的细胞类型,或者它可指代已被诱导以多倍体状态存在(例如,通过减数分裂、胞质分裂或DNA复制的特定调节、改变、失活、活化或修饰)的细胞。多倍体细胞可指代其整个基因组是多倍体的细胞,或者它可指代在特定感兴趣的基因组基因座中是多倍体的细胞。
在一些实施方案中,真菌细胞是二倍体细胞。如本文所用,“二倍体”细胞可指代其基因组以两个拷贝存在的任何细胞。二倍体细胞可指代天然以二倍体状态存在的细胞类型,或者它可指代已被诱导以二倍体状态存在(例如,通过减数分裂、胞质分裂或DNA复制的特定调节、改变、失活、活化或修饰)的细胞。例如,酿酒酵母菌株S228C可维持在单倍体或二倍体状态。二倍体细胞可指代其整个基因组是二倍体的细胞,或者它可指代在特定感兴趣的基因组基因座中是二倍体的细胞。在一些实施方案中,真菌细胞是单倍体细胞。如本文所用,“单倍体”细胞可指代其基因组以一个拷贝存在的任何细胞。单倍体细胞可指代天然以单倍体状态存在的细胞类型,或者它可指代已被诱导以单倍体状态存在(例如,通过减数分裂、胞质分裂或DNA复制的特定调节、改变、失活、活化或修饰)的细胞。例如,酿酒酵母菌株S228C可维持在单倍体或二倍体状态。单倍体细胞可指代其整个基因组是单倍体的细胞,或者它可指代在特定感兴趣的基因组基因座中是单倍体的细胞。
在一些实施方案中,工程化细胞是从受试者获得的细胞。在一些实施方案中,受试者是健康或未患病的受试者。在一些实施方案中,受试者是具有期望生理学和/或生物学特性的受试者,使得当产生工程化AAV衣壳粒子时,它可包装一种或多种货物多核苷酸,所述货物多核苷酸可与所需生理学和/或生物学特性有关和/或能够修改所需生理学和/或生物学特性。因此,所产生的工程化AAV衣壳粒子的货物多核苷酸能够将所需特性转移至受体细胞。在一些实施方案中,货物多核苷酸能够修饰工程化细胞的多核苷酸,使得工程化细胞具有所需生理学和/或生物学特性。
在一些实施方案中,用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立包含一个或多个载体衍生序列的新细胞系。
工程化细胞可用于产生工程化AAV衣壳多核苷酸、载体和/或粒子。在一些实施方案中,工程化AAV衣壳多核苷酸、载体和/或粒子经产生、收获和/或递送至有需要的受试者。在一些实施方案中,将工程化细胞递送至受试者。工程化细胞的其他用途在本文别处描述。在一些实施方案中,工程化细胞可包含在本文别处描述的制剂和/或药盒中。
工程化细胞可短期或长期存储以备后用。合适的存储方法在本领域中通常是已知的。此外,在以后的时间恢复存储的细胞以供使用(诸如在存储之后解冻、重构和以其他方式刺激工程化细胞中的代谢)的方法通常也是本领域已知的。
制剂
本文所述的组合物、多核苷酸、多肽、粒子、细胞、载体系统及其组合可包含在制剂诸如药物制剂中。在一些实施方案中,制剂可用于生成多肽和其他粒子,其包含本文所述的一种或多种肌肉特异性靶向部分。在一些实施方案中,可将制剂递送至有需要的受试者。在一些实施方案中,本文所述的工程化肌肉特异性靶向部分、其组合物、其递送系统、工程化细胞、工程化病毒粒子和/或其组合可包含在可递送至受试者或细胞的制剂中。在一些实施方案中,制剂是药物制剂。可将本文所述的一种或多种多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合提供给有需要的受试者或仅提供给细胞或提供作为诸如在药物制剂中的活性成分。因此,本文还描述了含有一定量的一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞或其组合的药物制剂。在一些实施方案中,药物制剂可含有有效量的一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合。本文所述的药物制剂可施用于有需要的受试者或细胞。
在一些实施方案中,基于有需要的受试者的体重或可施用药物制剂的特定患者群体的平均体重,包含在药物制剂中的一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、病毒粒子、纳米粒子、其他递送粒子及其组合的量的范围可为约1pg/kg至约10mg/kg。一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合在药物制剂中的量的范围可为约1pg至约10g或约10nL至约10ml。在其中药物制剂含有一个或多个细胞的实施方案中,量的范围可为约1个细胞至1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010或更多个细胞。在其中药物制剂含有一个或多个细胞的实施方案中,量的范围可为每nL、μL、mL或L约1个细胞至1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010或更多个细胞。
在其中工程化AAV衣壳粒子包含在制剂中的实施方案中,制剂可含有工程化AAV衣壳粒子的1至1x101、1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1017、1x1018、1x1019或1x1020个转导单位(TU)/mL。在一些实施方案中,制剂的体积可是0.1至100mL并且可含有工程化病毒粒子的1至1x101、1x102、1x103、1x104、1x105、1x106、1x107、1x108、1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016、1x1017、1x1018、1x1019或1x1020个转导单位(TU)/mL。
药学上可接受的载剂以及辅助成分和助剂
在实施方案中,含有一定量的一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、病毒粒子、纳米粒子、其他递送粒子及其组合的药物制剂可进一步包含药学上可接受的载剂。合适的药学上可接受的载剂包括但不限于水、盐溶液、醇、阿拉伯树胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、香料油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮,所述载剂不会与活性组合物发生有害反应。
药物制剂可经灭菌并且在需要时与助剂混合,所述助剂诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、调味物质和/或芳香物质等,所述助剂不会与活性组合物发生有害反应。
除了一定量的一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、病毒粒子、纳米粒子、其他递送粒子及其组合之外,药物制剂还可包含有效量的辅助活性剂,包括但不限于多核苷酸、氨基酸、肽、多肽、抗体、适体、核酶、激素、免疫调节剂、解热药、抗焦虑药、抗精神病药、镇痛药、解痉药、抗炎药、抗组胺药、抗感染药、化疗药及其组合。
合适的激素包括但不限于氨基酸衍生激素(例如褪黑激素和甲状腺素)、小肽激素和蛋白激素(例如促甲状腺激素释放激素、加压素、胰岛素、生长激素、促黄体激素、促卵泡激素和促甲状腺激素)、类花生酸(例如花生四烯酸、脂氧素和前列腺素)和类固醇激素(例如雌二醇、睾酮、四氢睾酮皮质醇)。合适的免疫调节剂包括但不限于强的松(prednisone)、硫唑嘌呤、6-MP、环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)、甲氨蝶呤、白介素(例如IL-2、IL-7和IL-12)、细胞因子(例如干扰素(例如IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-K、IFN-ω和IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子和咪喹莫特(imiquimod))、趋化因子(例如CCL3、CCL26和CXCL7)、磷酸胞嘧啶-鸟苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖、抗体和适体)。
合适的解热药包括但不限于非甾体抗炎药(例如布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、酮洛芬(ketoprofen)和尼美舒利(nimesulide))、阿司匹林和相关水杨酸类药物(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、对乙酰氨基酚/扑热息痛(paracetamol/acetaminophen)、安乃近(metamizole)、萘丁美酮(nabumetone)、非那宗(phenazone)和奎宁。
合适的抗焦虑药包括但不限于苯二氮卓类药物(例如阿普唑仑(alprazolam)、溴西泮(bromazepam)、氯二氮平(chlordiazepoxide)、氯硝西泮(clonazepam)、氯拉西泮(clorazepate)、地西泮(diazepam)、氟拉西泮(flurazepam)、劳拉西泮(lorazepam)、奥沙西泮(oxazepam)、替马西泮(temazepam)、三唑仑和托非索泮(tofisopam))、5-羟色胺能抗抑郁药(例如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂、三环类抗抑郁药和单胺氧化酶抑制剂)、美比卡(mebicar)、阿氟巴唑(afobazole)、西兰卡(selank)、布罗曼坦(bromantane)、埃默西泮(emoxypine)、阿扎哌隆(azapirones)、巴比妥类药物、羟嗪、普瑞巴林(pregabalin)、伐力多(validol)和β阻滞剂。
合适的抗精神病药包括但不限于苯哌利多(benperidol)、溴苯哌啶(bromoperidol)、氟哌利多(droperidol)、氟哌啶醇(haloperidol)、莫哌隆(moperone)、哌帕隆(pipaperone)、替米哌隆(timiperone)、氟斯必灵(fluspirilene)、五氟利多(penfluridol)、匹莫齐特(pimozide)、乙酰丙嗪、氯丙嗪、氰美马嗪(cyamemazine)、地西拉嗪(dizyrazine)、氟奋乃静(fluphenazine)、左美丙嗪(levomepromazine)、美索达嗪(mesoridazine)、培拉嗪(perazine)、哌氰嗪(pericyazine)、奋乃静(perphenazine)、哌泊噻嗪(pipotiazine)、普鲁氯嗪(prochlorperazine)、普马嗪(promazine)、异丙嗪、丙硫喷地(prothipendyl)、硫丙拉嗪(thioproperazine)、硫利达嗪(thioridazine)、三氟拉嗪(trifluoperazine)、三氟丙嗪(triflupromazine)、氯普噻吨(chlorprothixene)、氯哌噻吨(clopenthixol)、氟哌噻吨(flupentixol)、替沃噻吨(tiotixene)、珠氯噻醇(zuclopenthixol)、氯噻平(clotiapine)、洛沙平(loxapine)、丙硫喷地(prothipendyl)、卡匹帕明(carpipramine)、氯卡帕明(clocapramine)、吗啉吲酮(molindone)、莫沙帕明(mosapramine)、舒必利(sulpiride)、维拉必利(veralipride)、氨磺必利(amisulpride)、阿莫沙平(amoxapine)、阿立哌唑(aripiprazole)、阿塞那平(asenapine)、氯氮平(clozapine)、布南色林(blonanserin)、伊潘立酮(iloperidone)、鲁拉西酮(lurasidone)、美哌隆(melperone)、奈莫必利(nemonapride)、奥氮平(olanzapine)、帕潘立酮(paliperidone)、哌罗匹隆(perospirone)、奎硫平(quetiapine)、瑞莫必利(remoxipride)、利培酮(risperidone)、舍吲哚(sertindole)、曲米帕明(trimipramine)、齐拉西酮(ziprasidone)、佐替平(zotepine)、阿尔斯通尼(alstonie)、贝非普诺(befeprunox)、比托哌丁(bitopertin)、依匹哌唑(brexpiprazole)、大麻二醇(cannabidiol)、卡利拉嗪(cariprazine)、匹莫范色林(pimavanserin)、泼古迈德米斯尼(pomaglumetad methionil)、威比卡啉(vabicaserin)、呫诺美林(xanomeline)和辛阔那平(zicronapine)。
合适的镇痛药包括但不限于对乙酰氨基酚/扑热息痛、非甾体抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔(rofecoxib)、塞来昔布(celecoxib)和依托考昔(etoricoxib))、阿片类药物(例如吗啡、可待因、羟考酮(oxycodone)、氢可酮(hydrocodone)、二氢吗啡、哌替啶(pethidine)、丁丙诺啡(buprenorphine))、曲马多(tramadol)、去甲肾上腺素、氟吡汀(flupiretine)、奈福泮(nefopam)、奥芬那君(orphenadrine)、普瑞巴林、加巴喷丁(gabapentin)、环苯扎林(cyclobenzaprine)、东莨菪碱(scopolamine)、美沙酮(methadone)、凯托米酮(ketobemidone)、哌腈米特(piritramide)和阿司匹林以及相关水杨酸类药物(例如水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)。
合适的解痉药包括但不限于美贝维林(mebeverine)、罂粟碱、环苯扎林、卡立普多(carisoprodol)、奥芬那君、替扎尼定(tizanidine)、美他沙酮(metaxalone)、美索巴莫(methocarbamol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、巴氯芬(baclofen)、丹曲林(dantrolene)、巴氯芬、替扎尼定和丹曲林。合适的抗炎药包括但不限于强的松、非甾体抗炎药(例如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、COX-2抑制剂(例如罗非考昔、塞来昔布和依托考昔)和免疫选择性抗炎衍生物(例如颌下腺肽-T及其衍生物)。
合适的抗组胺药包括但不限于H1-受体拮抗剂(例如,阿伐斯汀(acrivastine)、氮卓斯汀(azelastine)、比拉斯汀(bilastine)、溴苯那敏(brompheniramine)、布克利嗪(buclizine)、溴苯海拉明(bromodiphenhydramine)、卡比沙明(carbinoxamine)、西替利嗪(cetirizine)、氯丙嗪、赛克利嗪(cyclizine)、扑尔敏(chlorpheniramine)、氯马斯汀(clemastine)、赛庚啶(cyproheptadine)、地氯雷他定(desloratadine)、右溴苯那敏(dexbrompheniramine)、右氯苯那敏(dexchlorpheniramine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、二甲茚定(dimetindene)、苯海拉明(diphenhydramine)、多西拉敏(doxylamine)、依巴斯汀(ebastine)、恩布拉敏(embramine)、非索非那定(fexofenadine)、羟嗪、左西替利嗪(levocetirizine)、氯雷他定(loratadine)、美克洛嗪(meclozine)、米氮平(mirtazapine)、奥洛他定(olopatadine)、奥芬那君、苯茚胺(phenindamine)、非尼拉敏(pheniramine)、苯托沙敏(phenyltoloxamine)、异丙嗪、吡拉明(pyrilamine)、奎硫平、卢帕他定(rupatadine)、曲吡那敏(tripelennamine)和曲普立啶(triprolidine))、H2-受体拮抗剂(例如西咪替丁(cimetidine)、法莫替丁(famotidine)、拉呋替丁(lafutidine)、尼扎替丁(nizatidine)、雷尼替丁(ranitidine)和罗沙替丁(roxatidine))、曲托喹啉(tritoqualine)、儿茶素(catechin)、色甘酸(cromoglicate)、奈多罗米(nedocromil)和p2-肾上腺素能激动剂。
合适的抗感染药包括但不限于抗阿米巴药(例如硝唑尼特(nitazoxanide)、巴龙霉素(paromomycin)、甲硝唑、替硝唑、氯喹、米替福新(miltefosine)、两性霉素(amphotericin)b和双碘喹啉(iodoquinol))、氨基糖苷类(例如巴龙霉素(paromomycin)、妥布霉素(tobramycin)、庆大霉素(gentamicin)、阿米卡星(amikacin)、卡那霉素(kanamycin)和新霉素(neomycin))、驱虫药(例如噻嘧啶(pyrantel)、甲苯咪唑(mebendazole)、伊维菌素(ivermectin)、吡喹酮(praziquantel)、阿苯达唑(albendazole)、噻苯达唑(thiabendazole)、奥沙尼喹(oxamniquine))、抗真菌药(例如唑类抗真菌药(如伊曲康唑(itraconazole)、氟康唑(fluconazole)、帕康唑(parconazole)、酮康唑(ketoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)和伏立康唑(voriconazole))、棘白菌素类(例如卡泊芬净(caspofungin)、阿尼芬净(anidulafungin)和米卡芬净(micafungin))、灰黄霉素(griseofulvin)、特比萘芬(terbinafine)、氟胞嘧啶(flucytosine)和多烯类(例如制霉菌素(nystatin)和两性霉素(amphotericin)b)、抗疟药(例如息疟定(pyrimethamine)/磺胺多辛(sulfadoxine)、蒿甲醚(artemether)/苯芴醇(lumefantrine)、阿托伐醌(atovaquone)/氯胍(proquanil)、奎宁(quinine)、羟氯喹(hydroxychloroquine)、甲氟喹(mefloquine)、氯喹(chloroquine)、强力霉素(doxycycline)、乙嘧啶(pyrimethamine)和卤泛群(halofantrine))、抗结核病药(例如氨基水杨酸类药物(例如氨基水杨酸)、异烟肼/利福平(isoniazid/rifampin)、异烟肼/吡嗪酰胺(pyrazinamide)/利福平、贝达喹啉(bedaquiline)、异烟肼、乙胺丁醇(ethambutol)、利福平、利福布丁(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、卷曲霉素(capreomycin)和环丝氨酸(cycloserine))、抗病毒药(例如金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、阿巴卡韦(abacavir)/拉米夫定(lamivudine)、恩曲他滨(emtricitabine)/替诺福韦(tenofovir)、可比司他(cobicistat)/埃替拉韦(elvitegravir)/恩曲他滨/替诺福韦、依法韦仑(efavirenz)/恩曲他滨/替诺福韦、阿巴卡韦/拉米夫定/齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定/齐多夫定、恩曲他滨/替诺福韦、恩曲他滨/洛匹那韦(lopinavir)/利托那韦(ritonavir)/替诺福韦、干扰素α-2v/利巴韦林(ribavirin)、聚乙二醇干扰素α-2b、马拉韦罗(maraviroc)、雷特格韦(raltegravir)、度鲁特韦(dolutegravir)、恩夫韦地(enfuvirtide)、膦甲酸(foscarnet)、福米韦森(fomivirsen)、奥司他韦(oseltamivir)、扎那米韦(zanamivir)、奈韦拉平(nevirapine)、依法韦仑、依曲韦林(etravirine)、利匹韦林(rilpivirine)、地拉夫定(delavirdine)、奈韦拉平、恩替卡韦(entecavir)、拉米夫定、阿德福韦(adefovir)、索非布韦(sofosbuvir)、地达诺新(didanosine)、替诺福韦、阿巴卡韦、齐多夫定、司他夫定(stavudine)、恩曲他滨、扎西他滨(zalcitabine)、替比夫定(telbivudine)、西咪匹韦(simeprevir)、博赛泼维(boceprevir)、特拉匹韦(telaprevir)、洛匹那韦/利托那韦、博赛泼维、地瑞那韦(darunavir)、利托那韦、替拉那韦(tipranavir)、阿扎那韦(atazanavir)、奈非那韦(nelfinavir)、安普那韦(amprenavir)、茚地那韦(indinavir)、沙威那韦(sawuinavir)、利巴韦林、伐昔洛韦(valacyclovir)、阿昔洛韦(acyclovir)、泛昔洛韦(famciclovir)、更昔洛韦(ganciclovir)和缬更昔洛韦(valganciclovir))、碳青霉烯类(例如多利培南(doripenem)、美罗培南(meropenem)、厄他培南(ertapenem)和西司他丁(cilastatin)/亚胺培南(imipenem))、头孢菌素类(例如头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢拉定(cephradine)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢吡肟(cefepime)、头孢唑啉(cefazoline)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢替坦(cefotetan)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢丙烯(cefprozil)、氯碳头孢、头孢西丁(cefoxitin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢克肟(cefixime)、头孢妥仑(cefditoren)、头孢唑肟(ceftizoxime)和头孢他啶(ceftazidime))、糖肽类抗生素(例如万古霉素(vancomycin)、达巴万星(dalbavancin)、奥利万星(oritavancin)和特拉万星(telavancin))、甘氨环素类(例如替加环素(tigecycline))、抗麻风药(例如氯法齐明(clofazimine)和沙利度胺(thalidomide))、林可霉素(lincomycin)及其衍生物(例如克林霉素(clindamycin)和林可霉素)、大环内酯类及其衍生物(例如泰利霉素(telithromycin)、非达霉素(fidaxomicin)、红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)和醋竹桃霉素(troleandomycin))、利奈唑胺(linezolid)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)/甲氧苄啶(trimethoprim)、利福昔明(rifaximin)、氯霉素(chloramphenicol)、磷霉素(Fosfomycin)、甲硝唑、氨曲南(aztreonam)、杆菌肽(bacitracin)、青霉素(penicillin)(阿莫西林(amoxicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、巴氨西林(bacampicillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、阿莫西林/克拉维酸(clavulanate)、氨苄青霉素/舒巴坦(sulbactam)、哌拉西林/他唑巴坦(tazobactam)、克拉维酸/替卡西林、青霉素、普鲁卡因青霉素(procaine penicillin)、苯唑西林(oxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)和萘夫西林(nafcillin))、喹诺酮类(例如洛美沙星(lomefloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、加替沙星(qatifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、西诺沙星(cinoxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、依诺沙星(enoxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、加替沙星、曲伐沙星(trovafloxacin)和司帕沙星(sparfloxacin))、磺胺类(例如磺胺甲恶唑/甲氧苄啶、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)和磺胺异恶唑(sulfasoxazole))、四环素类(例如强力霉素、地美环素(demeclocycline)、米诺环素(minocycline)、强力霉素/水杨酸、强力霉素/ω-3多不饱和脂肪酸和四环素(tetracycline))和泌尿抗感染药(例如呋喃妥因(nitrofurantoin)、乌洛托品(methenamine)、磷霉素、西诺沙星、萘啶酸、甲氧苄啶和亚甲蓝)。
合适的化疗药物包括但不限于紫杉醇(paclitaxel)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、多柔比星(doxorubicin)、5-FU(氟尿嘧啶(fluorouracil))、依维莫司(everolimus)、培美曲塞(pemetrexed)、美法仑(melphalan)、帕米磷酸二钠(pamidronate)、阿那曲唑(anastrozole)、依西美坦(exemestane)、奈拉滨(nelarabine)、奥法木单抗(ofatumumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、贝利司他(belinostat)、托西莫单抗(tositumomab)、卡莫司汀(carmustine)、博来霉素(bleomycin)、波舒替尼(bosutinib)、白消安(busulfan)、阿仑单抗(alemtuzumab)、伊立替康(irinotecan)、凡德他尼(vandetanib)、比卡鲁胺(bicalutamide)、洛莫司汀(lomustine)、柔红霉素(daunorubicin)、氯法拉滨(clofarabine)、卡博替尼(cabozantinib)、放线菌素(dactinomycin)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、阿糖胞苷(cytarabine)、癌得星(Cytoxan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、地西他滨(decitabine)、地塞米松(dexamethasone)、多西紫杉醇(docetaxel)、羟基脲(hydroxyurea)、地卡巴肼(decarbazine)、亮丙瑞林(leuprolide)、表柔比星(epirubicin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、天冬酰胺酶(asparaginase)、雌莫司汀(estramustine)、西妥昔单抗(cetuximab)、维莫德吉(vismodegib)、天冬酰胺酶菊基腐病菌(asparginase Erwinia chrysanthemi)、氨磷汀(amifostine)、依托泊苷(etoposide)、氟他胺(flutamide)、托瑞米芬(toremifene)、氟维司群(fulvestrant)、来曲唑(letrozole)、地加瑞克(degarelix)、普拉曲沙(pralatrexate)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氟尿苷(floxuridine)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、吉西他滨(gemcitabine)、阿法替尼(afatinib)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylatem)、卡莫司汀(carmustine)、艾日布林(eribulin)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、阿维他敏(altretamine)、托泊替康(topotecan)、帕纳替尼(ponatinib)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、依鲁替尼(ibrutinib)、阿西替尼(axitinib)、干扰素α-2a、吉非替尼(gefitinib)、罗米地辛(romidepsin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、鲁索替尼(ruxolitinib)、卡巴他赛(cabazitaxel)、ado曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)、卡非佐米(carfilzomib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、沙格司亭(sargramostim)、克拉屈滨(cladribine)、米托坦(mitotane)、长春新碱(vincristine)、丙卡巴肼(procarbazine)、甲地孕酮(megestrol)、曲美替尼(trametinib)、美司钠(mesna)、氯化锶-89(strontium-89chloride)、氮芥(mechlorethamine)、丝裂霉素(mitomycin)、白消安、吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、长春瑞滨(vinorelbine)、非格司亭(filgrastim)、培非格司亭(pegfilgrastim)、索拉非尼(sorafenib)、尼鲁米特(nilutamide)、喷司他丁(pentostatin)、他莫昔芬(tamoxifen)、米托蒽醌(mitoxantrone)、培门冬酶(pegaspargase)、地尼白介素(denileukin diftitox)、阿利维a酸(alitretinoin)、卡铂(carboplatin)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、顺铂(cisplatin)、泊马度胺(pomalidomide)、强的松(prednisone)、阿地白介素(aldesleukin)、巯嘌呤(mercaptopurine)、唑来膦酸(zoledronic acid)、来那度胺(lenalidomide)、利妥昔单抗(rituximab)、奥曲肽(octretide)、达沙替尼(dasatinib)、瑞格拉非尼(regorafenib)、组氨瑞林(histrelin)、舒尼替尼(sunitinib)、司妥昔单抗(siltuximab)、奥马西他辛(omacetaxine)、硫鸟嘌呤(thioguanine(硫鸟嘌呤(tioguanine)))、达拉菲尼(dabrafenib)、埃罗替尼(erlotinib)、蓓萨罗丁(bexarotene)、替莫唑胺(temozolomide)、噻替派(thiotepa)、沙利度胺、BCG、西罗莫司(temsirolimus)、盐酸苯达莫司汀(Bendamustine hydrochloride)、曲普瑞林(triptorelin)、三氧化二砷(arsenictrioxide)、拉帕替尼(lapatinib)、柔比星(valrubicin)、帕尼单抗(panitumumab)、长春花碱(vinblastine)、硼替佐米(bortezomib)、维甲酸(tretinoin)、阿扎西蒂纳(azacitidinea)、帕唑帕尼(pazopanib)、替尼泊苷(teniposide)、亚叶酸(leucovorin)、克唑替尼(crizotinib)、卡培他滨(capecitabine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、易普利姆玛(ipilimumab)、戈舍瑞林(goserelin)、伏立诺他(vorinostat)、艾代拉里斯(idelalisib)、色瑞替尼(ceritinib)、阿比特龙(abiraterone)、埃博霉素(epothilone)、他氟泊苷(tafluposide)、硫唑嘌呤(azathioprine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、长春地辛(vindesine)和全反式维甲酸(all-trans retinoic acid)。
在其中除了一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞、病毒粒子、纳米粒子、其他递送粒子及其组合之外,药物制剂中还含有辅助活性剂的实施方案中,辅助活性剂的量诸如有效量将根据辅助活性剂而变化。在一些实施方案中,辅助活性剂的量在0.001微克至约1毫克的范围内。在其他实施方案中,辅助活性剂的量在约0.01IU至约1000IU的范围内。在其他实施方案中,辅助活性剂的量在0.001mL至约1mL的范围内。在又其他实施方案中,辅助活性剂的量在总药物制剂的约1%重量/重量至约50%重量/重量的范围内。在另外的实施方案中,辅助活性剂的量在总药物制剂的约1%体积/体积至约50%体积/体积的范围内。在再其他实施方案中,辅助活性剂的量在总药物制剂的约1%重量/体积至约50%重量/体积的范围内。
剂型
在一些实施方案中,本文所述的药物制剂可是某种剂型。所述剂型可适合于通过任何适当的途径施用。适当的途径包括但不限于口服(包括口腔或舌下)、直肠、硬膜外、颅内、眼内、吸入、鼻内、局部(包括口腔、舌下或经皮)、阴道、尿道内、胃肠外、颅内、皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内、骨内、心内、关节内、海绵窦内、鞘内、玻璃体内、脑内、牙龈、龈下、脑室内和皮内。此类制剂可通过本领域已知的任何方法制备。
适用于口服施用的剂型可是离散的剂量单位,诸如胶囊、丸剂或片剂、散剂或颗粒剂、溶液或在水性或非水性液体中的混悬剂;可食用泡沫剂或泡剂,或呈水包油液体乳液或油包水液体乳液的形式。在一些实施方案中,适用于口服施用的药物制剂还包含给药物制剂调味、保存药物制剂、给药物制剂着色或帮助药物制剂分散的一种或多种剂。制备用于口服施用的剂型也可是液体溶液的形式,其可作为泡沫、喷雾或液体溶液经递送。在一些实施方案中,口服剂型可含有约1ng至1000g的药物制剂,所述药物制剂含有治疗有效量或其适当部分的靶向效应融合蛋白和/或其复合物或含有一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合的组合物。可将口服剂型施用于有需要的受试者。
在适当的情况下,本文所述的剂型可是微囊化的。
剂型还可经制备以延长或维持任何成分的释放。在一些实施方案中,一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合可是其释放被延迟的成分。在其他实施方案中,任选包含的辅助成分的释放被延迟。适用于延迟成分释放的方法包括但不限于将成分包覆或嵌入聚合物、蜡、凝胶等形式的材料中。迟释剂型制剂可按照诸如以下标准参考中所述来制备:"Pharmaceutical dosage form tablets,"编辑Liberman等人(New York,Marcel Dekker,Inc.,1989),"Remington-The science and practice of pharmacy",第20版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000,and"Pharmaceutical dosageforms and drug delivery systems",第6版,Ansel等人,(Media,PA:Williams andWilkins,1995)。这些参考提供了有关制备片剂和胶囊剂以及片剂和丸剂、胶囊剂和颗粒剂的迟释剂型的赋形剂、材料、设备和方法的信息。迟释可是约一小时至约3个月或更长时间。
合适的包覆材料的实例包括但不限于纤维素聚合物,诸如邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和琥珀酸乙酸羟丙基甲基纤维素;聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物以及甲基丙烯酸树脂(在商品名(Roth Pharma,Westerstadt,Germany)下可商购获得)、玉米蛋白、虫胶和多糖。
包衣可在或不在水不溶性/水溶性非聚合赋形剂的存在下用不同比率的水溶性聚合物、水不溶性聚合物和/或pH依赖性聚合物来形成,以产生所需释放曲线。包衣在剂型(基质或简单)上进行,包括但不限于片剂(压缩有包覆珠粒或没有)、胶囊剂(具有或不具有包覆珠粒)、珠粒、粒子组合物(“成分本身”被配制成不限于混悬剂形式或配制成喷洒剂型)。
适用于局部施用的剂型可经配制成软膏、乳膏、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。在治疗眼或其他外部组织例如口腔或皮肤的一些实施方案中,药物制剂作为局部软膏或乳膏应用。当配制在软膏中时,一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合可与石蜡或水混溶性软膏基质一起配制。在一些实施方案中,可将活性成分配制在具有水包油乳膏基质或油包水基质的乳膏中。适用于口腔中局部施用的剂型包括糖锭、锭剂和漱口水。
适用于鼻腔或吸入施用的剂型包括气雾剂、溶液剂、混悬液滴剂、凝胶剂或干粉剂。在一些实施方案中,一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合包含在适于吸入的剂型中,所述适于吸入的剂型呈通过微粉化获得或可获得的粒径减小的形式。在一些实施方案中,大小减小(例如微粉化)的化合物或其盐或溶剂化物的粒度定义为通过本领域已知的适当方法测量的约0.5至约10微米的D50值。适用于通过吸入施用的剂型还包括粒子粉尘或雾。其中载剂或赋形剂是液体的适用于作为鼻喷雾剂或滴剂施用的剂型包括活性成分(例如一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合和/或辅助活性剂)的水性或油溶液剂/混悬剂,其可由各种类型的计量剂量加压气雾剂、雾化器或吹入器生成。
在一些实施方案中,剂型可是适合通过吸入施用的气雾剂制剂。在这些实施方案中的一些中,气雾剂制剂可含有一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合和药学上可接受的水性或非水性溶剂的溶液或细混悬液。气雾剂制剂可以单剂量或多剂量以无菌形式存在于密封容器中。对于这些实施方案中的一些,密封容器是单剂量或多剂量的配备有计量阀(例如计量剂量吸入器)的鼻腔或气溶胶分配器,其旨在一旦容器的内容物已用完就丢弃。
当气溶胶剂型包含在气溶胶分配器中时,分配器含有合适的加压推进剂,诸如压缩空气、二氧化碳或有机推进剂,包括但不限于氢氟烃。其他实施方案中的气溶胶制剂剂型包含在泵雾化器中。加压气溶胶制剂还可含有一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合的溶液或混悬液。在其他实施方案中,气溶胶制剂还可含有共溶剂和/或改性剂,其经掺入以提高例如制剂的稳定性和/或味道和/或细粒子质量特性(量和/或分布)。气溶胶制剂的施用可是每天一次或每天若干次,例如每天2、3、4或8次,其中每次递送1、2或3个剂量。
对于一些适合于和/或适用于吸入施用的剂型,药物制剂是干粉可吸入制剂。除了一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合、辅助活性成分和/或其药学上可接受的盐之外,这样的剂型还可含有粉末基质诸如乳糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇和/或淀粉。在这些实施方案中的一些中,一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合的形式是粒径减小的。在其他实施方案中,性能改性剂,诸如L-亮氨酸或另一种氨基酸、纤维二糖八乙酸酯和/或硬脂酸的金属盐,诸如硬脂酸镁或硬脂酸钙。
在一些实施方案中,气溶胶剂型可经布置,使得每个计量剂量的气溶胶含有预定量的活性成分,诸如一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合中的一种或多种。
适用于阴道施用的剂型可作为阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂制剂呈现。适用于直肠施用的剂型包括栓剂或灌肠剂。
适用于胃肠外施用和/或适用于任何类型的注射(例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、皮内、骨内、硬膜外、心脏内、关节内、海绵体内、牙龈、牙龈下、鞘内、玻璃体内、脑内和脑室内)的剂型可包括水性和/或非水性无菌注射溶液剂,其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、致使组合物与受试者血液等渗的溶质,以及可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬剂。适用于胃肠外施用的剂型可存在于单单位剂量或多单位剂量容器中,所述容器包括但不限于密封安瓿或小瓶。可将剂量冻干并重新悬浮在无菌载剂中以在施用之前重构剂量。在一些实施方案中,临时注射溶液剂和混悬剂可由无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
适用于眼部施用的剂型可包括可任选适用于注射的水性和/或非水性无菌溶液剂,并且其可任选含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、致使组合物与受试者的眼睛或包含在其中或眼睛周围的流体等渗的溶质,以及可包含悬浮剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬剂。
对于一些实施方案,剂型含有每单位剂量预定量的一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合。在一些实施方案中,预定量的此类单位剂量因此可每天施用一次或多于一次。此类药物制剂可通过本领域熟知的任何方法制备。
药盒
本文还描述了含有一种或多种本文所述的组合物、多肽、多核苷酸、载体、细胞、病毒粒子、其他递送媒介物或其他组分及其组合和本文所述的药物制剂中的一种或多种的药盒。在实施方案中,一种或多种本文所述的多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合可作为组合药盒提供。如本文所用,术语“组合药盒”或“部分药盒”是指用于包装、筛选、测试、销售、营销、递送和/或施用其中含有的元素的组合或单一元素诸如活性成分的化合物或制剂和另外的组分。此类另外的组分包括但不限于包装材料、注射器、泡罩包装、瓶子等。组合药盒可含有一种或多种组分(例如一种或多种多肽、多核苷酸、载体、细胞及其组合中的一种或多种),或者其制剂可以单个制剂(例如液体、冻干粉等)或以多个独立制剂的形式经提供。独立组分或制剂可包含在药盒内的单个包装中或多个独立包装中。所述药盒还可包含有形表达媒介形式的说明书,所述说明书可含有关于其中含有的组分和/或制剂的内容物的信息和/或指导、关于其中含有的组分和/或制剂的内容物的安全性信息、关于其中含有的组分和/或制剂的数量、剂量、使用适应症、筛选方法、组分设计建议和/或信息、建议的治疗方案。如本文所用,“有形表达媒介”是指物理上有形或可访问的媒介,而不仅仅是抽象的思想或未记录的口语。“有形表达媒介”包括但不限于纤维素或塑料材料上的文字,或以合适的计算机可读存储器形式存储的数据。数据可存储在单元设备诸如闪存驱动器或CD-ROM上,或者存储在用户可通过例如网络界面访问的服务器上。
在一个实施方案中,本发明提供了一种药盒,其包含一种或多种本文所述的组分。在一些实施方案中,药盒包含载体系统和使用药盒的说明书。在一些实施方案中,载体系统包含与一种或多种工程化多核苷酸可操作地连接的调节元件(诸如含有肌肉特异性靶向部分和/或其组合物的那些),如本文别处所述,以及任选货物分子,其可任选与调节元件可操作地连接。在药盒内含有货物分子的实施方案中,一种或多种工程化递送系统多核苷酸可包含在与货物分子相同或不同的载体上。
在一些实施方案中,药盒包含载体系统和使用药盒的说明书。在一些实施方案中,载体系统包含(a)与正向重复序列可操作地连接的第一调节元件和用于在正向重复序列的上游(当适用时)或下游(当适用时)插入一个或多个引导序列的一个或多个插入位点,其中当表达时,引导序列在真核细胞中指导Cas9 CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合,其中Cas9 CRISPR复合物包含与引导序列复合的Cas9酶,所述引导序列与靶序列杂交;和/或(b)与编码所述Cas9酶的酶编码序列可操作地连接的第二调节元件,所述酶编码序列包含核定位序列。在适用的情况下,还可提供tracr序列。在一些实施方案中,药盒包含位于系统的相同或不同载体上的组分(a)和(b)。在一些实施方案中,组分(a)还包含与第一调节元件可操作连接的两个或更多个引导序列,其中当表达时,两个或更多个引导序列中的每一者在真核细胞中指导CRISPR复合物与不同靶序列的序列特异性结合。在一些实施方案中,Cas9酶包含一种或多种核定位序列,其强度足以驱动所述CRISPR酶以可检测量在真核细胞的细胞核中积聚。在一些实施方案中,CRISPR酶是V型或VI型CRISPR系统酶。在一些实施方案中,CRISPR酶是Cas9酶。在一些实施方案中,Cas9酶来源于土拉弗朗西斯菌1、土拉弗朗西斯菌新杀手亚种(Francisella tularensis subsp.novicida)、苏格兰普雷沃氏菌(Prevotella albensis)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)MC2017 1、瘤胃丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、异域菌门(Peregrinibacteria)细菌GW2011_GWA2_33_10、分枝杆菌(Parcubacteria)细菌GW2011_GWC2_44_17、密斯氏菌(Smithella sp.)SCADC、酸性氨基球菌(Acidaminococcus sp.)BV3L6、毛螺科菌MA2020、候选白蚁甲烷枝原体(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella bovoculi)237、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、毛螺科菌ND2006、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)3、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)Cas9(例如,修饰为具有至少一种DD或与其缔合),并且可包含Cas9的其他改变或突变,并且可是嵌合Cas9。在一些实施方案中,DD-CRISPR酶经密码子优化以在真核细胞中表达。在一些实施方案中,DD-CRISPR酶在靶序列位置处指导切割一条或两条链。在一些实施方案中,DD-CRISPR酶缺乏或基本上缺乏DNA链切割活性(例如,与野生型酶或不具有降低核酸酶活性的突变或改变的酶相比,不超过5%的核酸酶活性)。在一些实施方案中,第一调节元件是聚合酶III启动子。在一些实施方案中,第二调节元件是聚合酶II启动子。在一些实施方案中,引导序列的长度为至少16、17、18、19、20、25个核苷酸,或在16-30个核苷酸之间,或在16-25个核苷酸之间,或在16-20个核苷酸之间。
使用方法
一般讨论
包含一种或多种本发明的肌肉特异性靶向部分、工程化肌肉特异性递送系统、工程化病毒衣壳和粒子、多核苷酸、多肽、载体、工程化细胞的组合物通常可用于包装一种或多种货物和/或递送其至受体细胞。在一些实施方案中,递送是基于靶向部分的特异性以细胞特异性方式诸如以肌肉特异性方式进行的。在一些实施方案中,这是由工程化病毒衣壳的趋向性赋予的,所述趋向性可至少部分地受到包含本文别处描述的一种或多种RGD和或n-mer基序的影响。在一些实施方案中,趋向性是肌肉特异性的。在一些实施方案中,包含一种或多种肌肉特异性靶向部分、工程化病毒衣壳和病毒粒子的组合物可经施用于受试者或细胞、组织和/或器官并且可促进货物转移和/或整合至受体细胞。在其他实施方案中,能够产生含有一种或多种肌肉特异性靶向部分的组合物诸如多肽和其他粒子(例如,工程化AAV衣壳和病毒粒子)的工程化细胞可由本文所述的多核苷酸、载体和载体系统等生成。这包括但不限于工程化AAV衣壳系统分子(例如多核苷酸、载体和载体系统等)。在一些实施方案中,本文所述的能够生成含有一种或多种肌肉特异性靶向部分的组合物诸如多肽和其他粒子(例如工程化AAV衣壳和病毒粒子)的多核苷酸、载体和载体系统等可在体内、离体或体外经递送至细胞或组织。在一些实施方案中,当递送至受试者时,所述组合物可在体内或离体转化受试者的细胞以产生能够制造本文所述组合物的工程化细胞,所述组合物含有本文所述的一种或多种肌肉特异性靶向部分,所述组合物包括但不限于工程化AAV衣壳粒子,其可从工程化细胞中释放并在体内将货物分子递送至受体细胞或者产生个性化工程化组合物(例如AAV衣壳粒子)以重新引入受体细胞从其中获得的受试者中。
在一些实施方案中,工程化细胞可经递送至受试者,其中它可释放产生的本发明的组合物(包括但不限于工程化AAV衣壳粒子),使得它们可接着递送货物(例如货物多核苷酸)至受体细胞。这些通用方法可在生物生产中以及在其他各种应用中以多种方式用于治疗和/或预防受试者的疾病或其症状、生成模型细胞、生成修饰生物体、提供细胞选择和筛选测定。
在一些实施方案中,含有一种或多种肌肉特异性靶向部分的组合物诸如多肽和其他粒子(例如工程化AAV衣壳和病毒粒子)可经递送至受试者或细胞、组织和/或器官。通过这种方式,它们可用于递送它们可含有或与之相关的任何货物至肌细胞。
在一些实施方案中,工程化AAV衣壳多核苷酸、载体及其系统可用于生成工程化AAV衣壳变体库,所述库可用于挖掘具有所需细胞特异性的变体。由各种实施例支持的本文提供的描述可证明考虑到所需细胞特异性的人可利用本文所述的本发明来获得具有所需细胞特异性的衣壳。
本发明可用作研究计划的一部分,其中存在结果或数据的传输。计算机系统(或数字设备)可用于接收、传输、显示和/或存储结果、分析数据和/或结果、和/或产生结果和/或数据和/或分析的报告。计算机系统可理解为可从媒介(例如软件)和/或网络端口(例如从互联网)读取指令的逻辑装置,其可任选连接到具有固定媒介的服务器。
计算机系统可包含CPU、磁盘驱动器、输入设备诸如键盘和/或鼠标以及显示器(例如监视器)中的一个或多个。数据通信诸如指令或报告的传输可通过通信媒介到在本地或远程位置的服务器实现。通信媒介可包括传输和/或接收数据的任何方式。例如,通信媒介可是网络连接、无线连接或互联网连接。这种连接可提供在万维网(World Wide Web)上的通信。可以设想,与本发明有关的数据可通过此类网络或连接(或用于传输信息的任何其他合适的方式,包括但不限于邮寄实体报告,诸如印出)传输以通过接收器接收和/或审查。接收器可是但不限于个人系统或电子系统(例如,一台或多台计算机,和/或一台或多台服务器)。在一些实施方案中,计算机系统包含一个或多个处理器。处理器可与一个或多个控制器、计算单元和/或计算机系统的其他单元相关,或根据需要植入固件中。如果以软件实施,则例程可存储在任何计算机可读存储器中,诸如RAM、ROM、闪存、磁盘、光盘或其他合适的存储介质中。同样,此软件可通过任何已知的传输方法经传输至计算设备,所述方法包括例如通过通信信道诸如电话线、互联网、无线连接等,或通过可移动介质诸如计算机可读磁盘、闪存驱动器等。各个步骤可实施为各个块、操作、工具、模块和技术,而这些又可在硬件、固件、软件或硬件、固件和/或软件的任何组合中实施。当在硬件中实施时,块、操作、技术等中的一些或全部可在例如以下中实施:定制集成电路(IC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程逻辑阵列(FPGA)、可编程逻辑阵列(PLA)等。在本发明的实施方案中可使用主从式架构、关系数据库架构。主从式架构是一种网络架构,其中网络上的每台计算机或每个进程是客户端或服务器。服务器计算机通常是功能强大的计算机,专用于管理磁盘驱动器(文件服务器)、打印机(打印服务器)或网络流量(网络服务器)。客户端计算机包括用户在其上运行应用程序的PC(个人计算机)或工作站,以及如本文公开的示例性输出设备。客户端计算机依赖服务器计算机获取资源,诸如文件、设备以及甚至处理能力。在本发明的一些实施方案中,服务器计算机处理所有数据库功能。客户端计算机可具有处理所有前端数据管理的软件,并且也可接收来自用户的数据输入。包括计算机可执行代码的机器可读介质可采取多种形式,包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储器介质包括例如光盘或磁盘,诸如任何计算机等中的任何存储设备,诸如可用于实施附图中所示的数据库等。易失性存储器介质包括动态存储器,诸如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆;铜线和光导纤维,包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可采用电或电磁信号、或声或光波的形式,诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。计算机可读介质的通常形式因此包括例如:软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其它磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡片、纸带、具有孔的图案的任何其它物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输这种载波的电缆或链路或者计算机可从中读取程序代码和/或数据的任何其它介质。许多这些形式的计算机可读介质可涉及运送一个或多个指令的一个或多个序列至处理器供执行。因此,本发明包括执行本文讨论的任何方法和存储和/或传输数据和/或其结果和/或其分析,以及来自执行本文讨论的任何方法的产物,包括中间体。
治疗剂
在一些实施方案中,含有一种或多种本文所述的肌肉特异性靶向部分的组合物(包括但不限于本文所述的工程化AAV衣壳、工程化病毒粒子、工程化细胞和/或其制剂)可作为一种或多种疾病的疗法经递送至有需要的受试者。在一些实施方案中,待治疗的疾病是基于遗传或表观遗传的疾病。在一些实施方案中,待治疗的疾病不是基于遗传或表观遗传的疾病。在一些实施方案中,含有一种或多种本文所述的肌肉特异性靶向部分的组合物(包括但不限于本文所述的工程化病毒衣壳、病毒粒子、工程化细胞和/或其制剂)的一种可作为疾病的治疗或预防(或作为治疗或预防的一部分)经递送至有需要的受试者。应理解,待通过递送本发明的组合物、制剂、细胞等来治疗和/或预防的特定疾病可取决于与本发明的组合物、制剂、细胞等偶联、附接、包含在其中或以其他方式与其缔合的货物。
可治疗的遗传疾病在本文别处更详细地讨论(参见例如下文关于基于基因修饰的疗法的讨论)。其他疾病包括但不限于以下中任一种:癌症、Acubetivacter感染、放线菌病、非洲昏睡病、AIDS/HIV、阿米巴病(ameobiasis)、无形体病、血管圆线虫病、异尖线虫病、炭疽、溶血弧菌感染、阿根廷出血热、蛔虫病、曲霉病、星状病毒感染、巴贝西虫病、细菌性脑膜炎、细菌性肺炎、细菌性阴道病、拟杆菌感染、小袋虫病、巴尔通体病、贝氏蛔虫感染(Baylisascaris infection)、BK病毒感染、黑色发结节病、芽细胞增多症(Blastocytosis)、芽生菌病、玻利维亚出血热、肉毒杆菌毒素中毒、巴西出血热、布鲁氏菌病、黑死病、伯克霍尔德菌感染、布鲁里溃疡、杯状病毒发明、弯曲杆菌病、念珠菌病、毛细线虫病、腐肉病(Carrion’s disease)、猫抓病(Cat-scratch disease)、蜂窝组织炎、美洲锥虫病、软下疳、水痘、基孔肯雅热、衣原体、肺炎衣原体、霍乱、着色芽生菌病、壶菌病、支睾吸虫病(Clonochiasis)、难辨梭菌结肠炎(Clostridium difficile colitis)、球孢子菌病、科罗拉多蜱传热、鼻病毒/冠状病毒感染(普通感冒)、克-雅二氏病(Cretzfeldt-Jakobdisease)、克里米亚-刚果出血热、隐球菌病、隐孢子虫病、皮肤幼虫移行症(CLM)、环孢子虫病、囊尾蚴病、巨细胞病毒感染、登革热、链带藻感染(Desmodesmus infection)、脆弱双核阿米巴病(Dientamoebiasis)、白喉、裂头绦虫病(diphylobothriasis)、麦地那龙线虫病、埃博拉、包虫病、埃里希体病、蛲虫病、肠球菌感染、肠道病毒感染、流行性斑疹伤寒、传染性红斑(Erthemia Infectisoum)、幼儿急疹、片形吸虫病、姜片虫病、致死性家族性失眠症、丝虫病(filarisis)、产气荚膜梭菌感染(Clostridium perfingens infection)、梭状杆菌属感染、气性坏疽(梭菌性肌坏死(clostridial myonecrosis))、地霉病、格斯特曼-斯特劳斯勒-申克综合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)、贾第鞭毛虫病(Giardasis)、鼻疽病、颚口线虫病、淋病、腹股沟肉芽肿、A组链球菌感染、B组链球菌感染、流感嗜血杆菌感染、手足口病、汉坦病毒肺综合征、哈特兰病毒病(heartland virusdisease)、幽门螺杆菌感染、肾综合征出血热、亨得拉病毒感染(Hendra virusinfection)、肝炎(所有A组、B组、C组、D组、E组)、单纯疱疹、组织胞浆菌病、钩虫感染、人博卡病毒感染、人伊氏埃里希体病(human ewingii ehrlichiosis)、人粒细胞无形体病、人偏肺病毒感染(human metapneymovirus infection)、人单核细胞埃里希体病、人乳头状瘤病毒、膜壳绦虫病、EB感染(Epstein-Barr infection)、单核细胞增多症、流感、埃瑟泊瑞斯病(isoporisis)、川崎病(Kawasaki disease)、金氏金杆菌感染(Kingell kingaeinfection)、苦鲁病、拉萨热(Lasas fever)、军团杆菌病(军团菌病(Legionnaire’sdisease)和波托马克热(Potomac Fever))、利什曼病、麻风病、钩端螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、淋巴丝虫病、淋巴细胞脉络丛脑膜炎、疟疾、马尔堡出血热、麻疹、中东呼吸综合征、类鼻疽、脑膜炎、脑膜炎球菌病、后殖吸虫病、微孢子虫病、传染性软疣、猴痘、流行性腮腺炎、鼠型斑疹伤寒、支原体肺炎、生殖支原体感染、足菌肿、蝇蛆病、结膜炎、尼帕病毒感染(Nipah virus infection)、诺如病毒、变异型克雅氏病(Variant Creutzfeldt-Jakobdisease)、诺卡氏菌病(Nocardosis)、盘尾丝虫病、后睾吸虫病、副球孢子菌病、肺吸虫病、巴氏杆菌病、头虱病(Pdiculosisi capitis)、体虱病(Pediculosis corpis)、阴虱病(Pediculosis pubis)、盆腔炎性疾病、百日咳、鼠疫、肺炎球菌感染、肺孢子菌肺炎、肺炎、脊髓灰质炎、普氏菌感染、原发性阿米巴脑膜炎(primary amoebic menigoencephalitis)、进行性多灶性脑白质病、鹦鹉热、Q热、狂犬病、回归热、呼吸道合胞病毒感染、鼻病毒感染、立克次体感染、立克次体痘、裂谷热、落基山斑疹热、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌病、SARS、疥疮、猩红热、血吸虫病(Schistosomiais)、败血症、志贺氏菌病、带状疱疹、天花、孢子丝菌病(Sporotrichosisi)、葡萄球菌感染(包括MRSA)、类圆线虫病、亚急性硬化性全脑炎(subacute sclerosing panecephalitis)、梅毒、绦虫病、破伤风、毛癣菌感染(Trichophyton species infection)、弓蛔虫病(Tocariasis)、弓形虫病、沙眼、旋毛虫病、鞭虫病、肺结核、土拉杆菌病、伤寒、斑疹伤寒、解脲脲原体感染、溪谷热、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、弧菌感染(Vibrio species infection)、病毒性肺炎、西尼罗河热(WestNile Fever)、白色毛结节菌病、假结核耶尔森菌、耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病、黄热病、玉米孢子菌(Zeaspora)、寨卡热、接合菌病及其组合。
可使用本发明的实施方案治疗的其他疾病和病症包括但不限于内分泌疾病(例如I型和II型糖尿病、妊娠糖尿病、低血糖症、胰高血糖素瘤、甲状腺肿、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺炎、甲状腺癌、甲状腺激素抵抗、甲状旁腺疾病、骨质疏松症、畸形性骨炎、佝偻病、骨软化症(ostomalacia)、垂体功能减退、垂体瘤等)、感染性和非感染性皮肤病、感染性或非感染性眼病、感染性或非感染性胃肠疾病、感染性或非感染性心血管疾病、感染性或非感染性脑和神经元疾病、感染性或非感染性神经系统疾病、感染性或非感染性肌肉疾病、感染性或非感染性骨疾病、感染性或非感染性生殖系统疾病、感染性或非感染性肾系统疾病、感染性或非感染性血液疾病、感染性或非感染性淋巴系统疾病、感染性或非感染性免疫系统疾病、感染性或非感染性精神疾病等。
在一些实施方案中,待治疗的疾病是肌肉或肌肉相关疾病或病症,诸如遗传性肌肉疾病或病症。
本领域技术人员将理解其他疾病和病症。
过继细胞疗法
一般来说,过继细胞转移涉及转移(自体的、同种异体的和/或异种的)细胞至受试者。在递送至受试者之前,所述细胞可或可不经修饰和/或以其他方式经操纵。
在一些实施方案中,如本文所述的工程化细胞可包括在过继细胞转移疗法中。在一些实施方案中,如本文所述的工程化细胞可经递送至有需要的受试者。在一些实施方案中,细胞可从受试者中分离、在体外进行操纵,使得其含有和/或能够生成含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分(包括但不限于工程化病毒粒子)的本发明的组合物,以产生工程化细胞并以自体方式递送回受试者或以同种异体或异种方式递送至不同的受试者。经分离、操纵和/或递送的细胞可是真核细胞。经分离、操纵和/或递送的细胞可是干细胞。经分离、操纵和/或递送的细胞可是分化细胞。经分离、操纵和/或递送的细胞可是免疫细胞、血细胞、内分泌细胞、肾细胞、外分泌细胞、神经系统细胞、血管细胞、肌细胞、泌尿系统细胞、骨细胞、软组织细胞、心脏细胞、神经元或表皮系统细胞。本领域普通技术人员将立即理解其他特定的细胞类型。
在一些实施方案中,可对分离的细胞进行操纵,使得其变成如本文别处描述的工程化细胞(例如含有和/或表达一种或多种本文别处描述的工程化递送系统分子或载体)。制造此类工程化细胞的方法在本文别处更详细地描述。
根据本发明的细胞或细胞群体的施用可以任何方便的方式(包括通过气溶胶吸入、注射、摄食、输液、植入或移植)进行。细胞或细胞群体可皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内或淋巴内注射或腹膜内施用至患者。在一个实施方案中,本发明的细胞组合物优选通过静脉注射施用。
细胞或细胞群体的施用可是或涉及施用104-109个细胞/kg体重,包括那些范围内的所有整数值的细胞数量。在一些实施方案中,递送105至106个细胞/kg。过继细胞疗法中的给药可例如涉及施用106至109个细胞/kg,伴有或不伴有淋巴清除(例如用环磷酰胺)过程。可以一剂或多剂施用细胞或细胞群体。在另一实施方案中,有效量的细胞作为单剂量施用。在另一实施方案中,有效量的细胞在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内,并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群体可从任何来源获得,诸如血库或供体。尽管个体需求不同,但确定给定细胞类型对特定疾病或病状的有效量的最佳范围在本领域技术人员的技能范围内。有效量意指提供治疗或预防益处的量。施用剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、同时治疗(如果有的话)的种类、治疗频率和所需效果的性质。
在另一实施方案中,有效量的细胞或包含那些细胞的组合物经胃肠外施用。施用可是静脉内施用。可通过在组织内注射直接进行施用。在一些实施方案中,组织可是肿瘤。
为了防止可能的不良反应,工程化细胞可配备有转基因的形式的转基因安全开关,其致使细胞易于暴露于特定信号。例如,单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因可以这种方式使用,例如通过引入与Greco,等人,Improving the safety of cell therapy with theTK-suicide gene.Front.Pharmacol.2015;6:95中所讨论类似的工程化细胞中。在此类细胞中,施用核苷前药诸如更昔洛韦或阿昔洛韦会导致细胞死亡。替代的安全开关构建体包括诱导型半胱天冬酶9,例如通过施用小分子二聚体来触发,所述二聚体将两个非功能性icasp9分子结合在一起以形成活性酶。已经描述了实施细胞增殖控制的多种替代方法(参见美国专利公开号20130071414;PCT专利公开WO2011146862;PCT专利公开WO2014011987;PCT专利公开WO2013040371;Zhou等人BLOOD,2014,123/25:3895–3905;Di Stasi等人,TheNew England Journal of Medicine 2011;365:1673-1683;Sadelain M,The New EnglandJournal of Medicine 2011;365:1735-173;Ramos等人,Stem Cells 28(6):1107-15(2010))。
修饰分离的细胞以获得具有所需性质的工程化细胞的方法在本文别处描述。在一些实施方案中,方法可包括基因组修饰,包括但不限于使用CRISPR-Cas系统进行基因组编辑以修饰细胞。这可是除了引入例如本文别处描述的工程化AAV衣壳系统分子之外。
同种异体细胞被宿主免疫系统迅速排斥。已经证明,未经辐照的血液制品中存在的同种异体白细胞将持续不超过5至6天(Boni,Muranski等人2008Blood 1;112(12):4746-54)。因此,为了防止同种异体细胞的排斥,宿主的免疫系统通常必须在一定程度上受到抑制。然而,在过继细胞转移的情况下,免疫抑制药物的使用也对引入的治疗细胞诸如本文所述的工程化细胞具有不利影响。因此,为了在这些情况下有效地使用过继免疫治疗方法,引入的细胞将需要对免疫抑制治疗具有抗性。因此,在特定实施方案中,本发明还包括修饰工程化细胞以使它们对免疫抑制剂具有抗性的步骤,优选通过使编码免疫抑制剂靶标的至少一种基因失活。免疫抑制剂是通过若干种作用机制之一抑制免疫功能的剂。免疫抑制剂可是但不限于钙调神经磷酸酶抑制剂、雷帕霉素靶标、白细胞介素-2受体α-链阻滞剂、肌苷一磷酸脱氢酶抑制剂、二氢叶酸还原酶抑制剂、皮质类固醇或免疫抑制抗代谢物。本发明允许通过使工程化细胞中的免疫抑制剂的靶标失活来赋予工程化细胞免疫抑制抗性以用于过继细胞疗法。作为非限制性实例,免疫抑制剂的靶标可是免疫抑制剂的受体诸如:CD52、糖皮质激素受体(GR)、FKBP家族基因成员和亲环蛋白家族基因成员。
免疫检查点是减缓或停止免疫反应并防止免疫细胞不受控制的活动造成过度组织损伤的抑制途径。在某些实施方案中,靶向的免疫检查点是程序性死亡-1(PD-1或CD279)基因(PDCD1)。在其他实施方案中,靶向的免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA-4)。在另外的实施方案中,靶向的免疫检查点是CD28和CTLA4 Ig超家族的另一成员,诸如BTLA、LAG3、ICOS、PDL1或KIR。在又另外的实施方案中,靶向的免疫检查点是TNFR超家族的成员,诸如CD40、OX40、CD137、GITR、CD27或TIM-3。
另外的免疫检查点包括含Src同源2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP-1)(WatsonHA,等人,SHP-1:the next checkpoint target for cancer immunotherapy?Biochem SocTrans.2016年4月15日;44(2):356-62)。SHP-1是一种广泛表达的抑制性蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)。在T细胞中,它是抗原依赖性活化和增殖的负调节剂。它是一种胞质蛋白,并且因此不适合抗体介导的疗法,但它在活化和增殖中的作用使其成为过继转移策略(诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞)中遗传操纵的有吸引力的靶标。免疫检查点还可包括具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT/Vstm3/WUCAM/VSIG9)和VISTA(Le Mercier I,等人,(2015)Beyond CTLA-4and PD-1,the generation Z of negative checkpointregulators.Front.Immunol.6:418)。
国际专利公开号WO2014172606涉及使用MT1和/或MT1抑制剂以增加损耗的CD8+T细胞的增殖和/或活性并且减少CD8+T细胞损耗(例如,减少功能损耗或无反应的CD8+免疫细胞)。在某些实施方案中,金属硫蛋白通过过继转移T细胞中的基因编辑被靶向。
在某些实施方案中,基因编辑的靶标可是至少一个参与免疫检查点蛋白表达的靶向的基因座。此类靶标可包括但不限于CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、ICOS(CD278)、PDL1、KIR、LAG3、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、LAIR1、SIGLEC7、SIGLEC9、CD244(2B4)、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT1、FOXP3、PRDM1、BATF、VISTA、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2、GUCY1B3、MT1、MT2、CD40、OX40、CD137、GITR、CD27、SHP-1或TIM-3。在一些实施方案中,靶向参与PD-1或CTLA-4基因表达的基因座。在一些实施方案中,靶向基因组合,诸如但不限于PD-1和TIGIT。
在一些实施方案中,编辑至少两个基因。基因对可包括但不限于PD1和TCRα、PD1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、Tim3和TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ。
无论是在工程化细胞(诸如工程化T细胞(例如分离的细胞是T细胞))的遗传修饰或其他修饰之前或之后,工程化细胞通常可使用如例如在以下中描述的方法来活化和扩增:美国专利6,352,694;6,534,055;6,905,680;5,858,358;6,887,466;6,905,681;7,144,575;7,232,566;7,175,843;5,883,223;6,905,874;6,797,514;6,867,041;和7,572,631。工程化细胞可在体外或体内扩增。
在一些实施方案中,方法包括通过本文别处描述的合适的基因修饰方法(例如通过CRISPR-Cas系统进行基因编辑)离体编辑工程化细胞以消除潜在的同种异体反应性TCR或其他受体以允许同种异体过继转移。在一些实施方案中,通过CRISPR-Cas系统或其他合适的基因组修饰技术离体编辑T细胞以敲除或敲低编码TCR(例如,αβTCR)或其他相关受体的内源基因以避免移植抗宿主病(GVHD)。在其中工程化细胞是T细胞的一些实施方案中,通过CRISPR或其他适当的基因修饰方法离体编辑工程化细胞以使TRAC基因座突变。在一些实施方案中,通过CRISPR-Cas系统使用一个或多个靶向TRAC的第一外显子的引导序列离体编辑T细胞。参见Liu等人,Cell Research27:154-157(2017)。在一些实施方案中,使用另一种适当的基因修饰方法修饰TRAC的第一外显子。在一些实施方案中,方法包括使用CRISPR或其他适当的方法将编码CAR或TCR的外源基因敲入TRAC基因座,同时敲除内源TCR(例如,用在CAR cDNA之后的编码自切割P2A肽的供体序列)。参见Eyquem等人,Nature 543:113-117(2017)。在一些实施方案中,外源基因包含可操作地插入内源TCR启动子下游的无启动子的CAR-编码或TCR-编码序列。
在一些实施方案中,方法包括通过CRISPR-Cas系统离体编辑工程化细胞例如工程化T细胞,以敲除或敲低编码HLA-I蛋白的内源基因,以最大限度减小编辑的细胞(例如工程化T细胞)的免疫原性。在一些实施方案中,可通过CRISPR-Cas系统离体编辑工程化T细胞以使β-2微球蛋白(B2M)基因座突变。在一些实施方案中,通过CRISPR-Cas系统使用一个或多个靶向B2M的第一外显子的引导序列离体编辑工程化细胞例如工程化T细胞。B2M的第一外显子也可使用另一适当的修饰方法进行修饰。参见Liu等人,Cell Research27:154-157(2017)。B2M的第一外显子也可使用本领域普通技术人员将理解的另一适当的修饰方法进行修饰。在一些实施方案中,方法包括使用CRISPR-Cas系统将编码CAR或TCR的外源基因敲入B2M基因座,同时敲除内源B2M(例如,用在CAR cDNA之后的编码自切割P2A肽的供体序列)。参见Eyquem等人,Nature 543:113-117(2017)。这也可使用本领域普通技术人员将理解的另一适当的修饰方法来完成。在一些实施方案中,外源基因包含可操作地插入内源B2M启动子下游的无启动子的CAR-编码或TCR-编码序列。
在一些实施方案中,方法包括通过CRISPR-Cas系统离体编辑工程化细胞例如工程化T细胞,以敲除或敲低编码外源CAR或TCR靶向的抗原的内源基因。这也可使用本领域普通技术人员将理解的另一适当的修饰方法来完成。在一些实施方案中,通过CRISPR-Cas系统离体编辑工程化细胞诸如工程化T细胞,以敲除或敲低选自以下的肿瘤抗原的表达:人端粒酶逆转录酶(hTERT)、存活素、小鼠双微体2同源物(mouse double minute 2homolog)(MDM2)、细胞色素P450 1B 1(CYP1B)、HER2/neu、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)基因1(WT1)、活素(livin)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、粘蛋白16(MUC16)、MUC1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、p53或细胞周期蛋白(DI)(参见WO2016/011210)。这也可使用本领域普通技术人员将理解的另一适当的修饰方法来完成。在一些实施方案中,通过CRISPR-Cas系统离体编辑工程化细胞诸如工程化T细胞,以敲除或敲低选自以下的抗原的表达:B细胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化剂和CAML相互作用物(TACI)、或B细胞活化因子受体(BAFF-R)、CD38、CD138、CS-1、CD33、CD26、CD30、CD53、CD92、CD100、CD148、CD150、CD200、CD261、CD262或CD362(参见WO2017/011804)。这也可使用本领域普通技术人员将理解的另一适当的修饰方法来完成。
基因驱动
本发明还考虑使用含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分以通过递送一种或多种货物多核苷酸来生成基因驱动的组合物、其制剂、其细胞、载体系统等,或者产生含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分(包括但不限于工程化AAV衣壳粒子)的具有一种或多种能够产生基因驱动的货物多核苷酸的组合物。在一些实施方案中,基因驱动可是Cas介导的RNA引导的基因驱动,例如Cas-以提供RNA引导的基因驱动,例如在类似于国际专利公开WO 2015/105928中描述的基因驱动的系统中。这种系统可提供改变真核生殖细胞的方法,例如通过将编码RNA引导的DNA核酸酶和一种或多种引导RNA的核酸序列引入生殖细胞中。引导RNA可经设计成与生殖细胞的基因组DNA上的一个或多个靶位置互补。编码RNA引导的DNA核酸酶的核酸序列和编码引导RNA的核酸序列可提供在侧翼序列之间的构建体上,其中启动子经排列使得生殖细胞可表达RNA引导的DNA核酸酶和引导RNA,以及也位于侧翼序列之间的任何所需货物编码序列。侧翼序列通常将包含与选定靶染色体上的对应序列相同的序列,以便侧翼序列与构建体编码的组分一起发挥作用以促进外来核酸构建体序列通过同源重组等机制插入在靶切割位点的基因组DNA中,以致使生殖细胞与外来核酸序列纯合。通过这种方式,基因驱动系统能够将所需货物基因渗入整个繁殖群体中(Gantz等人,2015,Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of themalaria vector mosquito Anopheles stephensi,PNAS 2015,提前出版2015年11月23日,doi:10.1073/pnas.1521077112;Esvelt等人,2014,Concerning RNA-guided gene drivesfor the alteration of wild populations eLife 2014;3:e03401)。在选定实施方案中,可选择在基因组中几乎没有潜在脱靶位点的靶序列。使用多个引导RNA靶向靶基因座内的多个位点可增加切割频率并阻碍驱动抗性等位基因的进化。截断的引导RNA可减少脱靶切割。可使用配对的切口酶代替单个核酸酶,以进一步提高特异性。基因驱动构建体(诸如基因驱动工程化递送系统构建体)可包含编码转录调节子的货物序列,例如以活化同源重组基因和/或抑制非同源末端连接。可在必需基因内挑选靶位点,因此非同源末端连接事件可导致致死性,而不是产生驱动抗性等位基因。基因驱动构建体可经工程改造以在一系列温度下在一系列宿主中发挥作用(Cho等人2013,Rapid and Tunable Control of ProteinStability in Caenorhabditis elegans Using a Small Molecule,PLoS ONE 8(8):e72393.doi:10.1371/journal.pone.0072393)。
移植和异种移植
含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分的组合物、其制剂、其细胞、载体系统等可用于递送货物多核苷酸和/或以其他方式参与修饰供两个不同的人之间(移植)或物种之间(异种移植)移植的组织。用于生成转基因动物的此类技术在本文别处描述。种间移植技术在本领域中通常是已知的。例如,RNA引导的DNA核酸酶可使用(通过)本文所述的本发明的工程化病毒粒子或其他递送媒介物、多核苷酸、载体和/或工程化细胞来递送并且可用于敲除、敲低或破坏供移植的器官(例如离体(例如在收获之后但在移植之前)或体内(在供体或受体中))、动物诸如转基因猪(诸如人血红素加氧酶-1转基因猪系)中的选定基因,例如通过破坏编码人免疫系统识别的表位的基因(即异种抗原基因)的表达。供破坏的候选猪基因可例如包括α(1,3)-半乳糖基转移酶和胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶基因(参见国际专利公开WO 2014/066505)。此外,编码内源逆转录病毒的基因可被破坏,例如编码所有猪内源逆转录病毒的基因(参见Yang等人,2015,Genome-wide inactivation of porcineendogenous retroviruses(PERVs),Science 27 November 2015:第350卷第6264期第1101页-1104页)。此外,RNA引导的DNA核酸酶可用于靶向用于整合异种移植供体动物中的另外的基因诸如人CD55基因的位点,以提高针对超急性排斥的保护。
在种间移植(诸如人对人)的情况下,含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分的组合物或含有肌肉特异性靶向部分的组合物(例如本文所述的工程化AAV衣壳系统分子、载体、工程化细胞和/或工程化递送粒子)可用于递送货物多核苷酸和/或以其他方式参与修饰待移植的组织。在一些实施方案中,修饰可包括修饰一种或多种HLA抗原或其他组织类型决定子,使得免疫原性谱与受体的免疫原性谱比与供体的更类似或相同,从而减少受体排斥的发生。相关组织类型决定子在本领域中是已知的(诸如用于确定器官匹配的那些),并且确定免疫原性谱(由组织类型决定子的表达特征组成)的技术在本领域中通常是已知的。
在一些实施方案中,供体(诸如在收获之前)或受体(在移植之后)可接受能够修饰移植的细胞、组织和/或器官的免疫原性谱的本文所述的含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分的组合物、其制剂、其细胞、载体系统、工程化肌肉特异性递送系统分子、载体、工程化细胞和/或工程化递送粒子中的一种或多种。在一些实施方案中,移植的细胞、组织和/或器官可从供体收获并且能够修饰例如当移植到受体中时免疫原性较低或被修饰为具有一些特定特性的收获的细胞、组织和/或器官的本文所述的含有本文别处描述的肌肉特异性靶向部分的组合物、其制剂、其细胞、载体系统、工程化肌肉特异性递送系统分子、载体、工程化细胞和/或工程化递送粒子可经离体递送至收获的细胞、组织和/或器官。在递送之后,细胞、组织和/或器官可经移植到供体内。
基因修饰和治疗遗传或表观遗传方面的疾病
含有肌肉特异性靶向部分的本文所述的工程化肌肉特异性递送系统分子、载体、工程化细胞和/或工程化递送粒子可用于修饰基因或其他多核苷酸和/或治疗遗传和/或表观遗传方面的疾病。如本文别处描述,货物分子可是可经递送至细胞并且在一些实施方案中可整合到细胞基因组中的多核苷酸。在一些实施方案中,货物分子可是一种或多种CRISPR-Cas系统组分。在一些实施方案中,当通过本发明的组合物或其制剂诸如本文描述的工程化肌肉特异性病毒粒子或其他工程化递送媒介物递送时,CRISPR-Cas组分可任选在受体细胞中表达并发挥作用,以以序列特定性方式修饰受体细胞的基因组。在一些实施方案中,可由本文所述的工程化病毒粒子或其他工程化递送媒介物和/或组合物包装和递送的货物分子可通过不依赖CRISPR-Cas的方法促进/介导基因组修饰。此类非CRISPR-Cas基因组修饰系统将立即被本领域普通技术人员理解并且也至少部分地在本文别处描述。在一些实施方案中,修饰是在特定的靶序列处。在其他实施方案中,修饰是在整个基因组中随机的位置处。
疾病相关基因和多核苷酸以及疾病特异性信息的实例可从以下中获得:McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine,Johns Hopkins University(Baltimore,Md.)和National Center for Biotechnology Information,NationalLibrary of Medicine(Bethesda,Md.)(可在万维网上获得)。这些中的任一种都适合通过本文所述的方法中的一种或多种来治疗。在一些实施方案中,疾病是肌肉疾病或病症、神经肌肉疾病或病症或者心肌病。在一些实施方案中,疾病或病症选自以下中的任一种或多种:
(a)自身免疫疾病;
(b)癌症;
(c)肌营养不良;
(d)神经肌肉疾病;
(e)糖或糖原贮积病;
(f)扩增重复疾病;
(g)显性负效应疾病;
(h)心肌病;
(i)病毒性疾病;
(j)早衰病;或
(k)其任何组合。
在一些实施方案中,扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。在一些实施方案中,肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。在一些实施方案中,强直性肌营养不良是1型或2型。在一些实施方案中,LGMD是2A亚型、2B亚型、2C亚型、2D亚型、2E亚型或2L亚型。在一些实施方案中,心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、DMD相关心肌病或达农病。在一些实施方案中,糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。在一些实施方案中,MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。在一些实施方案中,神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
更具体地说,这些基因和途径中的突变可导致产生影响功能的不适当的蛋白质或不适当数量的蛋白质。基因、疾病和蛋白质的其他实例通过从2012年12月12日提交的美国临时申请61/736,527中引用并入本文。此类基因、蛋白质和途径可是本发明的CRISPR复合物的靶多核苷酸。疾病相关和/或细胞功能相关基因和多核苷酸的实例列于表A和表B中。
因此,本文还描述了在如本文所讨论的真核或原核细胞(体外,即在分离的真核细胞中)中诱导一种或多种突变的方法,所述方法包括将如本文所述的载体递送至细胞。突变可包括在细胞的靶序列处引入、删除或取代一个或多个核苷酸。在一些实施方案中,突变可包括在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代1-75个核苷酸。突变可包括在每个靶序列处引入、删除或取代1、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸。突变可包括在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸。突变可包括在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸。突变可包括在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或75个核苷酸。突变可包括在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代40、45、50、75、100、200、300、400或500个核苷酸。突变可包括在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800或9900至10000个核苷酸。
在一些实施方案中,修饰可包括通过核酸组分(例如,引导RNA或sgRNA)在所述细胞的每个靶序列处引入、删除或取代核苷酸,诸如由CRISPR-Cas系统介导的那些。
在一些实施方案中,修饰可包括通过非CRISPR-Cas系统或技术在所述细胞的靶序列或随机序列处引入、删除或取代核苷酸。此类技术在本文别处讨论,诸如在讨论工程化细胞和生成工程化细胞和生物体的方法的地方。
为了在使用CRISPR-Cas系统时最大限度地减小毒性和脱靶效应,控制递送的CasmRNA和引导RNA的浓度可能很重要。可通过在细胞或非人真核动物模型中测试不同浓度并使用深度测序分析潜在脱靶基因组位点的修饰程度来确定Cas mRNA和引导RNA的最佳浓度。替代地,为了最大限度地减小毒性和脱靶效应水平,Cas切口酶mRNA(例如具有D10A突变的化脓性链球菌Cas9样)可与一对靶向感兴趣的位点的引导RNA一起经递送。最大限度地减小毒性和脱靶效应的引导序列和策略可与WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)中一样;或者可通过如本文中的突变。
通常,在内源CRISPR系统的情况下,CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对内)的一条或两条链的切割。不希望受理论束缚,可包含野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)或由其组成的tracr序列也可形成CRISPR复合物的一部分,诸如通过沿着tracr序列的至少一部分与tracr伴侣序列的全部或部分杂交,所述tracr伴侣序列与引导序列可操作地连接。
在一个实施方案中,本发明提供了一种在真核细胞中修饰靶多核苷酸的方法。在一些实施方案中,方法包括递送具有作为货物分子的CRISPR-Cas分子的本文所述的工程化细胞和/或本文所述的工程化AAV衣壳粒子至受试者和/或细胞。递送的CRISPR-Cas系统分子可与靶多核苷酸复合以结合(例如以实现所述靶多核苷酸的切割),从而修饰靶多核苷酸,其中所述CRISPR复合物包含与引导序列复合的CRISPR酶,所述引导序列与所述靶多核苷酸内的靶序列杂交,其中所述引导序列可与tracr伴侣序列连接,所述tracr伴侣序列又与tracr序列杂交。在一些实施方案中,所述切割包括通过所述CRISPR酶在靶序列的位置处切割一条或两条链。在一些实施方案中,所述切割导致靶基因的转录减少。在一些实施方案中,方法还包括通过与外源模板多核苷酸同源重组来修复所述切割的靶多核苷酸,其中所述修复导致突变,其包括所述靶多核苷酸的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代。在一些实施方案中,所述突变导致由包含靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸变化。在一些实施方案中,方法还包括将一种或多种载体递送至所述真核细胞,其中一种或多种载体包含CRISPR酶并且一种或多种载体驱动以下中的一种或多种的表达:与tracr伴侣序列连接的引导序列,和tracr序列。在一些实施方案中,所述CRISPR酶驱动以下中的一种或多种的表达:与tracr伴侣序列连接的引导序列,和tracr序列。在一些实施方案中,这种CRISPR酶经递送至受试者中的真核细胞。在一些实施方案中,所述修饰发生在细胞培养物中的所述真核细胞中。在一些实施方案中,方法还包括在所述修饰之前从受试者中分离所述真核细胞。在一些实施方案中,方法还包括返回所述真核细胞和/或由其衍生的细胞至所述受试者。在一些实施方案中,可在将一种或多种工程化病毒粒子或其他工程化递送媒介物递送至分离的细胞之后将分离的细胞返回至受试者。在一些实施方案中,可在将一种或多种本文所述的工程化递送系统的分子递送至分离的细胞之后将分离的细胞返回至受试者,从而如前所述使分离的细胞成为工程化细胞。
筛选和细胞选择
本文所述的工程化肌肉特异性递送系统载体、工程化细胞、工程化病毒粒子和/或工程化肌肉特异性递送系统可用于筛选测定和/或细胞选择测定。本发明的工程化递送系统载体、工程化细胞和/或工程化病毒粒子和/或其他工程化递送系统可经递送至受试者和/或细胞。在一些实施方案中,细胞是真核细胞。细胞可是体外的、离体的、原位的或体内的。本文所述的工程化递送系统分子、递送媒介物、载体、工程化细胞和/或工程化病毒粒子可将外源分子或化合物引入它们所递送到的受试者或细胞。可检测外源分子或化合物的存在,这可允许鉴定细胞和/或其属性。在一些实施方案中,递送的分子或粒子可赋予基因或其他核苷酸修饰(例如突变、基因或多核苷酸插入和/或删除等)。在一些实施方案中,可通过测序在细胞中检测核苷酸修饰。在一些实施方案中,核苷酸修饰可导致对细胞的生理学和/或生物学修饰,这导致细胞中可检测的表型变化,这可允许对细胞进行检测、鉴定和/或选择。在一些实施方案中,表型变化可是细胞死亡,诸如其中CRISPR复合物与靶多核苷酸的结合导致细胞死亡的实施方案。本发明的实施方案允许选择特定细胞而不需要选择标记或可包括反选择系统的两步过程。细胞可是原核细胞或真核细胞。
在一个实施方案中,本发明提供了一种通过在一种或多种细胞中的基因中引入一种或多种突变来选择一种或多种细胞的方法,所述方法包括:将可包含一种或多种本文别处描述的工程化递送系统分子或载体的一种或多种载体引入细胞,其中所述一种或多种载体可包含CRISPR酶和/或驱动以下中的一者或多者的表达:与tracr伴侣序列、tracr序列和编辑模板连接的引导序列;或待插入细胞和/或其基因组的其他多核苷酸;其中,例如正在表达的在CRISPR酶内并由CRISPR酶在体内表达以及/或者编辑模板当包括在内时,包含一种或多种消除CRISPR酶切割的突变;允许编辑模板与待选择的细胞中的靶多核苷酸同源重组;允许CRISPR复合物与靶多核苷酸结合以实现所述基因内的靶多核苷酸的切割,其中CRISPR复合物包含与以下复合的CRISPR酶:(1)与靶多核苷酸内的靶序列杂交的引导序列以及(2)与tracr序列杂交的tracr伴侣序列,其中CRISPR复合物与靶多核苷酸的结合诱导细胞死亡,从而允许选择其中已引入一种或多种突变的一种或多种细胞。在优选实施方案中,CRISPR酶是Cas蛋白。在本发明的另一实施方案中,待选择的细胞可是真核细胞。
涉及工程化AAV衣壳系统分子、载体、工程化细胞和/或工程化AAV衣壳粒子的筛选方法(包括但不限于将一种或多种CRISPR-Cas系统分子递送至细胞的那些)可用于荧光原位杂交(FISH)等检测方法。在一些实施方案中,包含催化失活Cas蛋白的工程化CRISPR-Cas系统的一种或多种组分可通过包含本文别处描述的工程化肌肉特异性靶向部分的工程化递送系统分子(诸如工程化病毒粒子或其他工程化递送媒介物)、工程化细胞或其他组合物经递送至细胞并且可用于FISH方法。CRISPR-Cas系统可包含失活的Cas蛋白(dCas)(例如dCas9),其缺乏产生DNA双链断裂的能力,所述蛋白可与标记诸如荧光蛋白诸如增强型绿色荧光蛋白(eEGFP)融合并与小引导RNA共表达,以在体内靶向中心周围、中心和远距重复。dCas系统可用于可视化人类基因组中的重复序列和单个基因两者。标记的dCas、dCasCRISPR-Cas系统、工程化AAV递送系统分子、工程化细胞和/或工程化递送粒子(病毒或非病毒)的此类新应用可用于使细胞成像和研究功能性核结构,尤其是在具有小核体积或复杂3-D结构的情况下。(Chen B,Gilbert LA,Cimini BA,Schnitzbauer J,Zhang W,Li GW,Park J,Blackburn EH,Weissman JS,Qi LS,Huang B.2013.Dynamic imaging of genomicloci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.Cell 155(7):1479-91.doi:10.1016/j.cell.2013.12.001.,所述文献的教义可应用和/或适用于本文所述的CRISPR系统。类似的方法涉及:与标记(例如荧光标记)融合的多核苷酸可通过本文所述的工程化AAV衣壳系统分子、载体、工程化细胞和/或工程化AAV衣壳粒子经递送至细胞并整合到细胞基因组中和/或以其他方式与细胞基因组区域相互作用以进行FISH分析。
研究其他细胞器和其他细胞结构的类似方法可通过将一种或多种与标记(诸如荧光标记)融合的分子(例如,通过本文所述的工程化递送AAV衣壳分子、工程化细胞和/或工程化AAV衣壳粒子)递送至细胞来完成,其中与标记融合的分子能够靶向一种或多种细胞结构。通过分析标记的存在,可鉴别特定细胞结构和/或使其成像。
在一些实施方案中,工程化肌肉特异性递送系统分子可用于细胞内部或外部的筛选测定。在一些实施方案中,筛选测定可包括通过本发明的工程化肌肉特异性递送粒子递送CRISPR-Cas货物分子。
本发明还提供了本系统在筛选中的用途,例如功能筛选的增益。人为强制过度表达基因的细胞能够随着时间的推移(例如通过负反馈回路)下调基因(重新建立平衡)。到筛选开始时,未调节的基因可能会再次减少。其他筛选测定在本文别处讨论。
在一实施方案中,本发明提供了来自体外递送方法的细胞或体外递送方法的细胞,其中所述方法包括使递送系统与细胞(任选真核细胞)接触(由此递送系统的成分递送到细胞中)、以及任选从接触中获取数据或结果、以及传输数据或结果。
在一实施方案中,本发明提供了来自体外递送方法的细胞或体外递送方法的细胞,其中所述方法包括使递送系统与细胞(任选真核细胞)接触(由此递送系统的成分递送到细胞中)、以及任选从接触中获取数据或结果、以及传输数据或结果;并且其中所述细胞产物与未与所述递送系统接触的细胞相比发生了改变,例如从如果不接触所述细胞将是野生型的细胞产物发生改变。在一实施方案中,细胞产物是非人类或动物的。在一些实施方案中,细胞产物是人的。
在一些实施方案中,宿主细胞用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。在一些实施方案中,细胞被转染,因为它天然存在于任选被重新引入其中的受试者中。在一些实施方案中,被转染的细胞取自受试者。在一些实施方案中,细胞获得自或衍生自取自受试者的细胞,诸如细胞系。本文别处描述了工程化肌肉特异性递送系统及其粒子的递送机制和技术。
在一些实施方案中,设想将工程化肌肉特异性递送系统分子直接引入宿主细胞。例如,工程化肌肉特异性递送系统分子可与一种或多种货物分子一起经递送,所述货物分子被包装到工程化肌肉特异性病毒粒子中或者包含在非病毒工程化肌肉特异性递送粒子中或与其偶联。
在一些实施方案中,本发明提供了一种在细胞中表达待包装到工程化病毒粒子(诸如工程化肌肉特异性AAV粒子)中的工程化递送分子和货物分子的方法,所述方法可包括引入根据本文公开的任何载体递送系统的载体的步骤。
本发明在以下实施例中进一步描述,这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1–基于mRNA的检测方法对于AAV变体的选择更为严格。
图1证明了导致产生mRNA的腺相关病毒(AAV)转导机制。如图1中所证明:AAV粒子对细胞的功能性转导可导致产生mRNA链。尽管使用基于DNA的测定可检测到病毒基因组,但非功能性转导不会产生这种产物。因此,通过例如AAV检测转导的基于mRNA的检测测定可更严格,并就能够在功能上转导细胞的病毒粒子的功能提供反馈。图2示出了可证明基于mRNA的AAV变体选择可比基于DNA的选择更严格的图表。病毒库在CMV启动子的控制下经表达。
实施例2–基于mRNA的检测方法可用于根据衣壳变体库检测AAV衣壳变体
图3A-图3B示出了可证明病毒库与肝脏中的载体基因组DNA(图3A)和mRNA(图3B)之间的相关性的图表。图4A-图4F示出了可证明在不同组织中鉴定的以mRNA水平表达的衣壳变体的图表。
实施例3–衣壳mRNA表达可由组织特异性启动子驱动
图5A-图5C示出了可证明在细胞类型特异性启动子控制下的不同组织中的衣壳mRNA表达(如x轴上所指出的)的图表。CMV包括为示例性组成型启动子。CK8是肌肉特异性启动子。MHCK7是肌肉特异性启动子。hSyn是神经元特异性启动子。
实施例4–衣壳变体库生成、变体筛选和变体鉴定
一般地,AAV衣壳库可通过表达各自含有先前在适当AAV生产细胞系中描述的工程化AAV衣壳多核苷酸的工程化衣壳载体来生成。参见例如图8。这可生成AAV衣壳库,其可再多含有一个所需细胞特异性工程化AAV衣壳变体。图7示出了证明生成AAV衣壳变体库、特别是将随机n-mer(n=3-15个氨基酸)插入野生型AAV例如AAV9的实施方案的示意图。在此实施例中,随机7-mer被插入到AAV9病毒蛋白可变区VIII的aa588-589之间,并用于形成含有每个载体一个变体的载体的病毒基因组。如图8所示,衣壳变体载体库用于生成AAV粒子,其中每个衣壳变体将其编码序列封装为载体基因组。图9示出了代表性AAV衣壳质粒库载体的载体图谱(参见例如图8),所述图谱可用于AAV载体系统以生成AAV衣壳变体库。所述库可用在组织特异性启动子或组成型启动子控制下的衣壳变体多核苷酸生成。所述库也用包含多腺苷酸化信号的衣壳变体多核苷酸制成。
如图6所示,AAV衣壳库可经施用于各种非人动物,以进行第一轮基于mRNA的选择。如图1所示,AAV和相关载体的转导过程可导致产生反映转导细胞的病毒基因组的mRNA分子。如至少在本文的实施例中所证明的,对于确定病毒粒子能够在功能上转导细胞,基于mRNA的选择可更具特异性和有效性,因为是基于产生的功能性产物而不是仅仅通过测量病毒DNA的存在来检测病毒粒子的存在。
在第一轮施用之后,具有所需衣壳变体的一个或多个工程化AAV病毒粒子可接着用于形成经筛选的AAV衣壳库。可通过测量衣壳变体的mRNA表达并确定与非所需细胞类型相比哪些变体在所需细胞类型中高度表达来鉴定所需AAV病毒粒子。那些在所需细胞、组织和/或器官类型中高度表达的变体是所需AAV衣壳变体粒子。在一些实施方案中,编码AAV衣壳变体的多核苷酸在组织特异性启动子的控制下,所述启动子在所需细胞、组织或器官中具有选择性活性。
第一轮鉴定的工程化AAV衣壳变体粒子可接着经施用于各种非人动物。在一些实施方案中,用于第二轮选择和鉴定的动物与用于第一轮选择和鉴定的那些动物不同。与第1轮类似,在施用在所需细胞、组织和/或器官类型中的顶部表达变体之后,可通过测量细胞中的病毒mRNA表达来鉴定。在第二轮之后鉴定的顶部变体可接着任选经条形码化并任选经合并。在一些实施方案中,来自第二轮的顶部变体可接着经施用于非人灵长类动物以鉴定顶部细胞特异性变体,特别是如果顶部变体最终用于人类。每一轮的施用可是全身的。
图10示出了可证明由使用不同启动子生成的库产生的病毒滴度(按AAV9载体基因组/15cm培养皿来计算)的图表。如图10所证明,使用不同启动子对病毒滴度没有显著影响。
图11A-图11F示出了可证明在使用在MHCK7肌肉特异性启动子的控制下表达的衣壳库在C57BL/6小鼠中进行第一轮选择之后获得的结果的图表。
图12A-图12D示出了可证明在C57BL/6小鼠中进行第二轮选择之后获得的结果的图表。
图13A-图13B示出了可证明由同义密码子编码的变体的丰度之间的相关性的图表。此图表可证明病毒库和功能性病毒粒子两者中几乎不存在密码子偏倚。
图14示出了可证明在两种不同肌肉特异性启动子(MHCK7和CK8)控制下表达的相同变体的丰度之间的相关性的图表。此图表可证明使用哪种组织特异性启动子来生成衣壳变体库几乎没有影响,至少对于肌细胞是这样。
实施例5-肌肉趋向性rAAV衣壳
图15示出了可证明产生具有与野生型AAV9衣壳类似的滴度的rAAV的肌肉趋向性衣壳变体的图表。
图16示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图17示出了一组可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图18示出了一组可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图19示出了选择用于跨物种肌肉定向基因递送的有效衣壳变体的示意图。
图20A-图20C示出了可证明在不同的小鼠品系中进行的选择确定了与顶部肌肉趋向性相同的变体的表格。
实施例6-MyoAAV与AAV9和AAV8的比较
如先前讨论,图17可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较。
图21示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠肌肉转导的比较的图像。
图22示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的小鼠组织转导的比较的图像。
图23示出了可证明rAAV9-GFP与rMyoAAV-GFP之间的载体基因组生物分布的比较的图表。
图24A-图24B示出了可证明与AAV9和AAV8相比MyoAAV在肌肉中的体内基因表达动力学更快的图像。
图25可证明通过MyoAAV-CRISPR或AAV9-CRISPR校正模型mdx小鼠中的DMD突变的机制。
图26A-图26C可证明与AAV9-CRISPR相比用MyoAAV-CRISPR校正模型mdx小鼠中的DMD突变。
图27可证明MyoAAV使用整合素异二聚体作为受体以进入细胞。
图28示出了可证明myoAAV可比AAV9更有效地转导小鼠和人原代肌管两者的图表。
图29A-图29B可证明整合素αV小分子抑制剂抑制MyoAAV对人和小鼠原代肌管的转导。
实施例7-非人灵长类动物中的顶部n-mer基序。
使用肌肉特异性启动子开发肌肉特异性AAV衣壳,并且如本文别处和/或以下中所述在非人灵长类动物中筛选所得衣壳库:美国临时申请序列号62/899,453、62/916,207、63/018,454、63/055,252和62/916,221以及国际申请号PCT/US20/50534。表8和表9示出了肌肉特异性n-mer基序的顶部及其在每个表内的排序顺序的编码序列。
使用来自两种不同肌肉特异性启动子的表达开发肌肉特异性AAV衣壳,并且如本文别处和/或在以下中所述在非人灵长类动物中针对每种启动子筛选所得衣壳库:美国临时申请序列号62/899,453、62/916,207、63/018,454、63/055,252和62/916,221以及国际申请号PCT/US20/50534。
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本发明的所描述的方法、药物组合物和药盒的各种修改和变化对于本领域技术人员将显而易见而不背离本发明的范围和精神。尽管已经结合具体实施方案描述了本发明,但是应理解,它能够进行进一步的修改,并且所要求保护的本发明不应被不适当地限制于这些具体实施方案。事实上,对本领域技术人员来说显而易见的用于实施本发明的所描述模式的各种修改旨在落入本发明的范围内。本申请旨在涵盖本发明的任何变化、使用或改编,一般而言,遵循本发明的原理并且包括属于本发明所属领域内的已知习惯实践的本公开的此类背离,并且可是适用于本文之前阐述的基本特征。
Claims (87)
1.一种组合物,其包含:
有效靶向肌细胞的靶向部分,其中所述靶向部分包含n-mer基序;以及
货物,其中所述货物与所述靶向部分偶联或以其他方式缔合。
2.如权利要求1所述的组合物,其中所述n-mer基序包含RGD基序或非RGD n-mer基序。
3.如权利要求2所述的组合物,其中所述RGD基序具有式XmRGDXn,其中m为0-4个氨基酸,其中n为0-15个氨基酸,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
4.如权利要求3所述的组合物,其中所述RGD基序具有式RGDXn,其中n为4或5,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
5.如权利要求2所述的组合物,其中所述n-mer基序是SEQ ID NO:13-50、1277-2493、3737-4979、6647-8313、8314-8502或8692-8889中任一者。
6.如权利要求1所述的组合物,其中所述靶向部分包含多肽、多核苷酸、脂质、聚合物、糖或其组合。
7.如权利要求1所述的组合物,其中所述靶向部分包含病毒蛋白。
8.如权利要求7所述的组合物,其中所述病毒蛋白是衣壳蛋白。
9.如权利要求7所述的组合物,其中所述病毒蛋白是腺相关病毒(AAV)蛋白。
10.如权利要求7所述的组合物,其中所述n-mer基序位于所述病毒蛋白的两个氨基酸之间,使得所述n-mer基序在病毒衣壳的外部,所述病毒衣壳蛋白是所述病毒衣壳的一部分。
11.如权利要求10所述的组合物,其中所述n-mer基序插入在AAV9衣壳多肽中或在AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸262-269之间、327-332之间、382-386之间、452-460之间、488-505之间、527-539之间、545-558之间、581-593之间、704-714之间或其任何组合的任何两个连续氨基酸之间。
12.如权利要求11所述的组合物,其中所述n-mer基序插入在AAV9衣壳多肽中或在AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸588与589之间。
13.如权利要求1所述的组合物,其中所述组合物是工程化病毒粒子。
14.如权利要求13所述的组合物,其中所述工程化病毒粒子是工程化AAV病毒粒子。
15.如权利要求14所述的组合物,其中所述工程化AAV病毒粒子是工程化AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74或AAV rh.10病毒粒子。
16.如权利要求1所述的组合物,其中所述货物能够治疗或预防肌肉疾病或病症。
17.如权利要求16所述的组合物,其中所述肌肉疾病或病症为
a.自身免疫疾病;
b.癌症;
c.肌营养不良;
d.神经肌肉疾病;
e.糖或糖原贮积病;
f.扩增重复疾病;
g.显性负效应疾病;
h.心肌病;
i.病毒性疾病;
j.早衰病;或
k.其任何组合。
18.如权利要求1所述的组合物,其中所述货物为
a.吗啉代;
b.肽连接的吗啉代;
c.反义寡核苷酸;
d.治疗性转基因PMO;
e.编码治疗性多肽或肽的多核苷酸;
f.PPMO;
g.一种或多种肽或多肽;
h.一种或多种编码CRISPR-Cas蛋白、引导RNA或两者的多核苷酸;
i.核糖核蛋白,其中所述核糖核蛋白包含CRISPR-Cas系统分子;
j.治疗性转基因RNA或其他基因修饰或治疗性RNA和/或蛋白质;或
k.其任何组合。
19.如权利要求1所述的组合物,其中所述货物能够诱导基因中的外显子跳跃。
20.如权利要求1所述的组合物,其中所述货物能够诱导肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃。
21.如权利要求1所述的组合物,其中所述货物为小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因。
22.如权利要求21所述的组合物,其中所述小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复1、1'、2、3、16、17、20、21、22、23、24或其任何组合,以及任选nNOS结构域、肌动蛋白结合结构域、一个或多个铰链区、肌营养不良蛋白聚糖结合结构域或其任何组合。
23.如权利要求1所述的组合物,其中所述货物与肌肉特异性启动子可操作地偶联。
24.如权利要求17所述的组合物,其中所述扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
25.如权利要求17所述的组合物,其中所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。
26.如权利要求25所述的组合物,其中所述强直性肌营养不良是1型或2型强直性肌营养不良。
27.如权利要求17所述的组合物,其中所述心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、杜兴氏肌营养不良相关心肌病或达农病。
28.如权利要求17所述的组合物,其中所述糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。
29.如权利要求28所述的组合物,其中所述MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。
30.如权利要求17所述的组合物,其中所述神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
31.如权利要求1所述的组合物,其中所述组合物具有增加的肌细胞效能、肌细胞特异性、降低的免疫原性或其任何组合。
32.一种载体系统,其包含:
载体,其包含:
一个或多个多核苷酸,其各自编码一个或多个有效靶向肌细胞的靶向部分的全部或部分,其中每个靶向部分包含一个或多个n-mer基序,其中每个n-mer基序RGD基序或非RGD n-mer基序,并且其中每个多核苷酸至少编码所述一个或多个n-mer基序中的一个或多个;以及
任选地,调节元件,其与所述一个或多个多核苷酸中的一个或多个可操作地偶联。
33.如权利要求32所述的载体系统,其中所述RGD基序具有式XmRGDXn,其中m为0-4个氨基酸,其中n为0-15个氨基酸,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
34.如权利要求33所述的载体系统,其中所述RGD基序具有式RGDXn,其中n为4或5,其中X为任何氨基酸,并且其中存在的每个X氨基酸独立地彼此不同的选自由任何氨基酸组成的组。
35.如权利要求33所述的载体系统,其中所述n-mer基序是SEQ ID NO:13-50、1277-2493、3737-4979、6647-8313、8314-8502或8692-8889中任一者。
36.如权利要求32所述的载体系统,其还包含货物。
37.如权利要求36所述的载体系统,其中所述货物是货物多核苷酸并且任选与编码所述靶向部分、所述调节元件或两者的所述一个或多个多核苷酸中的一个或多个偶联。
38.如权利要求36所述的载体系统,其中所述货物多核苷酸与编码所述靶向部分的所述一个或多个多核苷酸存在于相同的载体或不同的载体上。
39.如权利要求36所述的载体系统,其中所述载体系统能够产生含有所述货物的病毒粒子。
40.如权利要求32所述的载体系统,其中所述载体系统能够产生包含一个或多个所述靶向部分的病毒衣壳多肽。
41.如权利要求32所述的载体系统,其中所述载体系统能够产生AAV病毒粒子。
42.如权利要求41中任一项所述的载体系统,其中AAV病毒粒子是工程化AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74或AAV rh.10病毒粒子。
43.如权利要求40所述的载体系统,其中所述衣壳多肽是工程化AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh.74、AAV rh.10衣壳多肽。
44.如权利要求39所述的载体系统,其中将编码所述一个或多个n-mer基序的所述一个或多个多核苷酸中的至少一个插入在对应于所述病毒蛋白的两个氨基酸的两个密码子之间,使得所述n-mer基序中的至少一个在所述病毒衣壳的外部。
45.如权利要求44所述的载体系统,其中所述两个密码子对应于AAV9衣壳多肽中或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸262-269之间、327-332之间、382-386之间、452-460之间、488-505之间、527-539之间、545-558之间、581-593之间、704-714之间或其任何组合的任何两个连续氨基酸。
46.如权利要求45所述的载体系统,其中所述两个密码子对应于AAV9衣壳多核苷酸中或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV rh.74或AAV rh.10衣壳多肽中的类似位置中的氨基酸588和589。
47.如权利要求32中任一项所述的载体系统,其中包含各自编码一个或多个靶向部分的全部或部分的所述一个或多个多核苷酸的所述载体不包含剪接调节元件。
48.如权利要求32所述的载体系统,其还包含编码病毒rep蛋白的多核苷酸。
49.如权利要求48所述的载体系统,其中所述病毒rep蛋白是AAV rep蛋白。
50.如权利要求48所述的载体系统,其中编码所述病毒rep蛋白的所述多核苷酸与各自编码一个或多个靶向部分的全部或部分的所述一个或多个多核苷酸在相同的载体或不同的载体上。
51.如权利要求48所述的载体系统,其中所述病毒rep蛋白与调节元件可操作地偶联。
52.一种多肽,其通过表达如权利要求32-51中任一项中的载体系统产生。
53.如权利要求52所述的多肽,其中所述多肽是病毒多肽。
54.如权利要求53所述的多肽,其中所述病毒多肽是AAV多肽。
55.一种粒子,其通过表达如权利要求32-51中任一项中的载体系统产生。
56.如权利要求55所述的粒子,其中所述粒子是病毒粒子。
57.如权利要求56所述的粒子,其中所述病毒粒子是腺相关病毒(AAV)粒子。
58.如权利要求56所述的粒子,其中所述病毒粒子具有肌肉特异性趋向性。
59.如权利要求36-51中任一项所述的载体系统、如权利要求52-54中任一项中的多肽或如权利要求55-58中任一项中的粒子,其中所述货物能够治疗或预防肌肉疾病或病症。
60.如权利要求59所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述肌肉疾病或病症是
a.自身免疫疾病;
b.癌症;
c.肌营养不良;
d.神经肌肉疾病;
e.糖或糖原贮积病;
f.扩增重复疾病;
g.显性负效应疾病;
h.心肌病;
i.病毒性疾病;
j.早衰病;或
k.其任何组合。
61.如权利要求60所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述货物是吗啉代;
a.肽连接的吗啉代;
b.反义寡核苷酸;
c.治疗性转基因PMO;
d.编码治疗性多肽或肽的多核苷酸;
e.PPMO;
f.一种或多种肽或多肽;
g.一种或多种编码CRISPR-Cas蛋白、引导RNA或两者的多核苷酸;
h.核糖核蛋白,其中所述核糖核蛋白包含CRISPR-Cas系统分子;
i.治疗性转基因RNA或其他基因修饰或治疗性RNA和/或蛋白质;或
j.其任何组合。
62.如权利要求59所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述货物能够诱导基因中的外显子跳跃。
63.如权利要求59所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述货物能够诱导肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃。
64.如权利要求59所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述货物是小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因。
65.如权利要求64所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述小肌营养不良蛋白基因或微肌营养不良蛋白基因包含血影蛋白样重复1、1'、2、3、16、17、20、21、22、23、24或其任何组合,以及任选nNOS结构域、肌动蛋白结合结构域、一个或多个铰链区、肌营养不良蛋白聚糖结合结构域或其任何组合。
66.如权利要求60所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
67.如权利要求60所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。
68.如权利要求67所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述强直性肌营养不良是1型或2型。
69.如权利要求60所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、DMD相关心肌病或达农病。
70.如权利要求60所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。
71.如权利要求70所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。
72.如权利要求60所述的载体系统、多肽或粒子,其中所述神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
73.如权利要求52-58中任一项所述的多肽或粒子,其中所述多肽、所述粒子或两者具有增加的肌细胞效能、肌细胞特异性、降低的免疫原性或其任何组合。
74.一种细胞,其包含:
a.如权利要求1-31中任一项中的组合物;
b.如权利要求32-51或59-72中任一项中的载体系统;
c.如权利要求52-54或59-73中任一项中的多肽;
d.如权利要求55-73中任一项中的粒子;或
e.其组合。
75.如权利要求74所述的细胞,其中所述细胞是原核的。
76.如权利要求74所述的细胞,其中所述细胞是真核的。
77.一种药物制剂,其包含:
a.如权利要求1-31中任一项中的组合物;
b.如权利要求32-51或59-72中任一项中的载体系统;
c.如权利要求52-54或59-73中任一项中的多肽;
d.如权利要求55-73中任一项中的粒子;
e.如权利要求74-76中任一项中的细胞;或
f.其组合;以及
药学上可接受的载剂。
78.一种方法,其包括:
向有需要的受试者施用
a.如权利要求1-31中任一项中的组合物;
b.如权利要求32-51或59-72中任一项中的载体系统;
c.如权利要求52-54或59-73中任一项中的多肽;
d.如权利要求55-73中任一项中的粒子;
e.如权利要求74-76中任一项中的细胞;
f.如权利要求77中的药物制剂;或
g.其组合。
79.如权利要求78所述的方法,其中所述有需要的受试者患有肌肉疾病或病症。
80.如权利要求79所述的方法,其中所述肌肉疾病或病症为
a.自身免疫疾病;
b.癌症;
c.肌营养不良;
d.神经肌肉疾病;
e.糖或糖原贮积病;
f.扩增重复疾病;
g.显性负效应疾病;
h.心肌病;
i.病毒性疾病;
j.早衰病;或
k.其任何组合。
81.如权利要求80所述的方法,其中所述扩增重复疾病是亨廷顿病、强直性肌营养不良或面肩肱型肌营养不良(FSHD)。
82.如权利要求80所述的方法,其中所述肌营养不良是杜兴氏肌营养不良、贝克氏肌营养不良、肢带型肌营养不良、埃默里-德赖弗斯肌营养不良、强直性肌营养不良或FSHD。
83.如权利要求82所述的方法,其中所述强直性肌营养不良是1型或2型。
84.如权利要求80所述的方法,其中所述心肌病是扩张型心肌病、肥厚型心肌病、DMD相关心肌病或达农病。
85.如权利要求80所述的方法,其中所述糖或糖原贮积病是MPS III型疾病或庞贝病。
86.如权利要求85所述的方法,其中所述MPS III型疾病是MPS IIIA型、IIIB型、IIIC型或IIID型。
87.如权利要求80所述的方法,其中所述神经肌肉疾病是恰克-马利-杜斯氏病或弗里德赖希共济失调。
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