CN115154393B - 一种芦荟发酵液及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种芦荟发酵液及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明的芦荟发酵液的制备方法包括以下步骤：(1)将发酵菌液接种到芦荟液和培养基的混合物中，得到发酵原液；(2)对所述发酵原液进行发酵，得到发酵产物，即为所述芦荟发酵液；所述发酵菌液由乳杆菌液、串珠菌液和乳球菌液组成。本发明的芦荟发酵液，通过优选发酵菌的种类及含量，复合发酵菌之间的协同增效作用，提高发酵效率和发酵液的美白抗氧化功效。

Description

一种芦荟发酵液及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种芦荟发酵液及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

芦荟为百合目、百合科的多年生常绿草本植物，又名库拉索芦荟、中华芦荟、油葱、洋芦荟、翠叶芦荟、美国芦荟等。芦荟原产于非洲热带干旱地区，分布几乎遍及世界各地。在印度和马来西亚一带、非洲大陆和热带地区都有野生芦荟分布。在中国福建、台湾、广东、广西、四川、云南等地有栽培，也有野生状态的芦荟存在。芦荟(即库拉索芦荟)是芦荟属中少数可食用的物种之一，其制品被广泛应用于食品、美容、保健、医药等领域。

芦荟作为一种集医药、美容、保健、食品及观赏为一体的纯天然绿色植物，芦荟的多种药用价值和治疗作用引起了医学界的广泛重视。从20世纪80年代开始，芦荟就已受到消费者的不断追捧，并迅速在全球范围内掀起了“芦荟”热潮。芦荟含有大量的氨基酸、维生素、多糖、蒽醌类化合物及各种酶、矿物质等，特别是在矿物质中还含有锶和锗，这些营养成分对人体都有补充作用。由于芦荟具有杀菌消炎、增强免疫功能、愈合伤口、清热通便、预防结肠炎，降低血脂、血糖和血压，改善循环系统及睡眠质量，防治消化系统疾病和增进食欲等多种治疗作用，因此芦荟在民间还拥有一个家喻户晓的名称－“植物医生”。芦荟与胃肠病芦荟的黄汁有消炎、杀菌、健胃、通便等作用，对急性胃炎的治疗效果显著。另外，因为芦荟丰富的粘液可以黏附在破损的溃疡面上，不仅可以赋活细胞组织再生，还可以使溃疡部位以及周围组织长出新的组织，所以，芦荟对治疗胃酸引起的胃溃疡也有很大帮助。芦荟与便秘研究证实，芦荟所含的蒽醌类化合物衍生物在肠管中释放出芦荟大黄素，能有效地刺激大肠蠕动，从而有效改善肠胃功能不佳、便秘等症状，并可排毒去火、补虚养颜。

长期以来，人们一直以芦荟胶的形式来制备芦荟活性成分。最初是采取割取芦荟叶片，收集叶汁，置于锅内熬成稠膏，再浸人容器，冷却凝固而得。然而此方法制备得到的芦荟胶较为粗糙，用锅煮加热的方法，会将天然活性成分多数分解。基于传统制取工艺，Cobble最先提出一种能够制取稳定透明芦荟胶的方法，即在制备过程中加入抗氧化剂、防腐剂，在芦荟胶的提取质量上有所改进，但该提取方法提取得到的芦荟胶会引起皮肤过敏现象，且加热和氧化等过程，但加热会加速有效成分的降解，而氧化则可能导致有效成分的氧化。此外，对芦荟有效成分的提取还有酸提取法、碱提取法和酶提取法。随着科技的发展，衍生出其他新的提取方法。

发酵是中药材传统炮制方法之一。早在千余年前,我国已开始用发酵的方法制药，如淡豆豉、沉香曲、五倍子、红曲等都是通过发酵而形成的药物。这些都是利用微生物具有强大的生物转化能力来实现的。现代发酵过程研究表明，微生物具有氧化、酯化、甲基化、羟基化、还原化等多种能力，中草药经发酵后，其有效成分能被充分分离、提取，使其更具有生物活性，并含有大量的活性酶，服用后能被机体组织细胞迅速吸收，达到祛病、健体、增强免疫调节的功能，更好地发挥中草药这一天然药物的药效作用。同时还可以将某些成分分解转化成新的成分，这些新成分成为出现新的药理作用或药理作用增强的物质基础。因此可以利用其进行发酵制药，从而降低用药成本、提高功效。

目前为止，采用发酵技术对芦荟有效成分进行提取的相关报道中，其功效成分的效果较差，难以充分的发挥芦荟的功效成分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种芦荟发酵液及其制备方法与应用，本发明采用复合发酵菌对芦荟进行发酵，制备得到的芦荟发酵液具有更高的美白抗氧化功效。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种芦荟发酵液的制备方法，包括以下步骤：(1)将发酵菌液接种到芦荟液和培养基的混合物中，得到发酵原液；(2)对所述发酵原液进行发酵，得到发酵产物，即为所述芦荟发酵液；由所述发酵菌液由乳杆菌液、串珠菌液和乳球菌液组成。

芦荟的新鲜汁液含芦荟大黄素甙、对香豆酸、葡萄糖等成分，芦荟具有补水、保湿等功效。但把新鲜芦荟汁直接涂于面部以求达到美肤效果的做法其实是错误的，因为芦荟汁直接涂于皮肤会有刺激，引起皮肤过敏等不良反应，且芦荟汁遇到空气容易被氧化为黑色。本申请发明人经过大量的实验发现，采用发酵菌液对新鲜榨取的芦荟液进行发酵后得到的芦荟发酵液比未发酵的芦荟液具有更强的美白抗氧化功效，且不会对皮肤产生刺激性。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，所述乳杆菌液由乳杆菌在液体培养基中活化得到，所述乳杆菌液中乳杆菌的浓度为10⁸～10⁹CFU/mL；所述串珠菌液由串珠菌在液体培养基中活化得到，所述串珠菌液中串珠菌的浓度为10⁸～10⁹CFU/mL；所述乳球菌液由乳球菌在液体培养基中活化得到，所述乳球菌液中乳球菌的浓度为10⁸～10⁹CFU/mL。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，所述发酵菌液由副干酪乳杆菌液、肠膜明串珠菌液和乳酸乳球菌液组成。

研究表明，副干酪乳杆菌属于乳杆菌属中的干酪乳杆菌群，广泛存在于奶酪、泡菜等发酵食品，它具有干酪乳杆菌属调节肠道和增强免疫力等益生功能，代谢产生的细菌素能够抑制肠道中的有害菌，对抑制病原菌、调节肠道平衡发挥着重要的作用；肠膜明串珠菌是串珠菌属的重要菌种，一般存在于植物体表，肠膜明串珠菌可发酵柠檬酸产生特征风味物质，常用于发酵乳制品、青贮、泡菜和果酒中；乳酸乳球菌是发酵工业中常用的的发酵剂之一，特别是在发酵乳制品中，乳酸乳球菌生长快速，分解与合成代谢分开；基因组小但包含足够的生物信息，胞内外蛋白易于分离、纯化，这些优势使乳酸乳球菌在代谢调控方面具有的重大研究价值。自然界的发酵菌种类繁多，不同的发酵菌的发酵机制不同，对不同的发酵底物进行发酵产生的发酵产物的性质和功效也千差万别。本申请发明人经过大量的实验筛选和验证发现，采用副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌组成复合发酵菌对芦荟液进行发酵，三种菌种之间通过协同增效作用，相互促进，使最终制备得到的芦荟发酵液具有很强的美白抗氧化功效。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，按所述发酵原液计，所述副干酪乳杆菌液的体积百分比为1～30％，肠膜明串珠菌液的体积百分比为1～30％，乳酸乳球菌液的体积百分比为1～30％。本申请发明人经过大量的实验发现，在此体积百分比范围内，副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌的之间的相互作用更强。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，按所述发酵原液计，所述副干酪乳杆菌液的体积百分比为2～10％，肠膜明串珠菌液的体积百分比为2～10％，乳酸乳球菌液的体积百分比为2～10％。本申请发明人经过大量的实验发现，在此优选体积百分比范围内，副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌的生长发酵作用更好。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，按所述发酵原液计，所述副干酪乳杆菌液的体积百分比为5％，肠膜明串珠菌液的体积百分比为5％，乳酸乳球菌液的体积百分比为5％。当副干酪乳杆菌液、肠膜明串珠菌液和乳酸乳球菌液的体积百分比均为5％时，三种菌的生长发酵作用最好。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，所述培养基为MRS培养基。本申请发明人经过大量的实验发现，采用MRS培养基作为芦荟发酵的培养基，更有利于创造复合发酵菌种生存的环境，进一步提高效用物质的含量，使得芦荟发酵液的美白抗氧化效果更佳。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，按所述发酵原液计，所述芦荟液的体积百分比为1～40％。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，按所述发酵原液计，所述芦荟液的体积百分比为2～30％。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，按所述发酵原液计，所述芦荟液的体积百分比为5％。本申请发明人经过大量的实验发现，芦荟液的添加量对复合发酵菌种的发酵有很大的影响，当发酵原液中芦荟液的体积百分比为5％，复合发酵菌种的发酵最好。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述发酵的温度为25℃～37℃，发酵的时间为12～48h，发酵原液的pH值为4.1～4.7。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，还包括对发酵产物依次进行灭菌、离心和收集上清液的步骤。

作为本发明所述芦荟发酵液的制备方法的优选实施方式，所述灭菌的条件为：灭菌温度为120～125℃，灭菌时间为10～20min；所述离心的条件为：离心温度为15～25℃，离心转速为5500～6500r/min，离心时间为25～35min。

本申请发明人经过大量的实验研究，对采用发酵菌对芦荟液进行发酵的发酵条件进行优选，最终发现当采用上述发酵温度、发酵时间和具体制备步骤进行发酵时，可使芦荟液的大分子有效成分化作小分子，使得发酵产物中的效用物质含量更高，最终制备得到的芦荟发酵液的美白抗氧化效果更佳。

本发明还提供所述的芦荟发酵液的制备方法得到的芦荟发酵液。

本发明还提供一种护肤品，所述护肤品包括所述的芦荟发酵液。

本发明还提供所述的芦荟发酵液在制备具有美白抗衰老功效的护肤品中的应用。

作为本发明所述应用的优选实施方式，所述护肤品包括面霜、眼霜、爽肤水或精华液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种芦荟发酵液，通过优选发酵菌的种类及含量，通过发酵菌之间的协同增效作用，提高发酵效率和发酵液的美白抗氧化功效；通过复合发酵菌发酵芦荟汁，能够将大分子的有效成分化作小分子，提高美白抗氧化活性物质的作用；通过优选发酵培养基的种类和芦荟汁的含量，为发酵菌营造更好地生长环境，提高发酵效率，提高芦荟的美白抗氧化作用。

附图说明

图1为副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌在不同的发酵培养基中的生长曲线图。

图2为副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌在不同的发酵温度下的生长曲线图。

图3为副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌分别在MRS培养基中的生长曲线图。

图4为副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌分别在5％的芦荟汁中的生长曲线图。

图5为副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌分别在MRS培养基+5％芦荟汁中的生长曲线图。

图6为复合菌种在MRS培养基+5％芦荟汁中的生长曲线图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例和对比例中所用的芦荟汁为芦荟叶片榨汁过滤制备得到；所述的芦荟叶片为市售。

下述实施例和对比例中所用发酵菌液的制备方法为：分别挑取副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌菌落一环到液体培养基中，在30℃的温度下于摇床中将菌种活化，分别得到活化后的副干酪乳杆菌菌液、肠膜明串珠菌菌液、乳酸乳球菌菌液；所述副干酪乳杆菌菌液、肠膜明串珠菌菌液、乳酸乳球菌菌液的浓度均为10⁸～10⁹CFU/mL。

实施例1

本发明实施例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的副干酪乳杆菌、5％的肠膜明串珠菌和5％的乳酸乳球菌发酵菌菌液接种到5％芦荟汁和培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

对比例1

本发明对比例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的副干酪乳杆菌液接种到5％芦荟汁和MRS培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

对比例2

本发明对比例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的肠膜明串珠菌液接种到5％芦荟汁和MRS培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

对比例3

本发明对比例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的乳酸乳球菌液接种到5％芦荟汁和MRS培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

对比例4

本发明对比例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的副干酪乳杆菌和5％的肠膜明串珠菌发酵菌菌液接种到5％芦荟汁和MRS培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

对比例5

本发明实施例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的副干酪乳杆菌和5％的乳酸乳球菌发酵菌菌液接种到5％芦荟汁和培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

对比例6

本发明实施例的一种芦荟发酵液，所述芦荟发酵液制备方法包括以下步骤：

(1)将5％的肠膜明串珠菌和5％的乳酸乳球菌发酵菌菌液接种到5％芦荟汁和培养基中，搅拌混合均匀得发酵原液；

(2)将发酵原液置于30℃的烘箱中发酵28h，得到发酵产物；

(3)将发酵产物置于121℃下灭菌15min，将灭菌后的发酵液在6000r/min、20℃的条件下离心30min，收集上清液得到芦荟发酵液。

试验例

1、本试验例对不同种类及浓度的培养基对发酵菌的生长发酵的影响进行探究，具体步骤如下：

(1)菌种分离纯化：分别挑取副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌菌落一环到液体培养基中，在30℃的温度下于摇床中将菌种活化，分别得到活化后的副干酪乳杆菌菌液、肠膜明串珠菌菌液、乳酸乳球菌菌液，所述副干酪乳杆菌菌液、肠膜明串珠菌菌液、乳酸乳球菌菌液的浓度均为10⁸～10⁹CFU/mL；

(2)发酵原液的配置：分别配制100ml的MRS、MRS+2％芦荟汁、MRS+5％芦荟汁、2％葡萄糖+2％芦荟汁、2％葡萄糖+5％芦荟汁、4％葡萄糖+2％芦荟汁、4％葡萄糖+5％芦荟汁七种培养基，置于高压灭菌锅中在121℃下灭菌15min；

(3)发酵培养：将7种培养基各取5ml装入5ml试管中，将副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌各取250ul分别接入到培养基中，放置到30℃培养12h；

(4)检测：将培养后的发酵液各取200uL到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下进行检测，检测OD值。

结果如表1、图1所示，由表1和图1可知，以MRS培养基+5％芦荟汁作为发酵培养基，副干酪乳杆菌菌、肠膜明串珠菌菌、乳酸乳球菌菌的生长情况更佳。

表1

2、本试验例对不同发酵温度对发酵菌的生长发酵的影响进行探究，具体步骤如下：

(1)菌种分离纯化：分别挑取副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌菌落一环到液体培养基中，在30℃的温度下于摇床中将菌种活化，分别得到活化后的副干酪乳杆菌菌液、肠膜明串珠菌菌液、乳酸乳球菌菌液；

(2)发酵原液的配置：分别配制100ml MRS培养基+5％芦荟汁发酵原液，置于高压灭菌锅中在121℃下灭菌15min；

(3)发酵培养：将步骤(2)的培养基取5ml装入5ml试管中，将副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌各取250ul分别接入到培养基中，分别置于25℃、30℃、37℃温度下培养12h；

(4)检测：将培养后的发酵液各取200uL到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下进行检测，检测OD值。

实验结果如表2、图2所示，由表2和图2可知，当发酵温度为30℃时，副干酪乳杆菌菌、肠膜明串珠菌菌、乳酸乳球菌菌的生长情况更佳。

表2

3、本试验例对不同发酵时间对发酵菌的生长发酵的影响及副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌之间是否具有相互促进的效果进行探究，具体实验步骤如下：

(1)菌种分离纯化：分别挑取副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌菌落一环到液体培养基中，在30℃的温度下于摇床中将菌种活化，分别将上述活化后的三种菌各取250ul于5ml的液体培养基中活化，分别得到活化后的副干酪乳杆菌菌液、肠膜明串珠菌菌液、乳酸乳球菌菌液；

(2)发酵原液的配置：配制100ml的MRS培养基、芦荟汁、MRS培养基+5％芦荟汁，并在121℃下灭菌15min；

(3)发酵培养：将步骤(2)的培养基取5ml装入5ml试管中，将副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌各取250ul分别接入到MRS培养基、芦荟汁、MRS培养基+5％芦荟汁培养基中，将5％类干酪乳杆菌、5％肠膜明串珠菌、5％乳酸乳球菌中的任意两种菌种接种到MRS培养基+5％芦荟汁培养基中，将5％类干酪乳杆菌、5％肠膜明串珠菌和5％乳酸乳球菌接种到MRS培养基+5％芦荟汁培养基中，将上述培养原液分别置于30℃的温度下培养48h；其中L代表副干酪乳杆菌；C代表肠膜明串珠菌；R代表乳酸乳球菌。

(4)检测：每隔一小时步骤(3)中各组培养原液发酵后的发酵液各取200uL到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下进行检测，检测OD值。

实验结果如表3～表4、图3～6所示，由表3～表4、图3～6可知，副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌在单纯的芦荟汁发酵原液中几乎不生长，故芦荟汁不能单独作为发酵原液；副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌在单纯的MRS培养基发酵原液中的最佳培养时间为24小时，而在MRS培养基+5％芦荟汁培养原液中，副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌三种菌单独培养或组合培养至28小时后，其生长OD值不再增加，对于生产成本而言，继续增加培养时间会使生产成本增加。因此副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸乳球菌三种菌在MRS培养基+5％芦荟汁培养原液中单独培养或组合培养的最佳培养时间均为28小时。

表3

表4

效果例

1、芦荟发酵液的安全性评价

对上述实施例1、对比例1～3制备得到的芦荟发酵液进行化妆品刺激评价。

(1)受试人群为女性，40人，年龄16～65岁之间。受试者皮肤健康，无皮肤病过敏史，符合受试者志愿选入标准。随机分组，分为4组，每组10人。

测试方法为人体贴斑试验。选用合格的斑试器，将受试物约0.020-0.025g放置于斑试器内，将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴覆于受试者的背部或前臂屈侧，用手掌轻压使之均匀地贴覆在皮肤上，持续24h。去除受试斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。按照2007年《化妆品卫生规范》和2015年《化妆品安全技术规范》为参照标准，记录其结果。

评价标准：0级：阴性反应；1级：可疑反应，仅有微弱红斑；2级：弱阳性反应，红斑、浸润、水肿、可有丘疹；3级：强阳性反应，红斑、浸润、水肿、可有丘疹、反应可超出受试区；4级：极强阳性反应，明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹、反应超出受试区。

(2)人体皮肤贴斑实验结果显示：各组受试者通过实施例1、对比例1～3制备得到的芦荟发酵液的斑贴实验，在试验后24h和48h观察受试者的皮肤反应，所有受试者的皮肤反应均为阴性，说明实施例1、对比例1～3制备得到的芦荟发酵液的抗皱紧致的组合物使用安全。

2、芦荟发酵液的DPPH自由基清除测试

DPPH自由基一种很稳定的氧中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品。保健品及药品的研究中。DPPH自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515nm处有强吸收。当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，其溶液颜色变浅，515nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH自由基的能力。

DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

(1)取等体积(一般为3mL)的待测液与2x10⁴mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；

(2)取等体积的无水乙醇(待测物溶剂)与2x10⁴mo1/L的DPPH溶液混匀(A2管)；

(3)取等体积的无水乙醇与待测液混匀(A3管)；

(4)反应30min后，在517nm下测A1、A2、A3管吸光度值。

清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2。

取实施例1、对比例1～6制备得到的芦荟发酵液溶于去离子水中，制成体积百分比为5％的芦荟发酵液待测液。

按DPPH自由基清除率测试方法分别测定上述体积百分比为5％的芦荟发酵液待测液的DPPH自由基清除率。试验结果如表5所示。

表5

由表5可知，经过副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌组成的复合发酵菌发酵的芦荟发酵液能够显著提高DPPH自由基的清除率。

4、芦荟发酵液的酪氨酸酶活性抑制测试

黑色素的合成受酪氨酸酶影响，酪氨酸酶能够催化L-酪氨酸羟化成多巴，并把多巴氧化成多巴醌，多巴醌形成最终的反应产物黑色素。具有酪氨酸酶活性抑制作用的受试物可以减慢酪氨酸酶催化L-酪氨酸转化成多巴醌，通过测定475nm处多巴醌的吸光度，根据吸光度的变化来评估受试物对酪氨酸酶活性的抑制效果。

酪氨酸酶活性抑制实验的具体实验步骤为：

(1)按照表6试剂添加量在96孔板依次加入酪氨酸溶液、样品溶液、PBS溶液，并充分混匀；

(2)置于37℃恒温环境下孵育10min后，依次加入20uL的酪氨酸酶溶液；

(3)37℃混匀反应5min后放入酶标仪，在475nm波长处进行测定。

酪氨酸酶活性抑制计算公式为：抑制率(％)＝[1-(Td-Tc)/(Tb-Ta)]×100％

表6

取实施例1、对比例1～6制备得到的芦荟发酵液溶于去离子水中，制成体积百分比为5％的芦荟发酵液待测液。

按酪氨酸酶活性抑制率测试方法分别测定上述体积百分比为5％的芦荟发酵液待测液的酪氨酸酶活性抑制率。试验结果如表7所示。

表7

由表7可知，经过副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌组成的复合发酵菌发酵的芦荟发酵液能够显著提高酪氨酸酶活性抑制率。

5、芦荟发酵液的美白抗衰功效测试

紫外线、光污染等外部环境对皮肤的伤害是导致皮肤衰老的主要原因，不仅会形成各种氧化自由基，破坏胶原蛋白合成，还会导致皮肤细胞DNA损伤等，从而引起皮肤衰老，出现皱纹，皮肤弹性下降，色素沉淀形成色斑。本测试通过VISA-CR面部图像分析仪的对面部皮肤的皱纹和色斑水平进行测量，通过仪器的云数据库及其算法进行评分，评分越低表示皱纹和色斑越多。

(1)测试方法：选取80名30～65岁的女性作为试用对象，分成4组，每组20人，每组分别试用实施例1、对比例1～3的芦荟发酵液。测试前测试人员洗净面部后在恒温恒湿环境(温度21-23℃，湿度55-65％)待30min后，利用VISA-CR进行面部拍照作为初次数据，受试者将各试验组的芦荟发酵液涂布于面部，每天使用1次，连续试用60天，并在第0天、第30天、第60天时洗净面部后用VISA-CR进行面部皱纹和色斑测试，分别记作D₀、D₃₀和D₆₀。需要说明的是每组D₀、D₃₀和D₆₀值均为该组这些数值的平均值，经仪器软件计算出使用前后面部皱纹和色斑的改善情况，评分越低表示皱纹和色斑越多。

(2)测试结果见表8。

表8

由表8可知，试用实施例1的芦荟发酵液的受试者的面部皱纹和色斑的改善情况最佳，说明实施例1的芦荟发酵液的美白抗衰功效最佳，且从实验数据可知，副干酪乳杆菌、肠膜明串珠菌和乳酸乳球菌三者具有协同增效作用，三者组成的复合发酵菌发酵得到的芦荟发酵液能够提高芦荟发酵液的美白抗衰功效。

6、芦荟发酵液的黑色素抑制功效测试

斑马鱼早期的胚胎全身透明，在发育至72hpf(hours post-fertilization)时黑色素在其体表沉积，在显微镜下能被清晰的观察到。若在72hpf前进行受试物给药处理，就可以看到黑色素的的形成是否有减少。斑马鱼体表中的黑色素的生成和抑制与人类有着较高的相似性，美白功效的产品主要的作用通路是通过抑制酪氨酸酶的活性，从而减少黑色素的生成，通过图像处理技术可以对受试物对黑色素的情况进行定量，从而实现美白功效的评价。具体实验方法如下：选用AB系野生型斑马鱼受精后24小时(24hpf)胚胎。将斑马鱼分成正常对照组和实验组。正常对照组不做处理，实验组使用实施例1制备的芦荟发酵液稀释液(稀释至浓度为0.01g/ml)，孵育一段时间后，对斑马鱼头部进行拍照，利用高级图像处理软件分析斑马鱼头部的黑色素信号强度。结果如表9所示。

表9

组别	黑色素信号强度
		正常对照组	46799.25
实验组	28464**

与空白组对比，“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示P＜0.0001。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种芦荟发酵液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将发酵菌液接种到芦荟液和培养基的混合物中，得到发酵原液；

(2)对所述发酵原液进行发酵，得到发酵产物；

(3)将发酵产物依次进行灭菌、离心和收集上清液，得所述芦荟发酵液；

所述发酵菌液由副干酪乳杆菌液、肠膜明串珠菌液和乳酸乳球菌液组成；

所述副干酪乳杆菌液由副干酪乳杆菌在液体培养基中活化得到，所述副干酪乳杆菌液中副干酪乳杆菌的浓度为10⁸～10⁹CFU/mL；所述肠膜明串珠菌液由肠膜明串珠菌在液体培养基中活化得到，所述肠膜明串珠菌液中肠膜明串珠菌的浓度为10⁸～10⁹CFU/mL；所述乳酸乳球菌液由乳酸乳球菌在液体培养基中活化得到，所述乳酸乳球菌液中乳酸乳球菌的浓度为10⁸～10⁹CFU/mL；

按所述发酵原液计，所述副干酪乳杆菌液的体积百分比为1～30％，肠膜明串珠菌液的体积百分比为1～30％，乳酸乳球菌液的体积百分比为1～30％，所述芦荟液的体积百分比为1～40％；

所述培养基为MRS培养基；

所述步骤(2)中发酵的温度为25℃～37℃，发酵的时间为12～48h，发酵原液的pH值为4.1～4.7。

2.根据权利要求1所述的芦荟发酵液的制备方法，其特征在于，按所述发酵原液计，所述副干酪乳杆菌液的体积百分比为2～10％，肠膜明串珠菌液的体积百分比为2～10％，乳酸乳球菌液的体积百分比为2～10％。

3.根据权利要求2所述的芦荟发酵液的制备方法，其特征在于，按所述发酵原液计，所述副干酪乳杆菌液的体积百分比为5％，肠膜明串珠菌液的体积百分比为5％，乳酸乳球菌液的体积百分比为5％。

4.根据权利要求1所述的芦荟发酵液的制备方法，其特征在于，按所述发酵原液计，所述芦荟液的体积百分比为2～30％。

5.根据权利要求4所述的芦荟发酵液的制备方法，其特征在于，按所述发酵原液计，所述芦荟液的体积百分比为5％。

6.根据权利要求1所述的芦荟发酵液的制备方法，其特征在于，所述灭菌的条件为：灭菌温度为120～125℃，灭菌时间为10～20min；所述离心的条件为：离心温度为15～25℃，离心转速为5500～6500r/min，离心时间为25～35min。

7.根据权利要求1～6任一项所述的芦荟发酵液的制备方法得到的芦荟发酵液。

8.一种护肤品，其特征在于，所述护肤品包括权利要求7所述的芦荟发酵液。

9.根据权利要求8所述的芦荟发酵液在制备具有美白抗衰老功效的护肤品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述护肤品为面霜、眼霜、爽肤水或精华液。

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