CN115125189A

CN115125189A - 一种尿源性干细胞的提取方法

Info

Publication number: CN115125189A
Application number: CN202210872833.1A
Authority: CN
Inventors: 李浪红; 余时沧; 段江洁; 熊周星; 陈泓豪; 熊娜; 张锐; 钟兴; 钱楠楠; 梁恺伦
Original assignee: First Affiliated Hospital of Army Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Army Medical University
Priority date: 2022-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2022-09-30

Abstract

本发明公开了一种尿源性干细胞(urine‑derived stem cells,USCs)的提取方法，该方法采用RetroNectin作为包被液，然后收集尿液中的原代细胞，清洗后进行培养，该方法能够缩短USCs克隆出现的时间，并且得到的细胞群体中USCs比例高、数量多。因此，该提取方法可用于USCs的分离和获取，对于推动USCs的临床应用具有重要意义。

Description

一种尿源性干细胞的提取方法

技术领域

本发明涉及干细胞提取领域，具体涉及一种尿源性干细胞的提取方法。

背景技术

尿源性干细胞(urine-derived stem cells,USCs)由于与间充质干细胞的相似性，且来源方便、取材无创，制备过程简便(仅需采集尿液，通过离心、冲洗，培养等步骤，即可培养出尿源性干细胞)，是理想的自体干细胞来源，在组织工程和再生医学领域显示出巨大的应用潜力。其一，可以作为合适的干细胞种子应用于临床；其二，可以应用于各种疾病模型。目前有越来越多的实验研究证明尿液中分离的尿源干细胞具有向其它多种细胞分化的潜能，可分化为尿上皮细胞、平滑肌细胞和内皮细胞等膀胱细胞系用于肾脏疾病的治疗；可诱导为软骨细胞、骨细胞和骨骼肌源性细胞用于骨科相关疾病的治疗；可向神经源性细胞分化用于神经源性疾病；也可分化为脂肪细胞用于美容行业。同时，利用USCs产生诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells)，可进一步扩大其应用领域，如心脏修复、疾病建模和药物筛选等。此外，USCs来源的细胞外囊泡、基质也有望改善多种疾病或调控其他干细胞分化。

目前尿源性干细胞的提取方法主要是通过包被胶原蛋白或基质胶等方法进行贴壁培养，所获得细胞群体中CD105、CD90阳性细胞是评价尿源性干细胞分离培养方法的重要指标较低，但常规方法中CD105、CD90阳性细胞比例较低，且提取效率较低。因此，亟需对现有的尿源性干细胞获取和培养方法进行改进，为尿源性干细胞的应用打下坚实的基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种尿源性干细胞的提取方法，该方法能够提高尿源性干细胞的提取效率。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种尿源性干细胞的提取方法，收集尿液细胞，然后用包被RetroNectin的孔板静置培养1～3d，补充初级培养基；再加入RE/MC proliferation medium继续培养，每天半换液，培养至细胞融合度为70～90％；所述RE/MC proliferation medium为REGMBulletKit的RE cell basal medium与含FBS、GlutaMAX、NEAA、bFGF、PDGF-AB和EGF的DMEM高糖培养基按体积比为1:1混合。

本发明优选的，所述收集尿液细胞的方法为收集尿液，300～600g离心5～10min收集沉淀，加入清洗缓冲液清洗后，200～400g条件离心5～10min，吸弃上清保留底部残余液体；加入初级培养基重悬细胞；所述初级培养基各组分如下：10％FBS、1000～500×Primocin、REGM SingleQuot kit supplements的DMEM：Ham's F-12为1:1的培养基。

本发明优选的，所述包被RetroNectin的方法是加入RetroNectin作为包被液，然后4℃孵育过夜。

本发明优选的，所述RetroNectin的浓度为12.5～100μg/ml。

本发明优选的，所述清洗缓冲液含有DPBS和原代细胞抗生素。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种尿源性干细胞的提取方法，该方法采用RetroNectin作为包被液，然后收集尿液中的原代细胞，清洗后进行培养，该方法能够USCs克隆出现的时间缩短至5天，且P0细胞数量是传统Matrigel包被法的5倍。因此，该方法可用于USCs的分离，对于促进USCs的临床转化应用具有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为提取后的尿源性干细胞典型图片。分别包被Matrigel、RetroNectin、铺底工作液，得到尿源性干细胞的典型图片。

图2为尿源性干细胞表型结果。将包被Matrigel、Retronectin获得的尿源性干细胞进行表型检测，发现RetroNectin包被后，尿源性干细胞群体中干细胞比例更高。

图3为不同包被方式时USCs克隆出现时间。通过不同包被方式获取尿源性干细胞，对克隆出现时间进行记录，发现RetroNectin包被后尿源性干细胞克隆出现时间短于Matrigel包被后。

图4为不同包被方式时USCs P0数量。收集不同包被方式下的P0尿源性干细胞数量，并进行比较，发现RetroNectin包被后尿源性干细胞数量高于Matrigel包被后获取的细胞数量。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明中Matrigel购自Corning(货号356234)，RetroNectin购自TaKaRa公司(货号T100B)，铺底工作液(赛贝CA3003100)，Tryple^TM Express、DPBS、FBS、DMEM/F-12购自Gibco公司(货号分别为12604-021、C14190500BT、16140071、11320033)，Primocin购自InvivoGen公司(货号ant-pm-1)，DMEM高糖培养基(DMEM/high glucose)购自Hyclone公司(货号SH30022.01B)，REGM SingleQuot kit supplements(REGM Renal Epithelial CellGrowth Medium SingleQuots Kit)、RE cell basal medium(REBM Renal EpithelialCell Growth Basal Medium)购自Lonza(货号分别为cc-4127、cc-3191)，EGF、bFGF、PDGF-AB购自Peprotech(货号分别为AF-100-15、100-18B、100-00AB)，GlutaMAX、NEAA购自Invitrogen(货号分别为35050、11140)。

实施例1

利用各包被液包被后培养尿源性干细胞的方法，具体步骤如下：

1)分别用RetroNectin、Matrigel或铺底工作液包被孔板，RetroNectin包被采用4℃孵育过夜；Matrigel包被采用37℃孵育30min；铺底工作液包被采用37℃孵育过夜。

2)收集中段尿，分装后于400g条件下室温离心10min：吸弃上清，管底保留1mL尿液后加10mL Washing Buffer(DPBS+500×Primocin)重悬，然后在200g条件下室温离心10min。

3)小心吸弃上清，保留约0.2mL残余液体；加入1mL Primary medium，重悬细胞，分别加入事先包被RetroNectin、Matrigel和铺底工作液的孔板中；培养箱中37℃孵育24h。

4)前2d不要动，第3d添加1mL初级培养基(Primary medium)；在96h后，吸弃大部分上清，保留约1mL培养基，加入1mL RE/MC proliferation medium；每天半换液，镜下观察，直到细胞融合度为70～90％，约9～12d；

其中，初级培养基各组分如下：10％FBS、500×Primocin、REGM SingleQuot kitsupplements的DMEM：Ham's F-12为1:1的培养基；

RE/MC proliferation medium为REGM BulletKit的RE cell basal medium与含添加剂的DMEM高糖培养基按体积比为1:1混合，添加剂各组分质量百分比如下：10％FBS、1％GlutaMAX、1％NEAA、5ng/ml bFGF、5ng/ml PDGF-AB和5ng/ml EGF、500×Primocin；

5)细胞长到70-90％时，传代培养。

检测不同包被液培养7d的尿源性干细胞，结果如图1所示。结果显示，RetroNectin包被后尿源性干细胞形态主要为米粒样(更利于增殖)且克隆较大，Matrigel和铺底工作液包被后尿源性干细胞形态呈梭形且克隆较小。

将包被Matrigel、RetroNectin获得的尿源性干细胞进行表型检测，结果如图2所示。结果发现RetroNectin包被后，尿源性干细胞群体中干细胞比例更高。

为研究不同包被方式对USCs克隆出现时间的影响，将不同包被方式获取尿源性干细胞出现时间进行记录，结果如图3所示。发现RetroNectin包被后尿源性干细胞克隆出现时间短于Matrigel包被后。

然后统计不同包被方式时的USCs P0数量，收集不同包被方式下培养12d左右的P0尿源性干细胞数量，并进行比较，结果如图4所示。发现RetroNectin包被后尿源性干细胞数量高于Matrigel包被后获取的细胞数量。

上述结果可以看出，使用RetroNectin包被能够在更短时间内提取得到更高比例的尿源性干细胞。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims

1.一种尿源性干细胞的提取方法，其特征在于：收集尿液细胞，然后用包被RetroNectin的孔板静置培养1～3d，补充初级培养基；再加入RE/MC proliferationmedium继续培养，每天半换液，培养至细胞融合度为70～90％；所述RE/MC proliferationmedium为含REGM BulletKit的RE cell basal medium与含FBS、GlutaMAX、NEAA、bFGF、PDGF-AB和EGF的DMEM高糖培养基按体积比为1:1混合。

2.根据权利要求1所述尿源性干细胞的提取方法，其特征在于：所述收集尿液细胞的方法为收集尿液，300～600g离心5～10min收集沉淀，加入清洗缓冲液清洗后，200～400g条件离心5～10min，吸弃上清保留底部残余液体；加入初级培养基重悬细胞；所述初级培养基各组分如下：10％FBS、1000～500×Primocin、REGM SingleQuot kit supplements的DMEM：Ham'sF-12为1:1的培养基。

3.根据权利要求1所述尿源性干细胞的提取方法，其特征在于：所述包被RetroNectin的方法是加入RetroNectin作为包被液，然后4℃孵育过夜或常温孵育2h或37℃孵育30min。

4.根据权利要求3所述尿源性干细胞的提取方法，其特征在于：所述RetroNectin的浓度为12.5～100μg/ml。

5.根据权利要求2所述尿源性干细胞的提取方法，其特征在于：所述清洗缓冲液含有DPBS和原代细胞抗生素。