CN115109787A

CN115109787A - 一组糖基转移酶基因及其在制备三七/人参皂苷中的应用

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Publication number: CN115109787A
Application number: CN202110285350.7A
Authority: CN
Inventors: 李检秀; 谢能中; 李燕婷
Original assignee: Guangxi Academy of Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Sciences
Priority date: 2021-03-17
Filing date: 2021-03-17
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2041-03-17
Also published as: CN115109787B

Abstract

本发明公开一组糖基转移酶基因及其在制备三七/人参皂苷中的应用，所述的基因为首次在三七基因组中挖掘得到3个糖基转移酶新基因，分别命名为PnUGT 87、PnUGT 19、PnUGT12，具有如SEQ ID NOs：1、2或3所示的核苷酸序列；同时公开了所述的糖基转移酶基因编码的氨基酸序列，分别如SEQ ID NOs：4、5或6所示。同时本发明还公开了含有上述基因的表达载体，以及由所述表达载体转化的宿主细胞。本发明的糖基转移酶基因弥补了现有人参/三七皂苷生物合成相关的基因的数量较少，绝大部分人参/三七皂苷分子合成机制尚不明确，为人工合成人参/三七皂苷单体提供新基因。

Description

一组糖基转移酶基因及其在制备三七/人参皂苷中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一组糖基转移酶基因及其在制备三七/人参皂苷中的应用。

背景技术

天然产物是自然界长期选择和优化的活性物质，是药物发现的最重要源泉。名贵药材三七和人参主要药效成分是各种皂苷，目前已从三七中鉴定皂苷100多种，人参中鉴定皂苷150多种。然而，三七和人参中皂苷含量低，总皂苷仅占根部干重的2％～9％，一些具有重要药效的稀有皂苷含量更是低于十万分之一，目前仅有很少数含量高的单体皂苷能够提取和应用。

利用生物技术手段合成皂苷并提高皂苷的含量已经成为了研究热点，近年来人们通过组织培养和生物转化进行了皂苷的生物合成的研究，为通过合成生物学技术生产皂苷提供了基本的元器件。目前已鉴定了人参来源的作用于原人参二醇型皂苷的C20-OH位点的糖基转移酶(UGTPg1)，绞股蓝来源的作用于原人参二醇和原人参三醇型皂苷的C20-O-Glc位点的糖基转移酶(GpUGT23)；此外分别作用于原人参二醇型皂苷C3-OH位点和C3-O-Glc位点的糖基转移酶PgUGT74AE2、UGTPg45和PgUGT94Q2、UGTPg29也先后被韩国和中国的科学家挖掘鉴定。2020年张学礼团队构建了一个源于三七的候选UGTs基因元件库，并通过“即插即用”的策略，成功鉴定了Pn1-3、Pn3-29、Pn3-31、Pn3-32、Pn3-32-i5五个糖基转移酶基因，其中糖基转移酶Pn3-32-i5能在原人参三醇型皂苷的C6-O-Glc位点延伸一分子木糖基。然而已知的参与人参/三七皂苷生物合成的功能基因数量较少，尤其是能催化延伸糖链的糖基转移酶基因，绝大部分人参/三七皂苷的分子合成机制尚未得到完整解析。在这种情况下，本发明对三七中的糖基转移酶基因进行鉴定，尤其是能在原人参二醇型皂苷的C3-O-Glc和C20-O-Glc位点延伸一分子葡萄糖基或者木糖基的糖基转移酶以及能在原人参三醇型皂苷的C6-O-Glc位点延伸一分子木糖基的糖基转移酶进行了克隆和鉴定。

发明内容

针对现有技术中已知的与人参/三七皂苷生物合成相关的基因的数量较少，绝大部分人参/三七皂苷化合物分子合成机制尚不明确，且部分稀有人参/三七皂苷在植物中含量极低的缺陷，本发明提供一组催化合成多种人参/三七皂苷单体的糖基转移酶基因及其在制备糖基化的四环三萜类化合物的应用。

本发明提供的糖基转移酶基因具有如SEQ ID NOs：1、2或3所示的核苷酸序列。

本发明通过整合功能基因组学、转录组学、代谢组学、生物信息学的技术与方法，建立了三七、人参、西洋参、绞股蓝等物种的糖基转移酶家族基因库；通过序列比对、保守结构域和进化树分析，对糖基转移酶基因资源库的基因功能进行预测和功能鉴定，首次在三七基因组中挖掘得到3个糖基转移酶新基因，分别命名为PnUGT 87、PnUGT 19、PnUGT 12，分别对应SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

同时，本发明还提供了上述糖基转移酶基因编码的糖基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NOs：4、5或6所示，其中：

SEQ ID NO：4的氨基酸序列由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码而得；

SEQ ID NO：5的氨基酸序列由SEQ ID NO：2的核苷酸序列编码而得；

SEQ ID NO：6的氨基酸序列由SEQ ID NO：3的核苷酸序列编码而得。

同时，本发明还提供了上述糖基转移酶的突变体，具体为PnUGT 87糖基转移酶的突变体和PnUGT 19糖基转移酶的突变体；所述的突变体是通过取代野生型糖基转移酶PnUGT 87、PnUGT 19多个位置上的氨基酸残基而获得的。

同时，本发明还提供了上述PnUGT 87糖基转移酶突变体和PnUGT 19糖基转移酶突变体编码的氨基酸序列，其中：

PnUGT 87糖基转移酶突变体的出发氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：4。它们分别是PnUGT 87A43T/V112L/T389K/K423T、PnUGT 87G107E/T389K/K423T、PnUGT 87T389K、PnUGT 87D418E。

PnUGT 19糖基转移酶突变体的出发氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO：5。它们分别是PnUGT 19P115L/T244I、PnUGT 19V89I/G355E/A361V/V423D、PnUGT 19V380A/G408D/P465S。

同时，本发明还提供了一种含有上述糖基转移酶基因的表达载体。

同时，本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。

同时，本发明还提供了上述糖基转移酶的应用，用作糖基催化反应的催化制剂，催化四环三萜类化合物形成糖基化的四环三萜类化合物。

同时，作为上述糖基转移酶的进一步应用，所述的催化四环三萜类化合物形成糖基化的四环三萜类化合物的催化反应，具体为以下一种或多种反应：

(Ⅰ)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C3-O-Glc位点，以延伸糖链；

(Ⅱ)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C20-O-Glc位点，以延伸糖链；

(III)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C6-OH位点，以增加一个糖基；

(IV)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C6-O-Glc位点，以延伸糖链。

作为上述催化反应的进一步改进，所述的糖基供体为尿苷二磷酸(UDP)糖：UDP-葡萄糖和/或UDP-木糖。

作为上述糖基转移酶的进一步应用，本发明通过底物特异性分析和产物鉴定明确了上述3个糖基转移酶的功能；上述3个糖基转移酶能够实现体外糖基化反应，催化四环三萜类化合物生成多种三七/人参皂苷产物，具体的：

(A)所述的催化反应(I)的反应式如下：

所述R1、R2、R3、R4为H、单糖糖基或多糖糖基。

所述的糖基供体为UDP-葡萄糖和/或UDP-木糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

R1、R2经取代后的化合物如表1所示。

表1：糖基转移酶PnUGT 87催化PPD型皂苷

(B)所述的催化反应(II)的反应式如下：

其中，R1为H，R2为单糖糖基；R3为H，R4为多糖糖基。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

R1、R2经取代后的化合物如表2所示。

表2：糖基转移酶PnUGT 87催化PPT型皂苷

(C)所述的催化反应(Ⅲ)的反应式如下：

其中，R1为H，R2为H、单糖糖基或多糖糖基，R3均为单糖糖基，R4为H、单糖糖基或多糖糖基。

所述糖基供体为UDP-葡萄糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

R1、R2经取代后的化合物如表3所示。

表3：糖基转移酶PnUGT 19催化PPT型皂苷

(D)所述的催化反应(IV)的反应式如下：

其中，R1为单糖糖基，R2为H或单糖糖基，R3为多糖糖基，R4为H或单糖糖基。

所述糖基供体为UDP-木糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

R1、R2经取代后的化合物如表4所示。

表4：糖基转移酶PnUGT 12催化PPT型皂苷

上述A、B、C、D四个糖基催化反应的底物为式(I)、(III)、(V)、(VII)化合物；所述的产物为式(II)、(IV)、(VI)、(VIII)化合物；

所述的式(I)化合物为皂苷CK，并且式(II)化合物为绞股蓝皂苷LXXV；

或者，所述的式(I)化合物为人参皂苷Rh2，并且式(II)化合物为人参皂苷Rg3；

或者，所述的式(I)化合物为人参皂苷F2，并且式(II)化合物为人参皂苷Rd或人参皂苷Rb1或绞股蓝皂苷XVII或越南参皂苷R16；

或者，所述的式(I)化合物为人参皂苷Rd，并且式(II)化合物为人参皂苷Rb1或人参皂苷Rb3；

或者，所述的式(I)化合物为绞股蓝皂苷XVII，并且式(II)化合物为人参皂苷Rb1或三七皂苷L；

或者，所述的式(I)化合物为三七皂苷Fd，并且式(II)化合物为人参皂苷Rb3或皂苷Fd-Xyl；

或者，所述的式(I)化合物为三七皂苷Fe，并且式(II)化合物为人参皂苷Rc或皂苷Fe-Xyl；或者，所述的式(III)化合物为人参皂苷F1，并且式(IV)化合物为三七皂苷U；

或者，所述的式(V)化合物为原人参三醇(PPT)，并且式(VI)化合物为人参皂苷Rh1；

或者，所述的式(V)化合物为人参皂苷F1，并且式(VI)化合物为人参皂苷Rg1；

或者，所述的式(V)化合物为人参皂苷F3，并且式(VI)化合物为三七皂苷FP1；

或者，所述的式(VII)化合物为人参皂苷Rg1，并且式(VIII)化合物为三七皂苷R1；

或者，所述的式(VII)化合物为人参皂苷Rh1，并且式(VIII)化合物为三七皂苷R2。

同时，本发明还提供了上述宿主细胞的应用，具体用于制备酶催化试剂、或产生糖基转移酶、或作为催化细胞、或产生糖基化的四环三萜类化合物(式(II)、(IV)、(VI)或(VIII)化合物)。

同时，本发明还提供了SEQ ID NO：1核苷酸序列编码的糖基转移酶PnUGT 87的应用，该糖基转移酶PnUGT 87具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，用作糖基催化反应的催化制剂，催化人参皂苷F2形成人参皂苷Rb1。

作为上述糖基转移酶PnUGT 87应用的进一步改进，所述的人参皂苷F2，是由糖基转移酶PnUGT 17催化PPD生成人参皂苷Rh2，再由糖基转移酶PnUGT 35催化人参皂苷Rh2生成的。

本发明利用合成生物学技术，开发了一整套酿酒酵母合成生物学标准生物元件库，多种辅酶调控体系，微生物定向改造以及高通量筛选平台。通过底物特异性分析和产物鉴定明确了糖基转移酶PnUGT 87的功能，糖基转移酶PnUGT 87具有特异性识别C3-O-Glc和C20-O-Glc位点，延伸一分子葡萄糖基的双重功能。

本发明还构建一条人参皂苷Rb1人工合成新途径，即在PPD微生物底盘细胞中导入PnUGT 17、PnUGT 35、PnUGT 87等3个糖基转移酶基因，实现人参皂苷Rb1单体的人工合成。具体地：以酿酒酵母BY4742为出发菌株，通过同源重组的方式，将不同物种来源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(tHMG1)、法尼基焦磷酸合成酶(ERG20)、角鲨烯合酶(ERG9)、角鲨烯环氧酶(ERG1)、达玛烯二醇合酶(DS)、原人参二醇合酶(CYP716A47)以及提供还原力NADPH的辅酶(ATR1)，整合到BY4742染色体多拷贝位点区，构建得到PPD底盘细胞；然后在PPD底盘细胞中，过表达三个糖基转移酶基因PnUGT 17、PnUGT 35和PnUGT 87，实现人参皂苷单体Rb1的从头合成。

本发明的有益效果：

1、本发明的糖基转移酶基因弥补了现有技术中，已知的与人参/三七皂苷生物合成相关的基因的数量较少，绝大部分人参/三七皂苷化合物分子合成机制尚不明确，且部分稀有人参/三七皂苷在植物中含量极低的缺陷，为皂苷合成提供了新的基因。

2、本发明的糖基转移酶基因表达产生的糖基转移酶，能够实现体外糖基化反应，催化四环三萜类化合物生成多种三七/人参皂苷，提高了三七/人参皂苷的合成途径和产量。

3、本发明鉴定得到的糖基转移酶PnUGT 87具有特异性识别C3-O-Glc和C20-O-Glc位点的功能，能够以人参皂苷F2为前体，通过连续两步糖基化，催化得到人参皂苷Rb1；在PPD底盘细胞中，仅协同表达PnUGT 17、PnUGT 35和PnUGT 87三个糖基转移酶基因，即可实现人参皂苷单体Rb1的从头合成，其中，糖基转移酶PnUGT 17可催化PPD生成人参皂苷Rh2，PnUGT 35可催化人参皂苷Rh2生成人参皂苷F2，PnUGT 87可催化人参皂苷F2通过两步糖基化反应生成人参皂苷Rb1。

附图说明

图1为以皂苷CK为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成绞股蓝皂苷LXXV的HPLC图。

图2为以皂苷CK为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成绞股蓝皂苷LXXV的LC-MS图。

图3为以人参皂苷Rh2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rg3的HPLC图。

图4为以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1的HPLC图。

图5为以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rd的LC-MS图。

图6为以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb1的LC-MS图。

图7为以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成绞股蓝皂苷XVII的LC-MS图。

图8为以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成越南参皂苷R16的HPLC图。

图9为以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成越南参皂苷R16的LC-MS图。

图10为以人参皂苷Rd为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb1的HPLC图。

图11为以人参皂苷Rd为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb1的LC-MS图。

图12为以人参皂苷Rd为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb3的HPLC图。

图13为以人参皂苷Rd为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb3的LC-MS图。

图14为以绞股蓝皂苷XVII为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT87催化其生成人参皂苷Rb1的HPLC图。

图15为以绞股蓝皂苷XVII为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT87催化其生成人参皂苷Rb1的LC-MS图。

图16为以绞股蓝皂苷XVII为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT87催化其生成三七皂苷L的HPLC图。

图17为以绞股蓝皂苷XVII为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT87催化其生成三七皂苷L的LC-MS图。

图18为以三七皂苷Fd为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb3的HPLC图。

图19为以三七皂苷Fd为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb3的LC-MS图。

图20为以三七皂苷Fe为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rc的HPLC图。

图21为以三七皂苷Fe为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rc的LC-MS图。

图22为以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成三七皂苷U的HPLC图。

图23为以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成三七皂苷U的LC-MS图。

图24为以原人参三醇(PPT)为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 19催化其生成人参皂苷Rh1的HPLC图。

图25为以原人参三醇(PPT)为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 19催化其生成人参皂苷Rh1的LC-MS图。

图26为以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 19催化其生成人参皂苷Rg1的HPLC图。

图27为以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 19催化其生成人参皂苷Rg1的LC-MS图。

图28为以人参皂苷F3为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 19催化其生成三七皂苷FP1的HPLC图。

图29为以人参皂苷F3为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 19催化其生成三七皂苷FP1的LC-MS图。

图30为以人参皂苷Rg1为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 12催化其生成三七皂苷R1的HPLC图。

图31为以人参皂苷Rg1为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 12催化其生成三七皂苷R1的LC-MS图。

图32为以人参皂苷Rh1为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 12催化其生成三七皂苷R2的HPLC图。

图33为以人参皂苷Rh1为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 12催化其生成三七皂苷R2的LC-MS图。

图34为以三七皂苷Fd为底物，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成Fd-Xyl的HPLC图。

图35为以三七皂苷Fd为底物，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成Fd-Xyl的LC-MC图。

图36为以三七皂苷Fe为底物，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成Fe-Xyl的HPLC图。

图37为以三七皂苷Fe为底物，UDP-木糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成Fe-Xyl的LC-MC图。

图38为以人参皂苷F2为前体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化产物的HPLC鉴定图。

图39为以人参皂苷F2为前体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化产物的LC-MS鉴定图，其中(A)为人参皂苷Rd，(B)为人参皂苷Rb1。

图40为实施例9工程菌发酵产物的HPLC鉴定图。

图41为以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶突变体PnUGT 87-1，PnUGT 87-2，PnUGT 87-3，PnUGT 87-4催化其生成三七皂苷U的HPLC图。

图42为以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，糖基转移酶突变体PnUGT 19-1，PnUGT 19-2，PnUGT 19-3催化其生成人参皂苷Rg1的HPLC图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明。

一、糖基转移酶基因PnUGT 87、PnUGT 19和PnUGT 12的获得

实施例1：

(1)利用HMMER3.1对已公布的三七全基因组数据进行注释，从已公布的三七基因组中34369个蛋白质中注释得到138个糖基转移酶；

(2)与基因组数据相结合，对三年生三七的根茎、主根、须根组织的样品进行了转录组差异表达分析、氨基酸序列比对、保守结构域和进化树分析，对上述糖基转移酶家族基因库的基因功能进行功能预测；

(3)选取转录表达水平高、与已报道功能基因同源关系近(90％以上)的糖基转移酶进行功能验证；

最后在三七基因组中挖掘得到3个糖基转移酶新基因PnUGT 87、PnUGT 19和PnUGT12；

获得的糖基转移酶PnUGT 87的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：4所示；

获得的糖基转移酶PnUGT 19的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQID NO：5示，

获得的糖基转移酶PnUGT 12的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQID NO：6所示。

二、糖基转移酶重组质粒的构建

实施例2：

(一)三七RNA的提取

(1)将三七根用无菌ddH₂O冲洗干净后，用无菌滤纸吸干水分；

(2)选取新鲜翠绿的根芽，迅速切成小块，转移至提前遇冷过的研钵中进行研磨，在研磨过程中不断补充液氮，直至材料被粉碎成为白色细腻粉末状；

(3)将研磨所得粉末(约100mg)转移至1.5mL离心管中，加入1mL Trizol试剂，充分混匀，室温静置10min，得到混合液a；

(4)将混合液a在4℃、12000rpm条件下离心10min，然后将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，加入200μL氯仿、35μL 3mol/L乙酸钠、15μLβ-巯基乙醇、10μL 1％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，充分混匀后冰浴15min，得到混合液b；

(5)将混合液b在4℃、12000rpm条件下离心10min，然后将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，200μL 3mol/L乙酸钠，-20℃下沉淀1h得到混合液c；

(6)将混合液c在4℃、12000rpm条件下离心10min，弃上清，加入1mL 75％的乙醇洗涤沉淀，得到混合液d；

(7)将混合液d在4℃、12000rpm的条件下离心10min，弃上清，尽量减少乙醇残留，然后真空干燥2min，再加入30μL RNase-free水，室温溶解5min最后在-80℃下保存备用；

(8)取2μL新提的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳分析。

(二)重组质粒的构建

(1)以提取的三七RNA为模板进行反转录，获得cDNA模板；

(2)以cDNA为模板使用引物对PnUGT 87-F1/R1、PnUGT 19-F/R、PnUGT 12-F/R(见表8)进行PCR扩增，获得1.4～1.5kb的扩增产物；

(3)利用琼脂糖凝胶回收PCR产物，获得糖基转移酶基因PnUGT 87及其8个突变体(PnUGT 87氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，8个突变体氨基酸序列在说明书中已说明)、PnUGT 19及其3个突变体(PnUGT 19氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，突变体氨基酸序列在说明书中已说明)、PnUGT 12(PnUGT 12氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)；

(4)分别将上述糖基转移酶及其突变体克隆至pYES3质粒上，得到pYES3-PnUGT87、pYES3-PnUGT 19、pYES3-PnUGT 12重组质粒及突变体基因重组质粒。

三、糖基转移酶基因PnUGT 87、PnUGT 19和PnUGT 12在酿酒酵母中的表达

实施例3：

(一)酿酒酵母W303-1B感受态的制备

(1)挑取酿酒酵母W303-1B单菌落到YPD培养基中，过夜摇培12h后，用分光光度计检测菌液的OD₆₀₀值，待其OD₆₀₀值在0.8～0.9，于6000rpm下离心5min，收集菌体沉淀；

(2)用无菌去离子水洗两次菌体沉淀，再用900μL水重悬，将菌体转移到无菌1.5mL离心管中，13000g离心30s收集菌体；

(3)再用900μL水重悬菌体后进行分装，每管100μL；离心弃上清的菌体即为感受态酿酒酵母W303-1B，用于转化。

(二)糖基转移酶在酿酒酵母中的表达

(1)将pYES3-PnUGT87、pYES3-PnUGT19、pYES3-PnUGT12重组质粒通过醋酸锂转化法转化到感受态酿酒酵母W303-1B中，空载体pYES3作为阴性对照；

(2)加入转化体系，重悬菌体(可以震荡)，于30℃培养箱中保温20min，保温后，轻轻混悬起来；

(3)将保温后的混悬液在42℃热激40min，吸取180μL涂布CM-Trp平板上，培养2d，挑取单克隆测序验证；

(4)将测序正确的菌接种到10mL CM-Trp(2％葡萄糖)培养基中，在30℃、200rpm条件下培养20h；

(5)将培养好的菌液在4℃、6000rpm下离心收集菌体，用无菌去离子水清洗菌体两遍，再用诱导培养基CM-Trp(2％半乳糖)重悬菌体，并接种到50mL诱导培养基中，使OD₆₀₀在0.4左右，然后在30℃、200rpm下诱导表达12h；

(6)将表达菌体在4℃、6000rpm下离心收集菌体，用无菌去离子水清洗菌体两遍，再用酵母裂解缓冲液重悬菌体沉淀，使OD₆₀₀在50～100之间，然后加入与菌体等体积的钢珠，用全自动研磨仪破碎细胞2min，最后在4℃、12000g下离心10min，收集细胞裂解上清液。

四、体外糖基化反应和产物检测方法

实施例4：

以上述步骤得到的重组酿酒酵母W303-1B-pYES3-PnUGT 87、W303-1B-pYES3-PnUGT 19和W303-1B-pYES3-PnUGT 12的细胞裂解液为粗酶液来进行糖基化反应，含空载体重组酿酒酵母W303-1B-pYES3的细胞裂解液作为阴性对照；

糖基化反应体系为：1％吐温-20，5mM UDP-葡萄糖或UDP-木糖，50mM Tris-HCl(pH8.5)，0.5mM皂苷底物，适量粗酶液；

(1)将反应体系混匀后，于30℃水浴锅进行反应12h后，加入200μL正丁醇终止反应；

(2)用旋转蒸发仪蒸干正丁醇后，样品用甲醇溶解，再用0.22μm过滤器过滤，HPLC进行检测；

HPLC检测条件：色谱柱使用安捷伦C18，柱温30℃，检测波长203nm，流动相为水和乙腈。洗脱条件：0min，22.5％乙腈；0～55min，62.5％乙腈；55～60min，62.5％乙腈；60～65min，22.5％乙腈；流速1mL/min。

本实施例以重组酿酒酵母W303-1B-pYES3-PnUGT 87的细胞裂解液上清为粗酶液来进行糖基化反应，所述的粗酶液具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，具体反应如下：

(1)以皂苷CK为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成绞股蓝皂苷LXXV；进行HPLC和LC-MS检测，绞股蓝皂苷LXXV的HPLC图如图1所示；绞股蓝皂苷LXXV的LC-MS图如图2所示。

(2)以人参皂苷Rh2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rg3；进行HPLC检测，人参皂苷Rg3的HPLC图如图3所示。

(3)以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1；进行HPLC检测，人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1的HPLC图如图4所示；人参皂苷Rd的LC-MS如图5所示；人参皂苷Rb1的LC-MS图如图6所示。

(4)以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成绞股蓝皂苷XVII；进行LC-MS检测，绞股蓝皂苷XVII的LC-MS图如图7所示。

(5)以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成越南参皂苷R16；进行HPLC和LC-MS检测，越南参皂苷R16的HPLC图如图8所示；越南参皂苷R16的LC-MS图如图9所示。

(6)以人参皂苷Rd为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rb1；进行HPLC和LC-MS检测，人参皂苷Rb1的HPLC图如图10所示；人参皂苷Rb1的LC-MS图如图11所示。

(7)以人参皂苷Rd为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rb3；进行HPLC和LC-MS检测，人参皂苷Rb3的HPLC图如图12所示；人参皂苷Rb3的LC-MS图如图13所示。

(8)以绞股蓝皂苷XVII为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rb1；进行HPLC和LC-MS检测，人参皂苷Rb1的HPLC图如图14所示；人参皂苷Rb1的LC-MS图如图15所示。

(9)以绞股蓝皂苷XVII为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成三七皂苷L；进行HPLC和LC-MS检测，三七皂苷L的HPLC图如图16所示，三七皂苷L的LC-MS图如图17所示。

(10)以三七皂苷Fd为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rb3；进行HPLC和LC-MS检测，人参皂苷Rb3的HPLC图如图18所示，人参皂苷Rb3的LC-MS图如图19所示。

(11)以三七皂苷Fd为为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成Fd-Xyl；进行HPLC和LC-MS检测，Fd-Xyl的HPLC图如图34所示，Fd-Xyl的LC-MS图如图35所示。

(12)以三七皂苷Fe为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rc；进行HPLC和LC-MS检测，人参皂苷Rc的HPLC图如图20所示，人参皂苷Rc的LC-MS图如图21所示。

(13)以三七皂苷Fe为底物，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成Fe-Xyl；进行HPLC和LC-MS检测，Fe-Xyl的HPLC图如图36所示，Fe-Xyl的LC-MS图如图37所示。

反应(1)～(13)底物的R1、R2经取代后生成的化合物如表1所示。

表1：糖基转移酶PnUGT 87催化PPD型皂苷

反应(1)～(13)的反应式如下：

所述R1、R2、R3、R4为H、单糖糖基或多糖糖基。

所述的糖基供体为UDP-葡萄糖和/或UDP-木糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

实施例5：

(14)以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成三七皂苷U；进行HPLC和LC-MS检测，三七皂苷U的HPLC图如图22所示；三七皂苷U的LC-MS图如图23所示。

上述反应(14)底物的R1、R2经取代后生成的化合物如表2所示。

表2：糖基转移酶PnUGT 87催化PPT型皂苷

反应(14)的反应式如下：

其中，R1为H，R2为单糖糖基；R3为H，R4为多糖糖基。

所述的糖基供体为UDP-葡萄糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

实施例6：

本实施例以重组酿酒酵母W303-1B-pYES3-PnUGT 19的细胞裂解液上清为粗酶液来进行糖基化反应，所述的粗酶液具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，具体反应如下：

(15)为以原人参三醇(PPT)为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rh1；进行HPL和LC-MSC检测，人参皂苷Rh1的HPLC图如图24所示；人参皂苷Rh1的LC-MS图如图25所示。

(16)以人参皂苷F1为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成人参皂苷Rg1；进行HPLC和LC-MS检测，人参皂苷Rg1的HPLC图如图26所示；人参皂苷Rg1的LC-MS图如图27所示。

(17)以人参皂苷F3为糖基受体，UDP-葡萄糖为糖基供体，催化其生成三七皂苷FP1；进行HPLC和LC-MS检测，三七皂苷FP1的HPLC图如图28所示；三七皂苷FP1的LC-MS图如图29所示。

反应(15)～(17)底物的R1、R2经取代后生成的化合物如表3所示。

表3：糖基转移酶PnUGT 19催化PPT型皂苷

反应(15)～(17)的反应式如下：

所述糖基供体为UDP-葡萄糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

实施例7：

本实施例以重组酿酒酵母W303-1B-pYES3-PnUGT 12的细胞裂解液上清为粗酶液来进行糖基化反应，所述的粗酶液具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，具体反应如下：

(18)以人参皂苷Rg1为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成三七皂苷R1；进行HPLC和LC-MS检测，三七皂苷R1的HPLC图如图30所示；三七皂苷R1的LC-MS图如图31所示。

(19)以人参皂苷Rh1为糖基受体，UDP-木糖为糖基供体，催化其生成三七皂苷R2；进行HPLC和LC-MS检测，三七皂苷R2的HPLC图如图32所示；三七皂苷R2的LC-MS图如图33所示。

反应(18)～(19)底物的R1、R2经取代后生成的化合物如表4所示。

表4：糖基转移酶PnUGT 12催化PPT型皂苷

反应(18)～(19)的反应式如下：

所述糖基供体为UDP-木糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

实施例8：

按照实施例3的步骤，将糖基转移酶基因PnUGT 87的4个突变体进行异源表达，表达后的酿酒酵母细胞裂解液上清为粗酶液进行糖基化反应，转空载体pYES3重组酿酒酵母的细胞裂解液作为阴性对照；具体步骤与第四项“体外糖基化反应和产物鉴定”的步骤一样，具体反应如下：

(20)以人参皂苷F1为底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，利用PnUGT 87突变体粗酶液进行体外催化反应，HPLC(具体结果见图41)检测，发现4个PnUGT 87突变体粗酶液的反应体系均检测到一新物质，且该物质与PnUGT 87和人参皂苷F1的产物U保留时间一致，表明在PnUGT 87突变体粗酶液的催化下，人参皂苷F1转化为三七皂苷U。

反应(20)的反应式如下：

其中，R1为H，R2为单糖糖基；R3为H，R4为多糖糖基。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

R1、R2经取代后的化合物如表5所示。

反应(20)底物的R1、R2经取代后生成的化合物如表5所示。

表5：糖基转移酶PnUGT 87突变体催化PPT型皂苷

五、糖基转移酶PnUGT 87的应用

实施例9：

(一)糖基转移酶PnUGT 87的功能验证

pYES3-PnUGT 87重组质粒通过实施例2的方法制备而得。

(1)酿酒酵母W303-1B感受态的制备

挑取酿酒酵母W303-1B单菌落到YPD培养基中，过夜摇培12h后，用分光光度计检测菌液的OD₆₀₀值，待其OD₆₀₀值在0.8～0.9，于6000rpm下离心5min，收集菌体沉淀；用无菌去离子水洗两次菌体沉淀，再用900μL水重悬，将菌体转移到无菌1.5mL离心管中，于13000rpm下离心30s收集菌体；再用900μL水重悬菌体后进行分装，每管100μL；离心弃上清的菌体用于转化。

(3)糖基转移酶PnUGT 87在酿酒酵母中的表达

将pYES3-PnUGT 87重组质粒通过醋酸锂转化法转化到酿酒酵母W303-1B中，空载体pYES3作为阴性对照；加入转化体系重悬菌体，可以震荡；于30℃培养箱中保温20min(保温后，轻轻混悬起来)，42℃下热激40min，吸取180μL涂布与CM-Trp平板上，培养2d，挑取单克隆测序验证。

将测序正确的菌接种到10mL CM-Trp(2％葡萄糖)培养基中，30℃，200rpm条件下培养20h；然后于4℃、6000rpm下离心收集菌体，用无菌去离子水清洗菌体两遍；再用诱导培养基CM-Trp(2％半乳糖)重悬菌体，并接种到50mL诱导培养基中，使OD₆₀₀在0.4左右，30℃，200rpm下诱导表达12h；然后于4℃、6000rpm下离心收集菌体，用无菌去离子水清洗菌体两遍；

用酵母裂解缓冲液重悬菌体沉淀，使OD₆₀₀在50～100之间，加入与菌体等体积的钢珠，用全自动样品快速研磨仪破碎酵母细胞2min，4℃、12000rpm下离心10min，收集细胞裂解液上清。

(4)体外转糖基活性和产物鉴定

以步骤(3)中重组酿酒酵母W303-1B-pYES3-PnUGT 87的细胞裂解液上清为粗酶液来进行转糖基反应，转空载体pYES3重组酿酒酵母的细胞裂解液作为阴性对照，反应时间为12h，通过HPLC对反应产物进行鉴定。

以人参皂苷F2为糖基受体，UDP-Glucose为糖基供体，糖基转移酶PnUGT 87催化其生成人参皂苷Rb1和Rd，产物的HPLC鉴定图如图38所示；产物的LC-MS鉴定图如图39所示。

其中，糖基转移酶PnUGT 17可催化PPD生成人参皂苷Rh2，PnUGT 35可催化人参皂苷Rh2生成人参皂苷F2，糖基转移酶PnUGT 87与F2反应12h，催化其生成人参皂苷单体Rb1。缩短反应时间至30min，检测到中间体人参皂苷Rd。表明糖基转移酶PnUGT 87能够通过连续两步糖基化，催化F2生成Rb1。

(二)PDD底盘细胞的构建

以酵母基因组DNA为模板，设计引物分别扩增基因tHMG1、ERG20、ERG9、ERG1。

以下基因DS(GeneBank:KJ804174.1)、CYP716A47(GeneBank:JN604536)、46ATR1(GeneBank:CAA0396366.1)按照酿酒酵母密码子偏好性委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，合成后构建相关的中间工具质粒(引物信息见表6)。

(1)T1-ERG20-ERG9质粒的构建

设计引物，以T1质粒为模板，扩增T1骨架；以酵母基因组DNA为模板，扩增EGR20和EGR9基因片段；将T1骨架、EGR20和EGR9基因片段通过同源重组技术进行连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)，转化子经测序验证。

(2)T2-ERG1-DS质粒的构建

设计引物，以T2质粒为模板，扩增T2骨架；以酵母基因组DNA为模板，扩增EGR1和DS基因片段；将T2骨架、EGR1和DS基因片段通过同源重组技术进行连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)，转化子经测序验证。

(3)T3-CYP716A47-46ATR1-tHMG1质粒的构建

设计引物，以T3质粒为模板，扩增T3骨架；以金唯智生物科技有限公司构建的质粒为模板，扩增CYP716A47、46ATR1和tHMG1基因片段；将T3骨架、CYP716A47、46ATR1和tHMG1基因片段通过同源重组技术进行连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)，转化子经测序验证。

(4)T4-CYP716A47-46ATR1质粒的构建

设计引物，以T4质粒为模板，扩增T4骨架；以金唯智生物科技有限公司构建的质粒为模板，扩增CYP716A47、46ATR1基因片段；将T4骨架、YP716A47、46ATR1基因片段通过同源重组技术进行连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)，转化子经测序验证。

(5)扩增功能片段

将分别以上述测序正确的转化子为模板，设计引物，扩增功能表达片段(具体如表7所示)：L1-ADH1-ERG20-tPI1-2HXT7-ERG9-PGI7-L2、L2-PGI-ERG1-ADH1-RPL8A-DS-CYC1-L3、L3-ADH1-CYP716A47-46ATR1-tFBA1-ADH3-tHMG1-tPDC1-L4、L4-pGK1-CYP716A47-46ATR1-tTDH1-L5。

T1、T2、T3、T4四个转化子给基因提供启动子、终止子以及同源臂接头；胶回收上述四个功能片段(注：以下的片段书写省略启动子和终止子)。

(6)基因功能片段共转化酿酒酵母BY4742

挑取酿酒酵母BY4742单菌落到YPD培养基中过夜摇培12h，用分光光度计测培养菌液的OD₆₀₀的值，待其OD₆₀₀值在0.8～0.9，6000rpm下离心5min收集菌体，无菌去离子水洗两次，再用900μL水重悬；

将菌体转移到无菌1.5mL离心管中，13000rpm下离心30s收集菌体，再用900μL水重悬菌体后进行分装，每管100μL，离心弃上清，加入240μL PEG3350(50％)、36μL 1.0M的LiAc、10μL鲑鱼精DNA(10mg/mL)、L1-ERG20-ERG9-L2、L2-ERG1-DS-L3、L3-CY P716A47-46ATR1-tHMG1-L4、L4-CYP716A47-46ATR1-L5各200ng、ddH₂O补齐至360μL；

将混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min，42℃下热激40min，涂布CM-His平板，培养2d，挑取单克隆测序验证。

表6：

表7：

引物名称	引物序列(5’→3’)
		L1-TPI1-F	CGTCTCCCCCGGTCCGTTTG
L2-PGIt-R	TAGTCCGCGAGTTGGATAGCC
		L2-ADH1-F	GACAAAGCGCCAAGGAACTGTAATA
L3-CYC1-R	GCGGACTTAGTCCGTTTCT
		L3-tFBA1-F	AACGACGGTAGACGCCAA
L4-tPDC1-R	AGGTTCCAACTGCTCTTACTGT
		L4-PGK1-F	CCAGACGATACAGAGGCTAAGA
L5-tTDH1-R	CGACGAACGAGATACGATAGAAC

(三)人参皂苷Rb1工程菌的构建

(1)糖基转移酶重组质粒的构建

通过RT-PCR从三七根部RNA中扩增PnUGT 17、PnUGT 35和PnUGT 87糖基转移酶基因，使其分别在启动子TDH3、TEF1、ENO2和终止子TPI1、CYC1、PDC1下进行表达，分别构建重组质粒G4-P_TDH3-PnUGT 17-T_TPI1、G4-P_TEF1-PnUGT 35-T_CYC1和G4-P_ENO2-PnUGT87-T_PDC1(引物信息见表8)。

(2)扩增功能片段

分别将以上述测序正确的质粒为模板，设计引物，扩增基因功能表达片段、筛选标签片段、整合位点同源臂(引物信息见表9)，胶回收上述5个功能片段。

挑取实施例9步骤(六)的阳性转化子，培养后制备成感受态，加入240μL PEG3350(50％)、36μL 1.0M的LiAc、10μL鲑鱼精DNA(10mg/mL)、基因功能片段up-URA3、P_TDH3-PnUGT17-T_TPI1、P_TEF1-PnUGT 35-T_CYC1、P_ENO2-PnUGT 87-T_PDC1、down of URA3各200ng、ddH₂O补齐至360μL；将混合好的转化体系重悬菌体，于30℃培养箱中保温20min，42℃下热激40min，涂布CM-URA3平板，培养2d，挑取单克隆测序验证。

(3)Rb1工程菌的培养及产物的提取

挑取步骤(2)得到的阳性转化子，接种到CM-URA液体培养基的直行瓶中，30℃，200rpm下培养2d，作为一级种子液，接种1％一级种子液到50mL YPD培养基中，30℃、200rpm下培养3d得到发酵液。

取5mL发酵液，6000rpm离心5min，收集菌体，菌体用ddH₂O清洗一遍，加入0.5mL裂解液(甲醇：丙酮＝1：1)重悬菌体，加入等菌体的钢珠，用高通量研磨仪研磨细胞3min，13000rpm、5min离心，上清液用0.22μm的滤器过滤，HPLC检测Rb1和中间体产量。

HPLC检测条件为：

色谱柱使用安捷伦C18；柱温为30℃；紫外波长为203nm；流动相为水和乙腈；流速为1mL/min；

洗脱条件为梯度洗脱，0min：22.5％乙腈、0～15min：22.5％～62.5％乙腈、15～20min：62.5％乙腈、20～21min：62.5％～90％乙腈、21～25min：90％乙腈、25～26min：90％～22.5％乙腈、26～28min：22.5％乙腈。

检测结果如图40所示，重组酵母裂解液中含有人参皂苷Rb1单体和中间体Rh2、F2、Rd、ⅩⅦ，表明3个糖基转移酶基因PnUGT 87和PnUGT 17、PnUGT 35协同表达，可实现人参皂苷Rb1的从头合成。

表8：

表9：

引物名称	引物序列(5’→3’)
		Z-up-F	CTAGGGAAGACAAGCAACGA
Z-URA3-R	CTTCTTGTTGTTGACGCTAACATTCAACGCTAGTATGGGTAATAACTGATATAATTAAA
		Z-TDH3-F	AATTAGAGCTTCAATTTAATTATATCAGTTATTACCCATACTAGCGTTGAATGTTAGCG
Z-TPI1-R	TGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCCTATATAACAGTTGAAATTTGG
		Z-CYC1-F	GAGAAGATGTTCTTATCCAAATTTCAACTGTTATATAGGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG
Z-TEF1-R	CTATAGAGTAAAGAACCCTTTCTATACCCGCAGCGTCGAAGTGATCCCCCACACACCAT
		Z-ENO2-F	AGAAACATTTTGAAGCTATGGTGTGTGGGGGATCACTTCGACGCTGCGGGTATAGAAAG
Z-PDC1-R	ATTTTTTTTTTTTCGTCATTATAGAAATCATTACGACCTGTTCCTTAATCAAGGATACC
		Z-down-F	CAAGGAAAAAAAAAGAGGTATCCTTGATTAAGGAACAGGTCGTAATGATTTCTATAATG
Z-down-R	GTCCCAAGGCAGCGTTTTG

实施例10：

按照实施例3的步骤，将糖基转移酶基因PnUGT 19的3个突变体进行异源表达，表达后的酿酒酵母细胞裂解液上清为粗酶液进行糖基化反应，转空载体pYES3重组酿酒酵母的细胞裂解液作为阴性对照；具体步骤与第四项“体外糖基化反应和产物鉴定”的步骤一样，具体反应如下：

(21)以人参皂苷F1为底物，UDP-葡萄糖为糖基供体，利用PnUGT 19突变体粗酶液进行体外催化反应，HPLC(具体结果见图42)检测，发现3个PnUGT 19突变体粗酶液均检测到一新物质，且该物质的保留时间与人参皂苷Rg1一致，表明在PnUGT 19突变体粗酶液的催化下，人参皂苷F1被转化为人参皂苷Rg1。

反应(21)的反应式如下：

所述糖基供体为UDP-葡萄糖。

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

反应(21)底物的R1、R2经取代后生成的化合物如表10所示。

表10：糖基转移酶PnUGT 19突变体催化PPT型皂苷

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 广西科学院

<120> 一组糖基转移酶基因及其在制备三七/人参皂苷中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1341

<212> DNA

<213> PnUGT 87

<400> 1

atggatatcg aaaaaggtag aatcagtata gttatgctgc catttttagc ccatggtcac 60

atatctccat tctttgagct agccaagcat ctctcaaaaa gaaattgcaa tatattcctc 120

tgttctaccc caatcaatct tagctccatc aagaacagag tatctgataa ggattcctct 180

gcttctataa aactagtaga gcttcatctt ccatcttccc ctgatcttcc tcctcagtac 240

cacaccacaa atggcctccc ttcccatctc atggtcccac tcaaaaacgc ctttgaaaca 300

gtaggcccca ccttctctga aatccttaaa accttagacc ctgatttgct tatttatgat 360

ttcaatccct catgggcacc ggagatcgct ttgtctcaca atattccggc agtttatttc 420

ctaacctcgg cagcagccac ctcttccgtg gccctacgtg ctttgaaaaa cccaggtgaa 480

aaatacccat ttccagattt ttatgataac agtaatatta cccctgaacc accttctgca 540

gataaaatga agctatttca tgattttgtt gcttgtttca aacgatcttg cgacattatt 600

ttgattaaga gttttagaga actagaaggg aaatatattg atttgctttc cactttatct 660

aagaaaactt tggttcctgt tggtccactc gttcaagatc ctttgggaca tgatgaagat 720

ccaaaaacag ggcatcttat aaactggctt gacaaaaggg ctgaatctac agtggtgttt 780

gtctgctttg gaagtgagta ttttccctcc aatgaggaat tggaagaagt agcaattggg 840

ctagagatta gcatggttaa tttcatattg gctgtgagat ttcttgaagg agagaaaaaa 900

ggggttttac cagaggggtt tgttcaaagg gtaggagaca gaggattggt tgtggagggg 960

tgggctccac aggcaagaat tttaggacat tcaagcaccg gtgggtttgt gagccattgt 1020

gggtggagtt ctattatgga gagtgtgaag tttggggttc cagtaattgc catggccagg 1080

catcttgatc agcctttgaa tgctaagctg gcggcggagg tcggtgtggg catggaggtt 1140

gtgagagatg aaaatgggaa gtataagaga gaagcgattg cagaggtaat aagaaaagtc 1200

gtgatggaga aaaatgggga ggttatcagg aggaaagcaa gggaattgag tgagaaaatg 1260

aaagagacag gagagcaaga gattggtagg gcagtggagg agctagtaca aatttgtaag 1320

atgaagaaag acgcacaata t 1341

<210> 2

<211> 1422

<212> DNA

<213> PnUGT 19

<400> 2

atgaagtcag aattgatatt cgtgcccgtc ccggccatcg gacacctcgt ggggatgatg 60

gagatggcta aacttttcat cagtcgacac gaaaacctct cggtcaccgt cctcatctcg 120

aaattcttca ttgatacggg tatagacaac tacaataaat cactctttgc gaaacctacc 180

ccgcgtctca caattataaa tctcccggaa atcgatcccc aaaaatattt gctcaaacca 240

cgttgcgcca tctttccttc cttcatcgag aatcagaaga cacacgtgcg agacgtaatt 300

tcccgcatga ctcagtccga gtcgactcgg gtcgttggtt tgctggcaga cattttgttc 360

gtcgacatct tcgacattgc cgatgagttc aatgttccaa cttatgtata ctcccctgcc 420

ggagccggtt ttcttggcct cgcgttccac ctccagacac tcaacgacga caaaatgcaa 480

gatgtgaccg agttcaggaa ctcggacact gagttattgg taccgagttt tgcaaacccg 540

gtccccgccg aggtcttgcc gtcgatattt ttggataaag aaggtaggca tgatgttttg 600

ttatcattgt accggaggtg cagggagaca aagggaatta ttgttaacac gtttgaggag 660

ctggaaccct atgcgatcaa ttccctccgg ctggatagta tgatccctcc gatatacccg 720

gtgggaccca tactaaatct caacggtgag ggccaaaact ccgatgaggc tgctgtgatc 780

cttggttggt tagatgatca accaccttca tctgtggtgt ttttgtgctt tggcagcttt 840

ggaagctttc cagaaaacca ggtgaaagag attgcaatgg gtctagagcg cagtgggcat 900

cgcttcttgt ggtccttgcg tccgtatatc tctgaaggtg agacaaagct tcaacttaaa 960

tactcaaatt tggaaacaaa tctcccagcc gacttcttgg ataggacatc atgtctcgga 1020

aaagtgattg gatgggcccc acaaatgtcc gtgctagcac acgaggcagt cggagggttc 1080

gtgtctcatt gtggttggaa ttcggcacta gagagtgtgt ggtatggcat gcctgtcgca 1140

acatggccaa tgtacggtga gcaacaactc aacgcttttg agatagttaa ggagttgggt 1200

cttgcggtgg aaattgaggt ggactatagg aatgaatata acaagactga ttttattgtt 1260

aaggctgacg aaattgagac gaaaataaag aagttgatga tggatggaaa gaatagtgaa 1320

ataaggaaga aggtaaagga aatgaaagaa aagagtaggg ctgccgtgtc agagaatgga 1380

tcatcttata cttctttggc gaaactattt gaggaaatta tg 1422

<210> 3

<211> 1338

<212> DNA

<213> PnUGT 12

<400> 3

atggataacc aagaggctag aatctctatc gtcatgcttc cattcttggc ccacggacac 60

atcagtcctt tcttcgaact tgccaagcat ttgtctaaaa gaaactgcaa tatttttttg 120

tgttctactc caatcaactt gtcttctatt aaaaatagag tttctgataa agactcttct 180

gcttctatca agttggtcga acttcacttg ccatctagtc cagacttgcc tcctcactac 240

cacactacca acggtttgcc aagtcacttg atggtccctt tgaggaacgc ctttgaaacc 300

gccggtccta ccttcagtga aatccttaaa actttgaatc cagatttgct tatctacgac 360

ttcaacccat cttgggcccc agagatcgcc tcttctcaca acatcccagc cgtctgcttc 420

atcattggtg gtgccgcctc tagtagtatg tctttgcatt cttttaagaa tcccggtgaa 480

aaatatcctt tcttggattt cgatgaaaac tctaacatca ccccagagcc tccaagtgcc 540

gataacatga aattgttcct tgacttcatg acttgtttcg agaggagttg tgacatcatc 600

cttatcaagt ctttcagaga attggaagga aaatactttg attttttcag taccctttct 660

gacaagactg tcgtcccagt tggtccattg gttcaagacc caatgggaca caacgaggac 720

ccaaagaccg agcagttcat caactggctt gataagaggg ccgagtctac cgtcgttttt 780

gtctgcttcg gttctgaata tttcttgtct aacgaagaat tggaggaggt cgccatcggt 840

ttggagatta gtatggttaa cttcatctgg gccgttagat ttttggaggg tgagaagaaa 900

ggtgtcttgc cagagggttt cgttcagaga gtcggtgata gaggtcttgt tgtcgaaggt 960

tgggctccac aagctaggat cttgggacac tcttctaccg gaggttttgt cagtcactgt 1020

ggttggtcta gtatcaccga gtctatgaag ttcggtgtcc cagttatcgc catggccaga 1080

cacttcgatc agcctcttaa cggtaaattg gccgctgagg ttggtgtcgg aatggaagtc 1140

gttagagacg agaacggaaa gtacaagagg gaagatatcg ctggtgttat caggaaagtc 1200

gtcgtcgaga agtctggtga ggttattaga aggaaggcca gagaattgag tgagaaaatg 1260

aaggaaaagg gtgaacaaga aatcgatagg gtcgttgagg aacttgtcca gatctgcaag 1320

aaaaaaaaag acgagcaa 1338

<210> 4

<211> 447

<212> PRT

<213> PnUGT 87

<400> 4

Met Ala Ile Gly Leu Gly Ala Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Pro Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Pro Pro Gly Leu Ala Leu His Leu Ser

20 25 30

Leu Ala Ala Cys Ala Ile Pro Leu Cys Ser Thr Pro Ile Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Leu Ala Ala Val Ser Ala Leu Ala Ser Ser Ala Ser Ile Leu

50 55 60

Leu Val Gly Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Ala Leu Pro Pro Gly Thr

65 70 75 80

His Thr Thr Ala Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Leu Ala

85 90 95

Ala Pro Gly Thr Val Gly Pro Thr Pro Ser Gly Ile Leu Leu Thr Leu

100 105 110

Ala Pro Ala Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ala Pro Gly

115 120 125

Ile Ala Leu Ser His Ala Ile Pro Ala Val Thr Pro Leu Thr Ser Ala

130 135 140

Ala Ala Thr Ser Ser Val Ala Leu Ala Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly

145 150 155 160

Leu Thr Pro Pro Pro Ala Pro Thr Ala Ala Ser Ala Ile Thr Pro Gly

165 170 175

Pro Pro Ser Ala Ala Leu Met Leu Leu Pro His Ala Pro Val Ala Cys

180 185 190

Pro Leu Ala Ser Cys Ala Ile Ile Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Leu

195 200 205

Gly Gly Leu Thr Ile Ala Leu Leu Ser Thr Leu Ser Leu Leu Thr Leu

210 215 220

Val Pro Val Gly Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly His Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Leu Thr Gly His Leu Ile Ala Thr Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ser

245 250 255

Thr Val Val Pro Val Cys Pro Gly Ser Gly Thr Pro Pro Ser Ala Gly

260 265 270

Gly Leu Gly Gly Val Ala Ile Gly Leu Gly Ile Ser Met Val Ala Pro

275 280 285

Ile Leu Ala Val Ala Pro Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Val Leu Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Gly Gly

305 310 315 320

Thr Ala Pro Gly Ala Ala Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Pro

325 330 335

Val Ser His Cys Gly Thr Ser Ser Ile Met Gly Ser Val Leu Pro Gly

340 345 350

Val Pro Val Ile Ala Met Ala Ala His Leu Ala Gly Pro Leu Ala Ala

355 360 365

Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Val Gly Met Gly Val Val Ala Ala Gly

370 375 380

Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ile Ala Gly Val Ile Ala Leu Val

385 390 395 400

Val Met Gly Leu Ala Gly Gly Val Ile Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu

405 410 415

Ser Gly Leu Met Leu Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ile Gly Ala Ala Val

420 425 430

Gly Gly Leu Val Gly Ile Cys Leu Met Leu Leu Ala Ala Gly Thr

435 440 445

<210> 5

<211> 474

<212> PRT

<213> PnUGT 19

<400> 5

Met Leu Ser Gly Leu Ile Pro Val Pro Val Pro Ala Ile Gly His Leu

1 5 10 15

Val Gly Met Met Gly Met Ala Leu Leu Pro Ile Ser Ala His Gly Ala

20 25 30

Leu Ser Val Thr Val Leu Ile Ser Leu Pro Pro Ile Ala Thr Gly Ile

35 40 45

Ala Ala Thr Ala Leu Ser Leu Pro Ala Leu Pro Thr Pro Ala Leu Thr

50 55 60

Ile Ile Ala Leu Pro Gly Ile Ala Pro Gly Leu Thr Leu Leu Leu Pro

65 70 75 80

Ala Cys Ala Ile Pro Pro Ser Pro Ile Gly Ala Gly Leu Thr His Val

85 90 95

Ala Ala Val Ile Ser Ala Met Thr Gly Ser Gly Ser Thr Ala Val Val

100 105 110

Gly Leu Leu Ala Ala Ile Leu Pro Val Ala Ile Pro Ala Ile Ala Ala

115 120 125

Gly Pro Ala Val Pro Thr Thr Val Thr Ser Pro Ala Gly Ala Gly Pro

130 135 140

Leu Gly Leu Ala Pro His Leu Gly Thr Leu Ala Ala Ala Leu Met Gly

145 150 155 160

Ala Val Thr Gly Pro Ala Ala Ser Ala Thr Gly Leu Leu Val Pro Ser

165 170 175

Pro Ala Ala Pro Val Pro Ala Gly Val Leu Pro Ser Ile Pro Leu Ala

180 185 190

Leu Gly Gly Ala His Ala Val Leu Leu Ser Leu Thr Ala Ala Cys Ala

195 200 205

Gly Thr Leu Gly Ile Ile Val Ala Thr Pro Gly Gly Leu Gly Pro Thr

210 215 220

Ala Ile Ala Ser Leu Ala Leu Ala Ser Met Ile Pro Pro Ile Thr Pro

225 230 235 240

Val Gly Pro Ile Leu Ala Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ala Ser Ala Gly

245 250 255

Ala Ala Val Ile Leu Gly Thr Leu Ala Ala Gly Pro Pro Ser Ser Val

260 265 270

Val Pro Leu Cys Pro Gly Ser Pro Gly Ser Pro Pro Gly Ala Gly Val

275 280 285

Leu Gly Ile Ala Met Gly Leu Gly Ala Ser Gly His Ala Pro Leu Thr

290 295 300

Ser Leu Ala Pro Thr Ile Ser Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Leu Leu

305 310 315 320

Thr Ser Ala Leu Gly Thr Ala Leu Pro Ala Ala Pro Leu Ala Ala Thr

325 330 335

Ser Cys Leu Gly Leu Val Ile Gly Thr Ala Pro Gly Met Ser Val Leu

340 345 350

Ala His Gly Ala Val Gly Gly Pro Val Ser His Cys Gly Thr Ala Ser

355 360 365

Ala Leu Gly Ser Val Thr Thr Gly Met Pro Val Ala Thr Thr Pro Met

370 375 380

Thr Gly Gly Gly Gly Leu Ala Ala Pro Gly Ile Val Leu Gly Leu Gly

385 390 395 400

Leu Ala Val Gly Ile Gly Val Ala Thr Ala Ala Gly Thr Ala Leu Thr

405 410 415

Ala Pro Ile Val Leu Ala Ala Gly Ile Gly Thr Leu Ile Leu Leu Leu

420 425 430

Met Met Ala Gly Leu Ala Ser Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Gly Met

435 440 445

Leu Gly Leu Ser Ala Ala Ala Val Ser Gly Ala Gly Ser Ser Thr Thr

450 455 460

Ser Leu Ala Leu Leu Pro Gly Gly Ile Met

465 470

<210> 6

<211> 446

<212> PRT

<213> PnUGT 12

<400> 6

Met Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ile Ser Ile Val Met Leu Pro Pro Leu

1 5 10 15

Ala His Gly His Ile Ser Pro Pro Pro Gly Leu Ala Leu His Leu Ser

20 25 30

Leu Ala Ala Cys Ala Ile Pro Leu Cys Ser Thr Pro Ile Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Ile Leu Ala Ala Val Ser Ala Leu Ala Ser Ser Ala Ser Ile Leu

50 55 60

Leu Val Gly Leu His Leu Pro Ser Ser Pro Ala Leu Pro Pro His Thr

65 70 75 80

His Thr Thr Ala Gly Leu Pro Ser His Leu Met Val Pro Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Pro Gly Thr Ala Gly Pro Thr Pro Ser Gly Ile Leu Leu Thr Leu

100 105 110

Ala Pro Ala Leu Leu Ile Thr Ala Pro Ala Pro Ser Thr Ala Pro Gly

115 120 125

Ile Ala Ser Ser His Ala Ile Pro Ala Val Cys Pro Ile Ile Gly Gly

130 135 140

Ala Ala Ser Ser Ser Met Ser Leu His Ser Pro Leu Ala Pro Gly Gly

145 150 155 160

Leu Thr Pro Pro Leu Ala Pro Ala Gly Ala Ser Ala Ile Thr Pro Gly

165 170 175

Pro Pro Ser Ala Ala Ala Met Leu Leu Pro Leu Ala Pro Met Thr Cys

180 185 190

Pro Gly Ala Ser Cys Ala Ile Ile Leu Ile Leu Ser Pro Ala Gly Leu

195 200 205

Gly Gly Leu Thr Pro Ala Pro Pro Ser Thr Leu Ser Ala Leu Thr Val

210 215 220

Val Pro Val Gly Pro Leu Val Gly Ala Pro Met Gly His Ala Gly Ala

225 230 235 240

Pro Leu Thr Gly Gly Pro Ile Ala Thr Leu Ala Leu Ala Ala Gly Ser

245 250 255

Thr Val Val Pro Val Cys Pro Gly Ser Gly Thr Pro Leu Ser Ala Gly

260 265 270

Gly Leu Gly Gly Val Ala Ile Gly Leu Gly Ile Ser Met Val Ala Pro

275 280 285

Ile Thr Ala Val Ala Pro Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Val Leu Pro

290 295 300

Gly Gly Pro Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Gly Gly

305 310 315 320

Thr Ala Pro Gly Ala Ala Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Pro

325 330 335

Val Ser His Cys Gly Thr Ser Ser Ile Thr Gly Ser Met Leu Pro Gly

340 345 350

Val Pro Val Ile Ala Met Ala Ala His Pro Ala Gly Pro Leu Ala Gly

355 360 365

Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Val Gly Met Gly Val Val Ala Ala Gly

370 375 380

Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ala Ile Ala Gly Val Ile Ala Leu Val

385 390 395 400

Val Val Gly Leu Ser Gly Gly Val Ile Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu

405 410 415

Ser Gly Leu Met Leu Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ile Ala Ala Val Val

420 425 430

Gly Gly Leu Val Gly Ile Cys Leu Leu Leu Leu Ala Gly Gly

435 440 445

Claims

1.一种糖基转移酶基因，其特征在于：所述的糖基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ IDNOs：1、2或3所示。

2.一种如权利要求1所述的糖基转移酶基因编码的糖基转移酶，其特征在于：所述的糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NOs：4、5或6所示，或者所述的氨基酸序列如SEQ ID NOs：4、5所示的糖基转移酶的突变体。

3.一种表达载体，其特征在于：所述的载体含有权利要求1所述的糖基转移酶基因。

4.一种宿主细胞，其特征在于：所述的宿主细胞含有如权利要求3所述的载体。

5.一种如权利要求2所述的糖基转移酶的应用，其特征在于：用作糖基催化反应的催化制剂，催化四环三萜类化合物形成糖基化的四环三萜类化合物；所述的催化四环三萜类化合物形成糖基化的四环三萜类化合物的催化反应为以下一种或多种反应：

(I)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C3-O-Glc位点，以延伸糖链；

(II)将来自糖基供体的糖基转移到四环三萜类化合物的C20-O-Glc位点，以延伸糖链；

6.根据权利要求5所述的糖基转移酶的应用，其特征在于：

所述的催化反应(I)的反应式如下：

其中，R1、R2、R3、R4为H、单糖糖基或多糖糖基；所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；

所述的催化反应(II)的反应式如下：

其中，R1为H，R2为单糖糖基；R3为H，R4为多糖糖基；所述的糖基转移酶具有如SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列；

所述的催化反应(III)的反应式如下：

其中，R1为H，R2为H、单糖糖基或多糖糖基，R3均为单糖糖基，R4为H、单糖糖基或多糖糖基；所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；

所述的催化反应(IV)的反应式如下：

其中，R1为单糖糖基，R2为H或单糖糖基，R3为多糖糖基，R4为H或单糖糖基；

所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的糖基转移酶的应用，其特征在于：所述的糖基催化反应的底物为式(I)、(III)、(V)或(VII)化合物，且所述的产物为式(II)、(IV)、(VI)或(VIII)化合物；

具体的，所述的式(I)化合物为皂苷CK，并且式(II)化合物为绞股蓝皂苷LXXV；

或者，所述的式(I)化合物为三七皂苷Fe，并且式(II)化合物为人参皂苷Rc或皂苷Fe-Xyl；

或者，所述的式(III)化合物为人参皂苷F1，并且式(IV)化合物为三七皂苷U；

或者，所述的式(VII)化合物为人参皂苷Rh1，并且式(VIII)化合物为三七皂苷R2；

所述的糖基供体为尿苷二磷酸(UDP)糖：UDP-葡萄糖和/或UDP-木糖。

8.一种如权利要求4所述的宿主细胞的用途，其特征在于：用于制备糖基催化反应的酶催化试剂、或产生糖基转移酶、或产生糖基化的四环三萜类化合物。

9.根据权利要求1所述的SEQ ID NO：1编码的糖基转移酶的应用，其特征在于：所述的糖基转移酶具有如SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，用作糖基催化反应的催化制剂，催化人参皂苷F2形成人参皂苷Rb1。

10.根据权利要求9所述的糖基转移酶的应用，其特征在于：所述的人参皂苷F2，是由糖基转移酶PnUGT 17催化PPD生成人参皂苷Rh2，再由糖基转移酶PnUGT 35催化人参皂苷Rh2生成的。