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CN115069099A - 具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用 - Google Patents

具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用 Download PDF

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CN115069099A
CN115069099A CN202210777677.0A CN202210777677A CN115069099A CN 115069099 A CN115069099 A CN 115069099A CN 202210777677 A CN202210777677 A CN 202210777677A CN 115069099 A CN115069099 A CN 115069099A
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nucleic acid
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buffer solution
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polymer
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Abstract

本发明涉及一种具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用，制备方法：将邻苯二酚类化合物和多胺化合物同时施加到聚合物多孔膜的表面上后，诱导邻苯二酚类化合物与多胺化合物之间发生迈克尔加成反应和席夫碱反应，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；应用：利用具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率为85％以上；本发明的制备方法工艺简单；本发明的产品应用于核酸分离纯化时，具有较高的回收效率。

Description

具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用
技术领域
本发明属于高分子材料技术领域，具体地涉及一种具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用。
背景技术
核酸是携带有重要遗传信息的生物大分子，核酸检测技术在遗传学、药理学、诊断及法医学等多领域起到了关键作用。生物、医药技术的快速发展离不开简捷高效的核酸分离纯化技术，但是现有核酸分离纯化方法在实际应用过程中仍存在着著多问题，核酸的分离纯化新技术、新材料的研发意义重大。亲和膜色谱技术作为新兴的分离纯化技术，同时具有膜分离技术与色谱法相关优势，已广泛应用于多种生物大分子的分离纯化，在DNA分离纯化中具有巨大潜力。
现有的生物核酸分离纯化方法及其存在的问题主要有：
(1)有机溶剂萃取法
采用苯酚、氯仿等有机溶剂从生物样品中液相萃取得到纯化核酸的方法。核酸的提取和纯化时，涉及有毒溶剂的大量使用，威胁生命健康，破坏生态环境；抽提、离心等复杂的纯化过程耗时费力，自动化操作无法实现。
(2)固相吸附法
不同固相(如硅胶膜、纤维素、磁珠等)利用与核酸分子之间的特异性结合作用，将核酸分子吸附到固相表面，后经过洗涤、解吸附步骤，实现核酸的分离纯化。固相吸附法在在实验操作、有机溶剂使用等方便得到了改善，因而是目前最为常用的方法，但在纯化过程中存在着尺寸适应性差、回收效率低的问题。
因此，研究一种具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用以解决上述问题具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的问题，提供一种具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制法和应用。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，将邻苯二酚类化合物和多胺化合物同时施加到聚合物多孔膜的表面上后，诱导邻苯二酚类化合物与多胺化合物之间发生迈克尔加成反应和席夫碱反应，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；
利用具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率为85％以上(回收效率＝产出的核酸的量/投入的核酸的量×100％)；现有技术通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率很难超过70％，例如CN202011480478.0中提到未经纯化前的DNA浓度为83.12nm/L，使用玻璃纤维素膜或变性硅胶膜纯化后的DNA浓度为42.17nm/L，回收效率仅为50.7％；CN201080020635.8中采用磁珠法纯化DNA，投入DNA平均量为5.43μg，产出DNA平均量为1.24μg，回收效率仅为22.8％；CN201810136469.6中采用磁珠固相分离技术，对于小尺寸核酸的回收效率仅为65～70％左右；
本发明的原理如下：
本发明的原料之一为聚合物多孔膜，其孔径、种类可调，制备方法不限，可适用于不同尺寸、不同形态的核酸分子分离纯化。
本发明中邻苯二酚类化合物基于海洋生物贻贝粘附特性，对于多种基材具有较强的粘附力，可对不同膜材料进行涂覆改性。
本发明中邻苯二酚类化合物与多胺化合物可发生迈克尔加成反应和席夫碱反应上生成聚合物，该聚合物可均匀涂覆在聚合物多孔膜上得到聚合物亲和膜。
本发明可赋予聚合物多孔膜高密度、高含量的核酸亲和配基，即：氨基。该亲和配基可在不同缓冲溶液条件(pH值)下实现质子化和去质子转变，即实现与核酸分子间基于氨基静电作用的结合和释放，从而制备得到了具有高效核酸分离纯化能力的聚合物亲和膜。
作为优选的技术方案：
如上所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体过程为：先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为6.0～10.0的缓冲溶液中，配置邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻(目的是避免施加到聚合物多孔膜之前邻苯二酚类化合物与多胺化合物之间发生迈克尔加成反应和席夫碱反应)将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中进行共涂覆改性，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜。
如上所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，所述邻苯二酚类化合物为儿茶酚、没食子酸、单宁酸、原儿茶酸、儿茶酸或槲皮苷；所述多胺化合物为三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、六乙烯七胺、多乙烯多胺或聚乙烯亚胺。
如上所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，所述邻苯二酚类化合物溶液的浓度为0.1～5mg/ml。
如上所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，所述混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:4～4:1。
如上所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.01～5μm，厚度为20～2000μm，孔隙率为40％～85％；所述聚合物多孔膜与所述混合溶液的质量体积比为0.1～10mg:20～100ml。
如上所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，所述共涂覆改性的时间为0.1～12h，温度为20～60℃。
本发明还提供一种采用如上任一项所述的制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，步骤如下：
(1)将1～15张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(2)向纯化柱中加入含有核酸的样品溶液与吸附缓冲液的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4.0～6.0；
(3)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；所述洗涤缓缓冲液为含有水溶性有机溶剂的溶液；
(4)向纯化柱中加入回收缓冲液，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的2～10％，3000～9000g离心过滤20～240s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为7.5～12.0，且高于洗涤缓冲液的pH值。
本发明通过使含有核酸的样品溶液与吸附缓冲液的混合溶液与所述亲和膜接触，使得所述核酸吸附到所述亲和膜上；通过使洗涤缓冲液与所述膜接触来洗涤该亲和膜，在此期间所述核酸仍吸附在该亲和上；通过使回收缓冲液与所述亲和膜接触，使得所述核酸从该亲和膜释放；通过合理控制各缓冲液的pH值保证其能够发挥相应的功能。
作为优选的技术方案：
如上所述的应用，步骤(2)中，所述含有核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为100bp～30kp，浓度为1～200ng/μl；所述含有核酸的样品溶液与所述吸附缓冲液的体积比为1:1～1:10。
如上所述的应用，步骤(3)中，所述水溶性有机溶剂为C1～C3的醇类。
有益效果
(1)本发明的制备方法，操作简单便捷，原料成本低廉，适用于工业化大规模生产。
(2)本发明制备的聚合物亲和膜，对核酸的回收效率为85％以上。
(3)本发明制备的聚合物亲和膜，具有较高的核酸尺寸适用性，对于尺寸100bp～30kb的核酸均具有较高的核酸回收效率。
附图说明
图1为实施例1中聚醚砜亲和膜表面的SEM图；
图2为实施例1中聚醚砜亲和膜截面的SEM图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以下各实施例和对比例中使用NanoDrop微量分光光度计测定纯化核酸溶液A260吸光度，表征纯化核酸溶液浓度及核酸回收效率，NanoDrop为表征核酸浓度的专用仪器，其测试原理为通过测定核酸溶液的A260吸光度给出核酸浓度。
实施例1
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：儿茶酚；
多胺化合物：多乙烯多胺；
聚合物多孔膜：聚醚砜膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.1μm，厚度为500μm，孔隙率为70％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为5mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照0.1mg:20ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于50℃下共涂覆改性12h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜，具体如图1和图2所示；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为2:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将5张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为200bp，浓度为50ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的8％，9000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8.5。
核酸的回收效率为87％。
对比例1
一种国产SiO2膜纯化柱的应用过程，具体步骤基本同实施例1的聚合物亲和膜的应用的步骤，不同之处仅在于步骤(I)中准备的是国产SiO2膜纯化柱(SanPrep Column PCRProduct Purification Kit，由生工生物工程(上海)股份有限公司生产)。
核酸的回收效率为55％。
与实施例1相比，对比例1的核酸的回收效率远远低于实施例1，这是因为实施例1中的聚合物亲和膜所具有的高密度、高数量的氨基为核酸分子的膜上吸附提供更强的结合能力；同时实施例1中的聚合物亲和膜基于氨基提供的不同缓冲溶液条件(pH值)下正负电位变化，可以提高核酸分子的释放效率。
实施例2
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：单宁酸；
多胺化合物：聚乙烯亚胺；
聚合物多孔膜：聚偏氟乙烯膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.6μm，厚度为180μm，孔隙率为80％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为8的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为1mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照1mg:30ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于35℃下共涂覆改性9h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将12张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，5000g离心过滤90s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为4.8kb，浓度为75ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:6；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，5000g离心过滤120s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，5000g离心过滤120s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为7.5。
核酸的回收效率为92％。
实施例3
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：儿茶酸；
多胺化合物：三乙烯四胺；
聚合物多孔膜：聚砜膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.4μm，厚度为250μm，孔隙率为66％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为6.5的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为3mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照2mg:60ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于40℃下共涂覆改性12h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:4。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将7张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，6000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为3kb，浓度为30ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，6000g离心过滤90s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，6000g离心过滤90s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8.5。
核酸的回收效率为85％。
实施例4
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：没食子酸；
多胺化合物：多乙烯多胺；
聚合物多孔膜：聚丙烯腈膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为2μm，厚度为140μm，孔隙率为72％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为9的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为0.5mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照0.1mg:25ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于50℃下共涂覆改性9h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为4:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将13张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤150s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为8.5kb，浓度为100ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:3；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤150s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，4000g离心过滤150s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为12。
核酸的回收效率为89％。
实施例5
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：槲皮苷；
多胺化合物：六乙烯七胺；
聚合物多孔膜：聚氯乙烯膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.05μm，厚度为1500μm，孔隙率为56％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为10的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为1mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照5mg:80ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于20℃下共涂覆改性0.5h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:3。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将1张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，8000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为5.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为150bp，浓度为150ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:1；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，8000g离心过滤90s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的8％，8000g离心过滤90s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8。
核酸的回收效率为90％。
实施例6
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：儿茶酚；
多胺化合物：多乙烯多胺；
聚合物多孔膜：聚苯砜膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.2μm，厚度为350μm，孔隙率为65％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为8.5的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为5mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照0.1mg:20ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于30℃下共涂覆改性2h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为2:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将8张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，8000g离心过滤40s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为200bp，浓度为50ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:8；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，8000g离心过滤60s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的8％，8000g离心过滤60s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为9。
核酸的回收效率为93％。
实施例7
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：儿茶酸；
多胺化合物：多乙烯多胺；
聚合物多孔膜：乙烯-乙烯醇共聚物膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为1.5μm，厚度为150μm，孔隙率为75％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为8的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为0.1mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照0.5mg:40ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于30℃下共涂覆改性12h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为3:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将10张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，4000g离心过滤120s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为6.5kb，浓度为50ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:8；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤120s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的8％，4000g离心过滤120s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为10。
核酸的回收效率为85％。
实施例8
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：单宁酸；
多胺化合物：多乙烯多胺；
聚合物多孔膜：聚丙烯膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为4μm，厚度为1500μm，孔隙率为60％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为7的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为0.2mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照1mg:40ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于55℃下共涂覆改性0.5h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:4。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将1张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤160s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为12kb，浓度为5ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:4；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤160s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，5000g离心过滤160s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为12。
核酸的回收效率为88％。
实施例9
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：儿茶酸；
多胺化合物：多乙烯多胺；
聚合物多孔膜：聚乙烯膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为5μm，厚度为600μm，孔隙率为48％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为10的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为3mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照10mg:200ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于60℃下共涂覆改性1h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为4:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将3张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤160s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为30kb，浓度为150ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:4；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，6000g离心过滤120s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，6000g离心过滤120s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为10。
核酸的回收效率为86％。
实施例10
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：原儿茶酸；
多胺化合物：聚乙烯亚胺；
聚合物多孔膜：聚甲基丙烯酸甲酯；所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.01μm，厚度为300μm，孔隙率为45％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为9的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为5mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照5mg:120ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于25℃下共涂覆改性8h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为2:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将6张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤30s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为100bp，浓度为150ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:10；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，9000g离心过滤40s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，9000g离心过滤30s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为11。
核酸的回收效率为92％。
实施例11
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：没食子酸；
多胺化合物：聚乙烯亚胺；
聚合物多孔膜：聚四氟乙烯膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为3μm，厚度为700μm，孔隙率为65％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为8的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为3mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照2mg:50ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于30℃下共涂覆改性6h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:1。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将3张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，4000g离心过滤120s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为13kb，浓度为200ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，5000g离心过滤120s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，4000g离心过滤240s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为12。
核酸的回收效率为87％。
实施例12
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：原儿茶酸；
多胺化合物：四乙烯五胺；
聚合物多孔膜：聚醚砜膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为1μm，厚度为75μm，孔隙率为74％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为7的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为2mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照10mg:100ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于40℃下共涂覆改性1h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:2。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将15张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的80％，3000g离心过滤240s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为5.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为5.5kb，浓度为15ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:5；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，3000g离心过滤240s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的2％，3000g离心过滤240s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为8。
核酸的回收效率为90％。
实施例13
具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)原料的准备：
邻苯二酚类化合物：儿茶酚；
多胺化合物：五乙烯六胺；
聚合物多孔膜：聚偏氟乙烯膜；所述聚合物多孔膜的平均孔径为1.2μm，厚度为120μm，孔隙率为82％；
(2)先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为6的缓冲溶液(缓冲溶液具体为Tris-HCl缓冲溶液)中，配置浓度为1mg/ml的邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻按照5mg:100ml的质量体积比将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中，于30℃下共涂覆改性3h，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；其中，混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:3。
采用上述制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，具体步骤如下：
(I)将12张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(II)向纯化柱中加入核酸的样品溶液(溶剂为超纯水)与吸附缓冲液(具体为磷酸盐缓冲液)的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的90％，5000g离心过滤160s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4.5；核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为6.0kb，浓度为30ng/μl；核酸的样品溶液与吸附缓冲液的体积比为1:6；
(III)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的90％，5000g离心过滤160s，去除收集管中溶液；洗涤缓缓冲液为含80wt％乙醇的超纯水，洗涤缓缓冲液的pH值为7；
(IV)向纯化柱中加入回收缓冲液(具体为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的10％，5000g离心过滤160s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为10。
核酸的回收效率为93％。
本发明中聚合物多孔膜的制备方法不限，本发明示例性地提供一种聚合物多孔膜的制备方法，具体过程为：首先将聚合物溶解在溶剂中，得到聚合物溶液，然后向聚合物溶液中添加致孔剂后搅拌至完全溶解，得到铸膜液，最后将铸膜液按照非溶剂致相分离法制成聚合物多孔膜；
所述溶剂为非质子性极性溶剂，所述聚合物为可溶于非质子性极性溶剂的聚合物，所述聚合物溶液的质量分数为14％～30％；
所述非质子性极性溶剂为DMAc、DMSO、NMP或DMF；所述可溶于非质子性极性溶剂的聚合物为聚醚砜、聚砜、聚偏氟乙烯、聚苯砜、聚氯乙烯或乙烯-乙烯醇共聚物；
所述致孔剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物，所述铸膜液中致孔剂的质量分数为1％～5％；
所述非溶剂致相分离法中的凝固浴为水或含有机溶剂的水溶液；
现结合具体实施例进行说明：
实施例12的聚醚砜膜的制备过程为：首先将聚醚砜溶解在DMAc中，配置为质量分数为14％的聚醚砜溶液，然后向聚醚砜溶液中添加致孔剂聚乙烯吡咯烷酮，搅拌至完全溶解得到铸膜液A，其中致孔剂占铸膜液质量分数为2％，最后将铸膜液按照非溶剂致相分离法制成聚合物多孔膜。
实施例13的聚偏氟乙烯膜的制备过程为：首先将聚偏氟乙烯溶解在DMAc中，配置为质量分数为13％的聚偏氟乙烯溶液，然后向聚偏氟乙烯溶液中添加致孔剂聚乙烯吡咯烷酮，搅拌至完全溶解得到铸膜液A，其中致孔剂占铸膜液质量分数为1％，最后将铸膜液按照非溶剂致相分离法制成聚合物多孔膜。

Claims (10)

1.具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，将邻苯二酚类化合物和多胺化合物同时施加到聚合物多孔膜的表面上后，诱导邻苯二酚类化合物与多胺化合物之间发生迈克尔加成反应和席夫碱反应，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜；
利用具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜通过固相吸附法对核酸进行分离纯化时，核酸的回收效率为85％以上。
2.根据权利要求1所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，具体过程为：先将邻苯二酚类化合物溶解在pH值为6.0～10.0的缓冲溶液中，配置邻苯二酚类化合物溶液，再向邻苯二酚类化合物溶液中添加多胺化合物，完全溶解得到混合溶液后，即刻将聚合物多孔膜浸润在混合溶液中进行共涂覆改性，得到具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜。
3.根据权利要求2所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚类化合物为儿茶酚、没食子酸、单宁酸、原儿茶酸、儿茶酸或槲皮苷；所述多胺化合物为三乙烯四胺、四乙烯五胺、五乙烯六胺、六乙烯七胺、多乙烯多胺或聚乙烯亚胺。
4.根据权利要求2所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚类化合物溶液的浓度为0.1～5mg/ml。
5.根据权利要求2所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，所述混合溶液中邻苯二酚类化合物和多胺化合物摩尔比为1:4～4:1。
6.根据权利要求2所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，所述聚合物多孔膜的平均孔径为0.01～5μm，厚度为20～2000μm，孔隙率为40％～85％；所述聚合物多孔膜与所述混合溶液的质量体积比为0.1～10mg:20～100ml。
7.根据权利要求2所述的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的制备方法，其特征在于，所述共涂覆改性的时间为0.1～12h，温度为20～60℃。
8.采用如权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的具有高效核酸分离纯化功能的聚合物亲和膜的应用，其特征在于，步骤如下：
(1)将1～15张的聚合物亲和膜堆叠置于纯化柱中；
(2)向纯化柱中加入含有核酸的样品溶液与吸附缓冲液的混合溶液，混合溶液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；吸附缓冲液的pH值为4.0～6.0；
(3)向纯化柱中加入洗涤缓冲液，洗涤缓冲液的体积为纯化柱容量的30～100％，3000～9000g离心过滤20～240s，去除收集管中溶液；所述洗涤缓缓冲液为含有水溶性有机溶剂的溶液；
(4)向纯化柱中加入回收缓冲液，回收缓冲液的体积为纯化柱容量的2～10％，3000～9000g离心过滤20～240s得到纯化核酸溶液；回收缓冲液的pH值为7.5～12.0，且高于洗涤缓冲液的pH值。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述含有核酸的样品溶液中核酸分子片段大小为100bp～30kp，浓度为1～200ng/μl；所述含有核酸的样品溶液与所述吸附缓冲液的体积比为1:1～1:10。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述水溶性有机溶剂为C1～C3的醇类。
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