[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN115054735A - 多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用 - Google Patents

多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115054735A
CN115054735A CN202210792585.XA CN202210792585A CN115054735A CN 115054735 A CN115054735 A CN 115054735A CN 202210792585 A CN202210792585 A CN 202210792585A CN 115054735 A CN115054735 A CN 115054735A
Authority
CN
China
Prior art keywords
uhmwpe
scaffold
epl
swelling
porous composite
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210792585.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN115054735B (zh
Inventor
田彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Stomatological Hospital
Original Assignee
Beijing Stomatological Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Stomatological Hospital filed Critical Beijing Stomatological Hospital
Priority to CN202210792585.XA priority Critical patent/CN115054735B/zh
Publication of CN115054735A publication Critical patent/CN115054735A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115054735B publication Critical patent/CN115054735B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/28—Materials for coating prostheses
    • A61L27/34—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
    • A61L27/44—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix
    • A61L27/46—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix with phosphorus-containing inorganic fillers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本发明涉及医用支架领域，公开一种UHMWPE/HA多孔复合支架及其制备方法与应用、EPL修饰支架及其制备方法与应用，该制备方法包括：S1将超高分子量聚乙烯、羟基磷灰石与可选地抗氧剂混合得到混合原料；S2在搅拌条件下，将混合原料与软化剂混合进行溶胀溶解得到溶胀溶解后的混合原料；S3将溶胀溶解后的混合原料送至螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架；S4将UHMWPE/HA复合支架在萃取剂中进行萃取。制备得到的UHMWPE/HA多孔复合支架内部具有大量的孔道，可以负载具有特殊化学和生物学性能的化合物，同时具有良好的生物相容性和骨诱导性能，还能够使用EPL修饰本发明的UHMWPE/HA多孔复合支架。

Description

多孔复合支架及其制备方法与应用、EPL修饰支架及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及医用支架技术领域，具体涉及一种UHMWPE/HA多孔复合支架及其制备方法与应用、EPL修饰支架及其制备方法与应用。
背景技术
骨缺损是临床常见病，自体骨移植技术是治疗骨缺损的一个重要手段，能通过自体骨移植来引导或诱导骨成型，达到治疗骨缺损的目的，但是在临床应用中自体骨移植依然存在一些不可避免的弊端，例如：(1)供区取材的局限性；(2)供区手术可能出现二次创伤。
骨组织工程作为一种新型而有效的骨缺损修复方法正在逐步替代自体骨移植技术。骨组织工程是在工程支架上接种或募集种子细胞，工程支架促使种子细胞的迁移、黏附、增殖和分化，从达到修复骨缺损的目的。其中，工程支架作为种子细胞的临时细胞外基质，是骨组织工程中的关键材料。理想的工程支架应具有完全连通的三维结构，合适的孔隙大小，同时还可以模仿细胞外基质为种子细胞提供迁移、黏附，增殖和分化的微环境，还要具有良好的生物相容性，并且，良好的机械性能对于骨组织工程支架而言也是极其重要的。
超高分子量聚乙烯(ultra-highmolecularweightpolyethylene,UHMWPE)的耐冲击性和耐磨损性能优异。然而超高分子量聚乙烯属于非生物活性材料，单独应用于骨组织工程时缺乏骨诱导性，不能满足骨组织工程支架材料的需求。
羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是天然骨组织无机物的主要组成成分。因其具有良好的机械性能、生物相容性、骨诱导性能，被认为是理想的骨替代材料。但是，羟基磷灰石抗拉强度低而且质地脆的缺点是不可忽视的。
感染是骨移植术后早期和后期常见的并发症之一，并可能导致最终骨缺损修复的失败，目前常使用一些具有抗菌作用的物质修饰支架，但存在抗菌物负载率不高，导致最终的支架性能不稳定。
发明内容
本发明的目的是为了克服医用支架中力学性、生物活性不佳以及不具备抗感染效果等问题，提供一种骨组织工程用支架。
如前述，超高分子量聚乙烯聚乙烯具有优异的耐冲击性和耐磨损性能，但是其属于非生物活性材料，不能单独用于骨组织工程支架材料，羟基磷灰石具有良好的生物活性，但是其抗拉强度低而且质地脆，在试验中，发明人相利用这两者组分来制备骨组织工程用支架，但是单独的超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石的相容性较差，形成的支架力学强度不稳定，性能优势得不到显现。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种UHMWPE/HA多孔复合支架的制备方法，该制备方法包括：
S1将超高分子量聚乙烯、羟基磷灰石与可选地抗氧剂混合得到混合原料；
S2在搅拌条件下，将混合原料与软化剂混合进行溶胀溶解得到溶胀溶解后的混合原料；
S3将溶胀溶解后的混合原料送至双螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架；
S4将UHMWPE/HA复合支架在萃取剂中进行萃取。
本发明第二方面提供一种由上述UHMWPE/HA多孔复合支架的制备方法制得的UHMWPE/HA多孔复合支架。
如前述，现有的支架的抗感染效果不佳，ε-多聚赖氨酸(ε-poly-lysine，EPL)是L-赖氨酸残基的阳离子均聚物，由ε-氨基和α-羧基依次连接而成。EPL由于其本身所具有的生物安全性、广谱抗菌、水溶性、生物可降解性、热稳定性、良好的生物相容性以及低成本的特点，所以EPL广泛应用于食物防腐、制药、材料表面改性及基础研究细胞培养等领域。
本发明第四方面提供了由上述制备方法制得的EPL修饰支架。
本发明第五方面提供了上述UHMWPE/HA多孔复合支架或上述EPL修饰支架在骨组织工程支架中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有下述有益效果：
1、制备得到的UHMWPE/HA多孔复合支架内部具有大量的孔道，可以负载具有特殊化学和生物学性能的化合物，同时具有良好的生物相容性和骨诱导性能；
2、UHMWPE/HA多孔复合支架具有内部大量的孔道、优异的力学性能和耐磨性能，使EPL修饰的UHMWPE/HA多孔复合支架同样具有优异的力学性能和耐磨性能；
3、使用EPL修饰的UHMWPE/HA多孔复合支架在体内具有良好的生物相容性以及组织再生诱导和免疫调节功能；
4、本发中的UHMWPE与HA具有良好的相容性，使得使用EPL修饰支架具有增强的组织生长和骨缺损修复能力。
附图说明
图1为实施例1中UHMWPE/HA支架在金黄色葡萄球菌中共培养后的图片；
图2为实施例1中EPL修饰支架在金黄色葡萄球菌中共培养后的图片；
图3为实施例1中UHMWPE/HA支架在大肠杆菌中共培养后的图片；
图4为实施例1中EPL修饰支架在大肠杆菌中共培养后的图片；
图5为实施例1中UHMWPE/HA支架在口腔变异链球菌中共培养后的图片，支架试样周围无抑菌环。
图6为实施例1中UHMWPE/HA支架在口腔变异链球菌中共培养后的图片，支架试样周围有抑菌环。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种UHMWPE/HA多孔复合支架的制备方法，该制备方法包括：
S1将超高分子量聚乙烯、羟基磷灰石与可选地抗氧剂混合得到混合原料；
S2在搅拌条件下，将混合原料与软化剂混合进行溶胀溶解得到溶胀溶解后的混合原料；
S3将溶胀溶解后的混合原料送至螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架；
S4将UHMWPE/HA复合支架在萃取剂中进行萃取。
超高分子量聚乙烯(UHMWPE)具有良好的耐磨性和耐冲击性，但是其属于非生物活性材料，羟基磷灰石(HA)是天然骨组织无机物的主要组成成分，但是其质地脆，发明人发现，两者在复合时存在相容性不佳的问题，在本发明中，超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石相互作用不仅增加了聚合物材料表面生物活性，而且改善了羟基磷灰石的脆性，形成的UHMWPE/HA多孔复合支架内部有大量的孔道，可以负载具有特殊化学和生物学性能的化合物，同时支架具有良好的力学性能和羟基磷灰石的组织再生诱导性，发明人推测，超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石先进行溶胀溶解后再在螺杆剪切作用下能够使得超高分子量聚乙烯在软化剂中进一步溶解，促进羟基磷灰石与超高分子量聚乙烯，软化剂更容易进入超高分子量聚乙烯内部，使得部分羟基磷灰石能够很好的存在于超高分子量聚乙烯内部，在羟基磷灰石促进作用下更容易形成均一稳定的孔道。
根据本发明，在步骤S1中，混合的方式没有限制，只要能实现超高分子量聚乙烯、羟基磷灰石与可选地抗氧剂的混合即可。
根据本发明，发明人前期经过大量实验得到，在一些实施方式中，所述超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石的质量比为(0.25-9):1，例如0.25:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1、2.3:1、2.5:1、3:1、4:1、6:1或9:1，及上述任意数值组成的范围，优选为(1-2.5):1，以采用前述实施方式，能够分子量聚乙烯与羟基磷灰石两者更好的相容，充分发挥两者的优异性能。
根据本发明，只要能实现本发明的目的，所述软化剂与超高分子量聚乙烯的加入量没有限定，在一些实施方式中，所述软化剂与超高分子量聚乙烯的质量比大于3:1，优选为(5-30):1，例如5:1、8:1、10:1、12:1、15:1、20:1或30:1，以及上述任意数值组成的范围，更优选为((8-15):1，采用前述实施方式，使超高分子量聚乙烯能够更加更好的溶解，同时使得羟基磷灰石与超高分子量聚乙烯的相容性更好，进一步促进了支架的生物相容性。
根据本发明，本领域的技术人员知晓超高分子量聚乙烯为平均分子量不小于200万的热塑性工程塑料，只要能实现本发明的目的，所述超高分子量聚乙烯的选择没有限制，在一些实施方式中，所述超高分子量聚乙烯的黏均分子量为200-800万，优选为300-600万(例如300万、350万、400万、420万、480万、560万或600万，以及上述任意数值组成的范围)。采用前述实施方式，能够生物支架具有优异的力学性能和耐磨性，同时制备得到的支架具有较好的孔隙率。
根据本发明，所述羟基磷灰石的平均粒径为50-800um(例如50um、80um、100um、150um、200um、300um、400um或500um，以及上述任意数值组成的范围)，优选为100-400um。采用前述实施方式，能够生物支架具有良好的机械性能、生物相容性、骨诱导性能。同时由于羟基磷灰石作为无机成分，可能会作为一个成核点，有利于孔道的形成，提高药物等活性物质的负载量。
根据本发明，在一些实施方式中，所述溶胀溶解的条件包括：溶胀溶解温度为70-200℃。
根据本发明，在步骤S2中，可以理解的是，搅拌是为了促进溶胀溶解的进行，对搅拌的方式没有限定，本领域的技术人员可根据本发明选择搅拌的方式，本发明对步骤S2中搅拌的方式不多加赘述。
根据本发明，在一些优选的实施方式中，所述软化剂的沸点大于螺杆温度。采用前述实施方式，避免了软化剂不均匀的地进入超高分子量聚乙烯内部导致形成的孔道不均匀的缺陷。
根据本发明，在一些实施方式中，所述软化剂的沸点为200-350℃、更优选为250-300℃。
根据本发明，只要能实现本发明的目的，所述软化剂的种类没有限定，在一些实施方式中，所述软化剂包括白油和/或液体石蜡。
根据本发明，在一些优选的实施方式中，所述软化剂为白油。采用前述实施方式，能够更好的促进超高分子量聚乙烯的溶胀溶解，同时白油具有良好的生物相容性，进一步增加了UHMWPE/HA多孔复合支架的生物相容性。
根据本发明，在一些实施方式中，在步骤S2中，溶胀溶解条件包括：溶胀溶解温度为70-200℃。
根据本发明，在一些优选的实施方式中，溶胀溶解条件包括：采用分温度阶段方式溶胀溶解；“分温度阶段方式”指不同时间阶段阶段的在不同温度下进行溶胀溶解。
根据本发明，在一些优选的实施方式中，溶胀溶解条件包括：先在60-70℃(例如60℃、62℃、65℃、70℃，以及上述任意数值组成的范围)下溶胀溶解3h以上(例如3.5h、4h、5h、6h、7h，以及上述任意数值组成的范围)；然后在70-200℃(例如70℃、80℃、90℃、120℃、140℃、150℃、180℃或200℃，以及上述任意数值组成的范围)下溶胀溶解30h以上。
根据本发明，在一些更优选的实施方式中，溶胀溶解条件包括：先在60-70℃下溶胀溶解5-6h；然后在90-140℃下溶胀溶解40-60h。
根据本发明，采用前述溶胀溶解条件能够更好的实现超高分子量聚乙烯的溶胀溶解，同时促进羟基磷灰石与超高分子量聚乙烯的相容性，更好的促进了制备得到的UHMWPE/HA多孔复合支架中稳定均一的多孔结构的形成，使得UHMWPE/HA多孔复合支架具有较好的力学性能的同时，还具有良好的生物相容性和骨诱导性能。
根据本发明，只要能实现本发明的目的，所述螺杆挤出机的类型没有限定，在一些实施方式中，在步骤S3中，所述螺杆挤出机为双螺杆挤出机或单螺杆挤出机，优选为双螺杆挤出机。
根据本发明，在一些优选的实施方式中，所述双螺杆挤出机螺杆的长径比7-18(例如7、10、12、15、16或10，以及上述任意数值组成的范围)，优选为10-15。
根据本发明，在一些实施方式中，在步骤S3中，螺杆转速为50-500rpm(例如50rpm、100rpm、200pm、300rpm、400rpm或50rpm，以及上述任意数值组成的范围)，优选为100-200rpm。
根据本发明，在一些实施方式中，在步骤S3中，螺杆温度为200-300℃(例如200℃、220℃、230℃、250℃、260℃、270℃、280℃、290℃或300℃，以及上述任意数值组成的范围)，优选为200-250℃。
根据本发明，可以理解的是，螺杆区的级数没有限制，只要温度在螺杆温度范围内即可。
根据本发明，采用前述实施方式，在双螺杆的剪切力作用下，使得超高分子量聚乙烯在白油中进一步溶解，分子链充分解缠，发明人推测采用前述实施方式还进一步促进了羟基磷灰石之间的相容性，同时无机成分羟基磷灰石还能作为成核点进一步促进了多孔结构的形成和稳定性。
根据本发明，步骤S3中模具的选择没有限制，可以根据所需支架的形状进行选择，在此不多加赘述。
根据本发明，只要能达到将UHMWPE/HA复合支架孔道内部的白油抽提出来的目的的萃取剂均适用于本申请，在一些实施方式中，所述萃取剂包括C5-C9环烷烃，优选包括C6-C8环烷烃，C6-C8环烷烃的实例有环己烷、环庚烷和环辛烷。
根据本发明，只要能将孔道内部的白油抽提出来，本领域技术人员可以根据需要选择萃取的操作方式，在一些实施方式中，萃取的操作方式为：将UHMWPE/HA复合支架放入萃取剂中搅拌萃取24-48h。
根据本发明，可选地氧化剂指混合原料可以根据需要选自加入氧化剂或是不加入氧化剂，在一些实施方式中，所述可选地抗氧剂的质量为混合原料质量的0-1％，优选为0.3-0.5％。
根据本发明，所述氧化剂的种类没有限定，本发明中抗氧剂N，N-二苯基对苯二胺作为示例性说明本发明的优势，但本发明不局限于此。
根据本发明，在一些实施方式中，步骤S4后还包括干燥、灭菌步骤，即
根据本发明，在一些实施方式中，干燥温度为70-80℃，干燥温度为70-80℃，干燥时间大于18h(例如为20h、22h、24h、26h、28h、32h，以及上述任意数值组成的范围)。
根据本发明，灭菌的方式没有限制，本发明中使用钴60辐照灭菌，但灭菌的方式并不限于此。
本发明第二方面提供一种由上述UHMWPE/HA多孔复合支架的制备方法制得的UHMWPE/HA多孔复合支架。
根据本发明，在一些实施方式中，所述多孔复合支架的平均孔隙率为30-70％，优选为45-55％；在一些实施方式中，所述多孔复合支架的压缩强度为5-15MPa，优选为13-15MPa。
根据本发明，本发明制备得到的UHMWPE/HA多孔复合支架具有内部大量的孔道、优异的力学性能和耐磨性能以及在体内具有良好的生物相容性以及组织再生诱导。
本发明第三方面提供一种EPL修饰支架的制备方法，该制备方法包括将所述UHMWPE/HA多孔复合支架浸入ε-多聚赖氨酸水溶液中搅拌后取出、干燥。
根据本发明，可以理解的是，ε-多聚赖氨酸水溶液与UHMWPE/HA多孔复合支架的量没有要求，只要ε-多聚赖氨酸水溶液能将UHMWPE/HA多孔复合支架完全浸没即可，本发明对此不多加赘述。
根据本发明，只要能实现本发明的目的，所述ε-多聚赖氨酸水溶液的浓度没有限制，在一些实施方式中，所述ε-多聚赖氨酸水溶液的浓度大于0.5mg/ml；优选为1-10mg/ml(例如1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、9mg/ml、10mg/ml，以及上述任意数值组成的范围)。
根据本发明，只要能实现本发明的目的，搅拌的条件没有限制，在一些实施方式中，搅拌转速小于200r/min；优选为30-80r/min(例如30r/min、40r/min、50r/min、60r/min、75r/min、80r/min，以及上述任意数值组成的范围)。
根据本发明，在一些实施方式中，搅拌时间大于30h(例如35h、40h、45h、48h、50h、55h、65h、70h，80h以及上述任意数值组成的范围)，优选为48-72h。
根据本发明，干燥的条件没有限制，在本发明中不多加赘述。
如前述，感染是骨移植术后早期和后期常见的并发症之一，并可能导致最终骨缺损修复的失败，根据本发明，发明人发现使用ε-多聚赖氨酸能够较好的修饰本发明的UHMWPE/HA多孔复合支架使得支架具有且抗感染的仿生微环境。
本发明第四方面提供了由上述制备方法制得的EPL修饰支架。
根据本发明，在一些实施方式中，所述EPL修饰支架的平均孔隙率为35-65％；优选为40-50％。
根据本发明，EPL修饰支架中有UHMWPE、HA、EPL存在，其在在体内具有良好的生物相容性以及组织再生诱导和免疫调节功能。
本发明第五方面提供了上述UHMWPE/HA多孔复合支架或上述EPL修饰支架在骨组织工程支架中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，以下实施例和对比例中：
以下实施例和对比例中的部分测试方法如下：
1、平均孔隙率检测
取3个支架样本，游标卡尺测量每个样本的体积记录为V，电子天平测量每个样本的重量记录为W0；然后将支架完全浸入到无水乙醇溶液中，直到无水乙醇完全浸入到支架孔隙中，取出支架并测量此时支架的重量记录为W1；最后，根据公式：孔隙率(％)＝(W1-W0)/ρV×100％，(‘ρ’代表无水乙醇的密度＝0.789g/ml)计算出支架的孔隙率。测量后取3个样本的平均值。
2、压缩性能测试
通过万能试验机来检测；将支架样本裁剪成10×10×5mm的试样，每组支架5个重复试样在温度为25℃、湿度为50±5％的环境中，用夹具夹持样本，逐步施加静态压缩负荷，实验速度为1mm/min；测试其压缩强度；
3、抗菌性能测试
使用金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，大肠杆菌(Escherichiacoli)，和口腔变异链球菌(Streptococcusmutans)来检测支架的抗菌性能。
细菌培养
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于营养琼脂固体培养基中，在有氧条件下置于37℃电热恒温培养箱中培养。24小时后用一次性无菌棉拭子取少量菌苔于无菌生理盐水中，超声震荡混匀，用比浊仪法调节菌悬液浓度为108CFU/ml，得到金黄色葡萄球菌悬液和大肠杆菌悬液；
将口腔变异链球菌接种于MSA厌氧固体培养基中，培养在兼性厌氧环境下。48小时后取数个变异链球菌菌落接种于MSA液态培养基中，在兼性厌氧环境培养，24小时后用分光光度仪法调节菌悬液浓度为108CFU/ml，得到口腔变异链球菌悬液。
抑菌圈实验
实验通过扩散法来检测EPL修饰支架的抑菌性能。平板制备方法采用预加菌液倾注平板法。按要求配置营养琼脂培养基，高压蒸汽灭菌，在培养基未凝固之前加入上述调配好的金黄色葡萄球菌悬液。使得最终菌浓度为106CFU/ml,手动摇匀。取细菌培养皿加入混有菌种的培养基13ml/皿；在培养基未凝固之前分别放入UHMWPE/HA支架试样、EPL修饰支架支架试样。室温凝固后置于恒温电热培养箱中共培养。24小时后观察各支架周围是否有抑菌圈出现。
大肠杆菌和口腔变异链球菌抑菌实验均按照上述方法进行。不同的是大肠杆菌最终菌浓度为105CFU/ml，口腔变异链球菌最终菌浓度为104CFU/ml。另外，口腔变异链球菌需要在兼性厌氧环境中培养。
支架试样周围均出现明显的抑菌环，说明支架具有良好的抑菌性能，支架周围无抑菌环出现，说明无抑菌功能。
实施例1
(1)UHMWPE/HA多孔复合支架的制备
在50℃，将质量比为6:4的超高分子量聚乙烯(黏均分子量为400万)与羟基磷灰石(平均粒径为300um)以及重量为超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石总重量的0.3％的抗氧剂N，N-二苯基对苯二胺加入高速搅拌机中，搅拌均匀混合30min得到混合原料；
按质量比白油(7号白油、温度在300℃附近)：超高分子量为10:1，在65℃搅拌状态下将混合原料与白油溶胀溶解6h后，再升温至120℃溶胀溶解48h得到溶胀溶解后的混合原料；将溶胀溶解后的混合原料送至双螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架，其中，双螺杆挤出机螺杆的长径比为12，螺杆转速为150rpm；螺杆一区温度为210℃、螺杆二区温度210℃、螺杆三区温度220℃、螺杆四区温度220℃、螺杆五区温度210℃；
将得到的UHMWPE/HA复合支架放入环己烷中，搅拌萃取骨架材料中的白油，经过36h后取出放入75℃的烘箱内进行干燥24h后经钴60辐照灭菌得到UHMWPE/HA多孔复合支架，密封包装备用。
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
图1为UHMWPE/HA支架在金黄色葡萄球菌中共培养后的图片，支架试样周围无抑菌环；图3为UHMWPE/HA支架在大肠杆菌中共培养后的图片，支架试样周围无抑菌环；图5为UHMWPE/HA支架在口腔变异链球菌中共培养后的图片，支架试样周围无抑菌环。
(2)EPL修饰支架的制备
将ε-多聚赖氨酸溶于无菌去离子水，制备成终浓度为5mg/ml的EPL水溶液，在50r/min下，将制备得到的UHMWPE/HA多孔复合支架浸入EPL水溶液中，72h后取出，在无菌容器内室温过夜干燥得到EPL修饰支架，密封无菌保存备用。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
通过FT-IR检测得在1000-1100cm-1波长处有非常明显的吸收峰，说明有HA的存在；在1500-1600、1050cm-1波长处有非常明显的吸收峰，说明有EPL的存在；在2925、2850cm-1波长处有非常明显的吸收峰，说明有UHMWPE存在。
图2为EPL修饰支架在金黄色葡萄球菌中共培养后的图片，支架试样周围有抑菌环；图4为EPL修饰支架在大肠杆菌中共培养后的图片，支架试样周围有抑菌环；图6为UHMWPE/HA支架在口腔变异链球菌中共培养后的图片，支架试样周围有抑菌环。
实施例2
按照实施例1的方法，不同的是：UHMWPE/HA多孔复合支架的制备，EPL修饰支架的制备与实施例1相同，即UHMWPE/HA多孔复合支架的制备如下所示：
UHMWPE/HA多孔复合支架的制备
在50℃，将质量比为5：5的超高分子量聚乙烯(黏均分子量为500万)与羟基磷灰石(平均粒径为400um)以及重量为超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石总重量的0.3％的抗氧剂N，N-二苯基对苯二胺加入高速搅拌机中，搅拌均匀混合30min得到混合原料
按质量比白油(3号白油、温度在250℃附近)：超高分子量为8:1，在60℃搅拌状态下将混合原料与白油溶胀溶解6h后，再升温至90℃溶胀溶解60h得到溶胀溶解后的混合原料；将溶胀溶解后的混合原料送至双螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架，其中，双螺杆挤出机螺杆的长径比为12，螺杆转速为150rpm；螺杆一区温度为210℃、螺杆二区温度210℃、螺杆三区温度220℃、螺杆四区温度220℃、螺杆五区温度210℃；
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
UHMWPE/HA支架在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、口腔变异链球菌中共培养后的图片与图1、图3、图5类似。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
FT-IR检测结果与实施例1中的类似。
EPL修饰支架在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、口腔变异链球菌中共培养后的图片与图2、图4、图6类似。
实施例3
按照实施例1的方法，不同的是UHMWPE/HA多孔复合支架的制备，EPL修饰支架的制备与实施例1相同，即UHMWPE/HA多孔复合支架的制备如下所示：
UHMWPE/HA多孔复合支架的制备
在50℃，将质量比为7：3的超高分子量聚乙烯(黏均分子量为600万)与羟基磷灰石(平均粒径为100um)以及重量为超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石总重量的0.3％的抗氧剂N，N-二苯基对苯二胺加入高速搅拌机中，搅拌均匀混合30min得到混合原料；
按质量比白油：超高分子量为15:1，在60℃搅拌状态下将混合原料与白油溶胀溶解6h后，再升温至140℃溶胀溶解40h得到溶胀溶解后的混合原料；将溶胀溶解后的混合原料送至双螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架，其中，双螺杆挤出机螺杆的长径比为12，螺杆转速为150rpm；螺杆一区温度为210℃、螺杆二区温度210℃、螺杆三区温度220℃、螺杆四区温度220℃、螺杆五区温度210℃；
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
UHMWPE/HA支架在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、口腔变异链球菌中共培养后的图片与图1、图3、图5类似。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
FT-IR检测结果与实施例1中的类似。
EPL修饰支架在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、口腔变异链球菌中共培养后的图片与图2、图4、图6类似。
实施例4
按照实施例1的方法，不同的是：
双螺杆挤出机螺杆的长径比为7。
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
实施例5
按照实施例1的方法，不同的是：
按质量比白油：超高分子量为10:1，在120℃搅拌状态下将混合原料与白油溶胀溶解50h后得到溶胀溶解后的混合原料。
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
实施例6
按照实施例1的方法，不同的是：
所述羟基磷灰石的平均粒径为600um；
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
实施例7
按照实施例1的方法，不同的是：
按质量比白油：超高分子量为10:1，在30℃搅拌状态下将混合原料与白油溶胀溶解6h后，再升温至250℃溶胀溶解48h得到溶胀溶解后的混合原料。
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
对比例1
(1)UHMWPE多孔支架的制备
在50℃，将实施例1中的超高分子量聚乙烯以及重量为超高分子量聚乙烯总重量的0.3％的抗氧剂N，N-二苯基对苯二胺加入高速搅拌机中，搅拌均匀混合30min得到混合原料
按质量比白油：超高分子量为10:1，在65℃、搅拌状态下将混合原料与白油溶胀溶解6h后，再升温至120℃溶胀溶解48h得到溶胀溶解后的混合原料；将溶胀溶解后的混合原料送至双螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE复合支架，其中，双螺杆挤出机螺杆的长径比为12，螺杆转速为150rpm；螺杆一区温度为210℃、螺杆二区温度210℃、螺杆三区温度220℃、螺杆四区温度220℃、螺杆五区温度210℃
将得到的UHMWPE复合支架放入环己烷中，搅拌萃取骨架材料中的白油，经过36h后取出放入75℃的烘箱内进行干燥24h后经钴60辐照灭菌得到UHMWPE多孔复合支架，密封包装备用。
UHMWPE多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
(2)EPL修饰支架的制备
将ε-多聚赖氨酸溶于无菌去离子水，制备成终浓度为5mg/ml的EPL水溶液，在50r/min下，将制备得到的UHMWPE多孔复合支架浸入EPL水溶液中，72h后取出，在无菌容器内室温过夜干燥得到EPL修饰支架，密封无菌保存备用。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
对比例2
按照实施例1的方法，不同的是：
实施例1中得到的溶胀溶解后的混合原料不送入双螺杆挤出机中，而直接送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架，其余与实施例1相同。
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
对比例3
按照实施例1的方法，不同的是：
实施例1中白油与超高分子量的混合原料不进行溶胀溶解，而是直接送至双螺杆挤出机中，经螺杆剪切，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架，其余同实施例1。
UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率、压缩强度、压缩模量的结果如表1所示。
EPL修饰支架的孔隙率的结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003730888680000181
Figure BDA0003730888680000191
通过表1的结果可以看出，采用本发明方法制备得到UHMWPE/HA多孔复合支架的实施例1-7具有较高的孔隙率，尤其是和实施例1-3还具有较好的压缩强度，同时进一步说明了本发明中UHMWPE和HA具有较好的相容性，使得支架具有较好的细胞相容性和成骨性能，EPL修饰相应的UHMWPE/HA多孔复合支架的孔隙率降低，说明EPL修饰支架上较好的负载了EPL，使得支架具有较好的抗感染性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种UHMWPE/HA多孔复合支架的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
S1将超高分子量聚乙烯、羟基磷灰石与可选地抗氧剂混合得到混合原料；
S2在搅拌条件下，将混合原料与软化剂混合进行溶胀溶解得到溶胀溶解后的混合原料；
S3将溶胀溶解后的混合原料送至螺杆挤出机中，经螺杆剪切后，送入模具中冷却成型后得到UHMWPE/HA复合支架；
S4将UHMWPE/HA复合支架在萃取剂中进行萃取。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，
所述超高分子量聚乙烯与羟基磷灰石的质量比为(0.25-9):1，优选为(1-2.5):1；和/或
所述软化剂与超高分子量聚乙烯的质量比大于3:1，优选为(5-30):1，更优选为(8-15):1；和/或
所述超高分子量聚乙烯的黏均分子量为200-800万，优选为300-600万；和/或
所述羟基磷灰石的平均粒径为50-800um，优选为100-400um。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，
所述软化剂的沸点大于螺杆温度；
优选地，所述软化剂的沸点为200-350℃、更优选为250-300℃；
更优选地，所述软化剂包括白油和/或液体石蜡，优选用白油；
和/或，
在步骤S2中，溶胀溶解条件包括：
溶胀溶解温度为70-200℃；
优选采用分温度阶段方式溶胀溶解，先在60-70℃下溶胀溶解3h以上；然后在70-200℃下溶胀溶解30h以上；
更优选地，先在60-70℃下溶胀溶解5-6h；然后在90-140℃下溶胀溶解40-60h。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备方法，其中，
在步骤S3中，所述螺杆挤出机为双螺杆挤出机或单螺杆挤出机，优选为双螺杆挤出机；
优选地，
所述双螺杆挤出机的长径比为7-18，优选为10-15；和/或
在步骤S3中，螺杆转速为50-500rpm，优选为100-200rpm；和/或
在步骤S3中，螺杆温度为200-300℃，优选为220-250℃。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的制备方法，其中，
所述萃取剂包括C5-C9环烷烃；
优选地，所述萃取剂包括C6-C8环烷烃；和/或
所述可选地抗氧剂的质量为混合原料质量的0-1％，优选为0.3-0.5％。
6.根据权利要求1-4中任意一项所述的制备方法，其中，
步骤S4后还包括干燥、灭菌步骤；
优选地，干燥温度为70-80℃，干燥时间大于15h。
7.一种由权利要求1-6中任意一项所述的制备方法制得的UHMWPE/HA多孔复合支架；
优选地，所述多孔复合支架的平均孔隙率为30-60％，优选为50-55％；和/或
所述多孔复合支架的压缩强度为5-15MPa，优选为13-15MPa。
8.一种EPL修饰支架的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：
将权利要求7的UHMWPE/HA多孔复合支架浸入ε-多聚赖氨酸水溶液中搅拌后取出、干燥；
优选地，ε-多聚赖氨酸水溶液的浓度大于0.5mg/ml，优选为1-10mg/ml；和/或
搅拌的条件包括：
搅拌转速小于200r/min；
更优选地，搅拌转速为30-80r/min；和/或
搅拌时间大于30h，优选为48-72h。
9.一种由权利要求8所述的制备方法制得的EPL修饰支架；
优选地，所述EPL修饰支架的平均孔隙率为30-60％；
更优选地，所述EPL修饰支架的平均孔隙率为45-50％。
10.一种权利要求7所述的UHMWPE/HA多孔复合支架或权利要求9所述的EPL修饰支架在骨组织工程支架中的应用。
CN202210792585.XA 2022-07-05 2022-07-05 多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用 Active CN115054735B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210792585.XA CN115054735B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210792585.XA CN115054735B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115054735A true CN115054735A (zh) 2022-09-16
CN115054735B CN115054735B (zh) 2023-02-10

Family

ID=83204320

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210792585.XA Active CN115054735B (zh) 2022-07-05 2022-07-05 多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115054735B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233480A1 (en) * 2006-11-08 2010-09-16 Panpan Hu Process for producing fiber of ultra high molecular weight polyethylene
CN104606716A (zh) * 2014-12-31 2015-05-13 上海杰视医疗科技有限公司 一种超高分子量聚乙烯复合材料及其制备方法
WO2017114764A1 (en) * 2015-12-29 2017-07-06 Fundación Tecnalia Research & Innovation Uhmwpe porous polymer article, process for its production and implant and/or scaffold made thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233480A1 (en) * 2006-11-08 2010-09-16 Panpan Hu Process for producing fiber of ultra high molecular weight polyethylene
CN104606716A (zh) * 2014-12-31 2015-05-13 上海杰视医疗科技有限公司 一种超高分子量聚乙烯复合材料及其制备方法
WO2017114764A1 (en) * 2015-12-29 2017-07-06 Fundación Tecnalia Research & Innovation Uhmwpe porous polymer article, process for its production and implant and/or scaffold made thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱美芳等: "《高性能纤维》", 30 November 2017, 中国铁道出版社 *
田彬等: "EPL／PCL／HA复合支架修复兔颅骨骨缺损的实验研究", 《口腔颌面修复学杂志》 *
董盼盼: "多孔生物复合材料的制备及其性能研究", 《CNKI优秀硕士学位论文全文库 工程科技Ⅰ辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115054735B (zh) 2023-02-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chen et al. 3D Bioprinting of shear-thinning hybrid bioinks with excellent bioactivity derived from gellan/alginate and thixotropic magnesium phosphate-based gels
Lei et al. Rapid‐fabricated and recoverable dual‐network hydrogel with inherently anti‐bacterial abilities for potential adhesive dressings
Rakhshaei et al. In situ synthesized chitosan–gelatin/ZnO nanocomposite scaffold with drug delivery properties: Higher antibacterial and lower cytotoxicity effects
CN113679888B (zh) 光固化成型复合水凝胶基质前驱体及其制备方法和带有其的支架
Li et al. Preparation and degradation of PLA/chitosan composite materials
Nair et al. A biodegradable in situ injectable hydrogel based on chitosan and oxidized hyaluronic acid for tissue engineering applications
KR101945938B1 (ko) 주입형 온도 감응성 키토산/목재 기반 산화 셀룰로오스 하이드로겔의 제조방법
Nahanmoghadam et al. Design and fabrication of bone tissue scaffolds based on PCL/PHBV containing hydroxyapatite nanoparticles: dual‐leaching technique
Chen et al. Robust silk fibroin/bacterial cellulose nanoribbon composite scaffolds with radial lamellae and intercalation structure for bone regeneration
Zhong et al. Fabrication of biomimetic poly (propylene carbonate) scaffolds by using carbon dioxide as a solvent, monomer and foaming agent
Zhang et al. Double‐network polyvinyl alcohol composite hydrogel with self‐healing and low friction
Alimirzaei et al. pH-sensitive chitosan hydrogel with instant gelation for myocardial regeneration
Salehi-Abari et al. Synthesis and Characterisation of semi-interpenetrating network of Polycaprolactone/polyethylene glycol diacrylate/zeolite-CuO as wound dressing
Lim et al. Fabrication of porous chitosan-polyvinyl pyrrolidone scaffolds from a quaternary system via phase separation
Nerantzaki et al. New N-(2-carboxybenzyl) chitosan composite scaffolds containing nanoTiO2 or bioactive glass with enhanced cell proliferation for bone-tissue engineering applications
Shokrollahi et al. Biological and mechanical properties of novel composites based on supramolecular polycaprolactone and functionalized hydroxyapatite
He et al. An antibacterial ε-poly-L-lysine-derived bioink for 3D bioprinting applications
Jeon et al. Flexibility enhancement of poly (lactide-co-glycolide) for fused deposition modeling technology
Oustadi et al. Preparation, characterization, and drug release study of ibuprofen-loaded poly (vinyl alcohol)/poly (vinyl pyrrolidone) bilayer antibacterial membrane
Pang et al. Gallic acid-grafted chitosan antibacterial hydrogel incorporated with polydopamine-modified hydroxyapatite for enhancing bone healing
CN115054735B (zh) 多孔复合支架及其制备方法与应用、epl修饰支架及其制备方法与应用
US8431623B2 (en) Process for forming a porous PVA scaffold using a pore-forming agent
US11497837B2 (en) Molded parts with thermoplastic cellulose biopolymer compositions having oriented fibers for medical devices and implants
Kadhim Investigation of Physochimechal and Biological Properties of Composite Sodium Alginate for Tissue Engineering
Rezaei et al. Characterization of sodium carboxymethyl cellulose/calcium alginate scaffold loaded with curcumin in skin tissue engineering

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant