CN115028731B

CN115028731B - 一种抗Flag标签的抗体及其应用

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Publication number: CN115028731B
Application number: CN202210655919.9A
Authority: CN
Inventors: 吴川; 潘炜松; 陈刚; 徐超; 吕杨涛
Original assignee: Shenzhen Nuoda Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Nuoda Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2042-06-10
Also published as: CN115028731A

Abstract

本发明公开了一种抗Flag标签的抗体，其包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3或其变体的重链，以及轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3或其变体的轻链；所述重链CDR1，其包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述重链CDR2，其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；所述重链CDR3，其包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述轻链CDR1，其包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述轻链CDR2，其包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；所述轻链CDR3，其包括SEQ ID NO:6所示的序列。该重组单克隆抗Flag标签的抗体与标签蛋白的亲和力达到5.219E‑10，纯化后的抗Flag标签单抗活性高，具有极大地应用潜力。

Description

一种抗Flag标签的抗体及其应用

技术领域

本发明属于分子免疫学领域，更具体地，涉及一种抗Flag标签的抗体及其应用。

背景技术

Flag是由8个氨基酸(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)组成的短肽，专门设计用于融合蛋白质的免疫吸附纯化。利用Flag标签可以建立一个基于融合多肽的高效检测和纯化系统。Flag标签结构短小，且与融合蛋白质之间含有一个肠激酶切割位点，可以通过肠激酶切割除去。

Flag抗原标签技术具有简单、方便的优点。但是，目前商品化抗Flag 标签蛋白的单克隆抗体种类不多，且多需从国外进口，价格十分昂贵。因此，研制一种新的抗Flag单克隆抗体，在融合蛋白质的免疫吸附分离纯化中具有广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种抗Flag标签的抗体及其应用，其目的在于通过Flag抗原刺激小鼠，在其体内发现一种高效价的Flag抗体，并通过该抗体可变区基因克隆及测序，获得该抗体重链和轻链的氨基酸序列，以此为基础制备重组单克隆Flag抗体，由此解决现有Flag抗体种类少、价格昂贵的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种抗Flag标签的抗体，其包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3或其变体的重链，以及轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3或其变体的轻链；

所述重链CDR1，其包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列T-Y-T-I-H；所述重链CDR2，其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列Y-I-N-P-S-S-G-Y-A-A-Y-N-Q-N-F-K-D；所述重链CDR3，其包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列E-K-F-Y-G-Y-D-Y；

所述轻链CDR1，其包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列 R-S-S-Q-S-I-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-E；所述轻链CDR2，其包括SEQ ID NO:5 所示的氨基酸序列K-V-S-N-R-F-S；所述轻链CDR3，其包括SEQ ID NO:6 所示的序列F-Q-G-S-H-V-P-Y-T。

优选地，所述抗Flag标签的抗体，其所述变体重链，其重链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变；所述变体的轻链，其轻链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQID NO:8 所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。

优选地，所述抗Flag标签的抗体，其所述变体重链，其重链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有10个以内氨基酸突变；所述变体的轻链，其轻链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90％以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列相比具有10个以内氨基酸突变。

优选地，所述抗Flag标签的抗体，其所述氨基酸突变为保守突变，优选置换、插入或缺失的氨基酸序列。

按照本发明的另一方面，提供了一种含有编码本发明所述抗Flag标签抗体或其片段的核酸序列，所述核酸序列，其重链的核酸序列，包括SEQ ID NO:9，轻链的核酸序列，包括SEQ ID NO:10，或者其保守置换的变体和互补序列。

优选地，所述编码抗Flag标签抗体或其片段的核酸序列，其所述核酸序列，包括基因DNA分子、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段寡核苷酸。

优选地，所述编码抗Flag标签抗体或其片段的核酸序列，其所述编码抗Flag标签抗体的核酸系列，其重链的核酸序列，包括SEQ ID NO:9，轻链的核酸序列，包括SEQ ID NO:10。

按照本发明的另一方面，还提供了一种含有编码如本发明所述抗Flag 标签的抗体或其片段核酸序列的生物材料，其所述生物材料，包括表达载体、表达盒、宿主细胞、工程菌或者杂交瘤细胞株。

按照本发明的另一方面，还提供了如本发明所述抗Flag标签的抗体或者本发明所述的核酸序列或者本发明所述的生物材料在制备Flag标签融合蛋白检测试剂中的应用。

按照本发明的另一方面，还提供了一种包括如本发明所述抗Flag标签抗体的检测试剂盒。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明在小鼠抗原免疫实验获得高效价抗Flag标签抗体的氨基酸序列基础上，通过人工改造获得该抗体的重组单克隆抗Flag标签抗体，本发明提供的抗Flag标签抗体与标签蛋白的亲和力达到5.219E-10，纯化后的抗 Flag标签单抗活性高，在融合蛋白质的免疫吸附分离纯化中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例3中杂交瘤细胞株6C10分泌的抗体的重链和轻链序列。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

术语和定义：

除非另有说明，本申请中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。

术语“氨基酸”表示天然存在或非天然存在的羧基α-氨基酸。术语“氨基酸”用在本申请中可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(三字母密码:Ala，单字母密码:A)，精氨酸(Arg， R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺 (Gln，Q)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸 (Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸 (Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp， W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Val，V)。非天然存在的氨基酸包括但不限于α-氨基己二酸，氨基丁酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，高亮氨酸，高精氨酸，羟基脯氨酸，正亮氨酸，吡啶基丙氨酸，肌氨酸等等。

在本发明中，肽、多肽、蛋白质不作严格区分，在一些情形中可以相互替代使用，一般指通过肽键连接的氨基酸组成的聚合物，不管是天然产生的还是合成的。多肽也可以包含非氨基酸成分，如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸成分可以是由表达所述多肽的细胞所加入的，并且可以随细胞类型而不同。多肽在本发明中关于其氨基酸骨架结构或编码其的核酸而限定。如碳水化合物基团的添加通常没有规定，但是，是可以存在的。所有的多肽序列按照通常接受的惯例书写，其中α-N-端氨基酸残基在左侧，且α-C-端氨基酸残基在右侧。当用于本发明时，术语“N-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-氨基基团，术语“C-端”是指多肽中氨基酸的游离的α-羧酸端。在N-端以某基团结束的多肽是指在N-端氨基酸残基的α- 氨基氮上携带基团的多肽。在N-端以某基团结束的氨基酸是指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。

抗体可变区，即CDR区，是抗体特异性识别抗原的区域，一般各有三段；而标签抗体是一种能够高度特异性识别通过重组技术构建的融合蛋白上特殊表位的抗体，其中抗Flag标签的抗体(简称Flag抗体)是广泛应用的一种。Flag抗体可以用于检测和Flag标签融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、定性或定量检测Flag融合表达蛋白等。科研人员在选择 Flag抗体时，主要根据自己的需要，特别是实验应用上的需要进行选择，而Flag抗体的效价往往是一个重要参考因素，甚至是决定性因素，这主要是因为一个高效价的Flag抗体不仅影响实验结果的灵敏度，还意味着更高的性价比，因此，寻找一种高效价的Flag抗体具有重大意义和良好的市场前景。

我们通过Flag抗原刺激小鼠，在其体内发现一种高效价Flag抗体。具体是利用Flag抗原，多次免疫BALB/c小鼠，制备大量杂交瘤细胞株，筛选分泌抗体阳性细胞并克隆，最后共获得五株稳定的抗Flag标签杂交瘤细胞株，制备腹水、纯化、得到单克隆抗体，通过抗体效价测定，筛选出分泌抗体效价较高的一株杂交瘤细胞6C10，实验结果显示，该杂交瘤细胞株 6C10分泌的腹水抗体的效价可达8.52×10⁶，显著高于其他4种杂交瘤细胞株；通过该抗体可变区基因克隆及测序，获得该抗体重链和轻链的氨基酸序列，经分析，其重链的互补决定区：CDR1：T-Y-T-I-H；CDR2： Y-I-N-P-S-S-G-Y-A-A-Y-N-Q-N-F-K-D；CDR3：E-K-F-Y-G-Y-D-Y；其轻链的互补决定区：CDR1：R-S-S-Q-S-I-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-E；CDR2： K-V-S-N-R-F-S；CDR3：F-Q-G-S-H-V-P-Y-T；依据获得该抗体重链和轻链的氨基酸序列制备重组抗体，即为本发明优选的抗Flag标签的抗体。

本发明提供了一种抗Flag标签的抗体，其包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3或其变体的重链，以及轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3或其变体的轻链；

所述重链CDR1，其包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列T-Y-T-I-H，或由其组成；所述重链CDR2，其包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列Y-I-N-P-S-S-G-Y-A-A-Y-N-Q-N-F-K-D，或由其组成；所述重链CDR3，其包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列E-K-F-Y-G-Y-D-Y，或由其组成；

所述轻链CDR1，其包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列 R-S-S-Q-S-I-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-E，或由其组成；所述轻链CDR2，其包括 SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列K-V-S-N-R-F-S，或由其组成；所述轻链 CDR3，其包括SEQ ID NO:6所示的序列F-Q-G-S-H-V-P-Y-T，或由其组成。

所述变体的重链，其重链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少90％，优选具有至少91％，92％，93％，94％，95％， 96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列；

或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变；优选具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变；所述氨基酸突变，优选保守突变，包括置换、插入或缺失的氨基酸序列；更优选如 SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

所述变体的轻链，其轻链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％， 97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变；优选具有1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个氨基酸突变，所述氨基酸突变，优选保守突变，包括置换，插入或缺失的氨基酸序列；更优选，如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明包括含有编码抗Flag标签的抗体或其片段的核酸序列。例如所述核酸序列，其重链的核酸序列，包括SEQ ID NO:9 所示的核酸序列，轻链的核酸序列，包括SEQ ID NO:10所示的核酸序列。在本发明中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、 mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明包括含有编码抗Flag标签的抗体或其片段的核酸序列的生物材料，所述生物材料包括表达载体、表达盒、宿主细胞、工程菌或杂交瘤细胞株。其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

另外，本发明还提供了如本发明所述抗Flag标签的抗体或本发明所述的核酸序列或者本发明所述的生物材料在制备Flag标签融合蛋白检测试剂中的应用。

另一个方面，本发明还提供了一种包含如本发明所述抗Flag标签抗体的检测试剂盒。

以下为实施例：

实施例1抗Flag标签抗体的氨基酸序列

所述抗Flag标签的抗体，包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3，所述重链CDR1，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列T-Y-T-I-H；所述重链CDR2，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列 Y-I-N-P-S-S-G-Y-A-A-Y-N-Q-N-F-K-D；所述重链CDR3，包含SEQ ID NO:3 所示的氨基酸序列E-K-F-Y-G-Y-D-Y；

并且所述抗体还包含轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3，所述轻链 CDR1，其包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列 R-S-S-Q-S-I-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-E；所述轻链CDR2，其包含SEQ ID NO:5 所示的氨基酸序列K-V-S-N-R-F-S；所述轻链CDR3，其包含SEQ ID NO:6 所示的序列F-Q-G-S-H-V-P-Y-T。

实施例2单克隆抗体的效价

1抗原免疫

将Flag抗原(八氨基酸短肽DYKDDDDK-偶联KLH)与弗氏完全佐剂 (外观：琥珀色细胞悬浮液；组份：Paraffin Oil 85％，Mannide Monooleate 15％，Mycobacteriumsmegmatis 1mg/mL)混合，得到油状乳液。将该乳液以0.15mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠，第一次免疫14天后腹腔增强免疫(等量抗原与弗氏不完全佐剂混合)，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。融合前3天，用相同剂量抗原腹腔注射追加免疫，免疫方法同上。

2制备杂交瘤细胞株

(1)饲养细胞的制备

以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含 HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。

(2)免疫脾细胞的制备

小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640 基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，得到免疫脾细胞，计数。

(3)骨髓瘤细胞的制备

小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。

(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤

将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1200rpm，离心10分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL 的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5-10分钟。弃上清，用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板， 50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HAT培养液(含HAT的 RPMI 1640完全培养液)两次。

(5)杂交瘤细胞筛选

用0.05M pH 9.6碳酸缓冲溶液稀释Flag抗原(DYKDDDDK偶联BSA) 使其终浓度为1μg/mL。每孔0.1mL，加入96孔聚苯乙烯板，37℃、2小时或4℃过夜。次日，用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.02M pH 7.2 PBS，0.15mL/孔，37℃封闭2小时，用于检测。融合后第七天，取细胞上清0.1mL于上述96孔检测板中，37℃30分钟，水洗六次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，37℃30分钟同上洗后，每孔加入100 μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH 5.0柠檬酸磷酸缓冲液， 37℃15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。RPMI 1640 完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值的比≧2.0为阳性细胞孔。

分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10％DMSO的培养液冻存，细胞密度为106个/mL。共获得五株稳定的抗Flag标签杂交瘤细胞株，分别命名为A、B、C、D、E。

3制备单克隆抗体

选6～8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷； 10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7-10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于-20℃冰箱保存。取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280 nm下的吸收值达到基线为止。再用 0.1M的甘氨酸洗脱液(pH 2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的溶液用0.1M Tris(pH 8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，-20℃分装冻存。

4抗体效价测定

以间接ELISA法检测上述5株杂交瘤细胞和分泌的腹水抗体的效价。具体实验步骤如下：

(1)包被：将Flag抗原(DYKDDDDK偶联BSA)稀释至1μg/mL，100μL/ 孔加至酶标板，37℃2小时或者4℃过夜；

(2)用洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

(3)用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔150μL，37℃放置1.5-2 小时；

(4)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

(5)加样品：分别将稀释成不同梯度的细胞培养上清和腹水加入用Flag 抗原包被好的酶标板，100μL/孔，37℃反应1小时(同时做阴性对照孔和阳性对照孔)；

(6)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

(7)加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗(用封闭液稀释6000倍)， 100μL/孔，37℃反应1小时；

(8)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

(9)加显色液TMB：即用即配，100μL/孔，37℃避光反应30分钟；

(10)终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50μL/孔；

(11)酶标仪读数：450nm，630nm波长测定。抗体效价结果见下表1。

表1不同抗体效价测定结果

Flag标签细胞株	杂交瘤细胞培养上清效价	腹水抗体效价
			2E9	<![CDATA[3.27×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[4.57×10<sup>5</sup>]]>
5B4	<![CDATA[3.18×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[6.24×10<sup>5</sup>]]>
			6C10	<![CDATA[6.29×10<sup>4</sup>]]>	<![CDATA[8.52×10<sup>6</sup>]]>
2B11	<![CDATA[4.24×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[5.13×10<sup>5</sup>]]>
			3G7	<![CDATA[2.23×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[4.19×10<sup>5</sup>]]>

由表1可知，杂交瘤细胞株6C10分泌的抗体，其效价可达8.52×10⁶，显著的高于其他4种杂交瘤细胞株分泌的抗体。

实施例3制备重组抗体

(1)抗体可变区基因克隆及测序

从实施例2分泌Flag单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C10中提取总RNA，用SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit表达盒及表达盒中的 SMARTER IIA Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。轻链基因以Universal PrimerA Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，重链基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP) 和mIgG CHR引物进行扩增。其中轻链的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，重链的引物对扩增出1.5KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链及轻链基因克隆各4个克隆送擎科公司进行测序。

经分析，以上杂交瘤细胞株6C10得到的抗体，具有序列如文后所附的轻链和重链序列。

经分析，重链的互补决定区：

CDR1：T-Y-T-I-H；

CDR2：Y-I-N-P-S-S-G-Y-A-A-Y-N-Q-N-F-K-D；

CDR3：E-K-F-Y-G-Y-D-Y。

轻链的互补决定区：

CDR1：R-S-S-Q-S-I-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-E；

CDR2：K-V-S-N-R-F-S；

CDR3：F-Q-G-S-H-V-P-Y-T。

(2)制备重组抗体进行亲和力分析、活性鉴定

①亲和力分析

以活性鉴定相同方式酶免间接法做数据，包被做四个梯度1μg/ml、0.5 μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml；抗体从1000ng/ml开始2倍梯度稀释至 0.97656ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度；带入公式：K＝ (n-1)/(2*(n*Ab`-Ab))计算出亲和力常数的倒数，其中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD。纯化后的抗Flag单抗亲和力分析数据见下表2。

表2纯化后的抗Flag单抗亲和力测定结果

样品名称	KD
		Flag标签抗体6C10	5.219E-10
2E9	6.145E-9
		5B4	3.289E-8
2B11	9.118E-9
		3G7	7.834E-8

由表2可知，纯化后的抗Flag单抗C亲和力，与另外4株杂交瘤细胞分泌的抗体的亲和力对照，亲和力明显更优。

②活性鉴定

用50mM碳酸盐缓冲液包被液稀释Flag抗原(DYKDDDDK偶联BSA) 到1μg/mL进行微孔板包被，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液用PBST 清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的抗Flag单克隆抗体6C10，从1000ng/ml始进行5倍比稀释，上样，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；用PBST洗涤液清洗 5次，拍干；加入辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃，30 min；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入过氧化脲(50μL/孔)，加入四甲基联苯胺(50μL/孔)，10min；加入稀盐酸终止反应，50μL/孔；酶标仪上 450nm(参考630nm)处读OD值。纯化后的抗Flag标签单抗活性鉴定，结果见下表3。

表3纯化后抗Flag标签单抗活性鉴定

样品浓度ng/ml	1000	200	40	8	1.6	0.32	0
								Flag抗体6C10	3.291	2.113	0.807	0.172	0.128	0.072	0.031

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 长沙诺合松生物科技合伙企业（有限合伙）

<120> 一种抗Flag标签的抗体及其应用

<130> 2022-6-8

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Thr Tyr Thr Ile His

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ala Ala Tyr Asn Gln Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Glu Lys Phe Tyr Gly Tyr Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Arg Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ala Ala Tyr Asn Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Glu Thr Thr Leu Thr Ala Asp Pro Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Lys Phe Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ala Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Arg

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Leu Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg

100 105 110

Arg Ala Asp

115

<210> 9

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atggaatggc ctttgatttt tttgtttttg ttgtctggaa ctgctggagt tcaatctcaa 60

gttcaattgc aacaatctgc tgctgaattg gctagacctg gagcttctgt taagatgtct 120

tgtaaggctt ctggatattc ttttactact tatactattc attgggttaa gcaaagacct 180

ggacaaggat tggaatggat tggatatatt aatccttctt ctggatatgc tgcttataat 240

caaaatttta aggatgaaac tactttgact gctgatcctt cttcttctac tgcttatatg 300

gaattgaatt ctttgacttc tgaagattct gctgtttatt attgtgctag agaaaagttt 360

tatggatatg attattgggg acaaggagct actttgactg tttcttctgc taagactact 420

cctccttctg tttatccttt ggctcctgga tctgctgctc aaactaattc tatggttact 480

ttgggatgtt tggttaaggg atattttcct gaacctgtta ctgttacttg gaattctgga 540

tctttgtctt ctggagttca tacttttcct gctgttttgc aatctgattt gtatactttg 600

tcttcttctg ttactgttcc ttcttctact tggccttctg aaactgttac ttgtaatgtt 660

gctcatcctg cttcttctac taaggttgat aagaagattg ttcctagaga ttgtggatgt 720

aagccttgta tttgtactgt tcctgaagtt tcttctgttt ttatttttcc tcctaagcct 780

aaggatgttt tgactattac tttgactcct aaggttactt gtgttgttgt tgatatttct 840

aaggatgatc ctgaagttca attttcttgg tttgttgatg atgttgaagt tcatactgct 900

caaactcaac ctagagaaga acaatttaat tctactttta gatctgtttc tgaattgcct 960

attatgcatc aagattggtt gaatggaaag gaatttaagt gtagagttaa ttctgctgct 1020

tttcctgctc ctattgaaaa gactatttct aagactaagg gaagacctaa ggctcctcaa 1080

gtttatacta ttcctcctcc taaggaacaa atggctaagg ataaggtttc tttgacttgt 1140

atgattactg atttttttcc tgaagatatt actgttgaat ggcaatggaa tggacaacct 1200

gctgaaaatt ataagaatac tcaacctatt atggatactg atggatctta ttttgtttat 1260

tctaagttga atgttcaaaa gtctaattgg gaagctggaa atacttttac ttgttctgtt 1320

ttgcatgaag gattgcataa tcatcatact gaaaagtctt tgtctcattc tcctggaaag 1380

tga 1383

<210> 10

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgagatgtt tggctgaatt tttgggattg ttggttttgt ggattcctgg agctattgga 60

gatgttttga tgactcaaat tcctttgtct ttgcctgttt ctttgggaga tcaagcttct 120

atttcttgta gatcttctca atctattgtt catagaaatg gaaatactta tttggaatgg 180

tatttgttga agcctggaca atctcctaag ttgttgattt ataaggtttc taatagattt 240

tctggagttc ctgatagatt ttctggatct ggatctggaa ctgattttac tttgaagatt 300

tctagagttg aagctgaaga tttgggagtt tattattgtt ttcaaggatc tcatgttcct 360

tatacttttg gaggaggaac taagttggaa attagaagag ctgatgctgc tcctactgtt 420

tctatttttc ctccttcttc tgaacaattg acttctggag gagcttctgt tgtttgtttt 480

ttgaataatt tttatcctaa ggatattaat gttaagtgga agattgatgg atctgaaaga 540

caaaatggag ttttgaattc ttggactgat caagattcta aggattctac ttattctatg 600

tcttctactt tgactttgac taaggatgaa tatgaaagac ataattctta tacttgtgaa 660

gctactcata agacttctac ttctcctatt gttaagtctt ttaatagaaa tgaatgttga 720

Claims

1.一种抗Flag标签的抗体，其特征在于，包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3，以及轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3；

所述重链CDR1，其为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列T-Y-T-I-H；所述重链CDR2，其为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列Y-I-N-P-S-S-G-Y-A-A-Y-N-Q-N-F-K-D；所述重链CDR3，其为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列E-K-F-Y-G-Y-D-Y；

所述轻链CDR1，其为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列R-S-S-Q-S-I-V-H-R-N-G-N-T-Y-L-E；所述轻链CDR2，其为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列K-V-S-N-R-F-S；所述轻链CDR3，其为SEQ ID NO:6所示的序列F-Q-G-S-H-V-P-Y-T。

2.如权利要求1所述的抗Flag标签的抗体，其特征在于，所述重链，其重链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQID NO:7所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变；所述轻链，其轻链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQID NO:8所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变。

3.如权利要求1或2所述的抗Flag标签的抗体，其特征在于，所述重链，其重链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比具有10个以内氨基酸突变；所述轻链，其轻链可变区包括任意一个与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比具有10个以内氨基酸突变。

4.如权利要求2所述的抗Flag标签的抗体，其特征在于，所述氨基酸突变为保守突变，包括置换、插入或缺失的氨基酸序列。

5.一种编码如权利要求1至4任意一项所述抗Flag标签抗体的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列，其重链的核酸序列，包括SEQ ID NO:9或其保守置换的变体或者互补序列；轻链的核酸序列，包括SEQ ID NO:10或其保守置换的变体或者互补序列。

6.如权利要求5所述的编码抗Flag标签抗体的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列，包括基因DNA分子、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段寡核苷酸。

7.如权利要求6所述的编码抗Flag标签抗体的核酸序列，其特征在于，所述编码抗Flag标签抗体的核酸序列，其重链的核酸序列，包括SEQ ID NO:9，轻链的核酸序列，包括SEQ IDNO:10。

8.一种含有编码如权利要求1所述抗Flag标签的抗体或其片段核酸序列的生物材料，其特征在于，所述生物材料，包括表达载体、表达盒、宿主细胞、工程菌或者杂交瘤细胞株。

9.如权利要求1至4任意一项所述抗Flag标签的抗体或者权利要求5或6所述的核酸序列或者权利要求8所述的生物材料在制备Flag标签融合蛋白检测试剂中的应用。

10.一种包括如权利要求1至4任意一项所述抗Flag标签抗体的检测试剂盒。