CN115025131B

CN115025131B - 罗伊氏乳杆菌e9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用

Info

Publication number: CN115025131B
Application number: CN202210625111.6A
Authority: CN
Inventors: 郑康帝; 刘彦; 陈涛; 张召
Original assignee: Guangdong Yiyuan Lanxin Biotechnology Co ltd; Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Yiyuan Lanxin Biotechnology Co ltd; Guangdong Longsee Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-06-02
Also published as: CN115025131A

Abstract

本发明公开了罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用，属于微生物技术领域。本发明公开了罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用，罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液，在体内失眠模型中均能显著降低斑马鱼的运动距离、狂躁时间、活跃时间，和显著增加静止时间，具备应用于体内缓解焦虑、改善睡眠的潜能。本发明公开的罗伊氏乳杆菌E9在缓解焦虑、改善睡眠方面有巨大的潜在应用前景。

Description

罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，更具体的说是涉及罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用。

背景技术

失眠，包括难以启动或保持睡眠，是人群中最常见的睡眠障碍。超过20％的成年人患有慢性失眠症。许多导致慢性失眠的因素，如轮班工作、不规律的工作时间、时差和压力，都与现代生活方式有关。睡眠不足会导致记忆丧失、易怒、抑郁、注意力不集中和疲劳。除了认知功能，睡眠障碍还与代谢综合征相关，如肥胖、炎症、糖尿病和心血管疾病。尽管有许多药物可用于治疗失眠，包括苯二氮卓受体激动剂、抗组胺药、褪黑激素受体激动剂、抗焦虑药、抗抑郁药和抗精神病药，但药物依赖和滥用的潜在问题令人担忧。此外，这些药物经常伴有副作用，如头晕、头痛、嗜睡、健忘症和认知障碍，甚至导致死亡风险增加。因此，重要的是寻找一种潜在的催眠辅助药物来替代或减少这些催眠药物的使用，以更安全的选择来提高睡眠质量和效率而不产生显著的不良反应。

由FAO/WHO于2002年提出，益生菌被定义为促进宿主健康的活微生物。越来越多的证据表明，长期摄入益生菌可以改善健康，而且没有明显的副作用。因此，益生菌的许多潜在功能被提出，甚至在心理健康领域。微生物群- 肠-脑轴(microbiome-gut-brain axis,MGBA)明确地指胃肠道与中枢神经系统之间通过肠道微生物的双向信号传递，它可能是由免疫调节、神经内分泌或迷走神经通路介导的。通过MGBA对精神或行为有益的益生菌被称为精神生物制剂，在未来的应用中具有广阔的潜力。

研究表明，睡眠障碍会导致代谢紊乱，并伴有轻微的肠道微生物群改变。最近，一些研究报告了初步证据，表明肠道微生物群影响睡眠。长期服用抗生素的小鼠表现出睡眠结构紊乱，并伴有肠道神经递质改变。此外，研究发现，膳食益生菌可以有效改善受压力影响的睡眠状况。这些结果表明，重塑微生物群可能通过MGBA改善宿主的睡眠质量。

然而，目前益生菌在缓解焦虑、改善睡眠中的研究和应用较少。国内生产企业所用益生菌菌种长期依赖进口，而且国外菌株未必适合我国居民胃肠道生理状况。另外，益生菌的功能缺乏有力的科学研究证据，严重影响了益生菌及其制品的推广。基于此，针对菌种资源的功能深入挖掘，筛选出拥有自主知识产权、具有特定功能性质、适合中国人群生理特性的新型益生菌菌株，对提高我国益生菌生产企业的核心竞争力，促进我国益生菌制品发展尤为重要。

因此，提供罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用，所述罗伊氏乳杆菌E9的保藏编号为CGMCC No.21768，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月29日，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri。

所述罗伊氏乳杆菌E9在PTZ诱导斑马鱼失眠模型中，可显著降低斑马鱼的运动距离、狂躁时间、活跃时间，显著增加静止时间，表现出良好的缓解焦虑、改善睡眠的益生功效。

进一步，所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备发酵乳制品及其他食品中的应用。

进一步，所述罗伊氏乳杆菌E9为菌悬液或发酵上清液。

本发明所述在体内失眠模型中能显著降低斑马鱼运动距离、狂躁时间、活跃时间，显著增加静止时间的菌株，包括菌株E9的发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体)。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用，罗伊氏乳杆菌E9是从广东省梅州市蕉岭县的长寿老人粪便中分离筛选得到的，在斑马鱼失眠模型中能显著降低斑马鱼运动距离、狂躁时间、活跃时间，显著增加静止时间；具备应用于体内缓解焦虑、改善睡眠的潜能，此为利用罗伊氏乳杆菌E9开发缓解焦虑、改善睡眠的益生菌制剂提供理论参考和指导依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9在MRS琼脂平板上的菌落形态；

图2附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液对PTZ诱导斑马鱼失眠模型的运动轨迹的影响；

图3附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液对PTZ诱导斑马鱼失眠模型的运动距离的影响；

图4附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液对PTZ诱导斑马鱼失眠模型的狂躁时间的影响；

图5附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液对PTZ诱导斑马鱼失眠模型的活跃时间的影响；

图6附图为本发明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液对PTZ诱导斑马鱼失眠模型的静止时间的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1罗伊氏乳杆菌E9分离、鉴定及保藏

(1)分离：将长寿老人粪便经梯度稀释后，分别接种于MRS固体培养基、BS固体培养基、BHI固体培养基中，37℃厌氧培养48h，挑取平板上的单菌落划线分离得到纯菌落。将平板上的纯菌落接种于MRS液体培养基中， 37℃厌氧培养12～16h，加入20％甘油，置于-80℃冰箱中保存。

(2)菌株的分子生物学鉴定：对所获得的菌株提取基因组DNA，通过 PCR技术利用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增16S rDNA全长片段，之后进行测序，鉴定菌株的种属。

其中，通用引物27F和1492R的引物序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.2。

实验结果：从广东省梅州市蕉岭县长寿老人粪便中筛选出的菌株，经形态观察、16S rDNA鉴定，其中菌株E9被鉴定为罗伊氏乳杆菌，其16S rDNA 序列如SEQ ID NO.3所示。

GGCTCCCTCCATAAAGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAAC TCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCAC CGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAGTCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTT ACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGT AGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCT CCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCA ACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC GACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAA GGGAACGCCTTATCTCTAAGGTTAGCGCAAGATGTCAAGACCTGGTAA GGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCG GGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAG GCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTC CAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAAT CCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGA CAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCG CTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCGCCCGGTTT CCGATGCACTTCTTCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGC AACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCCA CCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGG TTGGATACCGTCACTGCGTGAACAGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCC AACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGTGTTG CTCCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCC GTAGGAGTATGGACCGTGTCTCAGTTCCATTGTGGCCGATCAGTCTCTC AACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTACCAACTAG CTAATGCACCGCAGGTCCATCCCAGAGTGATAGCCAAAGCCATCTTTCA AACAAAAGCCATGTGGCTTTTGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTC CAAATGTTATCCCCCGCTCCGGGGCAGGTTACCTACGTGTTACTCACCC GTCCGCCACTCACTGGTGATCCATCGTCAATCAGGTGCAAGCACCATCA ATCAGTTGGGCCAGTGCGTACGACTGCA；SEQ ID NO.3。

菌株E9单菌落接种到MRS固体培养基上，37℃厌氧生长良好，菌落白色、呈球形、表面光滑、边缘整齐(图1)。菌株E9已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年01月29日，分类命名为罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri，保藏编号为CGMCCNo. 21768。

实施例2罗伊氏乳杆菌E9发酵上清液(胞外分泌物)、菌悬液(菌体) 的制备

将罗伊氏乳杆菌E9活化培养后接种于MRS液体培养基中，37℃培养17 h后，调整发酵菌浓度为1×10⁷CFU/mL，4℃，6000r/min离心10min，得到培养上清液和菌体沉淀，上清液经0.22μm滤膜过滤后得发酵上清液(胞外分泌物)；菌体沉淀经PBS两次洗涤后，将菌体用PBS重新悬浮，调整细胞浓度为1×10⁷CFU/mL得到菌悬液(菌体)。

实施例3罗伊氏乳杆菌E9对斑马鱼失眠模型的睡眠、焦虑的改善作用奥沙西泮和戊四唑(PTZ)均购自美国Sigma公司。

挑选发育至6dpf(days post fertilization)的健康野生型AB系斑马鱼置于 96孔细胞培养板中。实验设置空白对照组、模型组、阳性对照组、样品(菌悬液、发酵上清液)干预组，每组设置20个复孔，每孔1条鱼。空白对照组加入PBS，模型组加入PBS，阳性对照组加入奥沙西泮溶液(30μg/mL)，菌悬液组加入罗伊氏乳杆菌E9菌悬液，发酵上清液组加入罗伊氏乳杆菌E9 发酵上清液，每孔150μL；28℃孵育24h后，空白对照组加入50μL PBS，模型组、阳性对照组、菌悬液组、发酵上清液组分别加入PTZ(60mM)，每孔20μL，28℃孵育2h后，将96孔细胞培养板置于斑马鱼行为分析系统 (EthoVision XT 10.4，诺达思信息技术有限责任公司)中进行轨迹跟踪，关闭光源使斑马鱼适应环境5min，随后开启行为轨迹分析软件，采集斑马鱼在黑暗环境下5min内的行为轨迹。统计斑马鱼的运动距离；同时根据斑马鱼的游动速率将斑马鱼划分为3种运动状态：静止(<4mm/s)、活跃(4-20mm/s)、狂躁(>20mm/s)，并统计斑马鱼的狂躁时间、活跃时间、静止时间。

采用SPSS 19.0软件统计处理数据，实验数据均用x±SEM数据表示，用单因素方差分析。与空白对照组相比：^###p<0.005；与模型组相比：*P<0.05， **P<0.01，***P<0.005。

结果见图2-6；由图2和图3可知，红色的区域为斑马鱼运动的路径所覆盖的区域；与空白对照组相比，模型组斑马鱼的运动轨迹增加，表明模型组斑马鱼的活跃程度增加；同时，与空白对照组(51.52±5.39cm)相比，模型组斑马鱼的运动距离(95.39±4.60cm)显著增加(p<0.005)，表明本次斑马鱼失眠模型建立成功。

与模型组相比，阳性对照组(奥沙西泮)斑马鱼的运动轨迹减少，表明奥沙西泮在PTZ诱导斑马鱼失眠模型中，可降低斑马鱼的活跃程度；同时阳性对照组斑马鱼的运动距离为64.32±2.30cm，与模型组(95.39±4.60cm) 相比差异性显著(P<0.005)。因此，奥沙西泮具有缓解焦虑的作用，与临床结果一致。与模型组相比，罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液组、菌悬液组斑马鱼的运动轨迹减少，表明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液组、菌悬液组在PTZ诱导斑马鱼失眠模型中，可降低斑马鱼的活跃程度；同时罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液组，菌悬液组斑马鱼的运动距离分别为72.66±3.23cm、78.72± 3.68cm，与模型组(95.39±4.60cm)相比较均差异性显著(P<0.05)。因此，上述结果表明罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液、菌悬液在体内失眠模型中均能显著降低斑马鱼的运动距离，表现出缓解焦虑的作用。

由图4、图5和图6可知，与空白对照组(狂躁时间：15.65±0.85s、活跃时间：27.32±1.79s、静止时间：257.03±2.19s)相比，模型组斑马鱼的狂躁时间(62.84±2.85s)、活跃时间(72.70±4.58s)均显著增加(p<0.005)，静止时间(164.46±4.90s)显著减少(p<0.005)，表明本次斑马鱼失眠模型建立成功。

与模型组(狂躁时间：62.84±2.85s、活跃时间：72.70±4.58s、静止时间：164.46±4.90s)相比，阳性对照组斑马鱼的狂躁时间(25.64±0.73s)、活跃时间(36.08±3.19s)均显著减少(p<0.005)，静止时间(238.28±3.44 s)显著增加(p<0.005)，表明奥沙西泮具有缓解焦虑、催眠的作用，与临床结果一致。与模型组(狂躁时间：62.84±2.85s、活跃时间：72.70±4.58s、静止时间：164.46±4.90s)相比，罗伊氏乳杆菌E9的发酵上清液组、菌悬液组斑马鱼的狂躁时间(发酵上清液：31.99±2.48s、菌悬液：42.64±2.36s)、活跃时间(发酵上清液：36.50±3.67s、菌悬液：50.66±3.78s)均显著减少 (p<0.005)，静止时间(发酵上清液：231.51±4.09s、菌悬液：206.70±4.03 s)显著增加(p<0.005)。因此，上述结果表明罗伊氏乳杆菌E9的菌悬液、发酵上清液在体内失眠模型中均能显著减少斑马鱼的狂躁时间、活跃时间，和显著增加静止时间，表现出缓解焦虑、改善睡眠的作用。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 广东南芯医疗科技有限公司广东一元兰欣生物科技有限公司

<120> 罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1441

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggctccctcc ataaaggtta ggccaccgac tttgggcgtt acaaactccc atggtgtgac 60

gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta 120

gcgattccga cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga acggctttaa 180

gagattagct tactctcgcg agcttgcgac tcgttgtacc gtccattgta gcacgtgtgt 240

agcccaggtc ataaggggca tgatgatctg acgtcgtccc caccttcctc cggtttgtca 300

ccggcagtct cactagagtg cccaacttaa tgctggcaac tagtaacaag ggttgcgctc 360

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacgaccatg caccacctgt 420

cattgcgtcc ccgaagggaa cgccttatct ctaaggttag cgcaagatgt caagacctgg 480

taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540

tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt 600

agctccggca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacctagc actcatcgtt tacggcatgg 660

actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc gtcagttgca 720

gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt ccaccgctac 780

acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtcgccc ggtttccgat gcacttcttc 840

ggttaagccg aaggctttca catcagacct aagcaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 900

ataaatccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 960

gtgactttct ggttggatac cgtcactgcg tgaacagtta ctctcacgca cgttcttctc 1020

caacaacaga gctttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggtgttg ctccatcagg 1080

cttgcgccca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtatg gaccgtgtct 1140

cagttccatt gtggccgatc agtctctcaa ctcggctatg catcatcgcc ttggtaagcc 1200

gttaccttac caactagcta atgcaccgca ggtccatccc agagtgatag ccaaagccat 1260

ctttcaaaca aaagccatgt ggcttttgtt gttatgcggt attagcatct gtttccaaat 1320

gttatccccc gctccggggc aggttaccta cgtgttactc acccgtccgc cactcactgg 1380

tgatccatcg tcaatcaggt gcaagcacca tcaatcagtt gggccagtgc gtacgactgc 1440

a 1441

Claims

1.罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri) E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌E9的保藏编号为CGMCC No. 21768。

2.根据权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备缓解焦虑、改善睡眠药物中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌E9为菌悬液或发酵上清液。

3.权利要求1所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备发酵乳制品及其他食品中的应用。

4.根据权利要求3所述的罗伊氏乳杆菌E9在制备发酵乳制品及其他食品中的应用，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌E9为菌悬液或发酵上清液。