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CN114990170A - 一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法 - Google Patents

一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法 Download PDF

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CN114990170A
CN114990170A CN202210777010.0A CN202210777010A CN114990170A CN 114990170 A CN114990170 A CN 114990170A CN 202210777010 A CN202210777010 A CN 202210777010A CN 114990170 A CN114990170 A CN 114990170A
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glucose
fructose
gluconic acid
solution
enzyme
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CN202210777010.0A
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林建强
李�灿
林慧彬
林建群
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Qingdao Longding Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Qingdao Longding Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法。所述方法是以D‑葡萄糖为原料，首先加入葡萄糖异构酶，将D‑葡萄糖转化为D‑果糖，反应后去除葡萄糖异构酶，终止D‑葡萄糖与D‑果糖之间的相互转化反应；然后，在反应液中加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，将未转化的D‑葡萄糖转化为葡萄糖酸。产生的葡萄糖酸利用阴离子交换树脂与D‑果糖分离开来，分别得到高纯度的D‑果糖和葡萄糖酸。葡萄糖酸又可以与金属碱溶液反应生成相应的葡萄糖酸盐。本发明利用酶催化和简单的分离方法得到高纯度D‑果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐，工艺简单、效率高，可降低D‑果糖的生产成本，增加产品种类，具有广阔的工业化应用前景。

Description

一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法。
背景技术
D-果糖是最甜的天然甜味剂，其甜度大约为D-葡萄糖的3倍，蔗糖的1.2-1.8倍，并且其甜度口感纯正，而且不遮掩食品中其它物质的风味。D-果糖代谢不依赖胰岛素，不会引起血糖过大波动。由于具有上述优良特性，D-果糖被广泛应用于食品和医药行业。
D-果糖可由D-葡萄糖酶法异构生产，底物转化率在45-55%之间，工业上大量生产并使用含有D-果糖的糖浆。为了提高D-果糖含量需要使用色谱分离技术实现D-果糖和D-葡萄糖的分离，从而能够生产D-果糖含量达到95%以上的高纯度产品，后经结晶制成纯度达到98%以上的结晶D-果糖。然而，由于D-果糖和D-葡萄糖分子量一致，其它物化性质也极为接近，导致D-果糖和D-葡萄糖分离困难。目前普遍采用模拟移动床色谱技术进行D-果糖和D-葡萄糖的分离，但设备复杂、昂贵，不利于高纯度D-果糖的高效率、低成本、大规模生产。上述原因导致高纯度D-果糖价格偏高，阻碍了其市场应用。因此，仍需要一种高效率、低成本生产高纯度D-果糖的方法。
葡萄糖酸是一种重要的酸味剂，在食品、饮料等行业有重要应用。一些葡萄糖酸盐，如葡萄糖酸钾、钠、钙、铁、锌、镁等，可以作为人体必需金属元素补充剂，作为营养品补充人体所需的微量元素，具有很高的商业价值。可见，将D-果糖生产过程中残存的D-葡萄糖转化为易于与D-果糖分离的葡萄糖酸或葡萄糖酸盐，不仅简化了D-果糖分离纯化工艺和降低分离纯化成本，还增加了产品品种，提高了经济效益。
葡萄糖酸生产方法主要有化学催化法、电解氧化法、微生物发酵法和酶催化法。酶催化法具有天然绿色、反应专一性强、产物纯度高、浓度高、转化效率高等特点，越来越成为主流工艺。但目前还没有关于利用酶催化法联产D-果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其具有工艺简单、有效、低成本、高收益的优点。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，所述方法包含以下步骤：
（1）以D-葡萄糖为原料，用纯净水配制D-葡萄糖溶液；
（2）将步骤（1）的D-葡萄糖溶液加入葡萄糖异构酶，进行催化反应，得到反应液，离心，取上清液；
（3）将步骤（2）的上清液加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，进行催化反应，得到反应液，离心，取上清液；
（4）将步骤（3）的上清液中流经吸附树脂柱，吸附葡萄糖酸，过滤去除吸附树脂，得到较高纯度的D-果糖的透过液；
（5）将步骤（4）中过滤去除的吸附树脂用酸溶液解吸，得到较高纯度的葡萄糖酸溶液；
（6）将步骤（5）的葡萄糖酸溶液加入含金属离子的碱溶液至pH中性，得到含金属离子的葡萄糖酸盐溶液。
进一步的，所述步骤（1）中D-葡萄糖溶液的浓度为10%-80%，其通D-葡萄糖晶体加纯净水配制得到。
优选的，所述步骤（1）中D-葡萄糖溶液的浓度为60%。
进一步的，所述步骤（2）中葡萄糖异构选择游离的或固定化葡萄糖异构酶，其用量为D-葡萄糖溶液质量的1%-30%。在本发明中，固定化酶方便取出并可以反复使用，无需加热灭酶活步骤；游离酶酶需要高温灭活离心去除，只能一次性使用，并且加热过程易导致糖液颜色褐变。
进一步的，所述步骤（2）中催化反应的条件为：催化pH 7.0-9.0，催化温度为65℃-75℃，催化转速90 rpm-110 rpm，催化时间4-10 h。
优选的，所述步骤（2）中催化反应的条件为：催化pH 8.0，催化温度为70℃，催化转速100 rpm，催化时间8 h。
进一步的，所述步骤（3）中葡萄糖氧化酶选择游离的或固定化葡萄糖氧化酶，其用量为D-葡萄糖溶液质量的1%-30%；过氧化氢酶选择游离的或固定化过氧化氢酶，其用量为D-葡萄糖溶液质量的1%-30%。
优选的，所述步骤（3）中葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的用量分别为D-葡萄糖溶液质量的10%和6%。
进一步的，所述步骤（3）中催化反应的条件为：催化pH 4-5，催化温度为50℃-60℃，催化转速90 rpm-110 rpm，催化时间3-8 h。
优选的，所述步骤（3）中催化反应的条件为：催化pH 4.5，催化温度为55℃，催化转速100 rpm，催化时间8 h。
进一步的，述步骤（4）中的吸附树脂柱为阴离子交换树脂柱，具体为大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱；所述透过液中D-果糖的纯度不低于95%。
进一步的，所述步骤（5）中酸溶液为稀盐酸，其浓度为0.5M。
进一步的，所述步骤（6）中金属离子包括钾、钠、钙、铁、锌、镁；碱溶液的浓度为5 M或室温下饱和溶液。
进一步的，在所述步骤（2）或（3）中，若选择固定化葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶，不需对反应液进行加热灭酶活处理；若选择游离的葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶，则需对反应液进行加热灭酶活处理，该步骤具体为：将反应液加热至100℃并维持20 min使酶灭活；冷却至室温后8000 rpm-10000 rpm离心10 min-20min，取上清液。
进一步的，所述步骤（2）或（3）中灭酶活中，对于游离酶加热使之变性失活并在10000 rpm离心20 min去除变性酶蛋白；对于固定化酶8000 rpm离心20 min去除固体催化剂。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
本发明利用两步酶催化反应得到D-果糖和葡萄糖酸，并利用过量的离子交换树脂吸附去除葡萄糖酸可以得到较高含量、较高纯度的D-果糖溶液；树脂解吸后得到葡萄糖酸溶液可方便地转化为葡萄糖酸盐溶液，产品价值高。本发明所提供方法通过将D-葡萄糖转化为葡萄糖酸/葡萄糖酸盐克服了D-果糖和D-葡萄糖色谱分离的难题，不需要复杂分离设备，工艺简单、成本低，易于实现工业化生产，同时也增加了产品种类和产品价值，具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为本发明的酶催化方法的原理图，图中M为1价碱金属（也可以为二价或高价金属）。
图2为D-果糖HPLC图谱和标准曲线。
图3为（A）pH（D-果糖作为底物），（B）（D-葡萄糖作为底物）和（C）温度对固定化GI（D-果糖作为底物）酶活性的影响；（D）温度对固定化GI（D-果糖作为底物）的热稳定性的影响。
图4为不同树脂对葡萄糖氧化酶固定化的影响（-G代表戊二醛交联）。
图5为不同树脂的量（A）、戊二醛浓度（B）、时间（C）及固定化温度（D）对葡萄糖氧化酶固定化的影响。
具体实施方式
结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。
本发明利用葡萄糖异构酶将D-葡萄糖转化为D-果糖，反应平衡后得到D-葡萄糖和D-果糖的混合液（二者大约各占50%），然后灭酶活以终止异构化反应，再加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖产生葡萄糖酸和对该酶有抑制作用的过氧化氢，而过氧化氢酶则酶解过氧化氢产生氧气和水从而解除过氧化氢对葡萄糖氧化酶的抑制作用，促进葡萄糖氧化反应的进行（图1）。本发明产生的葡萄糖酸本身具有很好的市场价值，转化成各种葡萄糖酸盐还能增加产品种类并进一步提高市场价值。本发明简化了生产工艺，同时增加了产品种类和产品价值，具有很好的应用前景。
本发明中的葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶均为市售产品。固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶为自制，步骤见下述实施例。固定化酶可以反复使用，节约了酶的成本；此外，固定化酶易于从转化液中分离出来、无需加热灭酶活步骤，既节能又避免加热造成糖液褐变。
实施例1、葡萄糖异构酶活力测定
（1）葡萄糖异构酶活力测定：100 mmol/L的D-葡萄糖或D-果糖溶液（pH值8.0）作为底物，每毫升底物溶液加入100 mg的游离酶酶粉或固定化酶，70 ℃反应10 min，立即在沸水中煮20 min灭酶活，反应液10000 rpm，室温，离心10 min，PVDF 0.45 μm滤器过滤，HPLC测定D-果糖的生成或消耗量。
（2）D-果糖HPLC分析方法：分别称取100 mg和10 mg的D-果糖标准品，用1 mL双蒸水充分溶解作为母液，然后分别用双蒸水稀释到不同浓度。D-果糖的稀释浓度（g/L）分别为20、40、60、80、100。将配置好的不同浓度的标准品在10000 rpm条件下离心10 min，PVDF0.45 μm滤器过滤，然后用HPLC进行测定。
HPLC检测条件：色谱柱Carbomix Pb-NP column (10:8 %, 7.8×300 mm, 10 μm，赛分科技)；示差检测器；流动相：ddH2O，流速为0.5 mL/min；进样量10 μL；柱温78 ℃。
结果参见图2，D-果糖的保留时间约为24 min。分别以D-果糖的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线（图2）。D-果糖标准曲线方程为：YF=3.4×105XF+15077（R2=0.99995），根据其峰面积计算出D-阿洛酮糖的浓度（g/L）。
实施例2、固定化葡萄糖异构酶最适反应条件
（1）最适pH：配置pH 2至pH 9的100 mmol/L D-葡萄糖或D-果糖溶液，加入商品化固定化葡萄糖异构酶100 mg，70 ℃反应10 min，然后分离固定化酶与反应液，反应液10000rpm，室温，离心10 min，PVDF 0.45 μm滤器过滤，HPLC测定D-果糖的生成或消耗量。结果如图3A-3B所示，固定化葡萄糖异构酶的最适pH为8.0。
（2）最适温度和热稳定性：分别在20 ℃至90 ℃测定固定化葡萄糖异构酶的酶活力。结果如图3C所示，固定化葡萄糖异构酶的最适温度为70 ℃。
将固定化葡萄糖异构酶在20℃至70 ℃保存不同时间后，测定固定化酶的酶活力。结果见图3D，固定化葡萄糖异构酶的酶活性在70 ℃保存6 h后仍然可以保持在80%以上。
实施例3、葡萄糖氧化酶固定化及优化
1、葡萄糖氧化酶活力测定
葡萄糖氧化酶的酶活力测定方法：100 mmol/L的带有饱和空气的D-葡萄糖溶液（pH值5.0）作为底物，每毫升底物溶液加入100 mg酶，50 ℃反应2 min后，立即在沸水中煮10 min灭酶活，反应液10000 rpm，室温，离心10 min，PVDF 0.45 μm滤器过滤，HPLC测定葡萄糖酸的生成量。
HPLC检测条件：色谱柱Aminex HPX-87H柱（300×7.8mm，9μm，BIO-RAD，美国）；示差检测器；流动相：0.5 mmol/L硫酸，流速为0.4 mL/min；进样量10 μL；柱温55 ℃。
酶活力定义：在最适酶活力条件下（pH值5.0，50 ℃），每分钟催化1 mg D-葡萄糖转化为葡萄糖酸所需要的酶的量为一个酶活力单位。
相对酶活力定义：定义测定的最高酶活力为100%，其他条件的酶活力占最高酶活力的百分比。
2、葡萄糖氧化酶的固定化和优化
（1）固定化载体氨基树脂的活化与交联方法
取适量的氨基树脂，浸泡在100 mM的K2HPO4-KH2PO4（pH值为5.0）缓冲液中，25 ℃，120 rpm，活化5 h。
活化结束后，缓冲液中加入适量的戊二醛溶液，25 ℃，120 rpm交联5 h，然后，用K2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤戊二醛交联的树脂，洗涤3次，以洗去残留的戊二醛溶液，得到改性的树脂。
（2）不同树脂及固定化方法比较
分别选用了氨基树脂EA，离子交换树脂SQ，D293，D201，D202和H2888作为固定化载体进行了酶固定化研究。称取活化后的不同型号的树脂1 g，每种树脂分为戊二醛交联和不交联两个实验组；按每1 g树脂加入1 mL液体酶的比例，将树脂与葡萄糖氧化酶液混合，25℃，120 rpm固定化10 h；利用K2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤制备的固定化酶3次，以完全除去游离的酶液，得到固定化的葡萄糖氧化酶；测定相对酶活力，比较不同树脂的固定化效果。
结果如图4所示，氨基树脂EA通过戊二醛交联后对葡萄糖氧化酶的固定化效果最好。其原理是利用戊二醛交联后，使载体上的醛基与酶分子上的氨基发生反应形成Schiff碱进行酶的固定化。
（3）树脂用量、戊二醛浓度、固定化时间和固定化温度优化
选取不同的树脂用量与酶活力比值制备固定化葡萄糖氧化酶，然后测定相对酶活力，结果显示载体的使用量与酶活力的最适比例为1:500，所以1 g树脂固定化0.5 mL酶溶液是最佳的载体用量与酶活力比例（图5A）。
选取从0.5%至5%不同戊二醛浓度进行葡萄糖氧化酶的固定化，制备固定化葡萄糖氧化酶并测定相对酶活力，结果显示最佳的戊二醛交联浓度为3%（图5B）。
酶与树脂结合需要一定时间，分别选取5 h至20 h 5个不同的固定化时间，制备固定化葡萄糖氧化酶并测定相对酶活力，结果显示最佳固定化时间为10 h（图5C）。
酶的固定化温度对固定化酶活力具有影响。选取从10℃至30℃ 5个不同温度进行葡萄糖氧化酶的固定化，然后测定相对酶活力，结果显示25 ℃效果最好（图5D）。
实施例 4、共固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶
（1）取适量的氨基树脂，加入100 mM的K2HPO4-KH2PO4（pH值为5.0）缓冲液，使得树脂全部浸泡在缓冲液中，25 ℃，120 rpm，活化5 h；
（2）步骤（1）所得活化氨基树脂置于缓冲液中，加入终浓度3%的戊二醛溶液，25℃，120 rpm交联5 h，然后，用K2HPO4-KH2PO4缓冲液洗涤经戊二醛交联的树脂，洗涤3次，以洗去残留的戊二醛溶液，得到改性的树脂；
（3）将步骤（2）所得改性树脂用K2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH值为5.0）浸没，按每克湿树脂加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶各500单位，在25 ℃下，120 rpm固定10 h；
（4）将步骤（3）所得固定化酶经100 μm孔径滤器过滤，除去含混合酶液的缓冲液，然后用4℃ K2HPO4-KH2PO4（pH值为5.0）缓冲液洗涤3次，过滤后置于4℃冰箱备用。
实施例5、液体酶催化联产果糖和葡萄糖酸
（1）将结晶D-葡萄糖溶于纯净水，配制30% D-葡萄糖溶液；用5 M NaOH溶液调至pH8.0±0.5；
（2）将步骤（1）所得D-葡萄糖溶液加入10%液体葡萄糖异构酶（相当于D-葡萄糖质量），在70±0.5℃，100 rpm，催化反应8 h；
（3）将步骤（2）所得反应液加热至100℃并维持20 min灭酶活；冷却至室温后10000rpm离心10 min，去除热变性酶蛋白，保留上清液；
（4）将步骤（3）所得离心上清液用5 M HCl调pH 4.5，加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，用量分别为10%和6%（相当于D-葡萄糖质量），在55℃，pH 4.5，100 rpm，反应8 h；
（5）将步骤（4）所得反应液加热至100℃并维持20 min灭酶活；冷却至室温后10000rpm离心10 min，去除热变性酶蛋白，保留上清液；
（6）将步骤（5）所得离心上清液流经加载经过预处理的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂D309的树脂柱，吸附葡萄糖酸，得到含量95%的D-果糖透过溶液；
（7）将步骤（6）离子交换树脂柱用0.5 M稀盐酸解吸得到葡萄糖酸溶液。
实施例 6、固定化酶催化联产果糖和葡萄糖酸钙
（1）将结晶D-葡萄糖溶于纯净水，配制30% D-葡萄糖溶液；用5 M NaOH溶液调至pH8.0±0.5；
（2）将步骤（1）所得D-葡萄糖溶液加入5%固定化葡萄糖异构酶（相当于D-葡萄糖质量），在70±0.5℃，100 rpm，催化反应8 h；
（3）将步骤（2）所得反应液8000 rpm，离心5 min除去固定化酶；
（4）将步骤（3）所得上清液用5 M HCl调pH 4.5，加入实施例2制备的固定化葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，用量为20%（相当于总糖质量），在55℃，pH 4.5，100 rpm，反应8 h；
（5）将步骤（4）所得反应液8000 rpm，离心5 min除去固定化酶；
（6）将步骤（5）所得离心上清液中加入0.5%粉末活性炭，在50℃，100 rpm，吸附0.5h进行脱色，用400目过滤器滤除活性炭；
（7）将步骤（6）所得清液流经加载经过预处理的大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂D309的树脂柱，吸附葡萄糖酸，得到含D-果糖的透过液；
（8）将步骤（7）离子交换树脂柱用0.5 M稀盐酸解吸得到葡萄糖酸溶液；
（9）将步骤（8）得到的葡萄糖酸溶液中加入饱和Ca(OH)2溶液至pH中性，得到葡萄糖酸钙溶液。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）以D-葡萄糖为原料，配制D-葡萄糖溶液；
（2）将步骤（1）的D-葡萄糖溶液加入葡萄糖异构酶，进行催化反应，得到反应液，离心，取上清液；
（3）将步骤（2）的上清液加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，进行催化反应，得到反应液，离心，取上清液；
（4）将步骤（3）的上清液流经吸附树脂柱，吸附葡萄糖酸，得到含D-果糖的透过液；
（5）将步骤（4）中吸附树脂柱用酸溶液解吸，得到葡萄糖酸溶液；
（6）将步骤（5）的葡萄糖酸溶液加入含金属离子的碱溶液至pH中性，得到含金属离子的葡萄糖酸盐溶液。
2.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（1）中D-葡萄糖溶液的浓度为10%-80%，其通过D-葡萄糖晶体加纯净水配制得到。
3.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（2）中葡萄糖异构酶选择游离的或固定化葡萄糖异构酶，其用量为D-葡萄糖溶液质量的1%-30%。
4.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（2）中催化反应的条件为：催化pH 7.0-9.0，催化温度为65℃-75℃，催化转速90 rpm-110 rpm，催化时间4-10 h。
5.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（3）中葡萄糖氧化酶选择游离的或固定化葡萄糖氧化酶，其用量为D-葡萄糖溶液质量的1%-30%；所述过氧化氢酶选择游离的或固定化过氧化氢酶，其用量为D-葡萄糖溶液质量的1%-30%。
6.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（3）中催化反应的条件为：催化pH 4-5，催化温度为50℃-60℃，催化转速90 rpm-110 rpm，催化时间3-8 h。
7.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的吸附树脂柱为阴离子交换树脂柱，具体为大孔苯乙烯系弱碱性阴离子交换树脂柱；所述透过液中D-果糖的纯度不低于95%。
8.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（5）中酸溶液为稀盐酸，其浓度为0.5M。
9.根据权利要求1所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，所述步骤（6）中金属离子包括钾、钠、钙、铁、锌、镁；碱溶液的浓度为5 M或室温下饱和溶液。
10.根据权利要求5所述的酶催化葡萄糖联产果糖和葡萄糖酸或葡萄糖酸盐的方法，其特征在于，在所述步骤（2）或（3）中，若选择固定化葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶，不需对反应液进行加热灭酶活处理；若选择游离的葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶或过氧化氢酶，则需对反应液进行加热灭酶活处理，该步骤具体为：将反应液加热至100℃并维持20 min使酶灭活；冷却至室温后8000 rpm-10000 rpm离心10 min-20 min，取上清液。
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