CN114921473A - 一种负调控木薯内源水杨酸合成的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种负调控木薯内源水杨酸合成的基因，命名为木薯MeHB12基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明还提供了木薯MeHB12基因编码的蛋白质及应用。本发明首次从木薯中克隆得到MeHB12基因，能够调控植物生长发育及响应非生物胁迫反应，该基因的表达受低温等诱导。进一步将该基因转化到木薯中，获得转基因植株，发现能够增加植物根系数目，抑制植株株高及节间距，同时使其叶片发生卷曲，内源水杨酸累积降低，表明，该基因在木薯的生长发育中起着重要的调控作用，将来利用MeHB12基因对植物进行遗传改良，可为改善植物株型方面提供有效的基因资源。

Description

一种负调控木薯内源水杨酸合成的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种负调控木薯内源水杨酸合成的基因及其应用。

背景技术

木薯(Manihotesculenta)是全球重要的粮食和能源作物，其储藏根含有丰富的淀粉，是全球热带、亚热带地区近10亿人粮食的主要来源，我国主要为酒精和饲料原料，以及满足国民食品多元化需求。木薯作为灌木植物，其光合效率利用率是植株生长及产量的主要影响因素；同时，木薯人工收获的方式生产效率低、成本高，是限制木薯产业发展的重要因素。而茎秆长度及株型是光合利用效率及木薯机械化收割推广的主要限制因素。在长期的进化过程中，多依赖无性繁殖，造成其基因组杂合程度高，主要品质、抗性性状由多基因控制，受环境影响大，常规的遗传育种手段过程漫长且选择能力有限。快速选育木薯新品种是我国木薯生产中的主要研究课题之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种负调控木薯内源水杨酸合成的基因及其应用。

本发明的第一个方面是提供一种负调控木薯内源水杨酸合成的基因，命名为木薯MeHB12基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二个方面是提供如本发明第一个方面所述的木薯MeHB12基因编码的蛋白质。

本发明的第三个方面是提供一种重组载体，其包含原始载体和本发明第一个方面所述的木薯MeHB12基因。

其中，所述原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pCAMBIA1300载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述原始载体为pCAMBIA1300载体质粒，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列与pCAMBIA1300载体质粒经SalI和SpeI两种限制性内切酶双酶切连接。

本发明的第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的木薯MeHB12基因、或者本发明第二个方面所述的重组载体在抑制木薯SA合成关键基因PAL(Manes.07G098700，https://phytozome-next.jgi.doe.gov/report/gene/Mesculenta_v8_1/Manes.07G098700)的表达中的应用。

本发明的第五个方面是提供如本发明第一个方面所述的木薯MeHB12基因、或者本发明第二个方面所述的重组载体在在调控植物内源水杨酸中的应用。

本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的木薯MeHB12基因、或者本发明第二个方面所述的重组载体在在调节植物生长中的应用。

本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的木薯MeHB12基因、或者本发明第二个方面所述的重组载体在调控植物根系数目、和/或株高、和/或节间距、和/或植物叶片形态中的应用。

本发明首次从木薯中克隆得到MeHB12基因，能够调控植物生长发育及响应非生物胁迫反应，该基因的表达受低温等诱导。进一步将该基因转化到木薯中，获得转基因植株，发现能够增加植物根系数目，抑制植株株高及节间距，同时使其叶片发生卷曲，内源水杨酸累积降低，表明，该基因在木薯的生长发育中起着重要的调控作用，将来利用MeHB12基因对植物进行遗传改良，可为改善植物株型方面提供有效的基因资源。

附图说明

图1为木薯MeHB12基因的的系统进化树分析图。

图2为木薯MeHB12基因在木薯不同组织中的表达分析结果。

图3为木薯MeHB12基因在低温胁迫下的表达分析结果。

图4为木薯MeHB12基因在水杨酸胁迫下的表达分析结果。

图5为植物过表达载体结构示意图。

图6为转基因木薯株系Southern blot图。

图7为转基因木薯株系和野生型植株根系发育情况比较，上图左均为野生型木薯，上图右分别为MeHB12基因过表达转基因木薯OE-5、OE-7、OE-8。

图8为转基因木薯株系和野生型植株生长情况比较，左图为MeHB12基因过表达转基因木薯，右图为野生型木薯。

图9为转基因木薯株系和野生型植株的内源水杨酸累积情况。

图10为转基因木薯株系和野生型植株中PAL基因的表达分析结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

1.材料

本实验中所用木薯材料取自种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所温室培养cv.60444。木薯样品处理是选自长势相同且叶片健康的盆栽苗为样品进行活体处理。同一时间点取样，每个时间点以每株苗顶端第三、四片展开叶为一组，设置三个生物学重复，取下后置于-80℃保存备用。木薯不同组织(根、茎、叶、花、果实)的材料采自中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验基地实生苗，同一时间点采样，液氮冷冻后，置于-80℃保存备用。

2.木薯MeHB12基因的克隆

取木薯组织参照TIANGEN植物多糖多酚RNA提取试剂盒的方法提取RNA，得到符合后续试验要求的总RNA。根据反转录试剂盒说明书(Fastking gDNA Dispelling RTSuperMix,TIANGEN)进行反转录，得到cDNA。以获得的cDNA为模板，以

MeHB12-F(SEQ ID NO:2)：5’-GCGTCGACATGATGTTTGATGAAGCAGAA-3’和

MeHB12-R(SEQ ID NO:3)：5’-GAACTAGTTCAAACCCAGAAATCCCACCACT-3’为引物，进行高保真PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA Polymerase,TAKARA)，回收PCR产物，经测序验证后，得到正确的木薯MeHB12基因，其序列如SEQ ID No:1所示(带有SalI和SpeI两限制性内切酶的酶切位点)。

PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增程序：

3.木薯MeHB12基因进化树的构建

通过将木薯MeHB12基因在NCBI数据库中进行比对分析，筛选出与木薯MeHB12基因同源性较高的基因。通过MEGA7.0(Neighbor-Joing法，bootstrap值设为1000)软件构建MeHB12基因的系统进化树(图1)。结果表明，木薯MeHB12基因与橡胶树HB-12(NCBI序列号：XP_021647363.1)亲缘关系最近，同源性达87.14％。

4.MeHB12基因的表达分析

利用Real-time RCR技术分析木薯MeHB12基因在不同组织和处理中的表达特性，结果显示，该基因在不同的组织样品，如根、茎、叶和花中均有表达，其中茎中的表达最高(图2)。4℃低温胁迫下，检测MeHB12基因在0、6h、12h、24h时的表达情况，结果显示MeHB12基因的表达随胁迫时间的延长被诱导，到低温12h时表达量最高(图3)。外源水杨酸(SA)处理(30℃下喷施1mM的水杨酸)后，检测MeHB12基因在0、1h、3h、6h时的表达情况，结果显示MeHB12基因的表达呈下降趋势(图4)。

5.MeHB12基因过表达载体构建及转基因木薯植株的筛选

(1)pCAMBIA1300-MeHB12重组质粒

将上述木薯MeHB12基因的核苷酸序列，利用SalI和SpeI两种限制性内切酶分别对目的片段及pCAMBIA1300载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与植物表达载体pCAMBIA1300片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得pCAMBIA1300-MeHB12重组质粒(图5)。

(2)转基因木薯植株的筛选

将构建好的pCAMBIA1300-MeHB12重组质粒转入农杆菌LBA4404菌株。采用农杆菌浸泡法转化木薯CV.60444脆性愈伤组织。将转化后得到潮霉素抗性苗置于MS培养基上，培养一个月后，经过炼苗、移栽到营养土中。每株取一两片叶提取DNA，以Hyg基因引物(Hyg F：5’-GGTCGCGGAGGCTATGGATGC-3’；Hyg R：5’-GCTTCTGCGGGCGATTTGTGT-3’)进行PCR扩增，能够扩增700左右的目的片段的株系都是阳性植株。

提取阳性的转基因的植株基因组DNA，使用XbaI酶切12h。将酶切后的基因组进行电泳(40V，12h)和转膜。采用DIG(roche,11745832910)标记Hyg基因探针。使用Southernblot显色试剂盒(roche,11585762001)检测目的基因在基因组中的拷贝数。结果过如图6所示，过量表达MeHB12木薯转基因株系#1、#5、#8、#10为单拷贝转基因株系；#7、#20为双拷贝转基因株系。选取#5、#7，#8株系进行后续表型实验。

6.MeHB12基因过表达转基因木薯表型

转基因木薯苗瓶装继代，经过20天生长，与野生型木薯相比，MeHB12基因过表达转基因木薯根系数目增多(如图7所示)。转基因木薯苗移栽到营养土后，经过一个半月生长，与野生型木薯相比，MeHB12基因过表达转基因木薯叶片外卷，转基因木薯植株节间距显著缩短，植株矮化(如图8所示)。与此同时，转基因木薯植株内源SA累积水平较野生型显著降低(图9)。转录组及qPCR验证数据显示(如图10所示)：转基因木薯SA合成关键基因PAL的表达量较野生型植株显著降低。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一个负调控木薯内源水杨酸合成的基因及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 742

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

gcgtcgacat gatgtttgat gaagcagaat attctccttc cacagaggat ccttacagct 60

ccatcgacac cctcaatacc actagaaaga agaagaacag gaacaaaagg aggttcagtg 120

atgaacagat taaatcattg gagtctatgt ttgaatctga atcaaggctt gagcctcgaa 180

agaaactgca gctggctaaa gagcttggtt tgcagccacg acaggttgca atatggtttc 240

agaataagag agctagatgg aagtccaagc agatcgaaag agactatagt attctacttg 300

ccaattacaa tagcttggct tccaggtttg agactctgaa gaaggagaag caagctttgg 360

caacacagtt gcagaaactg aatgatctgt tgcagaagcc aagagaggaa ggagagtgtt 420

ctggggaggc agcagctgtg aatagcagtg aaggtgaatc ggaaaatgga gacgccgcaa 480

agtgtgattc agaagcgaag tgcagcttgt cattaattga aacgtcatca aatggattgg 540

gagttctttc agatgaagat agtagcataa aggttgaata tttcggatta gaggaagaac 600

ccaaccttat gagaatgatg gaacctggcg atggatcttt gacgacatca caagaggatt 660

gggggagttt agactctgat ggccttttcg atcaatcaaa cagtggttgc cagtggtggg 720

atttctgggt ttgaactagt tc 742

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

gcgtcgacat gatgtttgat gaagcagaa 29

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

gaactagttc aaacccagaa atcccaccac t 31

Claims (8)

1.一种木薯MeHB12基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的木薯MeHB12基因编码的蛋白质。

3.一种重组载体，其特征在于，其包含原始载体和权利要求1所述的木薯MeHB12基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述原始载体为pCAMBIA1300载体质粒，SEQ ID NO:1所示核苷酸序列与pCAMBIA1300载体质粒经SalI和SpeI两种限制性内切酶双酶切连接。

5.如权利要求1所述的木薯MeHB12基因、或者权利要求3或4所述的重组载体在抑制木薯SA合成关键基因PAL的表达中的应用。

6.如权利要求1所述的木薯MeHB12基因、或者权利要求3或4所述的重组载体在调控植物内源水杨酸中的应用。

7.如权利要求1所述的木薯MeHB12基因、或者权利要求3或4所述的重组载体在调节植物生长中的应用。

8.如权利要求1所述的木薯MeHB12基因、或者权利要求3或4所述的重组载体在调控植物根系数目、和/或株高、和/或节间距、和/或植物叶片形态中的应用。

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