CN114894752A - 一种高速点扫描超分辨显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种高速点扫描超分辨显微成像系统包括激光器组、激发光模块、抑制光模块、合束模块、扫描模块、样品台、探测模块。激光器组包括一个抑制光激光器和一个激发光激光器。样品台用于放置样品和为样品提供二维的高速移动，用于大视场成像的拼接。激本发明旨在通过激光器组产生激发光和抑制光，分别经过激发光模块和抑制光模块加载全息图案的调制，通过合束模块的调整，达到完全重合的效果，再经过傅里叶变换分别形成7个成正六边形均匀分布的光斑，然后激发光和抑制光共14个光斑进入到扫描模块，同步扫描致样品表面，最后探测模块对待成像样品受激发所产生的荧光信号进行STED超分辨成像。从而达到快速超分辨成像的效果。

Description

一种高速点扫描超分辨显微成像系统

技术领域

本申请涉及光学显微的技术领域，尤其是涉及一种高速点扫描超分辨显微成像系统。

背景技术

受激辐射损耗显微技术是一种超分辨成像技术，可以突破衍射极限对光学显微镜的分辨率的限制，实现超分辨显微成像。

其原理为利用两束激光来进行显微成像，其中一束为激发光，用于激发荧光材料；而另一束是光斑形状为圆环状，与激发光共轴且波长与荧光分子发射波长匹配的擦除光。两束光重叠区域会产生受激辐射作用，而在中心区域的荧光分子则不受擦除光的影响，只会发生自发辐射。

由于该显微技术每一路的扫描均需要两种波长的激光器来实现，为了提高扫描的速度，往往增加扫描激光器的数量来实现多点扫描，因此目前的多路受激辐射损耗系统的硬件复杂，光路设计冗杂、成本高昂。

发明内容

为了简化光路设计，减少系统成本，

本申请提供的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，采用如下的技术方案：

一种高速点扫描超分辨显微成像系统，包括

激光器组，包括抑制光激光器和激发光激光器；

激发光模块，用于调质激发光，包括第一空间光调制器，第一空间光调制器用于将经过第一空间光调制器的激发光衍射成7个正六边形分布的光斑，当激发光以一定的角度入射进第一空间光调制器芯片后，控制第一空间光调制器加载的全息相位图以调节每个像素的相位与强度；

抑制光模块，用于调质抑制光，包括第二空间光调制器，第二空间光调制器用于将经过第二空间光调制器的激发光衍射成7个正六边形分布的光斑，当抑制光以一定的角度入射进第二空间光调制器芯片后，控制第二空间光调制器加载的全息相位图以调节每个像素的相位与强度；

合束模块，用于反射抑制光和投射激发光以合并激发光和抑制光；

扫描模块，用于对激发光和抑制光进行同时扫描，实现对样品进行平面扫描；

样品台，用于放置样品且为样品提供平面移动；

探测模块，用于收集样品被激光激发的荧光信号成像出样品图案。

通过采用上述技术方案，空间光调制器简称SML。激发光和抑制光以一定的角度入射进SLM芯片，利用控制SLM加载的相位图，从而实现每个像素的相位与强度的调节，经过SLM衍射的多个光斑在合束后经过扫描模块共轭至样品面，进行点扫描。达到同时实现对荧光样品进行7路甚至N路的同时扫描效果，理论速度能达到单路点扫描成像的7倍甚至N倍。且当扫描光束变成N倍时，激光器数量不会随之增加，始终只采用一台抑制光激光器和一台激发光激光器。这样在提高扫描速度的同时，大大减少了系统的复杂程度和硬件的成本，同时也扩展了系统的应用范围。

可选的，所述激发光模块还包括第一扩束镜组，所述第一扩束镜组位于激光器组和第一空间光调制器之间，第一扩束镜组用于扩束激发光的光斑大小以使激发光能覆盖第一空间光调制器。

通过采用上述技术方案，第一扩束镜组用于扩束激光器组出来的光斑大小，这样可以有效的降低激光单位面积的能量，使其满足第一空间光调制器的损伤阈值，并使激光器组出来的光斑能覆盖第一空间光调制器，使激发光能进行更好的调制。

可选的，所述抑制光模块还包括第二扩束镜组，所述第二扩束镜组位于激光器组和第二空间光调制器之间，第二扩束镜组用于扩束激发光的光斑大小以使激发光能覆盖第二空间光调制器。

通过采用上述技术方案，第二扩束镜组用于扩束激光器组出来的光斑大小，这样可以有效的降低激光单位面积的能量，使其满足第二空间光调制器的损伤阈值，并使激光器组出来的光斑能覆盖第二空间光调制器，使抑制光能进行更好的调制。

可选的，所述合束模块依次包括第一反射镜、第一二向色镜和成像透镜组，所述第一反射镜用于反射抑制光，第一二向色镜用于反射激发光和投射抑制光以合并激发光和抑制光，所述成像透镜组用于对合束后的激光进行傅里叶变换。

通过采用上述技术方案，衍射的光斑经过合束后在成像透镜傅里叶面上成像出7个正六边形分布的光斑，以用于后续对样品的扫描。

可选的，所述合束模块还包含光掩模版，成像透镜组包括一对成像透镜，光掩模版位于两个成像透镜之间，所述光掩模版用于对光斑进行滤波。

通过采用上述技术方案，利用光掩模版对激光进行滤波，提高光斑质量。

可选的，所述合束模块还包括调节平台，所述调节平台包括底台、平行滑动连接于底台的中间台、转动连接于中间台的安装台，所述光掩模版安装于安装台。

通过采用上述技术方案，通过调节光掩模版相对光轴的角度，使得光掩模版上的图案与光斑一一对应。

可选的，所述扫描模块包括振镜和物镜，所述振镜用于对重合后的激发光和抑制光进行扫描实现对样品的平面扫描，所述物镜用于聚焦激发光和抑制光至样品面。

通过采用上述技术方案，样品放置样品台上，样品位于物镜的焦点处，样品台提供高速的二维移动，成正六边形分布的七个光斑共轭到样品面，激光激发样品面上的荧光染料发出荧光信号，返回经过物镜后进入探测模块。

可选的，所述扫描模块还包括光束校正组件，所述光束校正组件位于振镜和物镜之间，所述光束校正组件包括扫描透镜和场镜，所述光束校正组件用于对扫描光束进行边缘矫正。

通过采用上述技术方案，使得用于扫描样品的激光可符合预设轨迹。

可选的，所述探测模块包括第二二向色镜、收集透镜、多模光纤组和PMT组，样品激发的荧光信号返回依次经过物镜、场镜、扫描透镜、第二二向色镜、收集透镜、定制光纤组和PMT组。

通过采用上述技术方案，样品激发的荧光信号返回依次经过物镜、场镜、扫描透镜、第二二向色镜、收集透镜、定制光纤组，最后进入PMT组，PMT输出的信号经过采集卡的处理进行成像，从而可采集到样品成像。

可选的，所述第二二向色镜与光轴成45°角放置。

通过采用上述技术方案，起到将激发激光和返回的荧光信号区分的作用。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1.扩展了空间光调制器的使用，通过分析其功能，配合光掩模版选择不同衍射光斑，进而设计出一套高速点扫描超分辨显微成像系统，达到同时实现对荧光样品进行7路甚至N路的同时扫描效果，理论速度能达到单路点扫描成像的7倍甚至N倍；

2.当扫描光束变成N倍时，激光器数量不会随之增加，始终只采用一台抑制光激光器和一台激发光激光器。这样在提高扫描速度的同时，大大减少了系统的复杂程度和硬件的成本，同时也扩展了系统的应用范围。

附图说明

图1是实施例的系统设计示意图。

图2是实施例提供的STED超分辨成像原理图。

图3是实施例激发光模块中SLM预先设计计算好的全息相位图。

图4是实施例抑制光模块中SLM预先设计计算好的全息相位图。

图5是实施例激发光模块中SLM加载的全息相位图经过傅里叶变换后的光斑分布图。

图6是实施例抑制光模块中SLM加载的全息相位图经过傅里叶变换后的光斑分布图。

图7是实施例中调节平台的结构示意图；

附图标记说明：1、抑制光激光器；2、激发光激光器；3、第一扩束镜组；4、扩束镜；5、第一空间光调制器；6、第二扩束镜组；7、第二空间光调制器；8、第一反射镜；9、第一二向色镜；10、光掩模版；11、调节平台；12、成像透镜组；13、成像透镜；14、底台；15、中间台；16、安装台；17、丝杠组件；18、光学调整架；19、振镜；20、物镜；21、扫描透镜；22、场镜；23、第二二向色镜；24、第二反射镜；25、收集透镜；26、多模光纤组；27、 PMT组；28、样品台。

具体实施方式

以下结合附图1-7对本申请作进一步详细说明。

本申请实施例公开一种高速点扫描超分辨显微成像系统。参照图1，一种高速点扫描超分辨显微成像系统包括激光器组、激发光模块、抑制光模块、合束模块、扫描模块、样品台28、探测模块。激光器组包括一个抑制光激光器1和一个激发光激光器2。样品台28用于放置样品和为样品提供二维的高速移动，用于大视场成像的拼接。

参照图1和图2，工作时，将荧光样品放置于样品台28上，激发光激光器2出射适合样品激发荧光特性的的激光，并以一定角度入射激发光模块，通过调节激发光模块使得所需衍射光以一定角度进入后面的光学系统。抑制光激光器1出射适合样品激发荧光特性的的激光，并以一定角度入射抑制光模块，通过调节抑制光模块使得所需衍射光以一定角度进入后面的光学系统。通过合束模块将两束激光完全重合，合束后的光斑进入扫描模块，扫描模块对样品进行二维的平面扫描，并激发样品荧光信号和抑制不需要的荧光。样品发出的荧光沿着入射光路返回，进入到探测模块内，最后经过放大电路的信号放大，传送到处理单元进行成像。

具体的，参照图1，激发光激光器2用于激发样品的荧光特性，激发光激光器2的波长根据实际荧光样品的需要进行选择。在本实施例中，选用488mm波长的激发光。

参照图1，激发光模块包括第一扩束镜组3、第一空间光调制器5。第一扩束镜组3包括两个前后依次排列的扩束镜4，扩束镜4为透镜。第一扩束镜组3用于扩束激发光激光器2出来的光斑大小，以有效的降低激光单位面积的能量，使其满足第一空间光调制器5的损伤阈值，并使激发光激光器2出来的光斑能覆盖第一空间光调制器5，使激发光能进行更好的调制。第一空间光调制器5使用前，将预先计算好的全息相位图加载到第一空间光调制器5上，第一空间光调制器5对应的全息相位图参照图3所示。参照图1，通过调节第一空间光调制器5的角度，使得激发光扩束后以一定的角度入射进第一空间光调制器5芯片，利用控制第一空间光调制器5加载的全息相位图，从而实现每个像素的相位与强度的调节，然后经过第一空间光调制器5衍射的衍射光以一定角度进入后面的光学系统。

参照图1，抑制光激光器1用于抑制样品的荧光特性，抑制光激光器1的波长根据实际荧光样品的需要进行选择。在本实施例中，选用592mm波长的抑制光。

参照图1，抑制光模块包括第二扩束镜组6、第二空间光调制器7。第二扩束镜组6包括两个前后依次排列的扩束镜4，扩束镜4为透镜。第二扩束镜组6用于扩束抑制光激光器1出来的光斑大小，以有效的降低激光单位面积的能量，使其满足第二空间光调制器7的损伤阈值，并使激光器出来的光斑能覆盖第二空间光调制器7，使抑制光能进行更好的调制。第二空间光调制器7使用前，将预先计算好的全息相位图加载到第二空间光调制器7上，第二空间光调制器7对应的全息相位图参照图4所示。通过调节第二空间光调制器7的角度，使得抑制光扩束后以一定的角度入射进第二空间光调制器7芯片，利用控制第二空间光调制器7加载的全息相位图，从而实现每个像素的相位与强度的调节，然后经过第二空间光调制器7衍射的衍射光以一定角度进入后面的光学系统。

作为优选，第一空间光调制器5和第二空间光调制器7均可以选择纯相位型空间光调制器。

参照图1，合束模块包括第一反射镜8、第一二向色镜9、光掩模版10、调节平台11、成像透镜组12。从第一空间光调制器5衍射出的激发光被第一二向色镜9反射后摄入成像透镜组12。从第二空间光调制器7衍射出的抑制光被第一反射镜8反射并穿过第一二向色镜9，摄入成像透镜组12。从而实现了激发光和抑制光的合束。成像透镜组12包括一对成像透镜13，光掩模版10安装于调节平台11上，光掩模版10位于两个成像透镜13之间。通过调节平台11调节光掩模版10的角度，使得光掩模版10垂直于光轴。合束后的光斑经过成像透镜13，在成像透镜13傅里叶面上成像出7个正六边形分布的光斑，光斑形状参照图5和图6。经过光掩模版10后的光斑被滤波，提高了质量，为进入后面的光学系统做好准备。

参照图7，参照调节平台11包括底台14、平行滑动连接于底台14的中间台15、转动连接于中间台15的安装台16，光掩模版10安装于安装台16。中间台15通过丝杠组件 17安装于底台14上，通过旋转丝杠可驱使中间台15相对底台14滑动。安装台16和中间台15组成一个光学调整架18，通过转动光学调整架18上的螺栓，来实现安装台16相对中间台15的转动，从而实现对安装台16位置的调节。

扫描模块依次包括振镜19、光束校正组件、物镜20。光束校正组件包括扫描透镜21和场镜22。探测模块依次包括第二二向色镜23、第二反射镜24、收集透镜25、多模光纤组 26和PMT组27。第二二向色镜23与光轴成45°角放置。

合束后的光斑进入扫描单元，振镜19对样品进行二维的平面扫描，边缘光线由光束校正组件进行矫正。经过矫正后的光束经过物镜20，聚焦到样品面，同时激发样品荧光信号和抑制不需要的荧光。样品发出的荧光沿着入射光路返回，经过物镜20、扫描透镜21、场镜22、振镜19，达到第二二向色镜23，被第二反射镜24反射向收集透镜25，经过收集透镜25的汇聚，荧光信号被收集进多模光纤组26达到光电倍增管PMT组27，最后经过放大电路的信号放大，传送到处理单元进行成像。

本申请实施例一种高速点扫描超分辨显微成像系统的实施原理为：

1、将样品放置于样品台28上，激发光激光器2出射适合样品激发荧光特性的488nm波长的激光，经过第一扩束镜组3调节光斑的大小，可以根据激发光激光器2出射光斑和第一空间光调制器5的需求对扩束镜4的焦距进行调整，使光斑满足系统要求；

2、经过调节的光斑以一定的角度入射进第一空间光调制器5，通过调节第一空间光调制器5 芯片的角度使得所需衍射光以一定角度进入后面的光学系统；

3、控制第一空间光调制器5显示一定周期、相位的图案，经过第一个成像透镜13的傅里叶变换后，在成像透镜13的傅里叶面上呈现出7个成正六边形分布的点斑；

4、抑制光激光器1出射适合样品抑制样品荧光特性的592nm波长的激光，经过第二扩束镜组6调节光斑的大小，激光以一定的角度入射进第二空间光调制器7，通过调节第二空间光调制器7芯片的角度使得所需衍射光以一定角度进入后面的光学系统；

5、控制第二空间光调制器7显示一定周期、相位的图案，经过第一个成像透镜13的傅里叶变换后，在成像透镜13的傅里叶面上呈现出7个成正六边形分布的点斑；

6、依靠第一反射镜8和第一二向色镜9调节方向和角度，使两束激光完全重合；

7、光掩模版10的位置与成像透镜13的傅里叶面重合，起到对光斑的滤波作用，通过调节调节平台11，保证光掩模版10上的图案和经过傅里叶变换后的光斑重合；

8、合束后的光斑进入扫描单元，扫描单元对样品进行二维的平面扫描，边缘光线由扫描透镜21和场镜22进行矫正，经过矫正后的光束经过物镜20，聚焦到样品面，同时激发样品荧光信号和抑制不需要的荧光；

9、经过物镜20、扫描透镜21、场镜22、振镜19，达到第二二向色镜23，被第二反射镜24 反射向收集透镜25，经过收集透镜25的汇聚，荧光信号被收集进多模光纤组26达到光电倍增管PMT组27，最后经过放大电路的信号放大，传送到处理单元进行成像。

本发明的特点在于，本系统存在2个4f系统，很大程度上提高了成像的质量。第一空间光调制器5、第二空间光调制器7、光掩模版10、成像透镜组12、振镜19扫描模块形成一个4f系统；振镜19扫描模块、扫描透镜21、场镜22与物镜2018形成一个4f系统。两路激光经过一空间光调制器和第二空间光调制器7的调制，经过傅里叶变换后在光掩模版 10处分别变成正六边形均匀分布的7个实心高斯光斑和7个空心光斑。本系统只用2个激光器，就进行了7路STED的高速点扫描。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：包括

激光器组，包括抑制光激光器(1)和激发光激光器(2)；

激发光模块，用于调质激发光，包括第一空间光调制器(5)，第一空间光调制器(5)用于将经过第一空间光调制器(5)的激发光衍射成7个正六边形分布的光斑，当激发光以一定的角度入射进第一空间光调制器(5)芯片后，控制第一空间光调制器(5)加载的全息相位图以调节每个像素的相位与强度；

抑制光模块，用于调质抑制光，包括第二空间光调制器(7)，第二空间光调制器(7)用于将经过第二空间光调制器(7)的激发光衍射成7个正六边形分布的光斑，当抑制光以一定的角度入射进第二空间光调制器(7)芯片后，控制第二空间光调制器(7)加载的全息相位图以调节每个像素的相位与强度；

合束模块，用于反射抑制光和投射激发光以合并激发光和抑制光；

扫描模块，用于对激发光和抑制光进行同时扫描，实现对样品进行平面扫描；

样品台（28），用于放置样品且为样品提供平面移动；

探测模块，用于收集样品被激光激发的荧光信号成像出样品图案。

2.根据权利要求1所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述激发光模块还包括第一扩束镜组(3)，所述第一扩束镜组(3)位于激光器组和第一空间光调制器(5)之间，第一扩束镜组(3)用于扩束激发光的光斑大小以使激发光能覆盖第一空间光调制器(5)。

3.根据权利要求1所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述抑制光模块还包括第二扩束镜组(6)，所述第二扩束镜组(6)位于激光器组和第二空间光调制器(7)之间，第二扩束镜组(6)用于扩束激发光的光斑大小以使激发光能覆盖第二空间光调制器(7)。

4.根据权利要求1所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述合束模块依次包括第一反射镜(8)、第一二向色镜(9)和成像透镜组(12)，所述第一反射镜(8)用于反射抑制光，第一二向色镜(9)用于反射激发光和投射抑制光以合并激发光和抑制光，所述成像透镜组(12)用于对合束后的激光进行傅里叶变换。

5.根据权利要求4所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述合束模块还包含光掩模版(10)，成像透镜组(12)包括一对成像透镜(13)，光掩模版(10)位于两个成像透镜(13)之间，所述光掩模版(10)用于对光斑进行滤波。

6.根据权利要求5所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述合束模块还包括调节平台(11)，所述调节平台(11)包括底台(14)、平行滑动连接于底台(14)的中间台(15)、转动连接于中间台(15)的安装台(16)，所述光掩模版(10)安装于安装台(16)。

7.根据权利要求1所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述扫描模块包括振镜(19)和物镜(20)，所述振镜(19)用于对重合后的激发光和抑制光进行扫描实现对样品的平面扫描，所述物镜(20)用于聚焦激发光和抑制光至样品面。

8.根据权利要求6所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述扫描模块还包括光束校正组件，所述光束校正组件位于振镜(19)和物镜(20)之间，所述光束校正组件包括扫描透镜(21)和场镜(22)，所述光束校正组件用于对扫描光束进行边缘矫正。

9.根据权利要求7所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述探测模块包括第二二向色镜(23)、收集透镜(25)、多模光纤组(26)和PMT组(27)，样品激发的荧光信号返回依次经过物镜(20)、场镜(22)、扫描透镜(21)、第二二向色镜(23)、收集透镜(25)、定制光纤组和PMT组(27)。

10.根据权利要求8所述的一种高速点扫描超分辨显微成像系统，其特征在于：所述第二二向色镜(23)与光轴成45°角放置。

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