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CN114874376B - 多孔树脂珠及其制备方法和应用 - Google Patents

多孔树脂珠及其制备方法和应用 Download PDF

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CN114874376B
CN114874376B CN202210667591.2A CN202210667591A CN114874376B CN 114874376 B CN114874376 B CN 114874376B CN 202210667591 A CN202210667591 A CN 202210667591A CN 114874376 B CN114874376 B CN 114874376B
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swelling
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Hebei Dinaxingke Biotechnology Co ltd
Tsingke Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种多孔树脂珠及其制备方法和应用，该多孔树脂包括有取代或无取代的苯乙烯单元、二甲基丙烯酸酯单元、乙酰氧基苯乙烯单元和溶胀平衡单元；由于该多孔树脂珠中包括溶胀平衡单元，使得该多孔树脂珠在极性较大的溶剂中能够达到比普通的聚苯乙烯多孔树脂更高的溶胀性能，在进行长片段的寡核苷酸合成时，具有更高的反应效率，提高长片段寡核苷酸的纯度和产率；同时该多孔树脂珠在极性大的溶剂中的溶胀体积增大，在极性小的溶剂中的溶胀体积减小，在不同极性的溶剂中的溶胀性差距减小，进而减小了反应器中压力的波动，使得长片段寡核苷酸的产量稳定。

Description

多孔树脂珠及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及共聚物制备技术领域，特别是涉及一种多孔树脂珠及其制备方法和应用。
背景技术
寡核苷酸的合成能力可以通过产率和合成目的基因片段的全长比(纯度)来评价，合成寡核苷酸的长度通常的决定因素在于合成载体的孔径大小。目前普遍存在的合成载体为可控孔径的纳米孔玻璃，是一种刚性、非溶胀的无机材料，主要成分为二氧化硅。纳米孔玻璃的孔径可以控制在0-400nm左右，但是其比表面积和表面羟基含量随着孔径的增大而减小，并且其载量及碱基合成长度与孔径大小直接相关，合成长度如果大于相应参数，基因合成的纯度将大幅下降，故而纳米孔玻璃作为载体时不利于大规模合成长片段的寡核苷酸。
随着核酸药物的发展，多孔树脂被用作寡核苷酸合成过程中的固体载体，其载量可以控制到400umol/g，但是其在乙腈中的溶胀性较小，在甲苯中的溶胀性较大，作为固体载体时，会造成批次间产率的不稳定，合成20-mer以上的DNA时就会造成产率和纯度的大幅下降，亦不利于大规模合成长链的寡核苷酸。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够用于大规模、高纯度的长片段寡核苷酸合成的多孔树脂珠及其制备方法和应用。
一实施例提供的一种多孔树脂珠，包括有取代或无取代的苯乙烯单元、二甲基丙烯酸酯单元、乙酰氧基苯乙烯单元和溶胀平衡单元；
所述溶胀平衡单元包括丙烯酸酯单元和有取代或无取代的丙烯腈单元中的一种或多种。
在一些实施例中，所述有取代或无取代的丙烯腈单元包括丙烯腈单元和甲基丙烯腈单元中的一种或多种；和/或所述丙烯酸酯单元包括丙烯酸甲酯单元和丙烯酸丁酯单元中的一种或多种；
可选地，所述有取代或无取代的苯乙烯单元包括苯乙烯单元、卤代苯乙烯单元和烷基取代苯乙烯单元中的一种或多种；和/或所述二甲基丙烯酸酯单元包括双甲基丙烯酸二乙二醇酯单元和双甲基丙烯酸三乙二醇酯单元中的一种或多种。
在一些实施例中，所述多孔树脂珠包括多个羟基，多个所述羟基分别位于所述多孔树脂珠的表面和/或所述表面的多个孔道内；
可选地，多个所述羟基的含量为550～580μmol/g；
可选地，所述多孔树脂珠的粒径为100～400目。
一实施例提供的一种多孔树脂珠的制备方法，包括将有取代或无取代的苯乙烯单体、二甲基丙烯酸酯单体、乙酰氧基苯乙烯单体和溶胀平衡单体进行聚合反应，生成共聚物。
在一些实施例中，具体包括如下步骤：
将稳定剂、亚甲基蓝和水混合，制得分散介质；
将所述有取代或无取代的苯乙烯单体、所述二甲基丙烯酸酯单体、所述乙酰氧基苯乙烯单体、所述溶胀平衡单体、致孔剂和引发剂混合，制得油相；
将所述油相与所述分散介质混合，通氮气，搅拌，加热，制得所述共聚物；
将所述共聚物中含有的致孔剂去除，制得多孔共聚物；
将所述多孔共聚物于碱性醇水溶液中进行水解，制得羟基多孔树脂珠。
在一些实施例中，所述溶胀平衡单体占总单体的质量百分比为2～5％；和/或所述二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比为3～7％；和/或所述乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比为5～12％。
在一些实施例中，所述溶胀平衡单体包括有取代或无取代的丙烯腈单体和丙烯酸酯单体中的一种或多种；
可选地，所述溶胀平衡单体包括有取代或无取代的丙烯腈单体和丙烯酸酯单体；所述有取代或无取代的丙烯腈单体和所述丙烯酸酯单体的质量比为(1～8):1；
可选地，所述有取代或无取代的丙烯腈单体包括丙烯腈单体和甲基丙烯腈单体中的一种或多种；和/或所述丙烯酸酯单体包括丙烯酸甲酯单体和丙烯酸丁酯单体中的一种或多种；
可选地，所述有取代或无取代的苯乙烯单体包括苯乙烯单体、卤代苯乙烯单体和烷基取代苯乙烯单体中的一种或多种；和/或所述二甲基丙烯酸酯单体包括双甲基丙烯酸二乙二醇酯单体和双甲基丙烯酸三乙二醇酯单体中的一种或多种。
在一些实施例中，所述稳定剂包括聚乙烯醇；
可选地，所述聚乙烯醇包括如下条件中的至少一项：
(1)醇解度为75～89％；
(2)分子量为1700～2000Da；
可选地，所述稳定剂占所述水的质量百分比为0.02～1％；和/或所述亚甲基蓝占所述水的质量百分比为0.01～0.03％。
在一些实施例中，所述引发剂包括过氧化苯甲酰，所述引发剂占总单体的质量百分比为1～6％；和/或所述致孔剂包括异辛烷、异辛醇、十一醇、正癸醇和1-氯癸烷中的一种或多种，所述致孔剂占总单体的质量百分比为1.0～2.6％。
在一些实施例中，所述碱性醇水溶液中包括氢氧化钠、乙醇和水；
可选地，所述碱性醇水溶液中氢氧化钠和水的质量比为(1～5):100；和/或所述碱性醇水溶液中水和乙醇的体积比为1:2；
可选地，进行加热时，加热温度为70～90℃。
一实施例提供的如上述多孔树脂珠或上述多孔树脂珠的制备方法制备得到的多孔树脂珠在制备寡核苷酸中的应用。
上述提供的多孔树脂珠及其制备方法和应用，由于该多孔树脂珠中包括溶胀平衡单元，使得该多孔树脂珠在极性较大的溶剂中能够达到比普通的聚苯乙烯多孔树脂更高的溶胀性能，在进行长片段的寡核苷酸合成时，具有更高的反应效率，提高长片段寡核苷酸的纯度和产率；同时该多孔树脂珠在极性大的溶剂中的溶胀体积增大，在极性小的溶剂中的溶胀体积减小，在不同极性的溶剂中的溶胀性差距减小，进而减小了反应器中压力的波动，使得长片段寡核苷酸的产量稳定。
附图说明
图1为实施例1提供的多孔树脂珠的形貌图；
图2为对比例1提供的多孔树脂珠的形貌图；
图3为对比例2提供的多孔树脂珠的形貌图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本文中，“一种或多种”指所列项目的任一种或任两种或任两种以上的组合。
本文中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本文中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，70～90℃表示左端点“70”和右端点“90”的单位都是℃。
本文中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的可选范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
寡核苷酸的合成能力可以通过产率和合成目的基因片段的全长比(纯度)来评价，合成寡核苷酸的长度通常的决定因素在于合成载体的孔径大小。目前市面上普遍存在的合成载体为可控孔径的纳米孔玻璃，纳米孔玻璃是一种刚性、非溶胀的无机材料，主要成分为二氧化硅。纳米孔玻璃的孔径可以控制在0-400nm左右，但是其比表面积和表面羟基含量随着孔径的增大而减小。常用的用于寡核苷酸合成的纳米孔玻璃包括河北迪纳兴科生物科技有限公司的500A、1000A和2000A，500A的比表面积为80m2/g左右、载量最高在100μmol/g左右、碱基长度一般在20个左右，1000A的比表面积为35m2/g、载量最高在40μmol/g左右、碱基长度一般小于80个，2000A的比表面积为为20m2/g、载量最高在25μmol/g左右、碱基长度一般小于120个；纳米孔玻璃的载量及碱基合成长度与孔径大小直接相关，合成长度如果大于相应参数，基因合成的纯度将大幅下降，故而纳米孔玻璃作为载体时不利于大规模合成长片段的寡核苷酸。
随着核酸药物的发展，多孔树脂被用作寡核苷酸合成过程中的固体载体；多孔树脂作为固体载体时，对于RNA和DNA的负载能力在250μmol/g和400μmol/g左右，但是当用多孔树脂作为固体载体，在合成20-mer以上的DNA时就会造成产率和纯度的下降，亦不利于合成长链的寡核苷酸。
多孔树脂的溶胀孔径决定了寡核苷酸合成的长度，表面羟基载量大小决定寡核苷酸合成的产量。多孔树脂在亚磷酰胺固相合成法溶剂中仅能溶胀而不能溶解，当其作为载体时，含有功能基团的低分子化合物与其以共价键的形式结合，然后进行单步或多步的耦合反应，反应的副产物可以通过过滤去除。
多孔树脂的功能基团分布稀疏时可以避免大分子的副反应，有利于合成分子量较大的寡核苷酸。多孔树脂的功能基团分布密集时虽然可以提高合成的寡核苷酸的产量，但是对于分子链长度有一定的限制。
现在较多使用的多孔树脂大多是PS交联树脂，相对极性较小，在极性大的溶剂中，溶胀性较低，无法完全伸展。为了获得大量目标长度的寡核苷酸，需要在极性大的溶剂中溶胀到一定孔径，以达到较高的反应效率。但是多孔树脂在极性小的溶剂中具有良好的溶胀性能，在亚磷酰胺固相合成过程中经过多步，在多种有机溶剂中进行反应，将会造成反应柱及寡核苷酸产量变化。
为了解决上述问题，一实施例提供了一种多孔树脂珠，可以包括有取代或无取代的苯乙烯单元、二甲基丙烯酸酯单元、乙酰氧基苯乙烯单元和溶胀平衡单元。
需要说明的是，本文中提及单元是指多孔树脂珠中的链段。有取代或无取代的苯乙烯单元是指由有取代或无取代的苯乙烯单体参与聚合反应构成的链段；二甲基丙烯酸酯单元是指由二甲基丙烯酸酯单体参与聚合反应构成的链段；乙酰氧基苯乙烯单元是指由乙酰氧基苯乙烯单体参与聚合反应构成的链段；溶胀平衡单元是指由溶胀平衡单体参与聚合反应构成的链段，溶胀平衡单体指的是能够使得多孔树脂珠在不同溶剂中的溶胀体积差距减小的的单体。
该多孔树脂珠中包括溶胀平衡单元，使得该多孔树脂珠在极性较大的溶剂中能够达到比普通的聚苯乙烯多孔树脂更高的溶胀性能，在进行长片段的寡核苷酸合成时，具有更高的反应效率，提高长片段寡核苷酸的纯度和产率；同时该多孔树脂珠在极性大的溶剂中的溶胀体积增大，在极性小的溶剂中的溶胀体积减小，在不同极性的溶剂中的溶胀性差距减小，进而减小了反应器中压力的波动，使得长片段寡核苷酸的产量稳定。
该多孔树脂珠用于寡核苷酸酸固相合成载体时，载量能够达到350～400μmol/g，合成20个碱基的合成效率在89％及以上，合成40个碱基的合成效率在80％及以上，合成60个碱基的合成效率在73％及以上，合成80个碱基的合成效率在65％及以上。并且在大量合成寡核苷酸时，具有稳定的合成纯度和批次间产量差异。
在一些实施例中，所述溶胀平衡单元可以包括丙烯酸酯单元和有取代或无取代的丙烯腈单元中的一种或多种。
当多孔树脂珠中含有有取代或无取代的丙烯腈单元或丙烯酸酯单元时，该多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距均能减小；但是当多孔树脂珠中同时含有丙烯酸酯单元和有取代或无取代的丙烯腈单元时，该多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距最小。
在其中的一些实施例中，所述有取代或无取代的丙烯腈单元包括丙烯腈单元和甲基丙烯腈单元中的一种或多种。
在其中的一些实施例中，所述丙烯酸酯单元可以包括丙烯酸甲酯单元和丙烯酸丁酯单元中的一种或多种。
在一些实施例中，所述有取代或无取代的苯乙烯单元可以包括苯乙烯单元、卤代苯乙烯单元和烷基取代苯乙烯单元中的一种或多种。例如，卤代苯乙烯单元可以包括氯苯乙烯单元或二氯苯乙烯单元等，具体不做限定；烷基取代苯乙烯可以包括甲基苯乙烯单元等，具体不做限定。
在一些实施例中，所述二甲基丙烯酸酯单元可以包括双甲基丙烯酸二乙二醇酯单元和双甲基丙烯酸三乙二醇酯单元中的一种或多种。
在一些实施例中，所述多孔树脂珠可以包括多个羟基，多个所述羟基可以分别位于所述多孔树脂珠的表面和/或所述表面的多个孔道内。羟基为功能性基团，羟基的量影响合成的寡核苷酸的长度和纯度。
在其中的一些实施例中，多个所述羟基的含量可以为550～580μmol/g；例如，可以为550μmol/g、555μmol/g、560μmol/g、5655μmol/g、570μmol/g、575μmol/g或580μmol/g等，具体不做限定。
在一些实施例中，所述多孔树脂珠的粒径可以为100～400目。
一实施例提供的多孔树脂珠的制备方法，包括将有取代或无取代的苯乙烯单体、二甲基丙烯酸酯单体、乙酰氧基苯乙烯单体和溶胀平衡单体进行聚合反应，生成共聚物。
在一些实施例中，所述溶胀平衡单体可以包括有取代或无取代的丙烯腈单体和丙烯酸酯单体中的一种或多种。在制备多孔树脂珠时，加入有取代或无取代的丙烯腈单体或丙烯酸酯单体时，该多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距均能减小；但是当多孔树脂珠中同时含有丙烯酸酯单体和有取代或无取代的丙烯腈单体时，该多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距最小。
在一些实施例中，所述溶胀平衡单体占总单体的质量百分比可以为2～5％；例如，可以为2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％等。当溶胀平衡单体占总单体的质量百分比高于5％时，得不到规则的球形多孔树脂珠；当溶胀平衡单体占总单体的质量百分比低于2％时，不能够有效降低多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距。
可以理解的是，总单体指的是制备多孔树脂珠时采用的有取代或无取代的苯乙烯单体、二甲基丙烯酸酯单体、乙酰氧基苯乙烯单体和溶胀平衡单体。
在一些实施例中，所述溶胀平衡单体包括有取代或无取代的丙烯腈单体和丙烯酸酯单体；所述有取代或无取代的丙烯腈单体和所述丙烯酸酯单体的质量比可以为(1～8):1。例如，可以为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1等，优选为5:2。
在一些实施例中，所述有取代或无取代的丙烯腈单体可以包括丙烯腈单体和甲基丙烯腈单体中的一种或多种。
在一些实施例中，所述丙烯酸酯单体可以包括丙烯酸甲酯单体和丙烯酸丁酯单体中的一种或多种。
在一些实施例中，所述有取代或无取代的苯乙烯单体可以包括苯乙烯单体、卤代苯乙烯单体和烷基取代苯乙烯单体中的一种或多种；例如，卤代苯乙烯单体可以包括氯苯乙烯或二氯苯乙烯等，具体不做限定；烷基取代苯乙烯可以包括甲基苯乙烯等，具体不做限定。
在一些实施例中，所述二甲基丙烯酸酯单体可以包括双甲基丙烯酸二乙二醇酯单体和双甲基丙烯酸三乙二醇酯单体中的一种或多种。在制备多孔树脂珠时，二甲基丙烯酸酯单体具有交联剂的作用。
在一些实施例中，所述二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比为3～7％；例如，可以为3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％或7％等。当二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比低于3％时，将会显著提高多孔树脂珠在极性小的溶剂中的溶胀性能，且多孔树脂珠的产量减少；当二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比高于7％时，将会显著降低多孔树脂珠在极性小的溶剂中的溶胀性能，并且多孔树脂珠在极性大的溶剂中的溶胀性能也将下降，降低了长链寡核苷酸的合成效率。
在一些实施例中，所述乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比为5～12％；例如，可以为5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％或12％等，具体不做限定。在制备多孔树脂珠时，乙酰氧基苯乙烯单体提供羟基来源，当乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比低于5％时，用于合成的羟基位点过于稀疏，合成寡核苷酸的产量过低；当乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比高于12％时，用于合成的羟基位点过于密集，过量的羟基并不能显著增加中间体的含量，反而过量的羟基会造成合成寡核苷酸的纯度下降。
在一些实施例中，具体可以包括如下步骤：
将稳定剂、亚甲基蓝和水混合，制得分散介质；
将所述有取代或无取代的苯乙烯单体、所述二甲基丙烯酸酯单体、所述乙酰氧基苯乙烯单体、所述溶胀平衡单体、致孔剂和引发剂混合，制得油相；
将所述油相与所述分散介质混合，通氮气，搅拌，加热，制得所述共聚物；
将所述共聚物中含有的致孔剂去除，制得多孔共聚物；
将所述多孔共聚物于碱性醇水溶液中进行水解，制得多孔树脂珠。
本发明中，将所述油相与所述分散介质混合后通入氮气，能够促进单体间的聚合。
在一些实施例中，所述稳定剂可以包括聚乙烯醇；制备多孔树脂住时，加入稳定剂能够使得聚合反应渡过危险期，消除处于分散-聚集动态平衡状态中发粘液滴的聚集倾向，不仅能使各种单体分散的更加均匀，而且能保护这些发粘的珠滴，防止因相互粘结而引起的凝聚结块。
在其中的一些实施例中，所述聚乙烯醇的醇解度可以为75～89％；例如，可以为75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％等，优选为88～89％。聚乙烯醇的醇解度对悬浮聚合得到的树脂珠的分散稳定性有直接的影响；当聚乙烯醇的醇解度低于75％时，对于各单体的分散能力和保护能力较弱，制得的聚合物粗大，颗粒分布宽；当聚乙烯醇的醇解度高于89％时，制备过程中溶液粘度大，传热困难，容易造成聚合物聚集。
在其中的一些实施例中，所述聚乙烯醇的分子量可以为1700～2000Da；优选为1788Da。聚乙烯醇的分子量对悬浮聚合得到的树脂珠的分散稳定性亦有直接的影响。
在其中的一些实施例中，所速稳定剂占所述水的质量百分比可以为0.02～1％；例如，可以为0.02％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％或1％等，优选为0.5～1％。
在一些实施例中，所述亚甲基蓝占所述水的质量百分比可以为0.01～0.03％；例如，可以为0.01％、0.02％或0.03％等，具体不做限定。制备多孔树脂珠时，聚合反应后期聚乙烯醇的保护能力变弱，加入亚甲基蓝，能够保证在聚乙烯醇的保护能力变弱时，依然可以得到分散性良好的树脂珠。
在一些实施例中，所述引发剂可以包括过氧化苯甲酰。所述引发剂用于引发各单体发生聚合反应。
在其中的一些实施例中，所述引发剂占总单体的质量百分比可以为1～6％；例如，可以为1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％或6％等，具体不做限定。
在一些实施例中，所述致孔剂可以包括异辛烷、异辛醇、十一醇、正癸醇和1-氯癸烷中的一种或多种。致孔剂用于制备过程中在共聚物中形成孔道。
在其中的一些实施例中，所述致孔剂占总单体的质量百分比可以为1.0～2.6％；例如，可以为1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％或2.6％等，具体不做限定.
在一些实施例中，所述碱性醇水溶液中可以包括氢氧化钠、乙醇和水。
在其中的一些实施例中，所述碱性醇水溶液中水和乙醇的体积比可以为1:2；所述碱性醇水溶液中氢氧化钠和水的质量比可以为(1～5):100，例如，可以为1:100、1.5:100、2:100、2.5:100、3:100、3.5:100、4:100、4.5:100或5:100等，具体不做限定。当碱性醇水溶液中氢氧化钠和水的质量低于1:100时，乙酰氧基不能够完全水解，暴露的羟基的量少；当碱性醇水溶液中氢氧化钠和水的质量高于5:100时，碱性过强，将会破坏共聚物的结构。
在其中的一些实施例中，所述氢氧化钠和所述有取代或无取代的苯乙烯单体的质量比为(2～3):20；例如，可以为2:20、2.1:20、2.2:20、2.3:20、2.4:20、2.5:20、2.6:20、2.7:20、2.8:20、2.9:20或3:20等，具体不做限定。
在一些实施例中，进行加热时，加热温度可以为70～90℃；例如，可以为70℃、72℃、74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃或90℃等，具体不做限定。
进行加热时，可以采用分段式加热，具体可以包括如下过程：在80℃加热3～5h后，在85℃加热3～5h，然后在90℃加热3～5h。
在一些实施例中，搅拌速度可以为350rpm，搅拌时间可以为8-15h；通过搅拌可以得到粒径在100～400目的共聚物。
在一些实施例中，可以采用在丙酮中加热搅拌的方式将所述共聚物中含有的致孔剂去除。
在一些实施例中，在丙酮中加热搅拌时，加热搅拌的温度可以为50～70℃，例如，可以为50℃、55℃、60℃、65℃或70℃等，具体不做限定；加热搅拌的时间可以为10～15h，例如，可以为11h、12h、13h、14h或15h等，具体不做限定；丙酮与共聚物的体积比可以为(1.5～2):1，例如可以为1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1等，具体不做限定；通过丙酮中加热搅拌，可以溶解共聚物内含有的致孔剂，以形成多孔共聚物。
一实施例提供的上述多孔树脂珠或上述多孔树脂珠的制备方法制备得到的多孔树脂珠在制备寡核苷酸中的应用。所述多孔树脂珠用于寡核苷酸固相合成载体时，载量能够达到350～400μmol/g，合成20个碱基合成效率在89％及以上，合成40个碱基合成效率在80％及以上，合成60个碱基合成效率在73％及以上，合成80个碱基合成效率在65％及以上。并且在大量合成寡核苷酸时，具有稳定的合成纯度和批次间产量差异。
下述结合具体实施例对本发明的多孔树脂珠及其制备方法和应用进行详细说明。
需要说明的是，由于在寡核苷酸合成过程中常用试剂为乙腈和甲苯，下述实施例和对比例中进行多孔树脂珠的性能测定时，采用的极性较大的溶剂为乙腈，极性较小的溶剂为甲苯。
下述各实施例中提及的BPO指的是过氧化苯甲酰。
下述各实施例和各对比例中测定多孔树脂珠的羟基含量时采用的方法为：准确称量25g乙酸酐然后用无水吡啶定量至100mL，准确称量树脂珠1g至15mL密闭反应瓶，取定量后的吡啶乙酸酐溶液0.5mL至1g树脂珠，然后加入9.5mL吡啶，在95～100℃反应2h，然后加入1mL水，继续加热10min，用0.2mol/l浓度氢氧化钠进行滴定，未加树脂数空白滴定体积为A，加入树脂珠滴定体积为B，羟基含量为2000*(A-B)μmol/g
下述各实施例和各对比例中测定多孔树脂珠的溶胀体积时采用的方法为：准确称量1g树脂置于2个10mL定量准确的量筒，记录干燥体积，分别加入乙腈和甲苯后搅拌均匀，24h后观察树脂珠溶胀后体积。
下述各实施例和各对比例中测定多孔树脂珠的中间体载量时，需要将各实施例和各对比例中的多孔树脂珠与中间体进行偶联，偶联后结构如式I所示：
Figure BDA0003693425400000121
其中，式I中黑色实心球体表示多孔树脂珠，与黑色实心球体连接的部分为中间体。
实施例1
将10g分子量为1788Da、醇解度为87-88％的聚乙烯醇溶于1L水，加入0.2g亚甲基蓝，将水相加热至70℃溶解12h，然后降温至50℃，制得分散介质；
通氮气15min，将160g苯乙烯、10g双甲基丙烯酸二乙二醇酯、20g乙酰氧基苯乙烯、5g丙烯腈、2g丙烯酸甲酯、70g异辛烷、160g异辛醇、4.5gBPO混匀，制得油相；
将油相加入到水相中，调整转速为350rpm，使树脂珠颗粒在100-400目，搅拌时间在15min；然后加热到80度保温2h，85度保温3h，90度保温3h；然后用70度热水过滤；抽干后加1.5L丙酮在65℃下搅拌过夜，用酒精洗后60℃干燥20h，筛分100-400目树脂珠。
将20g上述得到的树脂溶于200mL酒精中，将2g氢氧化钠溶于100mL水后加入上述酒精溶液中，在75℃下搅拌6h，然后用盐酸中和后，去离子水、酒精洗涤树脂3次，60℃真空干燥，得到含羟基得多孔树脂珠。
采用前述方法测得其羟基含量为580μmol/g；其干燥体积为2.8mL，在乙腈中的溶胀体积为4.9mL，在甲苯中的溶胀体积为5.0mL；其中间体载量为352μmol/g；采用SEM扫描电子显微镜观察其形貌如图1所示。
实施例2
实施例2和实施例1的区别仅在于：未添加丙烯酸甲酯，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为582μmol/g；其干燥体积为2.8mL，在乙腈中的溶胀体积为3.4mL，在甲苯中的溶胀体积为5.6mL；其中间体载量为354μmol/g。
实施例3
实施例3和实施例1的区别仅在于：未添加丙烯腈，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为581μmol/g；其干燥体积为2.7mL，在乙腈中的溶胀体积为3.6mL，在甲苯中的溶胀体积为5.8mL；其中间体载量为351μmol/g。
实施例4
实施例4和实施例1的区别在于：采用双甲基丙烯酸三乙二醇酯代替双甲基丙烯酸二乙二醇酯，采用甲基丙烯腈代替丙烯腈，采用氯苯乙烯代替苯乙烯，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为578μmol/g；其干燥体积为2.6mL，在乙腈中的溶胀体积为4.7mL，在甲苯中的溶胀体积为4.9mL；其中间体载量为349μmol/g。
实施例5
实施例5和实施例1的区别在于：采用丙烯酸丁酯代替丙烯酸甲酯，采用甲基苯乙烯代替苯乙烯，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为584μmol/g；其干燥体积为3.0mL，在乙腈中的溶胀体积为4.7mL，在甲苯中的溶胀体积为5.0mL；其中间体载量为354μmol/g。
对比例1
对比例1和实施例1的区别仅在于：未加入亚甲基蓝，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为467μmol/g；其干燥体积为3.0mL，在乙腈中的溶胀体积为4.9mL，在甲苯中的溶胀体积为5.2mL；其中间体载量为281μmol/g；采用SEM扫描电子显微镜观察其形貌如图2所示。
对比例2
对比例2和实施例1的区别仅在于：未添加丙烯腈和丙烯酸甲酯，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为579μmol/g；其干燥体积为2.7mL，在乙腈中的溶胀体积为3.2mL，在甲苯中的溶胀体积为6.2mL；其中间体载量为350μmol/g；采用SEM扫描电子显微镜观察其形貌如图3所示。
对比例3
对比例3和实施例1的区别仅在于：双甲基丙烯酸二乙二醇酯的添加量为5g，其他均相同。双甲基丙烯酸二乙二醇酯量的减少造成了比表面积下降，羟基含量进而下降了，且树脂珠的产量下降。
采用前述方法测量其羟基含量为465μmol/g；其干燥体积为2.8mL，在乙腈中的溶胀体积为3.3mL，在甲苯中的溶胀体积为8.4mL；其中间体载量为270μmol/g。
对比例4
对比例4和实施例1的区别仅在于：双甲基丙烯酸二乙二醇酯的添加量为20g，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为577μmol/g；其干燥体积为2.8mL，在乙腈中的溶胀体积为3.0mL，在甲苯中的溶胀体积为4.5mL；其中间体载量为349μmol/g。
对比例5
对比例5和实施例1的区别仅在于：乙酰氧基苯乙烯的添加量为5g，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为340μmol/g，其干燥体积为2.8mL，在乙腈中的溶胀体积为4.8mL，在甲苯中的溶胀体积为4.9mL；其中间体载量为167μmol/g。
对比例6
对比例6和实施例1的区别仅在于：乙酰氧基苯乙烯的添加量为30g，其他均相同。
采用前述方法测量其羟基含量为750μmol/g，其干燥体积为2.8mL，在乙腈中的溶胀体积为4.9mL，在甲苯中的溶胀体积为5.0mL；其中间体载量为354μmol/g。
性能测试
采用擎科24道合成仪对各实施例和各对比例中制备的多孔树脂珠进行合成效率测试，合成条件如表1所示，
表1
Figure BDA0003693425400000151
Figure BDA0003693425400000161
合成步骤如下：
步骤1:预先连接在载体上的连接有保护基团的核苷酸单体去除保护基团(二甲氧基三苯甲基基团)，获得游离的5′-羟基；
步骤2:用亚磷酰胺及活化剂来活化载体上新的碱基单体的3’端，得到核苷亚磷酸活化中间体，将所述核苷亚磷酸活化中间体与步骤1中所述游离的5′-羟基进行缩合反应，得到核苷亚磷酸酯中间体；
步骤3:进行盖帽反应，消除未反应完的游离5′-羟基；
步骤4:将步骤2所述核苷亚磷酸酯中间体的亚磷酰氧化成磷酸三酯；
步骤5:用洗涤液将步骤1至步骤4中的残存试剂清除；
步骤6:重复步骤1至步骤5；
步骤7:将所述脱氧核苷酸引物预产物从所述载体上分离，得到脱氧核苷酸引物。
分别合成20、40、60、80个基因片段，然后通过测定各基因片段在260nm处的紫外吸光度，测定寡核苷酸的OD产率，使用waters 2695测试计算所得寡核苷酸的全长比。
将各实施例和各对比例中制得的多孔树脂珠的羟基含量、溶胀体积、中间体载量测试结果汇总如表2所示；将各实施例和各对比例中制得的多孔树脂珠作为载体制备的寡核苷酸的OD产率及全长比结果汇总如表3所示。
表2
Figure BDA0003693425400000162
Figure BDA0003693425400000171
表3
Figure BDA0003693425400000172
由实施例1、实施例2、实施例3及对比例2的结果可知，丙烯腈单体或丙烯酸酯单体的引入均可以增加多孔树脂珠在乙腈中的溶胀体积，减少多孔树脂珠在甲苯中的溶胀体积，但是丙烯腈单体和丙烯酸酯单体同时加入时效果最佳；表明制备多孔树脂珠时，加入有取代或无取代的丙烯腈单体或丙烯酸酯单体，该多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距均能减小；但是当多孔树脂珠中同时含有丙烯酸酯单体和有取代或无取代的丙烯腈单体时，该多孔树脂珠在不同极性的溶剂中的溶胀性差距最小
由图1、图2和图3进行比较可知，制备多孔树脂珠时加入亚甲基蓝，可以得到单分散性良好的球形聚苯乙烯树脂珠；表明制备多孔树脂珠时，聚合反应后期聚乙烯醇的保护能力变弱，加入亚甲基蓝，能够保证在聚乙烯醇的保护能力变弱时，依然可以得到分散性良好的树脂珠。由表3对比例1数据得知，聚合的树脂珠会造成羟基含量下降，合成效果严重变差。
由实施例1和对比例3及对比例4的结果可知，当双甲基丙烯酸二乙二醇酯占总单体的质量百分比低于3％时，制得的多孔树脂珠在甲苯中的溶胀体积显著增大，当双甲基丙烯酸二乙二醇酯占总单体的质量百分比高于7％时，制得的多孔树脂珠在甲苯中的溶胀体积减小，但是在乙腈中的溶胀体积也显著减小，长链寡核苷酸的合成效率降低；表明当二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比低于3％时，将会显著提高多孔树脂珠在极性小的溶剂中的溶胀性能，但是在乙腈中的溶胀性能改变不大，且树脂珠的产量变低；当二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比高于7％时，将会显著降低多孔树脂珠在极性小的溶剂中的溶胀性能，并且多孔树脂珠在极性大的溶剂中的溶胀性能也将下降，降低了长链寡核苷酸的合成效率。
由实施例1和对比例5及对比例6的结果可知，当乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比低于5％时，制得的多孔树脂珠的羟基含量低，合成寡核苷酸的产率不变，但是载量下降，合成相同量的寡核苷酸需要合成树脂的量增大；当乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比高于12％时，制得的多孔树脂珠的羟基含量过高，但是中间体的载量未随着羟基含量的增加而提高，中间体的载量最高在400μmol/g左右，而剩余的羟基反而对合成效率造成了严重的影响，用于合成时合成纯度下降；表明在制备多孔树脂珠时，乙酰氧基苯乙烯单体提供羟基来源，当乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比低于5％时，用于合成的羟基位点过于稀疏，合成寡核苷酸的产率不变，但是产量过低；当乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比高于12％时，用于合成的羟基位点过于密集，中间体载量只能有限的与羟基位点结合，而剩余的过多的羟基在合成过程中参与反应，使合成寡核苷酸的纯度下降。
由表3可知，采用有取代或无取代的苯乙烯单体、二甲基丙烯酸酯单体、乙酰氧基苯乙烯单体、有取代或无取代的丙烯腈单体、丙烯酸酯单体制备得到的多孔树脂珠，用于寡核苷酸固相合成载体时，合成20个碱基的合成效率在89％及以上，合成40个碱基的合成效率在80％及以上，合成60个碱基的合成效率在73％及以上，合成80个碱基的合成效率在65％及以上，同时可以满足核酸大量合成时，具有稳定的合成纯度和批次间产量差异。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.一种多孔树脂珠，其特征在于，包括有取代或无取代的苯乙烯单元、二甲基丙烯酸酯单元、乙酰氧基苯乙烯单元和溶胀平衡单元；
所述溶胀平衡单元包括丙烯酸酯单元和有取代或无取代的丙烯腈单元中的一种或多种；
所述多孔树脂珠的制备原料包括有取代或无取代的苯乙烯单体、二甲基丙烯酸酯单体、乙酰氧基苯乙烯单体和溶胀平衡单体；所述二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比为3～7％；所述乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比为5～12％；
制备所述多孔树脂珠时包括将稳定剂、亚甲基蓝和水混合制备分散介质的步骤；
所述有取代或无取代的苯乙烯单元包括苯乙烯单元、卤代苯乙烯单元和烷基取代苯乙烯单元中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的多孔树脂珠，其特征在于，所述有取代或无取代的丙烯腈单元包括丙烯腈单元和甲基丙烯腈单元中的一种或多种；和/或所述丙烯酸酯单元包括丙烯酸甲酯单元和丙烯酸丁酯单元中的一种或多种；
可选地，所述二甲基丙烯酸酯单元包括双甲基丙烯酸二乙二醇酯单元和双甲基丙烯酸三乙二醇酯单元中的一种或多种。
3.根据权利要求1～2中任一项所述的多孔树脂珠，其特征在于，所述多孔树脂珠包括多个羟基，多个所述羟基分别位于所述多孔树脂珠的表面和/或所述表面的多个孔道内；
可选地，多个所述羟基的含量为550～580μmol/g；
可选地，所述多孔树脂珠的粒径为100～400目。
4.一种多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，包括将有取代或无取代的苯乙烯单体、二甲基丙烯酸酯单体、乙酰氧基苯乙烯单体和溶胀平衡单体进行聚合反应，生成共聚物；
所述溶胀平衡单体包括丙烯酸酯单体和有取代或无取代的丙烯腈单体中的一种或多种；
所述二甲基丙烯酸酯单体占总单体的质量百分比为3～7％；所述乙酰氧基苯乙烯单体占总单体的质量百分比为5～12％；
制备所述共聚物时包括将稳定剂、亚甲基蓝和水混合制备分散介质的步骤；
所述有取代或无取代的苯乙烯单体包括苯乙烯单体、卤代苯乙烯单体和烷基取代苯乙烯单体中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
将稳定剂、亚甲基蓝和水混合，制得分散介质；
将所述有取代或无取代的苯乙烯单体、所述二甲基丙烯酸酯单体、所述乙酰氧基苯乙烯单体、所述溶胀平衡单体、致孔剂和引发剂混合，制得油相；
将所述油相与所述分散介质混合，通氮气，搅拌，加热，制得所述共聚物；
将所述共聚物中含有的致孔剂去除，制得多孔共聚物；
将所述多孔共聚物于碱性醇水溶液中进行水解，制得多孔树脂珠。
6.根据权利要求4或5所述的多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，所述溶胀平衡单体占总单体的质量百分比为2～5％。
7.根据权利要求4或5所述的多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，所述溶胀平衡单体包括有取代或无取代的丙烯腈单体和丙烯酸酯单体；所述有取代或无取代的丙烯腈单体和所述丙烯酸酯单体的质量比为(1～8):1；
可选地，所述有取代或无取代的丙烯腈单体包括丙烯腈单体和甲基丙烯腈单体中的一种或多种；和/或所述丙烯酸酯单体包括丙烯酸甲酯单体和丙烯酸丁酯单体中的一种或多种；
可选地，所述二甲基丙烯酸酯单体包括双甲基丙烯酸二乙二醇酯单体和双甲基丙烯酸三乙二醇酯单体中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，所述稳定剂包括聚乙烯醇；
可选地，所述聚乙烯醇包括如下条件中的至少一项：
(1)醇解度为75～89％；
(2)分子量为1700～2000Da；
可选地，所述稳定剂占所述水的质量百分比为0.02～1％；和/或所述亚甲基蓝占所述水的质量百分比为0.01～0.03％。
9.根据权利要求5所述的多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，所述引发剂包括过氧化苯甲酰，所述引发剂占总单体的质量百分比为1～6％；和/或所述致孔剂包括异辛烷、异辛醇、十一醇、正癸醇和1-氯癸烷中的一种或多种，所述致孔剂占总单体的质量百分比为1.0～2.6％。
10.根据权利要求5所述的多孔树脂珠的制备方法，其特征在于，所述碱性醇水溶液中包括氢氧化钠、乙醇和水；
可选地，所述碱性醇水溶液中氢氧化钠和水的质量比为(1～5):100；和/或所述碱性醇水溶液中水和乙醇的体积比为1:2；
可选地，进行加热时，加热温度为70～90℃。
11.如权利要求1～3中任一项所述的多孔树脂珠或权利要求4～10中任一项所述的多孔树脂珠的制备方法制备得到的多孔树脂珠在制备寡核苷酸中的应用。
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