[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN114853912B - 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114853912B
CN114853912B CN202210571495.8A CN202210571495A CN114853912B CN 114853912 B CN114853912 B CN 114853912B CN 202210571495 A CN202210571495 A CN 202210571495A CN 114853912 B CN114853912 B CN 114853912B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gly
bovine viral
viral diarrhea
diarrhea virus
ala
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210571495.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114853912A (zh
Inventor
郑海学
茹毅
李亚军
郝荣增
杨洋
卢炳州
秦晓东
刘华南
张贵财
李丹
张越
陈娇
吴秀萍
赵东梅
任蕊芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202210571495.8A priority Critical patent/CN114853912B/zh
Publication of CN114853912A publication Critical patent/CN114853912A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114853912B publication Critical patent/CN114853912B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种牛病毒性腹泻病毒E2‑E0融合蛋白、制备方法及应用。本发明首先提供了一种将牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白融合，不仅能够促进E0蛋白的表达，而且不影响E0蛋白的免疫原性，可用于牛病毒性腹泻亚单位疫苗的制备；在上述牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的基础上，本发明发现，将牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的160‑162位氨基酸由IAA突变为GGG，能够使E2‑E0融合蛋白的表达量进一步提升18％以上，且不影响其免疫原性。

Description

一种牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白、制备方法及应用。
背景技术
牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的以腹泻、繁殖障碍、免疫机能障碍等为主要特征的一种急性、热性、高度接触性传染病。牛感染BVDV会导致生产性能下降、生长迟缓、产奶量的减少以及对其他疾病的易感性增加，从而导致早期宰杀动物。该病发病率高，防治的难点在于BVDV进入机体后可造成免疫抑制和持续性感染，降低机体免疫力，易诱发其他致病原的混合感染或继发感染，严重影响牛群的健康状态和生产性能，是全球最重要的牛传染病之一。
BVDV属于黄病毒科(Flaviviridea)瘟病毒属(Pestivirus)，基因组由一个长度约12.3kb的单链正义RNA分子组成。BVDV有3种生物型，通常基于5′-UTR序列、基因组氨基端自身蛋白酶(Npro)或包膜糖蛋白(E2)区域分为BVDV-1型和BVDV-2型，BVDV-3型被描述为非典型的BVDV。BVDV-1型进一步分为21个亚型(1a～1u)，BVDV-2型分为3个亚型(2a～2c)。目前国内主要流行8个亚型：1a、1b、1c、1d、1m、1o、1p和1q。BVDV基因组编码4个结构蛋白，分别是P14(C)、gP48(E0)、gP25(E1)、gP53(E2)，其他的均为非结构蛋白。其中E0、E1、E2组成了病毒的囊膜结构，位于病毒的表面。
目前，控制BVDV的传播主要有两种方法：消灭持续感染动物和疫苗接种。改良活疫苗或灭活疫苗主要用于BVDV疫苗接种计划，但这些疫苗分别存在生物安全风险或免疫保护效力不足等问题。灭活疫苗对怀孕牛安全，但其免疫期较短；弱毒疫苗虽免疫期长，但对怀孕牛存在安全风险。基于此，研究者长期致力于BVD亚单位疫苗的研发。E0蛋白能够诱导机体产生病毒中和性抗体，是BVDV的重要保护性抗原，也是BVD亚单位疫苗研制的候选抗原。E0蛋白的氨基酸序列中存在多个糖基化位点，对于保持其抗原性具有重要作用。通过原核大肠杆菌对E0进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对E0进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了BVD亚单位疫苗的研发。
发明内容
为了解决BVDV E0蛋白在CHO细胞中表达量低或不表达的技术问题，本发明经过大量研究发现，将BVDV E0蛋白进行截短并将其与BVDV E2蛋白融合后能够在CHO细胞中促进BVDV E0的表达，既不影响E2蛋白的表达，且不影响E0蛋白和E2蛋白的免疫原性，可用于BVD亚单位疫苗的制备，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白，所述融合蛋白包括牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；所述牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，编码所述牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，编码所述牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述牛病毒性腹泻病毒E0蛋白片段的第160-162位氨基酸由IAA突变为GGG；所述突变后的牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选地，编码所述突变后的牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白突变的基因序列如SEQID NO.8所示。
优选地，所述牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
优选地，编码所述牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.10所示。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白在制备牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。
优选地，所述疫苗为亚单位疫苗。
第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的制备方法，所述方法包括：将编码牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的基因串联后，克隆到真核表达载体中得到表达牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组质粒；再将所述的重组质粒转染至CHO细胞中，培养、筛选、纯化得到牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白。
优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1载体。
优选地，所述CHO细胞为CHO悬浮细胞。
优选地，所述方法为：
(1)PCR扩增编码牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因片段，所述基因片段如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示；
(2)用限制性内切酶Xho I、Hind III分别对载体pcDNA3.1和牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因片段进行双酶切，并将酶切片段用DNA连接酶连接，获得表达牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的重组质粒pcDNA3.1-BVDV-E2-E0；
(3)将重组质粒pcDNA3.1-BVDV-E2-E0转染CHO悬浮细胞，悬浮培养，收集细胞培养上清，纯化即得牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白。
本发明的有益效果是：①通过原核大肠杆菌对E0进行制备时，产物以不可溶的包涵体形式存在，且缺乏糖基化修饰，严重影响了抗原蛋白的免疫原性；通过具有完备糖基化修饰功能的真核CHO细胞对E0进行制备时，目标蛋白不表达或表达量极低，以上情况严重阻碍了BVD亚单位疫苗的研发；而本发明意外发现，将牛病毒性腹泻病毒E0蛋白截短获得E0蛋白，将其与牛病毒性腹泻病毒E2蛋白融合，不仅能够促进E0蛋白的表达，而且不影响原有E0蛋白和E2蛋白的免疫原性，可用于BVD亚单位疫苗的制备；②在上述牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的基础上，本发明发现，将牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的第160-162位氨基酸由IAA突变为GGG，进一步促进了牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的表达，蛋白表达量提升18％以上，且不影响其免疫原性。
附图说明
图1牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达鉴定结果；
图2牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的纯化结果；
图3牛病毒性腹泻病毒E0蛋白、E0截短蛋白和氨基酸突变的E0截短蛋白表达结果；
图4牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的纯化结果；
图5牛病毒性腹泻病毒氨基酸突变的E0截短蛋白的纯化结果；
图6牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短融合蛋白的表达鉴定结果；
图7牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短融合蛋白的纯化结果；
图8牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短突变融合蛋白的表达鉴定结果；其中，1为E0截短突变表达鉴定；2为E2-E0截短突变后表达鉴定；
图9牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短突变融合蛋白的纯化结果；
图10间接ELISA免疫兔血清抗体检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和牛病毒性腹泻病相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
BVDV-NADL疫苗标准株(购自中国兽医药品监察所-中国兽医微生物菌种保藏管理中心)、真核表达载体pcDNA3.1(+)、BVDV阳性血清由本实验室保存。CHO悬浮细胞表达系统、Unstained protein MW marker(26610)、RT-PCR扩增试剂盒、6×His Tag MonoclonalAntibody(HIS.H8)、Unstained protein MW marker(26616)及BCA蛋白定量试剂盒、Alexa
Figure BDA0003660440300000042
Figure BDA0003660440300000041
488标记的羊抗兔二抗均购自Thermo Fisher Scientific公司。亲和层析Ni柱购自GE公司。RNA提取试剂盒和DNA凝胶纯化回收试剂盒均购自OMEGA有限公司。Xho I和HindIII限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)公司。大肠杆菌DH5α感受态细胞购自全式金公司。大量质粒提取试剂盒购自MACHEREY-NAGEL公司。ECL显色液购自上海碧云天生物技术有限公司。截流分子量为8000-10000道尔顿的MD44透析袋购自北京索莱宝科技有限公司。
术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的亚单位疫苗。
本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与猪或牛的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。
本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
实施例1牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短融合蛋白及E2-E0截短突变融合蛋白的制备
1.基因片段合成
由北京六合华大基因科技有限公司合成编码牛病毒性腹泻病毒E0蛋白、E0截短蛋白、E0截短突变蛋白、E2蛋白、E2-E0截短融合蛋白及E2-E0截短突变融合蛋白的基因片段，并经核酸凝胶电泳鉴定正确。其中，编码牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的基因片段如SEQ IDNO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；编码牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的基因片段如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码牛病毒性腹泻病毒E0截短突变的基因片段如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，E0截短突变蛋白是指将E0截短蛋白的第160-162位氨基酸由IAA突变为GGG；编码牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的基因片段如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短融合蛋白的基因片段如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码牛病毒性腹泻病毒E2-E0截短突变融合蛋白的基因片段如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQID NO.9所示。
2.表达质粒的构建与鉴定
重组质粒命名为pcDNA3.1-BVDV-E0(E0蛋白全长)、pcDNA3.1-BVDV-tE0(E0截短蛋白)、pcDNA3.1-BVDV-mE0(E0截短蛋白突变)、pcDNA3.1-BVDV-E2(E2蛋白)、pcDNA3.1-BVDV-E2-tE0(E2-E0截短融合蛋白)、pcDNA3.1-BVDV-E2-mE0(E2-E0截短突变融合蛋白)，由北京六合华大基因科技有限公司合成，具体为：pcDNA3.1载体用限制性内切酶Xho I、Hind III双酶切，切胶回收纯化载体片段；同时将回收纯化的E0蛋白基因片段、E0截短蛋白基因片段、E0截短蛋白突变基因片段、E2蛋白片段、E2-E0截短融合蛋白基因片段、E2-E0截短突变融合蛋白基因片段分别用限制性内切酶Xho I、Hind III双酶切并回收纯化DNA片段后与纯化的pcDNA3.1(+)载体片段通过T4 DNA连接酶连接，程序为16℃，12h，连接产物分别转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落增菌培养，利用质粒提取试剂盒提取重组质粒，重组质粒命名为pcDNA3.1-BVDV-E0、pcDNA3.1-BVDV-tE0、pcDNA3.1-BVDV-mE0、pcDNA3.1-BVDV-E2、pcDNA3.1-BVDV-E2-tE0、pcDNA3.1-BVDV-E2-mE0；重组质粒用Xho I、Hind III进行双酶切鉴定，双酶切鉴定正确的重组质粒进行测序鉴定，确定目的基因序列的正确插入，确保阅读框完全正确。
构建的重组表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E0、pcDNA3.1-BVDV-tE0、pcDNA3.1-BVDV-mE0、pcDNA3.1-BVDV-E2、pcDNA3.1-BVDV-E2-tE0、pcDNA3.1-BVDV-E2-mE0片段突变融合经Xho I和Hind III双酶切后，酶切产物大小与理论值相符，表明扩增的E0片段、E0截短片段、E0截短突变片段、E2片段、E2-E0截短片段、E2-E0截短突变片段正确与载体连接，而基因测序结果也显示目的片段成功插入表达载体中。
3.蛋白的表达与纯化
参照ExpiCHO表达系统试剂盒说明书，将重组质粒pcDNA3.1-BVDV-E0、pcDNA3.1-BVDV-tE0、pcDNA3.1-BVDV-mE0、pcDNA3.1-BVDV-E2、pcDNA3.1-BVDV-E2-tE0、pcDNA3.1-BVDV-E2-mE0分别转染CHO悬浮细胞，转染的细胞于32℃、5％CO2、湿度90％条件下继续悬浮培养12天后，4000g离心10min收集细胞培养上清进行SDS-PAGE鉴定。离心收集的细胞培养上清，经0.22μm滤膜过滤后，依照GE公司亲和层析Ni柱说明书进行纯化。SDS-PAGE鉴定纯化后的目标蛋白，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
离心收取转染pcDNA3.1-BVDV-E0质粒、pcDNA3.1-BVDV-tE0质粒、pcDNA3.1-BVDV-mE0质粒、pcDNA3.1-BVDV-E2质粒、pcDNA3.1-BVDV-E2-tE0质粒、pcDNA3.1-BVDV-E2-mE0质粒的细胞培养上清液，进行SDS-PAGE鉴定。依照GE公司亲和层析Ni柱说明书进行纯化，表达蛋白上清经过滤后上样，洗脱样品经SDS-PAGE鉴定，并使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的可溶性表达鉴定结果如图1所示，转染pcDNA3.1-BVDV-E2质粒的细胞培养上清在45-66.2kD之间观察到特异性蛋白条带，表明E2蛋白表达；纯化样品SDS-PAGE鉴定结果如图2所示：在45-66.2kD处观察到特异性蛋白条带，与细胞上清鉴定结果相符，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后E2蛋白的浓度为1.15mg/mL。
牛病毒性腹泻病毒E0蛋白、tE0蛋白和mE0蛋白的可溶性表达鉴定结果如图3所示，转染pcDNA3.1-BVDV-E0质粒的细胞培养上清在30kD左右未观察到特异性蛋白条带，表明E0蛋白基本无表达；而转染pcDNA3.1-BVDV-tE0质粒和pcDNA3.1-BVDV-mE0质粒的细胞培养上清在30kD左右观察到特异性蛋白条带，表明tE0蛋白以及mE0蛋白能够表达；牛病毒性腹泻病毒tE0蛋白纯化样品SDS-PAGE鉴定结果如图4所示：在25-35kD处观察到特异性蛋白条带，与细胞上清鉴定结果相符，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后tE0蛋白片段的浓度为0.35mg/mL；牛病毒性腹泻病毒mE0蛋白纯化样品SDS-PAGE鉴定结果如图5所示：在25-35kD处观察到特异性蛋白条带，与细胞上清鉴定结果相符，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后mE0突变蛋白的浓度为0.47mg/mL。
牛病毒性腹泻病毒E2-tE0融合蛋白的可溶性表达鉴定结果如图6所示，转染pcDNA3.1-BVDV-E2-tE0融合蛋白质粒的细胞培养上清在66.2-116kD左右观察到特异性蛋白条带，表明E2-tE0融合蛋白表达；牛病毒性腹泻病毒E2-tE0融合蛋白纯化样品SDS-PAGE鉴定结果如图7所示：在66.2-116kD处观察到特异性蛋白条带，与细胞上清鉴定结果相符，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后E2-tE0融合蛋白的浓度为1.04mg/mL。
牛病毒性腹泻病毒E2-mE0融合蛋白的可溶性表达鉴定结果如图8所示，转染pcDNA3.1-BVDV-E2-mE0融合质粒的细胞培养上清在66.2-116kD左右观察到特异性蛋白条带，表明E2-mE0融合蛋白表达；牛病毒性腹泻病毒E2-mE0融合蛋白纯化样品SDS-PAGE鉴定结果如图9所示：在66.2-116kD处观察到特异性蛋白条带，与细胞上清鉴定结果相符，BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后E2-mE0片段突变融合蛋白的浓度为1.23mg/mL。
实施例2免疫原性检测
采用间接ELISA对mE0蛋白、E2蛋白、E2-tE0融合蛋白、E2-mE0融合蛋白免疫兔血清进行检测，分析其免疫原性。用50mM碳酸盐缓冲液将纯化的BVDV-mE0蛋白、BVDV-E2蛋白、BVDV-E2-tE0融合蛋白、BVDV-E2-mE0融合蛋白(50ng/孔)分别包被于ELISA酶标板中，4℃孵育过夜。用1％牛血清白蛋白(BSA)37℃，封闭2h。将待检血清用血清稀释液按1:2000稀释并加入反应孔中，100μL/孔，每个样品设3个复孔，37℃孵育1h。HRP标记的山羊抗兔IgG抗体用血清稀释液按1:5000稀释后加入反应孔中，100μL/孔，37℃孵育1h。TMB显色，每孔50μL，显色10min后，加入50μL终止液终止反应，读取OD450nm值。
间接ELISA结果如图10所示，用mE0蛋白、E2蛋白、E2-tE0融合蛋白、E2-mE0融合蛋白免疫兔血清后7天，即可检测血清抗体，二免7天后抗体水平显著升高，在免疫后第28天抗体保持较高水平。相较于灭活BVDV抗原组，BVDV-mE0蛋白、BVDV-E2蛋白、BVDV-E2-tE0融合蛋白、BVDV-E2-mE0融合蛋白免疫后抗体水平显著升高；而相较于BVDV-mE0蛋白、BVDV-E2蛋白，采用本发明所述的BVDV-E2-tE0融合蛋白、BVDV-E2-mE0融合蛋白免疫后抗体水平进一步升高；结果证明了CHO细胞表达的本发明所述的E2-mE0片段融合蛋白以及突变融合蛋白具有良好的免疫原性。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白、制备方法及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Gly Ala Ile Thr Gly Thr Ala Leu Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Ala Met Pro Gly Ala Gly Val Ala Ala Ser Leu His Gly
20 25 30
Ile Thr Pro Gly Leu Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr
35 40 45
Ala Met Gly Leu Leu Ala Ile His Gly Met Met Ala Ala Ser Gly Leu
50 55 60
Thr Ala Thr Thr Cys Cys Ala Leu Gly Ala His Gly Thr Ala Leu His
65 70 75 80
Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ile Gly Pro Thr Val Leu Ile Met Ala
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Ala Leu Thr Gly Gly Gly Pro Pro Ala Gly Cys Ala
100 105 110
Val Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Val Val Thr Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Pro Thr Leu Leu Thr Gly Cys Leu Leu Gly Leu Ala
130 135 140
Pro Ser Pro Ala Gly Ile Leu Met Gly Gly Pro Cys Ala Pro Gly Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ser Ala Val Leu
165
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgaaaaca taacacagtg gaacttgcaa gataatggga cagaagggat acaacgggcg 60
atgttccaaa ggggcgtgaa taggagccta catggaatct ggccagagaa aatctgtaca 120
ggtgtaccat cccatctagc cactgatatg gaattaaaag caattcacgg catgatggat 180
gcaagtgaaa agaccaacta cacatgttgc agacttcagc gccacgagtg gaacaaacat 240
ggttggtgca actggtacaa cattgaacct tgggtattga tcatgaatag gacccaagct 300
aatcttacag agggtcaacc accaagagag tgcgccgtca cgtgcaggta tgatagagat 360
aatgacataa atgttgtaac gcaagctaga gacagaccca cgctactgac aggctgtaag 420
aaagggaaga atttctcctt tgcaggaata ttgatgcagg gtccttgcaa ctttgagata 480
gcggcaagtg atgtgctg 498
<210> 3
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Leu Ala Cys Leu Pro Gly Pro Ser Thr Ala Ile Ala Leu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Ile Gly Gly Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Thr Leu Gly
20 25 30
Thr Ser Pro Gly Met Leu Leu Gly Ala Thr Met Val Ile Ala Thr Cys
35 40 45
Gly Ala Gly Leu Leu Met Thr Leu Gly Ala Cys Thr Ala Gly Thr Ala
50 55 60
Thr Leu Ala Ile Leu His Thr Ala Ala Leu Pro Thr Ser Val Val Pro
65 70 75 80
Leu Leu Leu Pro Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Val Val Gly Met Ala
85 90 95
Ala Ala Pro Gly Pro Gly Leu Cys Pro Cys Ala Ala Leu Pro Ile Val
100 105 110
Ala Gly Leu Pro Ala Thr Thr Leu Leu Ala Gly Pro Ala Pro Gly Met
115 120 125
Val Cys Pro Ile Gly Thr Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr Ser Pro Ala
130 135 140
Met Ala Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Ala Thr Thr Ala Ala Ser Leu
145 150 155 160
Pro Pro Pro His Ala Gly Gly Cys Ile Thr Gly Leu Ala Leu Gly Gly
165 170 175
Ala Leu His Ala Cys Ile Leu Gly Gly Ala Thr Thr Cys Val Pro Gly
180 185 190
Ala Gly Leu Leu Thr Leu Gly Gly Ser Ile Gly Ser Cys Leu Thr Cys
195 200 205
Gly Thr Gly Pro Leu Gly Ser Gly Gly Leu Pro His Thr Pro Ile Gly
210 215 220
Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Thr Gly Thr Ala Leu Val Ala Ser Thr
225 230 235 240
Ser Cys Ala Ala Gly Gly Val Ala Ile Val Pro Gly Gly Thr Leu Leu
245 250 255
Cys Leu Ile Gly Leu Thr Thr Val Gly Val Ile Ala Met Ala Thr Leu
260 265 270
Leu Gly Pro Met Pro Cys Ala Pro Thr Gly Ile Ile Ser Ser Gly Gly
275 280 285
Pro Val Gly Leu Thr Ala Cys Thr Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Leu
290 295 300
Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala Ser Thr Pro Gly Gly Thr Met Leu
305 310 315 320
Leu Gly Gly Thr Gly Thr Thr Pro Ala Leu Gly Val Thr Ala His His
325 330 335
Ala Ala
<210> 4
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacttggatt gcaaacctga attctcgtat gccatagcaa aggacgaaag aattggtcaa 60
ctgggggctg aaggccttac caccacttgg aaggaatact cacctggaat gaagctggaa 120
gacacaatgg tcattgcttg gtgcgaagat gggaagttaa tgtacctcca aagatgcacg 180
agagaaacca gatatctcgc aatcttgcat acaagagcct tgccgaccag tgtggtattc 240
aaaaaactct ttgatgggcg aaagcaagag gatgtagtcg aaatgaacga caactttgaa 300
tttggactct gcccatgtga tgccaaaccc atagtaagag ggaagttcaa tacaacgctg 360
ctgaacggac cggccttcca gatggtatgc cccataggat ggacagggac tgtaagctgt 420
acgtcattca atatggacac cttagccaca actgtggtac ggacatatag aaggtctaaa 480
ccattccctc ataggcaagg ctgtatcacc caaaagaatc tgggggagga tctccataac 540
tgcatccttg gaggaaattg gacttgtgtg cctggagacc aactactata caaagggggc 600
tctattgaat cttgcaagtg gtgtggctat caatttaaag agagtgaggg actaccacac 660
taccccattg gcaagtgtaa attggagaac gagactggtt acaggctagt agacagtacc 720
tcttgcaata gagaaggtgt ggccatagta ccacaaggga cattaaagtg caagatagga 780
aaaacaactg tacaggtcat agctatggat accaaactcg gacctatgcc ttgcagacca 840
tatgaaatca tatcaagtga ggggcctgta gaaaagacag cgtgtacttt caactacact 900
aagacattaa aaaataagta ttttgagccc agagacagct actttcagca atacatgcta 960
aaaggagagt atcaatactg gtttgacctg gaggtgactg accatcaccg ggat 1014
<210> 5
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
His Leu Asp Cys Lys Pro Glu Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ile Gly Gln Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu
20 25 30
Tyr Ser Pro Gly Met Lys Leu Glu Asp Thr Met Val Ile Ala Trp Cys
35 40 45
Glu Asp Gly Lys Leu Met Tyr Leu Gln Arg Cys Thr Arg Glu Thr Arg
50 55 60
Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Val Phe
65 70 75 80
Lys Lys Leu Phe Asp Gly Arg Lys Gln Glu Asp Val Val Glu Met Asn
85 90 95
Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro Ile Val
100 105 110
Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met
115 120 125
Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr Ser Phe Asn
130 135 140
Met Asp Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg Ser Lys
145 150 155 160
Pro Phe Pro His Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Asn Leu Gly Glu
165 170 175
Asp Leu His Asn Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Pro Gly
180 185 190
Asp Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Ile Glu Ser Cys Lys Trp Cys
195 200 205
Gly Tyr Gln Phe Lys Glu Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly
210 215 220
Lys Cys Lys Leu Glu Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Val Asp Ser Thr
225 230 235 240
Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Gln Gly Thr Leu Lys
245 250 255
Cys Lys Ile Gly Lys Thr Thr Val Gln Val Ile Ala Met Asp Thr Lys
260 265 270
Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Tyr Glu Ile Ile Ser Ser Glu Gly
275 280 285
Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys
290 295 300
Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu
305 310 315 320
Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp His His
325 330 335
Arg Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu
355 360 365
Gly Ile Gln Arg Ala Met Phe Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His
370 375 380
Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala
385 390 395 400
Thr Asp Met Glu Leu Lys Ala Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu
405 410 415
Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys
420 425 430
His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Val Leu Ile Met
435 440 445
Asn Arg Thr Gln Ala Asn Leu Thr Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys
450 455 460
Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Ile Asn Val Val Thr
465 470 475 480
Gln Ala Arg Asp Arg Pro Thr Leu Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys
485 490 495
Asn Phe Ser Phe Ala Gly Ile Leu Met Gln Gly Pro Cys Asn Phe Glu
500 505 510
Ile Ala Ala Ser Asp Val Leu
515
<210> 6
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacttggatt gcaaacctga attctcgtat gccatagcaa aggacgaaag aattggtcaa 60
ctgggggctg aaggccttac caccacttgg aaggaatact cacctggaat gaagctggaa 120
gacacaatgg tcattgcttg gtgcgaagat gggaagttaa tgtacctcca aagatgcacg 180
agagaaacca gatatctcgc aatcttgcat acaagagcct tgccgaccag tgtggtattc 240
aaaaaactct ttgatgggcg aaagcaagag gatgtagtcg aaatgaacga caactttgaa 300
tttggactct gcccatgtga tgccaaaccc atagtaagag ggaagttcaa tacaacgctg 360
ctgaacggac cggccttcca gatggtatgc cccataggat ggacagggac tgtaagctgt 420
acgtcattca atatggacac cttagccaca actgtggtac ggacatatag aaggtctaaa 480
ccattccctc ataggcaagg ctgtatcacc caaaagaatc tgggggagga tctccataac 540
tgcatccttg gaggaaattg gacttgtgtg cctggagacc aactactata caaagggggc 600
tctattgaat cttgcaagtg gtgtggctat caatttaaag agagtgaggg actaccacac 660
taccccattg gcaagtgtaa attggagaac gagactggtt acaggctagt agacagtacc 720
tcttgcaata gagaaggtgt ggccatagta ccacaaggga cattaaagtg caagatagga 780
aaaacaactg tacaggtcat agctatggat accaaactcg gacctatgcc ttgcagacca 840
tatgaaatca tatcaagtga ggggcctgta gaaaagacag cgtgtacttt caactacact 900
aagacattaa aaaataagta ttttgagccc agagacagct actttcagca atacatgcta 960
aaaggagagt atcaatactg gtttgacctg gaggtgactg accatcaccg ggatggcggc 1020
ggcggttccg gaggtggcgg cagtggcggc ggtggttctg gtgaaaacat aacacagtgg 1080
aacttgcaag ataatgggac agaagggata caacgggcga tgttccaaag gggcgtgaat 1140
aggagcctac atggaatctg gccagagaaa atctgtacag gtgtaccatc ccatctagcc 1200
actgatatgg aattaaaagc aattcacggc atgatggatg caagtgaaaa gaccaactac 1260
acatgttgca gacttcagcg ccacgagtgg aacaaacatg gttggtgcaa ctggtacaac 1320
attgaacctt gggtattgat catgaatagg acccaagcta atcttacaga gggtcaacca 1380
ccaagagagt gcgccgtcac gtgcaggtat gatagagata atgacataaa tgttgtaacg 1440
caagctagag acagacccac gctactgaca ggctgtaaga aagggaagaa tttctccttt 1500
gcaggaatat tgatgcaggg tccttgcaac tttgagatag cggcaagtga tgtgctg 1557
<210> 7
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Gly Ala Ile Thr Gly Thr Ala Leu Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Ala Met Pro Gly Ala Gly Val Ala Ala Ser Leu His Gly
20 25 30
Ile Thr Pro Gly Leu Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr
35 40 45
Ala Met Gly Leu Leu Ala Ile His Gly Met Met Ala Ala Ser Gly Leu
50 55 60
Thr Ala Thr Thr Cys Cys Ala Leu Gly Ala His Gly Thr Ala Leu His
65 70 75 80
Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ile Gly Pro Thr Val Leu Ile Met Ala
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Ala Leu Thr Gly Gly Gly Pro Pro Ala Gly Cys Ala
100 105 110
Val Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Val Val Thr Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Pro Thr Leu Leu Thr Gly Cys Leu Leu Gly Leu Ala
130 135 140
Pro Ser Pro Ala Gly Ile Leu Met Gly Gly Pro Cys Ala Pro Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Ala Val Leu
165
<210> 8
<211> 498
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgaaaaca taacacagtg gaacttgcaa gataatggga cagaagggat acaacgggcg 60
atgttccaaa ggggcgtgaa taggagccta catggaatct ggccagagaa aatctgtaca 120
ggtgtaccat cccatctagc cactgatatg gaattaaaag caattcacgg catgatggat 180
gcaagtgaaa agaccaacta cacatgttgc agacttcagc gccacgagtg gaacaaacat 240
ggttggtgca actggtacaa cattgaacct tgggtattga tcatgaatag gacccaagct 300
aatcttacag agggtcaacc accaagagag tgcgccgtca cgtgcaggta tgatagagat 360
aatgacataa atgttgtaac gcaagctaga gacagaccca cgctactgac aggctgtaag 420
aaagggaaga atttctcctt tgcaggaata ttgatgcagg gtccttgcaa ctttgagggc 480
ggcggcagtg atgtgctg 498
<210> 9
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
His Leu Asp Cys Lys Pro Glu Phe Ser Tyr Ala Ile Ala Lys Asp Glu
1 5 10 15
Arg Ile Gly Gln Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu
20 25 30
Tyr Ser Pro Gly Met Lys Leu Glu Asp Thr Met Val Ile Ala Trp Cys
35 40 45
Glu Asp Gly Lys Leu Met Tyr Leu Gln Arg Cys Thr Arg Glu Thr Arg
50 55 60
Tyr Leu Ala Ile Leu His Thr Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Val Phe
65 70 75 80
Lys Lys Leu Phe Asp Gly Arg Lys Gln Glu Asp Val Val Glu Met Asn
85 90 95
Asp Asn Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ala Lys Pro Ile Val
100 105 110
Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln Met
115 120 125
Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Thr Val Ser Cys Thr Ser Phe Asn
130 135 140
Met Asp Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Arg Thr Tyr Arg Arg Ser Lys
145 150 155 160
Pro Phe Pro His Arg Gln Gly Cys Ile Thr Gln Lys Asn Leu Gly Glu
165 170 175
Asp Leu His Asn Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Pro Gly
180 185 190
Asp Gln Leu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser Ile Glu Ser Cys Lys Trp Cys
195 200 205
Gly Tyr Gln Phe Lys Glu Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly
210 215 220
Lys Cys Lys Leu Glu Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Val Asp Ser Thr
225 230 235 240
Ser Cys Asn Arg Glu Gly Val Ala Ile Val Pro Gln Gly Thr Leu Lys
245 250 255
Cys Lys Ile Gly Lys Thr Thr Val Gln Val Ile Ala Met Asp Thr Lys
260 265 270
Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Tyr Glu Ile Ile Ser Ser Glu Gly
275 280 285
Pro Val Glu Lys Thr Ala Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Lys
290 295 300
Asn Lys Tyr Phe Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu
305 310 315 320
Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Glu Val Thr Asp His His
325 330 335
Arg Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
340 345 350
Ser Gly Glu Asn Ile Thr Gln Trp Asn Leu Gln Asp Asn Gly Thr Glu
355 360 365
Gly Ile Gln Arg Ala Met Phe Gln Arg Gly Val Asn Arg Ser Leu His
370 375 380
Gly Ile Trp Pro Glu Lys Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala
385 390 395 400
Thr Asp Met Glu Leu Lys Ala Ile His Gly Met Met Asp Ala Ser Glu
405 410 415
Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys
420 425 430
His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn Ile Glu Pro Trp Val Leu Ile Met
435 440 445
Asn Arg Thr Gln Ala Asn Leu Thr Glu Gly Gln Pro Pro Arg Glu Cys
450 455 460
Ala Val Thr Cys Arg Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Ile Asn Val Val Thr
465 470 475 480
Gln Ala Arg Asp Arg Pro Thr Leu Leu Thr Gly Cys Lys Lys Gly Lys
485 490 495
Asn Phe Ser Phe Ala Gly Ile Leu Met Gln Gly Pro Cys Asn Phe Glu
500 505 510
Gly Gly Gly Ser Asp Val Leu
515
<210> 11
<211> 1557
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cacttggatt gcaaacctga attctcgtat gccatagcaa aggacgaaag aattggtcaa 60
ctgggggctg aaggccttac caccacttgg aaggaatact cacctggaat gaagctggaa 120
gacacaatgg tcattgcttg gtgcgaagat gggaagttaa tgtacctcca aagatgcacg 180
agagaaacca gatatctcgc aatcttgcat acaagagcct tgccgaccag tgtggtattc 240
aaaaaactct ttgatgggcg aaagcaagag gatgtagtcg aaatgaacga caactttgaa 300
tttggactct gcccatgtga tgccaaaccc atagtaagag ggaagttcaa tacaacgctg 360
ctgaacggac cggccttcca gatggtatgc cccataggat ggacagggac tgtaagctgt 420
acgtcattca atatggacac cttagccaca actgtggtac ggacatatag aaggtctaaa 480
ccattccctc ataggcaagg ctgtatcacc caaaagaatc tgggggagga tctccataac 540
tgcatccttg gaggaaattg gacttgtgtg cctggagacc aactactata caaagggggc 600
tctattgaat cttgcaagtg gtgtggctat caatttaaag agagtgaggg actaccacac 660
taccccattg gcaagtgtaa attggagaac gagactggtt acaggctagt agacagtacc 720
tcttgcaata gagaaggtgt ggccatagta ccacaaggga cattaaagtg caagatagga 780
aaaacaactg tacaggtcat agctatggat accaaactcg gacctatgcc ttgcagacca 840
tatgaaatca tatcaagtga ggggcctgta gaaaagacag cgtgtacttt caactacact 900
aagacattaa aaaataagta ttttgagccc agagacagct actttcagca atacatgcta 960
aaaggagagt atcaatactg gtttgacctg gaggtgactg accatcaccg ggatggcggc 1020
ggcggttccg gaggtggcgg cagtggcggc ggtggttctg gtgaaaacat aacacagtgg 1080
aacttgcaag ataatgggac agaagggata caacgggcga tgttccaaag gggcgtgaat 1140
aggagcctac atggaatctg gccagagaaa atctgtacag gtgtaccatc ccatctagcc 1200
actgatatgg aattaaaagc aattcacggc atgatggatg caagtgaaaa gaccaactac 1260
acatgttgca gacttcagcg ccacgagtgg aacaaacatg gttggtgcaa ctggtacaac 1320
attgaacctt gggtattgat catgaatagg acccaagcta atcttacaga gggtcaacca 1380
ccaagagagt gcgccgtcac gtgcaggtat gatagagata atgacataaa tgttgtaacg 1440
caagctagag acagacccac gctactgaca ggctgtaaga aagggaagaa tttctccttt 1500
gcaggaatat tgatgcaggg tccttgcaac tttgagggcg gcggcagtga tgtgctg 1557
<210> 11
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Gly Ala Ile Thr Gly Thr Ala Leu Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ile Gly Ala Ala Met Pro Gly Ala Gly Val Ala Ala Ser Leu His Gly
20 25 30
Ile Thr Pro Gly Leu Ile Cys Thr Gly Val Pro Ser His Leu Ala Thr
35 40 45
Ala Met Gly Leu Leu Ala Ile His Gly Met Met Ala Ala Ser Gly Leu
50 55 60
Thr Ala Thr Thr Cys Cys Ala Leu Gly Ala His Gly Thr Ala Leu His
65 70 75 80
Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala Ile Gly Pro Thr Val Leu Ile Met Ala
85 90 95
Ala Thr Gly Ala Ala Leu Thr Gly Gly Gly Pro Pro Ala Gly Cys Ala
100 105 110
Val Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Val Val Thr Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Pro Thr Leu Leu Thr Gly Cys Leu Leu Gly Leu Ala
130 135 140
Pro Ser Pro Ala Gly Ile Leu Met Gly Gly Pro Cys Ala Pro Gly Ile
145 150 155 160
Ala Ala Ser Ala Val Leu Pro Leu Gly His Ala Cys Thr Ala Val Pro
165 170 175
Gly Ala Thr Ala His Thr Leu Val Ala Gly Met Thr Ala Thr Val Gly
180 185 190
Ser Ala Ala Gly Gly Thr Ala Leu Leu Thr Thr Thr Leu Gly Ala Gly
195 200 205
Leu Gly Ile Leu Gly Leu Leu Leu Gly Ala Leu Ser Leu Thr Thr Pro
210 215 220
Gly Ala Thr Ala
225
<210> 12
<211> 684
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtgaaaaca taacacagtg gaacttgcaa gataatggga cagaagggat acaacgggcg 60
atgttccaaa ggggcgtgaa taggagccta catggaatct ggccagagaa aatctgtaca 120
ggtgtaccat cccatctagc cactgatatg gaattaaaag caattcacgg catgatggat 180
gcaagtgaaa agaccaacta cacatgttgc agacttcagc gccacgagtg gaacaaacat 240
ggttggtgca actggtacaa cattgaacct tgggtattga tcatgaatag gacccaagct 300
aatcttacag agggtcaacc accaagagag tgcgccgtca cgtgcaggta tgatagagat 360
aatgacataa atgttgtaac gcaagctaga gacagaccca cgctactgac aggctgtaag 420
aaagggaaga atttctcctt tgcaggaata ttgatgcagg gtccttgcaa ctttgagata 480
gcggcaagtg atgtgctgtt taaagaacat gactgcacta atgtattcca ggatactgcc 540
cattaccttg tcgacgggat gaccaacacc gtagaaagtg ccaggcaagg gaccgcaaaa 600
ctaacaacct ggttaggcag acagcttggg atactgggaa aaaagctgga gaacaaaagt 660
aagacatggt tcggggcgta tgcg 684

Claims (10)

1.一种牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白，其特征在于，所述E2-E0融合蛋白包括牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白和牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；所述牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
2.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种编码权利要求2所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.6所示。
4.如权利要求1所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白的第160-162位氨基酸由IAA突变为GGG；所述突变后的牛病毒性腹泻病毒E0截短蛋白突变的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.如权利要求4所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白，其特征在于，所述牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
6.一种编码权利要求5所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO.10所示。
7.如权利要求1-2或权利要求4-5任一所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白在制备牛病毒性腹泻病毒疫苗中的应用。
8.如权利要求1-2或权利要求4-5任一所述的牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将编码牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因克隆到真核表达载体中得到表达牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的重组质粒；再将所述的重组质粒转染至CHO细胞中，培养、筛选、纯化得到牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1载体；所述CHO细胞为CHO悬浮细胞。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述方法为：
(1)PCR扩增编码牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因片段，所述基因片段如SEQID NO.6或SEQ ID NO.10所示；
(2)用限制性内切酶Xho I、Hind III分别对载体pcDNA3.1和牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因片段进行双酶切，并将酶切片段和牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的基因片段用DNA连接酶连接，获得表达牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白的重组质粒；
(3)将步骤(2)所述重组质粒转染CHO悬浮细胞，悬浮培养，收集细胞培养上清，纯化即得牛病毒性腹泻病毒E2-E0融合蛋白。
CN202210571495.8A 2022-05-24 2022-05-24 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用 Active CN114853912B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210571495.8A CN114853912B (zh) 2022-05-24 2022-05-24 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210571495.8A CN114853912B (zh) 2022-05-24 2022-05-24 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114853912A CN114853912A (zh) 2022-08-05
CN114853912B true CN114853912B (zh) 2023-06-13

Family

ID=82639703

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210571495.8A Active CN114853912B (zh) 2022-05-24 2022-05-24 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114853912B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1989240A (zh) * 2004-05-19 2007-06-27 贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司 含有减毒瘟病毒的疫苗

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090068223A1 (en) * 2005-11-15 2009-03-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Combination vaccine comprising an attenuated bovine viral diarrhea virus
CN102517260A (zh) * 2011-12-29 2012-06-27 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 携带牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白ns3优势区的融合蛋白及其重组表达方法与应用
CN112359023A (zh) * 2020-10-22 2021-02-12 中国农业大学 牛病毒性腹泻病毒bvdv-bj175170及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1989240A (zh) * 2004-05-19 2007-06-27 贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司 含有减毒瘟病毒的疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
CN114853912A (zh) 2022-08-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111393531B (zh) 一种亚单位融合蛋白CD2V-Fc及其制备方法和应用
CN108586618B (zh) 一种猪流行性腹泻亚单位疫苗的制备及应用
CN113845576B (zh) 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用
CN114107228B (zh) 缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用
CN108273054A (zh) 猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用
CN114853912B (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用
CN111773383B (zh) 一种o型口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN114773438B (zh) 一种牛病毒性腹泻病毒e0截短蛋白、制备方法及应用
CN109705223B (zh) 一种羊口疮病毒重组亚单位疫苗及其生产方法
CN111973738A (zh) 一种基于猪瘟病毒基因的核酸和重组蛋白共免疫疫苗、制备方法及应用
CN108671227B (zh) 一种预防猪链球菌感染的广谱多联亚单位疫苗
CN114805609B (zh) 一种猪瘟病毒e2-e0融合蛋白、制备方法及应用
CN111925449B (zh) 一种表达鸡vp2和鸡gal-1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用
CN114437235B (zh) 马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN114835782B (zh) 一种猪瘟病毒e0截短蛋白、制备方法及应用
CN116240222A (zh) 一种密码子优化的牛病毒性腹泻病毒1型e2蛋白基因及其应用
CN113861277A (zh) 一种牛轮状病毒重组vp8蛋白与应用
CN116589538B (zh) 七组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗
CN110747215A (zh) 一种高效表达猪瘟e2蛋白的重组杆状病毒及其构建方法
CN116747296B (zh) 十一组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗
CN116589539B (zh) 九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗
CN111304173A (zh) 一种高效表达猪瘟e2-il1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用
CN114085293B (zh) 用于预防禽安卡拉病的重组蛋白及构建方法和应用
CN116785419B (zh) 二十三组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗
CN116904489B (zh) 一种鸭坦布苏病毒核酸疫苗及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant