CN114839373B - 一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型及其构建方法和应用，涉及生物检测试剂盒。本发明提供检测外泌体中蛋白质的表达量的试剂在构建食管鳞癌淋巴结转移预测工具中的应用，并以血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白表达量为基础，构建血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白联合诊断食管鳞癌淋巴结转移预测模型的AUC＝0.854，说明血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白联合诊断食管鳞癌淋巴结转移效果较好，且在训练集及验证集中结果稳定。该预测模型的构建将为食管鳞癌淋巴结转移的评估提供更多的理论依据，并为精确制定食管鳞癌患者的治疗方案和预后判断提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型及其构建方法和应用。
背景技术
淋巴结转移是食管鳞癌(EC)死亡的主要原因，且淋巴结转移数目与食管鳞癌不良预后相关，因此，食管鳞癌淋巴结转移的早期识别，对于指导临床治疗及预后判断具有重要的意义。目前，判断EC的临床分期主要依靠CT、MRI、PET-CT及食管内镜超声。虽然影像检查设备不断更新发展，检查策略也更精细化，但目前对于淋巴结转移的诊断仍存在一定的局限性。CT目前仍然是EC术前分期和可切除性评价最常用的方法，其成本较低且广泛可得，但其在判定淋巴结转移方面存在局限性。当前，多以淋巴结最短径大于10mm作为判断淋巴结转移的标准，该标准使得CT诊断淋巴结转移的准确率不超过60％，且敏感性低，仅为30％～60％。此外，正常大小的淋巴结也可发生微转移，但CT无法识别淋巴结微转移，从而出现假阴性。MRI诊断食管癌淋巴结转移的灵敏为75.5％～88.73％，但其拍摄时受患者呼吸、吞咽等运动影响较大。研究表明，PET-CT判断淋巴结转移的准确性从27％～90％不等，当淋巴结离原发肿瘤很近的时候，假阳性诊断更多。食管内镜超声检查是EC临床分期的重要手段，但其在检测区域淋巴结时受含气体组织(如气管、肺等)的干扰较大，再者其为有创检查，因此其在普及与应用上受限。淋巴结转移判断不准确会导致错估临床分期，进而可能导致治疗方案制定的失误。病理分期作为诊断淋巴结转移和分期的金标准，由于其对患者创伤较大，且仅适用于手术患者，难以对食管鳞癌手术后的病人进行长期监测。
因此，寻找一种方便快捷，损伤小却又具有高灵敏度与高特异度的食管鳞癌淋巴结转移的识别方法是亟需解决的临床难题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型及其构建方法和应用，对于食管鳞癌淋巴结转移的检测，具有很好的可操作性和普及性，并且灵敏度高、特异度好，能很好的诊断食管鳞癌淋巴结转移效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了检测外泌体中蛋白质的表达量的试剂在构建食管鳞癌淋巴结转移预测工具中的应用，所述蛋白质包括CORO1C、LIMS1和SULT1A3中的一种或两种以上。
优选的，所述试剂包括Western Blot检测试剂、Elisa检测试剂或免疫组化检测试剂。
本发明还提供了一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型的构建方法，包括以下步骤：检测术前或术后的食管鳞癌患者的外泌体中蛋白质的表达量，对表达量数据进行数据统计后，构建食管鳞癌淋巴结转移预测模型；
所述蛋白质包括CORO1C、LIMS1和SULT1A3中的一种或两种以上。
优选的，所述数据统计方法包括：logistic回归分析方法、随机森林方法或人工神经网络。
优选的，所述外泌体中蛋白质的来源包括血液样本、尿液样本或唾液样本。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的食管鳞癌淋巴结转移预测模型。
本发明还提供了一种预测食管鳞癌淋巴结转移的试剂盒，包括CORO1C抗体、LIMS1抗体和SULT1A3抗体。
优选的，还包括进行Western Blot检测的其他试剂。
有益效果：本发明提供了检测外泌体中蛋白质的表达量的试剂在构建食管鳞癌淋巴结转移预测工具中的应用，本发明利用蛋白质组学技术发现，血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白与食管鳞癌淋巴结早期转移存在关联。收集食管鳞癌病人(包括有淋巴结转移和无淋巴结转移的病人)血液后提取外泌体，运用Western Blot的方法测量食管鳞癌病人中血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白的表达量。以血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白表达量为基础，构建血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白联合诊断食管鳞癌淋巴结转移预测模型的AUC＝0.854(灵敏度为0.724、特异度为0.839)，说明血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白联合诊断食管鳞癌淋巴结转移效果较好，且在训练集及验证集中结果稳定。该预测模型的构建将为食管鳞癌淋巴结转移的评估提供更多的理论依据，并为精确制定食管鳞癌患者的治疗方案和预后判断提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明食管鳞癌淋巴结转移预测方法的流程图；
图2为血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白与食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线；
图3为血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白联合分析预测食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供了检测外泌体中蛋白质的表达量的试剂在构建食管鳞癌淋巴结转移预测工具中的应用，所述蛋白质包括CORO1C、LIMS1和SULT1A3中的一种或两种以上。
本发明对所述试剂的类型并没有特殊限定，优选包括Western Blot检测试剂、Elisa检测试剂或免疫组化检测试剂，还可以是其他能够检测蛋白质表达量变化的试剂。本发明实施例中以Western Blot检测试剂为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。本发明在进行所述检测时，优选CORO1C、LIMS1和SULT1A3为共同靶点。本发明所述蛋白质的来源优选包括血液样本、尿液样本或唾液样本，实施例中以血液样本来源的外泌体中蛋白质为例进行说明，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。
本发明还提供了一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型的构建方法，包括以下步骤：检测术前或术后的食管鳞癌患者的外泌体中蛋白质的表达量，对表达量数据进行数据统计后，构建食管鳞癌淋巴结转移预测模型；
所述外泌体中蛋白质包括CORO1C、LIMS1和SULT1A3中的一种或两种以上。
本发明对所述外泌体中蛋白质的表达量的检测方法优选与上述相同，在此不再赘述。本发明优选对利用上述方法得到的表达量进行数据统计，所述数据统计方法优选包括：logistic回归分析方法、随机森林方法或人工神经网络。在本发明实施例中，优选利用logistic回归分析方法进行数据统计，具体包括将研究对象随机分为训练集与验证集，使用logistic回归分析计算血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的概率，使用受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线和曲线下面积(Area Under Curve，AUC)来判断其诊断淋巴结转移的效能，并计算构建模型的灵敏度和特异度，从而构建得到食管鳞癌淋巴结转移预测模型。
本发明还提供了利用上述构建方法构建得到的食管鳞癌淋巴结转移预测模型。
在本发明中，使用logistic回归分析计算血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的概率，以淋巴结是否转移为结局变量，绘制食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线。结果显示，使用logistic回归分析整合血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线下面积在全模型、训练集和验证集的AUC分别为：0.854(0.787,0.921)、0.837(0.749,0.925)、0.900(0.803,0.997)。联合三个血浆外泌体中蛋白质预测食管鳞癌淋巴结转移的预测模型，其预测效能优于使用单个血浆外泌体中蛋白质(Delong法，均P<0.05)。
本发明还提供了一种预测食管鳞癌淋巴结转移的试剂盒，包括CORO1C抗体、LIMS1抗体和SULT1A3抗体。
本发明对所述CORO1C抗体、LIMS1抗体和SULT1A3抗体的来源并没有特殊限定，优选购自Abcam，货号分别为：ab283693、ab76112和ab92476。本发明所述试剂盒中优选还包括进行WesternBlot检测的其他试剂。
本发明还提供了一种预测食管鳞癌淋巴结转移的方法，流程如图1所示，包括利用Western Blot的方法，检测术前或术后CORO1C、LIMS1和SULT1A3的表达量变化，并经logistic回归分析后，以淋巴结是否转移为结局变量，绘制食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线。利用本发明所述方法，根据血浆外泌体CORO1C、LIMS1和SULT1A3的表达量对食管淋巴结转移进行判断，无需手术，只需抽取静脉血，具有很好的可操作性和普及性；相关步骤已经有成熟的试剂盒，提取过程方便，可操作性强，费用较低；可以通过术前、术后动态检测血浆中外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3的表达量，判断术前淋巴结是否转移，术后病人预后和复发转移情况；通过Western Blot实验检测血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3的表达量的变化，具备高灵敏度和高特异度的特点，诊断食管鳞癌淋巴结转移效果较好。
本发明对所述外泌体以及外泌体中蛋白质的提取方法并没有特殊限定，优选利用本领域的常规试剂盒，根据试剂盒的说明书进行操作即可。在本发明中，优选使用ExoQuickTM试剂盒(货号：EXOQ20A-1，SBI)提取血浆外泌体，并利用Total Exosome RNA andProtein Isolation Kit试剂盒(货号：4478545，SBI)提取外泌体中蛋白质，使用BCA试剂盒(货号：ZD301-1，北京庄盟国际生物基因科技有限公司)测外泌体中蛋白质浓度。
本发明对所述Western Blot的方法并没有特殊限定，优选包括：
1)根据计算得到的待测蛋白的浓度，加入适当的超纯水和5×SDS缓冲液调节浓度，使得5×SDS缓冲液的体积占总体积的20％；
2)将蛋白质样品放在干式恒温器上煮5分钟，冷却后即可直接用于实验，或保存于-20℃冰箱；
3)SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备
表1凝胶溶液配制
本发明所使用的SDS聚丙烯酰胺凝胶下层为12.5％分离胶，上层为5％浓缩胶。配制凝胶时，10％AP与催化剂TEMED最后加入，震荡后须立即注入玻璃板之间，再注入1ml正丁醇压胶。凝胶聚合完成后，可在液面间看到折光线。接着，将正丁醇冲洗干净，用滤纸小心吸干残液，再加入5％浓缩胶，尽量避免气泡产生，将梳子缓慢插入浓缩胶中，室温静置30分钟左右，等浓缩胶聚合后拔掉梳子。
4)将做好的凝胶安装入电泳槽，加少量电泳液观察是否存在漏液，漏液需重新安装，不漏则加入足量电泳液(1L左右)。
5)样品孔中加入蛋白样品(50～100μL)，上样量根据蛋白质浓度确定。在适当位置加入5μL蛋白质Marker。
6)接通电源，最初使用60V恒压。当蛋白质Marker开始出现分离时，电压改为90V。电泳时间可根据目的蛋白自行调整。
7)取下凝胶，浸泡于转膜液之中，同时取两块厚滤纸浸泡。注意每块凝胶需做好标记便于区分。
8)剪下一块与凝胶大小相当的PVDF膜，先用甲醇浸泡5分钟，再用转膜液浸泡20分钟。
9)在转膜仪面板上按顺序放下厚滤纸、PVDF膜、凝胶、厚滤纸。叠加过程注意防止气泡的产生。
10)转一张膜时，要恒流110mA，而同时转两张膜时，需要恒流220mA。转膜时间一般为60～90分钟。
11)放入脱脂牛奶封闭液中，置于摇床上，缓慢摇动1小时以上。
12)按照条带分子量大小，将PVDF膜剪成条带，分别置于稀释过的一抗孵育液中，一抗孵育液的稀释比例为1:1000，在4℃低速摇床上孵育过夜。
13)用TBST漂洗PVDF膜条带3次，每次5分钟，分别置于稀释过的二抗孵育液中，二抗孵育液的稀释比例为1:2000，在室温低速摇床上孵育1小时。
14)用TBST漂洗PVDF膜条带10次，每次10分钟。
15)按照l:l配制显影液A液和B液，每块PVDF膜条带加200μL，用枪头涂抹均匀，除去气泡，使用化学发光成像仪进行曝光，调整参数直到图像清晰，选取清晰图片保存。
下面结合实施例对本发明提供的一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据明确的纳入和排除标准收集2014年至今于福建省肿瘤医院，2016年6月起于福建医科大学附属第一医院就诊的食管鳞癌患者。
纳入标准：(1)经手术病理组织学确诊的原发性食管鳞癌；(2)具有血样标本；(3)在福建本地居住10年以上；(4)自愿签署知情同意书。
排除标准：(1)经病理诊断确诊为非原发性食管鳞癌、复发性食管鳞癌患者；(2)伴有肝肾功能不全或急慢性感染；(3)伴有其他严重内科疾病；(4)病情危重不能清晰回答问题者。本研究共纳入120例研究对照，其中淋巴结未转移患者58例和淋巴结未转移患者62例。
使用WesternBlot检测转移组与未转移组血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白的表达情况。CORO1C(货号：ab283693)、LIMS1(ab76112)、SULT1A3(ab92476)抗体购买于Abcam；内参β-Tublin(A12289)抗体购买于ABclonal。
将120例研究对象按2:1将研究对象随机分为训练集(n＝76)与验证集(n＝41)。使用logistic回归分析计算血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的概率，使用受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic，ROC)曲线和曲线下面积(Area Under Curve，AUC)来判断其诊断淋巴结转移的效能，并计算构建模型的灵敏度和特异度。
试验结果：
(1)血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白与食管鳞癌淋巴结转移ROC曲线
以淋巴结是否转移为结局变量，分别绘制血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白与食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线，结果显示，在全模型中，血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的AUC分别为：0.696(0.581,0.810)、0.711(0.618,0.805)、0.797(0.711,0.883)；其在训练集及验证集的灵敏度及特异度、ROC曲线如表2、图2所示。
表2血浆外泌体中蛋白质构建食管鳞癌淋巴结转移预测模型的灵敏度、特异度及AUC
(2)使用logistic回归分析整合血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白构建食管鳞癌淋巴结转移预测模型
使用logistic回归分析计算血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的概率，以淋巴结是否转移为结局变量，绘制食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线。结果如表3和图3所示，使用logistic回归分析整合析血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白预测食管鳞癌淋巴结转移的ROC曲线下面积在全模型、训练集和验证集的AUC分别为：0.854(0.787,0.921)、0.837(0.749,0.925)、0.900(0.803,0.997)。联合三个血浆外泌体中蛋白质预测食管鳞癌淋巴结转移的预测模型，其预测效能优于使用单个血浆外泌体中蛋白质(Delong法，均P<0.05)的预测模型。
表3血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3蛋白联合分析构建食管鳞癌淋巴结转移的预测模型
综上可知，联合使用血浆外泌体CORO1C、LIMS1、SULT1A3构建食管鳞癌淋巴结转移的模型其预测能力均优于仅使用单种血浆外泌体中蛋白质组学构建的模型。将研究对象按2:1随机分为训练集与验证集，以上模型在训练集及验证集的结果较为一致，说明结果较为稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.检测外泌体中蛋白质的表达量的试剂在构建食管鳞癌淋巴结转移预测工具中的应用，其特征在于，所述蛋白质包括CORO1C、LIMS1和SULT1A3中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述试剂包括Western Blot检测试剂、Elisa检测试剂或免疫组化检测试剂。
3.一种食管鳞癌淋巴结转移预测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：检测术前或术后的食管鳞癌患者的外泌体中蛋白质的表达量，对表达量数据进行数据统计后，构建食管鳞癌淋巴结转移预测模型；
所述蛋白质包括CORO1C、LIMS1和SULT1A3中的一种或两种以上。
4.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述数据统计方法包括：logistic回归分析方法、随机森林方法或人工神经网络。
5.根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述外泌体中蛋白质的来源包括血液样本。
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