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CN114828852A - 用于治疗hbv的靶向hbv的抗病毒药剂和/或免疫调节剂的药物组合 - Google Patents

用于治疗hbv的靶向hbv的抗病毒药剂和/或免疫调节剂的药物组合 Download PDF

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CN114828852A CN202080087097.8A CN202080087097A CN114828852A CN 114828852 A CN114828852 A CN 114828852A CN 202080087097 A CN202080087097 A CN 202080087097A CN 114828852 A CN114828852 A CN 114828852A
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Abstract

本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的组合物和方法。特别地，本发明涉及一种组合疗法，其包括施用某些抗病毒化合物和免疫调节剂化合物。

Description

用于治疗HBV的靶向HBV的抗病毒药剂和/或免疫调节剂的药 物组合
技术领域
本发明涉及用于治疗乙型肝炎病毒感染的组合物和方法。具体而言，本发明涉及用于治疗慢性乙型肝炎患者的组合疗法，其包括施用靶向HBV的治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂。本发明还进一步涉及用于治疗慢性乙型肝炎患者的药物组合，其包括各种抗病毒化合物和免疫调节剂化合物。
背景技术
HBV感染仍然是全世界的主要健康问题，估计有3.5亿慢性携带者受到影响。预计大约25％的携带者会死于慢性肝炎、肝硬化或肝癌。乙型肝炎病毒是仅次于烟草的第二大致癌物，导致所有原发性肝癌的60％至80％。
HBV的外包膜蛋白统称为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg由三个相关的多肽组成，它们被称为S、M和L，由重叠的开放阅读框(ORF)编码。最小的包膜蛋白是具有226个氨基酸的S，称为S-ORF。M和L由上游翻译起始位点产生，分别向S添加55和108个氨基酸。HBV S、M和L糖蛋白存在于被称为Dane颗粒的完整的、传染性HBV病毒粒子的病毒包膜中，并且三者均大量产生和分泌，形成在慢性HBV患者的血液中发现的非传染性亚病毒球形和丝状颗粒(均称为诱饵颗粒)。诱饵颗粒表面上的丰富HBsAg被认为会抑制慢性HBV感染(CHB)患者的体液免疫和自发清除。
目前慢性HBV感染的护理标准是用口服核苷(核苷酸)类似物(如恩替卡韦或替诺福韦)治疗，其通过抑制HBV DNA合成来提供对HBV复制的抑制，但不直接作用于病毒抗原，如HBsAg。即使长期用核苷(核苷酸)类似物治疗，也仅显示出低水平的HBsAg清除。在这方面，患有慢性乙型肝炎的患者表现出非常弱的HBV T细胞反应且缺乏抗-HB抗体，这被认为是这些患者无法清除病毒的原因之一。
临床上的一个重要目标是实现慢性HBV感染的功能性治愈，定义为HBsAg血清转换和血清HBV-DNA消除。预计这将产生持久的反应，从而防止肝硬化和肝癌的发展，并延长存活期。目前，由于病毒基因组作为共价闭合环状DNA(cccDNA)在受感染肝细胞的细胞核中长期或永久存在，因此无法完全根除慢性HBV感染。慢性HBV感染的完全治愈需要从受感染的肝细胞中消除这种cccDNA。
评论文章Soriano等人2017 Expert Opinion on Investigational DrugsVol.26,pp 843描述了药物开发的现状，旨在实现HBV的功能性治愈或完全治愈。该文章重点介绍了目前正在HBV疗法中测试的超过30种药物中的一些，还提到任何导致治愈的有效治疗都可能需要结合病毒靶向疗法和免疫疗法。
Toll样受体TLR7是对病毒感染的先天免疫反应的组成部分，并且主要在浆细胞样细胞和B细胞上表达。这类免疫细胞的反应性改变可能导致慢性病毒感染期间先天免疫反应的降低。因此，激动剂诱导的TLR7活化代表了一种使用免疫疗法来治疗慢性病毒感染的可能方法。几种TLR激动剂正在临床试验中进行测试，包括GS-9620。替代的TLR7激动剂描述于WO 2006/066080、WO 2016/055553和WO 2016/91698中。
反义寡核苷酸基本上是能够通过与靶核酸杂交来调节靶基因表达的单链寡核苷酸。靶标调节可能经由RNA酶H介导的降解或通过阻断转录进行下调。反义寡核苷酸也可以上调靶标，例如经由剪接转换或微小RNA抑制。对于肝脏中的靶标，GalNAc缀合已被证明对于递送反义寡核苷酸非常有效。WO 2014/179627和WO2015/173208描述了通过使用单链反义寡核苷酸结合GalNAc缀合来降解肝细胞中的HBV mRNA从而治疗HBV。WO2015/173208中简要提到了包括TLR7激动剂GS-9620的各种组合疗法。
WO2016/077321描述了通过使用双链siRNA接合有义链上的GalNAc缀合来降解肝细胞中的HBV mRNA从而治疗HBV。简要提到了包括TLR7激动剂的各种组合疗法。
据我们所知，尚未在体外或体内测试过治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂的特定组合。
发明目的
本发明鉴定了包括靶向HBV的治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂的抗病毒化合物和免疫调节剂化合物的新型组合，其在延长血清HBV-DNA减少和延迟HBsAg反弹方面提供优于单一化合物治疗的优势。此外，采用组合治疗可以实现治疗窗口的增加，因为与单一治疗中使用的药物浓度相比，使用组合治疗时可以以低3-5倍的剂量实现显著改善的效果，并且与高剂量的相同组合相比，采用低3-5倍剂量的组合治疗可以实现基本相同的效果。
发明内容
本发明的一个方面是一种药物组合，其包括作为治疗性寡核苷酸的第一药物化合物和作为如下定义的式(I)或(II)TLR7激动剂的第二药物化合物，或由它们组成。本发明的优选实施例是一种药物组合，其包括作为RNAi寡核苷酸的第一药物化合物和作为如下定义的式(I)或(II)TLR7激动剂的第二药物化合物，或由它们组成，所述RNAi寡核苷酸优选为用于降低HBsAg mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包括长度为19至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包括与如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:33)中所示的HBsAg mRNA序列互补的区域。本发明的另一实施例是一种药物组合，其包括作为反义寡核苷酸的第一药物化合物和作为如下定义的式(I)或(II)TLR7激动剂的第二药物化合物，或由它们组成，所述反义寡核苷酸优选为长度为13至22个核苷酸的GalNAc缀合的反义寡核苷酸，其中至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与来自SEQ ID NO:1的位置1530至1602的连续序列100％互补。
式(I)和(II)：
Figure BDA0003695063620000031
其中X为CH2或S；
对于式(I)，R1为-OH或-H并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
对于式(II)，R1为-OH或-H或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基，
或其药用盐、对映体或非对映体。
本发明的另一方面涉及用于治疗HBV感染个体，特别是患有慢性HBV的个体的药物组合。
本发明的另一方面是治疗性寡核苷酸在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的第一药物中的用途，其中第一药物是如本申请中所述的治疗性寡核苷酸并且其中第一药物与第二药物组合施用，其中第二药物是如本申请中所述的TLR7激动剂。
在一个实施例中，治疗性寡核苷酸化合物(第一药物或第一药物化合物)被配制用于皮下注射并且TLR7激动剂化合物(第二药物或第二药物化合物)被配制用于口服施用。由于药物化合物将通过两种不同的施用途径来施用，因此它们可以遵循不同的施用方案。为了最佳组合效果，第一和第二药物化合物的施用间隔小于一个月，例如间隔小于一周，例如间隔两天，例如在同一天。
本发明的另一方面是一种多部件试剂盒，其包括第一药物化合物(第一药物)和包装插页，所述包装插页具有在治疗HBV中施用第二药物化合物(第二药物)的施用说明。在一个实施例中，部件的试剂盒包括第一药物化合物和第二药物化合物二者。
本发明的另一方面是一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向感染乙型肝炎病毒的受试者(例如慢性感染个体)施用治疗有效量的如本申请中所述的治疗性寡核苷酸(第一药物)与治疗有效量的如申请中描述的TLR7激动剂(第二药物)的组合。
在高度优选的实施例中，本申请中提及的治疗性寡核苷酸为RNAi寡核苷酸，优选小干扰RNA(siRNA)，优选用于降低HBsAg mRNA的表达的RNAi寡核苷酸或siRNA。在不同的实施例中，治疗性寡核苷酸为反义寡核苷酸，优选GalNAc缀合的反义寡核苷酸，优选靶向HBV的反义寡核苷酸或GalNAc缀合的反义寡核苷酸。
本发明的其他方面是包括至少两种活性成分的进一步的药物组合，所述活性成分选自本文公开的抗病毒化合物和免疫调节剂化合物。本发明的其他方面是用于治疗乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向感染乙型肝炎病毒的受试者(例如慢性感染个体)施用治疗有效量的这些进一步的药物组合。
附图说明
图1：说明了示例性的反义寡核苷酸缀合物，显示了各种立体异构体，其中寡核苷酸以波浪线(A-D)或“寡核苷酸”(E-H和K)或T2(I-J)表示，并且靶向缀合物部分的脱唾液酸糖蛋白受体是三价N-乙酰基半乳糖胺部分。化合物A至D包含二赖氨酸支链分子，PEG3间隔物和三个末端GalNAc碳水化合物部分。在化合物A和B中，寡核苷酸直接附接至靶向缀合物部分的脱唾液酸糖蛋白受体，无需接头。在化合物C和D中，寡核苷酸通过C6接头附接于靶向缀合物部分的脱唾液酸糖蛋白受体。化合物E-J包含可商业获得的三倍体支链分子和不同长度和结构的间隔物以及三个末端GalNAc碳水化合物部分。化合物K由在仍位于固体支持物上的同时作为合成的一部分添加到寡核苷酸的单体GalNAc亚磷酰胺组成，X＝S或O且n＝1-3(参见WO 2017/178656)。图1B和1D在本文中也被称为GalNAc2或GN2，分别没有和带有C6接头。
图2：CMP ID NO:29_1的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图3：CMP ID NO:23_1的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图4：CMP ID NO:16_1的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图5：CMP ID NO:15_1的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图6：CMP ID NO:15_2的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图7：CMP ID NO:26_1的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图8：CMP ID NO:20_1的结构式。其药用盐包括与化合物缔合的一价或二价阳离子，例如Na+、K+和Ca2+或这些的混合物。
图9：显示了各种单一和组合治疗对AAV/HBV小鼠血清中HBV-DNA的影响。子图A，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每隔一天(QOD)施用(虚线；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。子图B，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每周(QW)施用(虚线，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。子图C，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每隔一天(QOD)施用(虚线；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。子图D，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每周(QW)施用(虚线，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。
图10：显示了各种单一和组合治疗对AAV/HBV小鼠血清中HBsAg的影响。子图A，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每隔一天(QOD)施用(虚线；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以1.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。子图B的小鼠遵循以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMPID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每周(QW)施用(虚线，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBVASO)以1.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。子图C，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每隔一天(QOD)施用(虚线；矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。子图D，经以下处理：盐水(媒介物，虚线和圆圈)；CMP ID NO:VI(TLR7激动剂)以100mg/kg每周(QW)施用(虚线，矩形)；CMP ID NO：15_1(抗HBV ASO)以7.5mg/kg给药(虚线；三角形)；或二者的组合(实线和正方形)。
图11：在HBV基因组的组织结构示意图上显示了RNAi靶位点的示例。
图12：显示了用于减少HDI小鼠中HBsAg表达的寡核苷酸的单剂量评估。
图13：显示了在采用HBsAg靶向寡核苷酸的指定给药方案期间血浆HBsAg水平随时间变化的示意图。如本示例所示，寡核苷酸显示出临床前效力，并在给药期之后保持降低的水平。
图14：显示的图表描绘了使用报告基因测定法在HeLa细胞中的HBsAg映射的结果。在特定浓度下，使用靶向HBV基因组的位置254的未修饰siRNA作为阳性对照。来自ThermoFisher的可商业获得的Silencer siRNA作为这些实验的阴性对照。误差条代表SEM。
图15：显示了基因型保守比较，表明HBsAg靶向寡核苷酸HBV-219中设计的错配增加了对HBV基因型的覆盖。
图16：说明了为使用HBV基因型A作为原型序列的psiCHECK2报告基因测定法而设计的载体。
图17：显示了设计用于评估引入错配的影响的若干寡核苷酸示例。亲本链和错配链的寡核苷酸序列对齐显示，错配位置显示在方框中。进一步描绘了psiCHECK2报告基因测定法中所用的相应报告基因序列。
图18：显示了在错配研究中评估的寡核苷酸的单剂量滴定图，这表明在体内耐受引导链中的错配。
图19：显示了体内剂量滴定图，表明将错配掺入HBsAg靶向寡核苷酸不会对体内效力产生不利影响。
图20：显示了具有化学修饰和双链体形式的HBsAg靶向寡核苷酸(HBV(s)-219)的示例。较深的阴影表示2'-O-甲基核糖核苷酸。较浅的阴影表示2'-氟-脱氧核糖核苷酸。
图21A：描绘了检测肝细胞中HBV核心抗原(HBcAg)的亚细胞分布的免疫组织化学染色结果。
图21B：描绘了将经检测的RNA转录物序列相对于HBV pgRNA映射的RNA测序结果。
图22A：描绘了在HBV的流体动力注射(HDI)模型中遵循以下处理的HBsAg mRNA表达的时间过程比较：靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸前体HBV(s)-219P2、媒介物对照和靶向HBV X抗原(HBxAg)mRNA的RNAi寡核苷酸。
图22B：描绘了经以下处理后在AAV-HBV模型中的HBsAg mRNA表达的时间过程比较：靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸前体HBV(s)-219P2、媒介物对照和靶向HBxAgmRNA的RNAi寡核苷酸。
图23：显示了免疫组织化学染色结果，其显示了经以下处理后从AAV-HBV模型和HBV的HDI模型中获得的肝细胞中HBcAg的亚细胞分布比较：靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸、媒介物对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸(GalXC-HBVX)。
图24A-24D：显示了HBV(s)-219前体1(HBV(s)-219P1)在PXB-HBV模型中的抗病毒活性。9只小鼠的群组被给予3周剂量的在PBS中的0或3mg/kg HBV(s)-219P1，皮下施用。在每个所示的时间点(图24A和24B)，通过对来自每个群组的六只小鼠的血清HBsAg和血清HBVDNA进行非终末下颌颊出血分析。在第28天(从第一剂HBV(s)-219P1开始)，对所有剩余的小鼠实施安乐死，并收集肝活检物以通过RT-qPCR检测肝HBV DNA(图24C)和肝cccDNA(图24D)。
图25A-25C：显示HBV(s)-219前体2(HBV(s)-219P2)增强恩替卡韦的抗病毒活性。在HBV小鼠流体动力学注射(HDI)模型中，在第1天给小鼠皮下施用单剂HBV(s)-219P2，然后每天口服500ng/kg恩替卡韦(ETV)，持续14天。通过qPCR测量循环病毒载量(HBV DNA)(图25A)。通过ELISA测量血浆HBsAg水平(图25B)。通过qPCR测量肝HBV mRNA和pgRNA水平(图25C)。结果显示了组合疗法具有明显累加效应。单独的ETV疗法显示了对循环HBsAg或肝病毒RNA没有效果。如通过HBsAg或HBV RNA测量的HBV(s)-219P2的抗病毒活性不受ETV共同给药的影响。“BLOD”意指“低于检测限”。
图26A-26B：显示靶向S抗原(HBV(s)-219P2)或X抗原(指定为GalXC-HBVX)的GalNac缀合的寡核苷酸的HBsAg抑制活性的比较。结果显示，HBVS-219P2对HBsAg抑制的持续时间比GalXC-HBVX或两种RNAi药剂的等摩尔组合更长。图26A显示了HBV基因组中RNAi靶位点的位置影响表达HBV的小鼠的HBsAg恢复动力学。图26B显示了给药后2周(左图)和给药后9周(右图)的血浆HBsAg水平，表明单独或与HBV(s)-219P2组合地靶向HBVX编码区使活性持续时间更短。显示了个体动物的数据。若干数据点(最浅的灰色圆圈)低于检测限。
图27A-27C：显示了用HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或1:1组合来治疗的表达HBV的小鼠中HBV核心抗原(HBcAg)的亚细胞定位。图27A显示了在给药后第1、2、6、9和13周获得的肝切片中的代表性肝细胞，并对HBcAg进行了染色。图27B显示了每只动物中具有核染色的HBcAg阳性细胞的百分比(n＝3/组，每只动物计数50个细胞，给药后2周)。设计了替代序列，并在X和S开放阅读框内测试靶向。图27C显示了在施用靶向S抗原或X抗原的替代RNAi寡核苷酸后第2、3和9周获得的肝细胞中HBcAg的亚细胞分布。
图28：按群组信息显示了一项研究的剂量，该研究旨在评估HBV(s)-219在健康患者中的安全性和耐受性以及HBV(s)-219在HBV患者中的治疗效果。
图29A-29B：显示了HBV(s)-219和HBV(s)-219P2的化学结构。(图29A)HBV-219的化学结构。(图29B)HBV(s)-219P2的化学结构。
图30：显示了HBV-LNA(CMP ID NO:15_1，根据本发明的反义寡核苷酸)和DCR-S219(根据本发明的RNAi寡核苷酸，特别是siRNA)随时间降低HBsAg滴度的效果。“DCR-AUD1”(靶向HBV以外的序列的对照siRNA)和“媒介物”(无菌水)是阴性对照。图30中HBV-LNA的剂量是6.6mg/kg，而DCR-S219的剂量是9mg/kg，但是HBV-LNA的摩尔剂量是DCR-S219的摩尔剂量的三倍左右。
具体实施方式
定义
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常是在实验室中制作，先经固相化学合成后再加以纯化和分离。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。
此外，寡核苷酸是例如长度小于100个核苷酸的短核酸。寡核苷酸可以是单链或双链。寡核苷酸可以具有或不具有双链体区域。作为一组非限制性示例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、dicer底物干扰RNA(dsiRNA)、反义寡核苷酸、短siRNA或单链siRNA。在一些实施例中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
合成的如本文所用，术语“合成的”是指核酸或其他分子，其被人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))或者以不从通常产生该分子的天然来源(例如，细胞或生物体)衍生的其他方式得到。
双链寡核苷酸
如本文所用，术语“双链寡核苷酸”是指基本上呈双链体形式的寡核苷酸。在一些实施例中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对是在共价分离的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成。在一些实施例中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对是在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成。在一些实施例中，双链寡核苷酸的双链体区域的互补碱基配对是从单个核酸链形成，该核酸链被折叠(例如，经由发夹)以提供碱基配对在一起的核苷酸的互补反平行序列。在一些实施例中，双链寡核苷酸包含彼此完全双链体化的两条共价分离的核酸链。然而，在一些实施例中，双链寡核苷酸包含部分双链体化(例如，在一端或两端具有突出端)的两条共价分离的核酸链。在一些实施例中，双链寡核苷酸包含部分互补的核苷酸的反平行序列，因此可具有一个或多个错配，该错配可包括内部错配或末端错配。
链
如本文所用，术语“链”是指通过核苷酸间键(例如，磷酸二酯键、硫代磷酸酯键)连接在一起的核苷酸的单个连续序列。在一些实施例中，链具有两个自由端，例如，5'-端和3'-端。
双链体
如本文所用，关于核酸(例如，寡核苷酸)的术语“双链体”是指通过两个反平行核苷酸序列的互补碱基配对形成的结构。
突出端
如本文所用，术语“突出端”是指末端非碱基配对核苷酸，由一条链或区域延伸超出与该一条链或区域形成双链体的互补链的末端而产生。在一些实施例中，突出端包含一个或多个从双链寡核苷酸的5'末端或3'末端处的双链体区域延伸的未配对核苷酸。在某些实施例中，突出端是双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3'或5'突出端。
环
如本文所用，术语“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其侧接核酸的两个彼此充分互补的反平行区域，使得在适当的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区域两侧的两个反平行区域杂交形成双链体(称为“茎”)。
RNAi寡核苷酸
如本文所用，术语“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(过客)和反义链(指导)的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分被Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于裂解靶mRNA或(b)具有单个反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链(或该反义链的一部分)被Ago2核酸内切酶用于裂解靶mRNA。
RNAi药剂
本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi药剂”、“iRNA药剂”和“RNA干扰药剂”是指一种药剂(例如，RNAi寡核苷酸)，其包含本文的RNA核苷并经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向裂解。iRNA通过已知为RNA干扰(RNAi)的过程引导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节，例如，抑制靶核酸在细胞(例如受试者，诸如哺乳动物受试者内的细胞)中的表达。RNAi药剂包括单链RNAi药剂和双链siRNA，以及短发夹RNA(shRNA)。本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是RNAi药剂的形式，或者是RNAi药剂的一部分，诸如siRNA或shRNA。在本发明的一些实施例中，本发明的寡核苷酸或其连续核苷酸序列是RNAi药剂，诸如siRNA。
siRNA
术语siRNA是指小干扰核糖核酸RNAi药剂，是一类双链RNA分子，在本领域中也称为短干扰RNA或沉默RNA。siRNA通常包含有义链(也称为过客链)和反义链(也称为指导链)，其中每条链的长度为17-30个核苷酸，通常为19-25个核苷，其中反义链与靶核酸(合适地是成熟的mRNA序列)互补(例如，完全互补)，并且有义链与反义链互补，使得有义链和反义链形成双链体或双链体区域。siRNA链可形成平末端双链体，或者有利地，有义和反义链的3’末端可形成3’突出端，例如1、2或3个核苷。在一些实施例中，有义链和反义链均具有2nt 3'突出端。因此，双链体区域的长度可以是例如17-25个核苷酸，例如21-23个核苷酸。
一旦进入细胞内，反义链就被掺入RISC复合物中，该RISC复合物介导靶核酸的靶降解或靶抑制。除了RNA核苷之外，siRNA通常包含修饰的核苷，或者在一些实施例中，siRNA链的所有核苷酸都可以被修饰(有义2'糖修饰的核苷，例如LNA(参见例如WO2004083430、WO2007085485)、2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基可掺入siRNA中)。在一些实施例中，siRNA的过客链可以是不连续的(例如，参见WO2007107162)。已经报道了在siRNA的反义链的种子区出现的热不稳定核苷酸的掺入可用于减少siRNA的脱靶活性(例如，参见WO18098328)。
在一些实施例中，dsRNA剂，诸如本发明的siRNA，包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施例中，有义链的基本上所有核苷酸均包含修饰；反义链的基本上所有核苷酸都包含修饰，或者有义链的基本上所有核苷酸都包含修饰并且反义链的基本上所有核苷酸都包含修饰。在其他实施例中，有义链的所有核苷酸均包含修饰；反义链的所有核苷酸都包含修饰，或者有义链的所有核苷酸都包含修饰并且反义链的所有核苷酸都包含修饰。
在一些实施例中，修饰的核苷酸可以独立地选自由以下项组成的组：脱氧核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、未锁定的核苷酸、构象受限的核苷酸、受约束的乙基核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、未连接的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5’-磷酸的核苷酸、包含5'-磷酸模拟物的核苷酸、乙二醇修饰的核苷酸和2-O-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸、及其组合。合适地，siRNA在反义链的5'端包含5'磷酸基团或5'-磷酸模拟物。在一些实施例中，反义链的5'端是RNA核苷。
在一个实施例中，dsRNA药剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键可以在一条或两条链(例如，反义链；或有义链)的3'-末端处；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键可以在一条或两条链(例如，反义链；或有义链)的5'末端处；或者硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷间键可以在一条或两条链(例如反义链；或有义链)的5'-末端和3'-末端二者处。在一些实施例中，剩余的核苷间键是磷酸二酯键。
dsRNA剂可以进一步包含配体。在一些实施例中，配体缀合至有义链的3'端。对于生物学分布，例如，可将siRNA缀合至靶向配体和/或配制成脂质纳米颗粒。
本发明的其他方面涉及包含这些dsRNA的药物组合物，例如适合用于治疗用途的siRNA分子，以及通过施用dsRNA分子(例如本发明的siRNA)来抑制靶基因表达的方法，例如用于治疗如本文所公开的各种疾病。
四环
如本文所用，术语“四环”是指增加由核苷酸侧翼序列杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的增加，该解链温度高于从一组由随机选择的核苷酸序列组成的可比长度的环平均预期的相邻茎双链体的Tm。例如，四环可以向包含至少2个碱基对长度的双链体的发夹赋予在10mM NaHPO4中至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。在一些实施例中，四环可以通过堆叠相互作用来稳定相邻茎双链体中的碱基对。此外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对、堆叠相互作用、氢键、和接触相互作用(Cheong等人,Nature 1990Aug.16；346(6285):680-2；Heus和Pardi,Science 1991Jul.12；253(5016):191-4)。在一些实施例中，四环包含4至5个核苷酸。在某些实施例中，四环包含三个、四个、五个或六个核苷酸，或由三个、四个、五个或六个核苷酸组成，该核苷酸可以被修饰或可以不被修饰(例如，其可以与或不与靶向部分缀合)。在一个实施例中，四环由四个核苷酸组成。任何核苷酸都可以用于四环，并且可以使用此类核苷酸的标准IUPAC-IUB符号，如Cornish-Bowden(1985)Nucl.Acids Res.13:3021-3030中所述。例如，字母“N”可以用来表示任何碱基都可以在那个位置，字母“R”可以用来表示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在那个位置，而“B”可以用来表明C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以在那个位置。四环的示例包括四环的UNCG家族(例如，UUCG)、四环的GNRA家族(例如，GAAA)和CUUG四环(Woese等人，Proc Natl Acad Sci USA.1990 November；87(21):8467-71；Antao等人,NucleicAcids Res.1991 Nov.11；19(21):5901-5)。DNA四环的示例包括四环的d(GNNA)家族(例如，d(GTTA))、四环的d(GNRA)家族、四环的d(GNAB)家族、四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如，d(TTCG))。参见例如：Nakano等人Biochemistry,41(48),14281-14292,2002.SHINJI等人Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th；NO.2；PAGE.731(2000)，它们的相关公开内容通过引用并入本文。在一些实施例中，四环包含在有切口的四环结构内。
有切口的四环结构
“有切口的四环结构”是一种RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于存在单独的有义(过客)链和反义(指导)链，其中有义链具有与反义链互补的区域，并且其中至少一条链(通常为有义链)具有四环，该四环被配置用于稳定在至少一条链内形成的相邻茎区域。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解的是，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(同一寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要其内部或相互间的自身互补程度小于寡核苷酸全长的50％。
优选地，本发明的单链反义寡核苷酸不包含RNA核苷，因为这将降低核酸酶抗性。
有利的是，本发明的反义寡核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，诸如2'糖修饰的核苷。此外，优选的是未修饰的核苷是DNA核苷。
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换地使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F'缺口聚物区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团附着到连续核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或可以不互补。应理解的是，该寡核苷酸的邻接核苷酸序列不能比寡核苷酸本身更长，并且该寡核苷酸不能比邻接核苷酸序列更短。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸酯基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
脱氧核糖核苷酸
如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比在其戊糖的2'位置具有氢而不是羟基的核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸是具有除2'位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代。
核糖核苷酸
如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，其在2'位置含有羟基基团。修饰的核糖核苷酸是具有除2'位置以外的原子的一个或多个修饰或取代的核糖核苷酸，包括核糖、磷酸酯基团或碱基中的修饰或取代。
修饰的核苷
如本文所用，术语“经修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。
经修饰的核苷酸
如本文所用，术语“经修饰的核苷酸”是指与选自以下的相应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸、腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施例中，经修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸酯基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施例中，经修饰的核苷酸具有一个或多个与相应参考核苷酸缀合的化学部分。通常，经修饰的核苷酸赋予其中存在该经修饰的核苷酸的核酸一种或多种期望的特性。例如，经修饰的核苷酸可以提高热稳定性、降解抗性、核酸酶抗性、溶解度、生物利用度、生物活性、降低的免疫原性等。
修饰的核苷间键
如技术人员通常所理解的，术语“经修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，经修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸酯基团。修饰的核苷间键可用于稳定体内使用的寡核苷酸，并可用于防止本发明的寡核苷酸中DNA核苷区域或RNA核苷区域的核酸酶裂解，例如在缺口聚体寡核苷酸的缺口区域G内以及在修饰的核苷区域中，例如区域F和F'。
在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个从天然磷酸二酯修饰的核苷间键，诸如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是经修饰的，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是经修饰的。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷间键是经修饰的。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键都是抗核酸酶核苷间键。
有利的是在本发明的寡核苷酸中使用硫代磷酸酯核苷间键。
硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少75％、诸如至少80％或诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的全部核苷间键均为硫代磷酸酯。
在一些实施例中，除了二硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkage)外，本发明的寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷间键及至少一个磷酸二酯键，诸如2、3或4个磷酸二酯键。在缺口聚物寡核苷酸中，当存在时，磷酸二酯键合适地不位于缺口区G中的邻接DNA核苷之间。
抗核酸酶键，诸如硫代磷酸酯键，在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚物的区域G。然而，硫代磷酸酯键也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，诸如缺口聚物的区域F和F'。在一些实施例中，缺口聚体寡核苷酸可在区域F或F'，或者同时在区域F和F'中包含一个或多个磷酸二酯键，其中区域G中的所有核苷间键均可以是硫代磷酸酯。
优选地，寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯，或寡核苷酸的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。特别地，反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的所有核苷间键都是硫代磷酸酯，或反义寡核苷酸的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。
应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，治疗性寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间，其根据EP 2 742135可以例如以其他方式在DNA硫代磷酸酯的间隔区域中被耐受。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖经修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中。
在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚物，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语经修饰的寡核苷酸描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是已在文献中用于描述具有经修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
互补性
如本文所用，“互补”是指在两个核苷酸之间(例如，在两个相对的核酸上或在单个核酸链的相对区域上)，或在两个核苷酸序列之间的结构关系，其允许这两个核苷酸或两个核苷酸序列彼此形成碱基对。例如，与相反核酸的嘧啶核苷酸互补的一种核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施例中，互补核苷酸可以Watson-Crick方式或允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所用，术语“互补性百分比”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如靶序列或序列基序)互补的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列之间(当与靶序列5'-3’和3'-5’的寡核苷酸序列比对时)互补(形成例如Watson Crick碱基对)的对准的核碱基数，将其除以寡核苷酸中核苷酸的总数，然后乘以100，来计算互补性的百分比。在此类比较中，未对准(例如形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。在计算连续核苷酸序列的互补性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定互补性时，只要保留了形成例如Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5’-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
术语“完全互补”是指100％的互补性。
以下是与HBV转录物区域完全互补的连续核苷酸序列的示例。
以下是与HBV靶标区域(SEQ ID NO:28)完全互补的连续核苷酸序列(SEQ ID NO:6)的示例。
Figure BDA0003695063620000201
在一些实施例中，如本文所述，两个核酸可以具有彼此互补的多个核苷酸的区域，以便形成互补区域。
互补区域
如本文所用，术语“互补区域”是指与反平行的核苷酸序列充分互补以允许两个核苷酸序列之间在合适的杂交条件下(例如在磷酸盐缓冲液中、在细胞中等)杂交的核酸(例如，双链寡核苷酸)的核苷酸序列。
同一性
如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列的与参考序列(例如序列基序)相同的核苷酸比例(以百分比表示)，该核酸分子跨连续核苷酸序列。因此，通过计数两个序列(在本发明的化合物的连续核苷酸序列中和在参考序列中)相同(匹配)的对准核碱基数，将该数除以寡核苷酸的核苷酸总数再乘以100，来计算同一性百分比。因此，同一性百分比＝(匹配数x100)/比对区域的长度(例如，连续核苷酸序列)。在计算连续核苷酸序列的同一性百分比时，不允许插入和删除。应当理解的是，在确定同一性时，只要保留了形成Watson Crick碱基配对的核碱基的功能能力，就不考虑核碱基的化学修饰(例如，在计算同一性百分比时，认为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶相同)。
杂交
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体(例如寡核苷酸和靶核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(Tm)来描述，其定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm并非确实与亲和力严格成比例(Mergny与Lacroix,2003年，Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态的吉布斯自由能ΔG°更精确地表示结合亲和力，并且通过ΔG°＝-RTln(Kd)与反应的解离常数(Kd)相关，其中R为气体常数，T为绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间的反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸与靶核酸之间的强杂交。ΔG°是与水浓度为1M、pH为7、温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸的杂交是自发反应，而自发反应的ΔG°小于零。ΔG°可经由实验来测量，例如，利用如Hansen等人，1965,Chem.Comm.36–38和Holdgate等人，2005,Drug Discov Today中所述的等温滴定量热法(ITC)方法测量。技术人员将知道商用设备可用于ΔG°测量。ΔG°还可以使用SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388–5405描述的推导的热力学参数在数值上进行估计。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以低于-10kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。在一些实施例中，杂交的程度或强度通过标准状态吉布斯自由能ΔG°测量。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸以-10至-60kcal，诸如-12至-40、诸如-15至-30kcal或-16至-27kcal诸如-18至-25kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。
靶核酸
根据本发明，靶核酸是编码乙型肝炎病毒的核酸，并且可以例如是基因、RNA、mRNA、病毒mRNA或cDNA序列。靶核酸由SEQ ID NO:1及其天然存在的变体表示。
对于体内或体外应用，本发明的寡核苷酸通常能够抑制表达HBV靶核酸的细胞中HBV靶核酸的表达。本发明的寡核苷酸的核碱基的连续序列通常与HBV靶核酸互补，如在整个寡核苷酸的长度上测量的，任选地，除了一个或两个错配以外，并且任选地排除可以将寡核苷酸与任选的官能团连接的基于核苷酸的接头，诸如缀合物或其他非互补的末端核苷酸(例如区域D’或D”)。
靶序列
本文所用的术语“靶序列”意指存在于靶核酸中的核苷酸的序列，其包含与本发明的寡核苷酸为互补的核碱基序列。在一些实施例中，靶序列由靶核酸上具有与本发明寡核苷酸的连续核苷酸序列互补的核碱基序列的区域组成。靶核酸的这一区域可以互换地称为靶标核苷酸序列、靶序列或靶标区域。在一些实施例中，所述靶序列比单一寡核苷酸的互补序列更长，并且可以例如代表所述靶核酸的被本发明的若干寡核苷酸所靶向的优选区域。
本文描述的是由来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28的位置1530至1602的序列表示的治疗性寡核苷酸的HBV mRNA靶区域。这个靶区域可以被分割成更小的靶序列并选自SEQID NO:1的位置1530至1602；1530至1598；1530-1543；1530-1544；1531-1543；1551-1565；1551-1566；1577-1589；1577-1591；1577-1592；1578-1590；1578-1592；1583-1598；1584-1598；1585-1598或1583-1602。
在某一实施例中，本发明的治疗性寡核苷酸包含与来自SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:28的位置1530至1602的靶序列互补或杂交的连续核苷酸序列。特别是选自1530-1544；1531-1543；1585-1598和1583-1602的靶序列。
与反义寡核苷酸互补或杂交的靶序列通常包含至少10个核苷酸的连续核碱基序列。靶区域的连续核苷酸序列的长度介于10至50个核苷酸，诸如12至30个、诸如14至20个、诸如15至18个连续核苷酸。
靶细胞
本文所用的术语“靶细胞”是指正在表达靶核酸的细胞。在一些实施例中，靶细胞可以是体内或体外的。在一些实施例中，靶细胞是HBV感染的哺乳动物细胞，例如啮齿动物细胞，例如小鼠细胞或人细胞，特别是HBV感染的肝细胞。
在优选的实施例中，靶细胞表达HBV mRNA并分泌HBsAg和HBeAg。
肝细胞
如本文所用，术语“肝细胞”或“多个肝细胞”是指肝脏实质组织的细胞。这些细胞约占肝脏质量的70-85％，并产生血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血因子的凝血酶原组(因子3和4除外)。肝细胞谱系细胞的标记物可以包括但不限于：甲状腺素运载蛋白(Ttr)、谷氨酰胺合成酶(Glul)、肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标记物可包括但不限于：细胞色素P450(Cyp3a11)、延胡索乙酰乙酸水解酶(Fah)、葡萄糖6-磷酸(G6p)、白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等人，(2013),Nature,494(7436):247-250，其与肝细胞标记物有关的内容通过引用并入本文。
降低的表达
如本文所用，术语基因的“降低的表达”是指相比于适当的参考细胞或受试者，由基因编码的RNA转录物或蛋白质的量减少和/或细胞或受试者中基因的活性量减少。例如，用药物组合或双链寡核苷酸(例如，具有与HBsAg mRNA序列互补的反义链的寡核苷酸)处理细胞的行为可能导致RNA转录物、蛋白质和/或酶活性(例如，由HBV基因组的S基因编码的)的量与未分别用药物组合或双链寡核苷酸处理的细胞相比降低。类似地，如本文所用，“降低表达”是指导致基因(例如，HBV基因组的S基因)表达降低的行为。
自然产生变体
术语“其天然存在的变体”是指靶核酸的变体，其天然存在于定义的分类群内，例如HBV基因型A-H。通常，当提及多核苷酸的“天然存在的变体”时，该术语还可以涵盖通过染色体易位或复制发现的编码基因组DNA的靶序列的任何等位基因变体，以及RNA，例如衍生自其的mRNA。“天然存在的变体”还可以包括衍生自靶序列mRNA的可变剪接的变体。当提及例如特异性多肽序列，该术语还包括可以因此被加工的蛋白质的天然存在形式，该加工例如是通过共翻译或翻译后修饰，例如信号肽裂解、蛋白水解裂解、糖基化等。
高亲和力修饰的核苷
高亲和力修饰的核苷是修饰的核苷酸，其在掺入到寡核苷酸中时，增强了寡核苷酸对其互补靶标的亲和力，例如如通过解链温度(Tm)测量的。本发明的高亲和力修饰的核苷优选地使每一个修饰的核苷的解链温度增加介于+0.5℃至+12℃之间，更优选地介于+1.5℃至+10℃之间并且最优选地介于+3℃至+8℃之间。许多高亲和力修饰的核苷是本领域已知的，并且包括例如许多2’取代的核苷以及锁核酸(LNA)(参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213)。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
这样的修饰包括其中核糖环结构被修饰的那些修饰，例如，通过用己糖环(HNA)或双环替换核糖环结构来实现，其通常在核糖环(LNA)的C2和C4碳原子之间具有双基桥，或通常在C2和C3之间缺乏键的未连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括，例如，双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO2013/154798)。经修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。
2'糖修饰的核苷
2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)或包含能够在2'碳与核糖环中的第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2'糖取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷掺入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷的实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。有关进一步的实例，请参见例如Freier&Altmann；Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443和Uhlmann；Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012,19,937。下面是一些2'取代的修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0003695063620000251
关于本发明，2'取代的糖修饰的核苷不包括像LNA那样的2'桥连的核苷。
锁定的核酸核苷(LNA核苷)
“LNA核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包含连接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647,WO2008/150729、Morita等人，Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76、Seth等人J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人，Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238和Wan和Seth，J.Medical Chemistry 2016,59,9645-9667中。
其他非限制性的示例性LNA核苷公开于方案1中。
方案1：
Figure BDA0003695063620000271
特定的LNA核苷是β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA(ScET)和ENA。一种特别有利的LNA是β-D-氧基-LNA。
磷酸酯类似物
如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施例中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5'末端核苷酸处，以代替通常易于被酶去除的5'-磷酸酯。在一些实施例中，5'磷酸酯类似物含有磷酸酶抗性键。磷酸酯类似物的示例包括5’膦酸酯，例如5'亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施例中，寡核苷酸在5'-末端核苷酸的糖的4'-碳位置具有磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。4'-磷酸酯类似物的示例是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基基团的氧原子与糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物结合。参见，例如，2016年9月2日提交的美国临时申请号62/383,207和2016年9月12日提交的美国临时申请号62/393,401，其中每一个与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文。已经针对寡核苷酸的5'端开发了其他修饰(参见，例如，WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；和Prakash等人(2015),NucleicAcids Res.,43(6):2993-3011，其中每一个与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。
核酸酶介导的降解
核酸酶介导的降解意指一寡核苷酸能够在与互补核苷酸序列形成双链体时，居中影响所述序列的降解。
在一些实施例中，反义寡核苷酸可经由靶核酸的核酸酶介导的降解而发挥作用，其中，本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选地核糖核酸内切酶(RNA酶)，诸如RNA酶H。经由核酸酶介导的机制而运作的寡核苷酸设计的示例是这样的寡核苷酸，其通常包含长度为至少5或6个连续DNA核苷的区域并且在一侧或两侧上侧接有亲和力增强核苷，例如缺口聚物、头聚物及尾聚物。
核糖核酸酶H活性和募集
在一个实施例中，治疗性寡核苷酸是能够募集RNA酶H的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的RNA酶H活性是指其在与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定RNA酶H活性的体外方法，该方法可用于确定募集RNA酶H的能力。如果在向寡核苷酸提供互补靶核酸序列时具有以下初始速率(以pmol/l/min计)，则一般认为其能够募集RNA酶H，该初始速率是使用WO01/23613(通过引用在此并入)的实例91至95提供的方法学，使用具有与所测试的经修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但在寡核苷酸中的所有单体之间仅包含具有硫代磷酸酯键的DNA单体的寡核苷酸确定的初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％。为了用于确定RNA酶H活性，可从Lubio Science GmbH,Lucerne,Switzerland获得重组人RNA酶H1。
缺口聚物
在本发明的治疗性寡核苷酸是反义寡核苷酸的一些实施例中，本发明的核酸分子或其连续核苷酸序列是缺口聚物反义寡核苷酸。反义缺口聚物一般用于通过核糖核酸酶H介导的降解来抑制靶核酸。在本发明的某一实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够募集RNA酶H。
缺口聚物反义寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，即5'-侧翼、缺口和3'-侧翼，在‘5->3'方向为F-G-F'。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5'侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3'侧翼区域(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2'糖修饰、诸如独立地选自LNA和2'-MOE。
在缺口聚物设计中，缺口区域的5'和3'最末端核苷是DNA核苷，分别位于5'(F)或3'(F')区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的端，即在5’侧翼的5’端和3’侧翼的3’端，具有至少一个糖修饰的核苷。
区域F-G-F'形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F'的缺口聚物区域。
缺口聚物设计F-G-F'的总长度可以是例如12至30个核苷，诸如13至24个核苷，诸如14至22个核苷，诸如13至17个核苷，诸如14至16个核苷。
举例来说，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以由下式表示：
F1-6-G6-16-F'1-6，诸如
F1-4-G7-10-F'2-4
前提条件是缺口聚物区域F-G-F'的总长度至少为12个，诸如至少13个核苷酸。
在本发明的方面，反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列由式5'-F-G-F'-3'的缺口聚物组成或包含式5'-F-G-F'-3'的缺口聚物，其中区域F和F'独立地包含1-8个核苷或由1-8个核苷组成，其中1-4个经2'糖修饰且限定F和F'区域的5’和3'端，并且G为能够募集RNA酶H的介于6个与16个核苷之间的区域。
在本发明的一个实施例中，连续核苷酸序列是式5'-F-G-F'-3'的缺口聚物，其中区域F和F'独立地由2-4个经2'糖修饰的核苷酸组成且限定F和F'区域的5'和3'端，并且G为能够募集RNA酶H的介于6个与10个DNA核苷之间的区域。
在一些实施例中，缺口区G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个邻接的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施例中，缺口区域G由7至10个DNA核苷组成。在一些实施例中，缺口中的所有核苷间键是硫代磷酸酯键。
在一些实施例中，区域F和F′独立地由糖修饰的核苷的邻接序列组成或包含糖修饰的核苷的邻接序列。在一些实施例中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。
在一些实施例中，区域F或F′或者F和F′的所有核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施例中，区域F由1-5个，诸如2-4个、诸如3-4个、诸如1个、2个、3个、4个或5个邻接LNA核苷组成。在一些实施例中，区域F和F′的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施例中，区域F或F'或者F和F'的所有核苷都是2'取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷。在一些实施例中，区域F由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个邻接OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，仅一个侧翼区域可以由2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，5'(F)侧翼区域由2'取代的核苷诸如OMe或MOE核苷组成，而3'(F')侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施例中，3'(F')侧翼区域由2'取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成，而5'(F)侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
其他缺口聚物设计公开于WO2004/046160、WO2007/146511和WO2008/113832中，其据此通过引用在此并入。
LNA缺口聚物
LNA缺口聚物是其中区域F和F'中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚物。β-D-氧基缺口聚物是其中区域F和F'中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚物。
在一些实施例中，LNA缺口聚物具有下式：[LNA]1–5-[区域G]6-10-[LNA]1-5，其中区域G具有如在缺口聚物区域G定义中的定义。
MOE缺口聚物
MOE缺口聚物是其中区域F和F′由MOE核苷组成的缺口聚物。在一些实施例中，MOE缺口聚物的设计为[MOE]1-8-[区域G]5-16-[MOE]1-8，诸如[MOE]2-7-[区域G]6-14-[MOE]2-7，诸如[MOE]3-6-[区域G]8-12-[MOE]3-6，其中区域G具有如缺口聚体定义中的定义。具有5-10-5设计的MOE缺口聚物(MOE-DNA-MOE)已在本领域中广泛使用。
混合型翼缺口聚物
混合型翼缺口聚体是一种LNA缺口聚体，其中区域F及F'中的一者或两者都包含2'取代的核苷，诸如独立选自以2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元及2'-氟-ANA单元组成的组的2'取代核苷，诸如MOE核苷。在其中区域F和F'中的至少一者或区域F和F'两者都包含至少一个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在其中区域F和F'中的至少一者或区域F和F'两者都包含至少两个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。
混合型翼缺口聚物设计已公开于WO2008/049085及WO2012/109395，该两者在此以引用方式并入。
寡核苷酸中的区域D'或D”
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以包含以下项或由其组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的邻接核苷酸序列，诸如缺口聚物F-G-F′，以及另外的5′和/或3′核苷。另外的5'和/或3'核苷可以与靶核酸完全互补或可以不与靶核酸完全互补。这种另外的5'和/或3'核苷在本文中可以称为区域D'和D”。
出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚物)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D'或D”。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。替代地，其可以用于提供核酸外切酶保护或使合成或制备变得容易。
可以将区域D'和D”分别连接到区域F的5'端或区域F'的3'端，以生成下式D'-F-G-F'、F-G-F'-D”或D'-F-G-F'-D”的设计。在这种情况下，F-G-F'是寡核苷酸的缺口聚物部分，而区域D'或D”构成寡核苷酸的单独部分。区域D'和F区域之间以及区域F'和D”区域之间的过渡的特征在于具有朝向D'或D”区域的磷酸二酯键和朝向F或F'区域的硫代磷酸酯键的核苷，并且该核苷被认为是缺口聚物的一部分(与靶核酸互补的连续核苷酸序列)。
区域D'或D”可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F′区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D'或D”区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5'和/或3'端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。WO2014/076195中公开了适合用作区域D’或D”的基于核苷酸的可生物裂解的接头，其包括例如磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。在一些实施例中，区域D'或D”与靶核酸不互补或包含至少50％的错配。
在一些实施例中，区域D'或D”包含序列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC或GG的二核苷酸，或由该二核苷酸的组成，其中C可以是5-甲基胞嘧啶，并且/或者T可以被U替换。二核苷酸中的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，区域D'或D”包含序列AAA、AAT、AAC、AAG、ATA、ATT、ATC、ATG、ACA、ACT、ACC、ACG、AGA、AGT、AGC、AGG、TAA、TAT、TAC、TAG、TTA、TTT、TTC、TAG、TCA、TCT、TCC、TCG、TGA、TGT、TGC、TGG、CAA、CAT、CAC、CAG、CTA、CTG、CTC、CTT、CCA、CCT、CCC、CCG、CGA、CGT、CGC、CGG、GAA、GAT、GAC、CAG、GTA、GTT、GTC、GTG、GCA、GCT、GCC、GCG、GGA、GGT、GGC和GGG的三核苷酸，或由该三核苷酸的组成，其中C可以是5-甲基胞嘧啶并且/或者T可以被U替换。核苷间键是磷酸二酯键。将认识到，当提及(天然存在的)核碱基A(腺嘌呤、T(胸腺嘧啶)、U(尿嘧啶)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)时，这些可被替换为具有同等天然核碱基的功能(例如与互补核苷的碱基对)的核碱基类似物。
在一个实施例中，本发明的反义寡核苷酸除构成缺口聚物的连续核苷酸序列外还包含区域D'和/或D”。
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸可由下式表示：
D'-F-G-F'，特别是D'1-3-F1-4-G6-10-F'2-4
F-G-F'-D”，特别是F1-4-G6-10-F'2-4-D”1-3
D'-F-G-F'-D”，特别是D'1-3-F1-4-G6-10-F'2-4-D”1-3
在一些实施例中，位于区域D'和区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F'和区域D'之间的核苷间键是磷酸二酯键。
缀合物
如本文所用，术语缀合物是指非核苷酸部分(缀合物)，例如GalNAc簇，其可以共价连接至治疗性寡核苷酸。术语缀合物和簇或缀合物部分可以互换使用。在一些情况下，缀合的治疗性寡核苷酸也可以称为寡核苷酸缀合物。在某一实施例中，缀合物是靶向配体。
靶向配体
如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性结合感兴趣的组织或细胞的同源分子(例如，受体)的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)，并且其可与另一种物质缀合以将另一种物质靶向至感兴趣的组织或细胞。例如，在一些实施例中，可以将靶向配体缀合至寡核苷酸，以将寡核苷酸靶向至感兴趣的特异性组织或细胞。在一些实施例中，靶向配体选择性地结合至细胞表面受体。因此，在一些实施例中，当与寡核苷酸缀合时，靶向配体通过与细胞表面上表达的受体的选择性结合以及细胞对包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物的内体内化来促进寡核苷酸递送到特定细胞中。在一些实施例中，靶向配体经由接头与寡核苷酸缀合，该接头在细胞内化之后或期间被裂解，使得寡核苷酸从细胞中的靶向配体释放。
寡核苷酸接头
键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物基团可直接或通过连接部分(例如接头或系链)附着到寡核苷酸。接头用于将缀合物基团共价连接至与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列。
在本发明的一些实施例中，治疗性寡核苷酸可任选地包含接头区，该接头区位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列与缀合物之间。
此类接头可以是包含生理上不稳定的键或由生理上不稳定的键组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或在与之相似的条件下可裂解。在一个实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。
对于置于缀合物与治疗性寡核苷酸之间的可生物裂解的接头，优选地，在靶组织(例如肌肉、肝脏、肾脏或肿瘤)中看到的裂解率大于在血清中发现的裂解率。在“材料和方法”部分中描述了用于确定靶组织相对于血清中的裂解水平(％)或通过S1核酸酶的裂解的合适方法。在一些实施例中，当与标准比较时，可生物裂解的接头至少约20％裂解、例如至少约30％裂解、例如至少约40％裂解、例如至少约50％裂解、例如至少约60％裂解、例如至少约70％裂解、例如至少约75％裂解。
在一个优选的实施例中，对核酸酶敏感的接头包含介于1个至10个核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷，更优选地包含介于2个至6个核苷，并且最优选地包含介于2个至4个联接的核苷，该核苷包含至少两个连续的磷酸二酯键，诸如至少3个或4个或5个连续的磷酸二酯键。优选地，核苷是DNA或RNA。包含可生物裂解的接头(PO接头)的磷酸二酯在WO 2014/076195(通过引用在此并入)中更详细描述。
不一定是可生物裂解的但主要用于将缀合物共价连接到寡核苷酸的额外或替代的接头也可以单独使用或与PO接头组合使用。不可裂解的接头可以包含重复单元诸如乙二醇、氨基酸单元或氨基烷基基团的链结构或寡聚物。在一些实施例中，不可裂解的接头是氨基烷基，诸如C2-C36氨基烷基基团，包括例如C6至C12氨基烷基基团。在优选的实施例中，接头是C6氨基烷基基团。
乙型肝炎病毒
如本文所用，“乙型肝炎病毒”或“HBV”是指嗜肝DNA病毒科的成员，其具有约3,200个碱基对的小双链DNA基因组和对肝细胞的嗜性。“HBV”包括感染多种哺乳动物(例如人类、非人类灵长类动物等)和禽类(鸭等)宿主中的任何一种的乙型肝炎病毒。“HBV”包括任何已知的HBV基因型，例如血清型A、B、C、D、E、F和G；任何HBV血清型或HBV亚型；任何HBV分离株；HBV变体，例如HBeAg阴性变体、耐药性HBV变体(例如，拉米夫定耐药性变体；阿德福韦耐药性突变体；替诺福韦耐药性突变体；恩替卡韦耐药性突变体等)；等等。
“HBV”是属于嗜肝DNA病毒科的一种小型DNA病毒，并且属于正肝炎病毒属的模式种。HBV病毒颗粒(病毒粒子)包含外部脂质包膜和由蛋白质组成的二十面体核衣壳核心。核衣壳通常包围病毒DNA和具有类似于逆转录病毒的逆转录酶活性的DNA聚合酶。HBV外包膜包含嵌入的蛋白质，这些蛋白质参与病毒结合和进入易感细胞。攻击肝脏的HBV已基于序列根据至少十种基因型(A-J)进行分类。一般来说，基因组编码四个基因，这些基因分别称为C、P、S和X。核心蛋白质由基因C(HBcAg)编码，并且其起始密码子前面有一个上游的框内AUG起始密码子，从该框内AUG起始密码子产生前核心蛋白质。HBeAg是通过前核心蛋白质的蛋白水解加工产生的。DNA聚合酶由基因P编码。基因S编码表面抗原(HBsAg)。HBsAg基因是一个长的开放阅读框，但包含三个框内“起始”(ATG)密码子，这些密码子将基因分为三个部分，pre-S1、pre-S2和S。由于有多个起始密码子，产生了三种不同大小的多肽，称为大、中和小(pre-S1+pre-S2+S、pre-S2+S、或S)。它们的比例可能为1:1:4(Heermann等人，1984)。
乙型肝炎病毒(HBV)蛋白质可分为几个类别和功能。聚合酶作为逆转录酶(RT)从前基因组RNA(pgRNA)制备病毒DNA，也作为DNA依赖性聚合酶从病毒DNA制备共价闭合的环状DNA(cccDNA)。它们共价附着到负链的5'端。核心蛋白质制造病毒衣壳和分泌的E抗原。表面抗原是肝细胞内化配体，也是病毒球形和丝状颗粒的主要组分。病毒颗粒的产生是Dane颗粒(传染性病毒粒子)的1000倍以上，并且可能充当免疫诱饵。
乙型肝炎病毒表面抗原
如本文所用，术语“乙型肝炎病毒表面抗原”或“HBsAg”是指由HBV基因组的基因S(例如，ORF S)编码的S-域蛋白。乙型肝炎病毒颗粒在由基因S编码的三种蛋白质(即大表面蛋白、中表面蛋白和主要表面蛋白)所包裹的核心颗粒中携带病毒核酸。在这些蛋白质中，主要的表面蛋白质通常为约226个氨基酸，仅包含S域。
感染
如本文所用，术语“感染”是指微生物例如病毒在受试者中的病原性侵入和/或扩增。感染可能是溶源性的，例如病毒DNA在细胞内处于休眠状态。替代地，感染可以是溶解性的，例如，其中病毒积极增殖并导致受感染细胞的破坏。感染可能会或可能不会引起临床上明显的症状。感染可能保持在局部，也可能扩散，例如，通过受试者的血液或淋巴系统。患有例如HBV感染的个体可以通过检测病毒载量、表面抗原(HBsAg)、e-抗原(HBeAg)和本领域已知的用于检测HBV感染的各种其他测定法中的一种或多种来鉴定。用于检测HBV感染的测定法可以涉及检测血清或血液样品中是否存在HBsAg和/或HBeAg，以及任选地进一步筛选是否存在一种或多种病毒抗体(例如，IgM和/或IgG)以作为HBV抗原可能处于检测不到的水平的任何时期的补充。
HBV感染
术语“乙型肝炎病毒感染”或“HBV感染”在本领域中是公知的，是指由乙型肝炎病毒(HBV)引起并影响肝脏的传染病。HBV感染可以是急性或慢性感染。一些感染者在最初感染期间没有任何症状，而一些感染者会迅速出现呕吐、皮肤发黄、疲倦、尿色深和腹痛等症状(“Hepatitis B Fact sheet N°204”.who.int.July 2014.2014年11月4日检索)。这些症状通常会持续数周并可能导致死亡。症状开始出现可能需要30到180天。在出生时感染的人中，90％会发展为慢性乙型肝炎感染，而在5岁后感染的人中只有不到10％会发展为慢性乙型肝炎感染(“Hepatitis B FAQs for the Public-Transmission”,U.S.Centers forDisease Control and Prevention(CDC)，2011-11-29检索)。大多数慢性病患者没有症状；然而，最终可能会发展出肝硬化和肝癌(Chang,2007,Semin Fetal Neonatal Med,12:160-167)。这些并发症导致15％至25％的患有慢性疾病的那些人死亡(“Hepatitis B Factsheet N°204”.who.int.July 2014，2014年11月4日检索)。在此，术语“HBV感染”包括急性和慢性乙型肝炎感染。术语“HBV感染”还包括初始感染的渐进阶段、症状阶段以及HBV感染的渐进慢性阶段。
肝脏炎症
如本文所用，术语“肝脏炎症”或“肝炎”是指其中肝脏变得肿胀、功能失调和/或疼痛的身体状况，尤其是由于损伤或感染，这可能是由于暴露于肝毒剂。症状可能包括黄疸(皮肤或眼睛发黄)、疲劳、虚弱、恶心、呕吐、食欲下降和体重减轻。如果不及时治疗，肝脏炎症可能会发展为纤维化、肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。
肝纤维化
如本文所用，术语“肝纤维化”或“肝脏纤维化”是指细胞外基质蛋白在肝脏中的过度积累，其可包括胶原蛋白(I、III和IV)、纤连蛋白、粗纤维调节素、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸和由炎症和肝细胞死亡导致的蛋白多糖。如果不及时治疗，肝纤维化可能会发展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌。
TLR7
如本文所用，“TLR7”是指任何来源物种(例如，人、鼠、土拨鼠等)的Toll样受体7。
TLR7激动剂
如本文所用，“TLR7激动剂”是指充当TLR7激动剂的化合物。除非另有说明，TLR7激动剂可以包括任何药学上可接受的形式的化合物，包括任何异构体(例如，非对映体或对映体)、盐、溶剂化物、多晶型物等。可以以任何合适的方式确定特定化合物的TLR激动作用。例如，用于检测测试化合物的TLR激动作用的测定法在例如于2002年12月11日提交的美国临时专利申请序列号60/432,650中有述，并且适用于此类测定法的重组细胞系在例如于2002年12月11日提交的美国临时专利申请序列号60/432,651中有述。用于评估TLR7激动剂的另一种测定法是在WO2016/091698的实例43中描述的HEK293-Blue-hTLR-7细胞测定法(该测定法通过引用在此并入)。
非对映体
如本文所用，术语“非对映体”是指具有两个或更多个手性中心并且其分子并非彼此镜像的立体异构体。非对映体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、光谱特性、活性和反应性。
含有一个或若干个手性中心的通式(I)-(V)化合物可作为外消旋体、非对映体混合物或光学活性单一异构体存在。可以根据已知方法将外消旋体分离成对映体。特别地，可通过结晶分离的非对映体盐是通过与光学活性酸诸如D-酒石酸或L-酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸或樟脑磺酸反应从外消旋混合物中形成的。
药用盐
根据本发明的化合物可以以其药用盐的形式存在。
术语“药用盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性的盐，其并非在生物学上或其它方面所不希望的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸形成。
替代地，可通过无机碱或有机碱与游离酸的加成制备这些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于与下述有机碱形成的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然出现的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。式(I)化合物也可以两性离子的形式存在。式(I)的化合物的特别优选的药用盐为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和甲磺酸的盐。
为了获得改善的化合物的物理和化学稳定性、吸湿性、流动性和溶解性而将药物化合物化学修饰成盐是药物化学家众所周知的技术。例如，Bastin在《有机工艺研究与发展》(Organic Process Research&Development)2000年第4期，第427-435页或Ansel在以下文章中对此进行了描述：《药物剂型和药物递送系统(第六版)》(Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,6th ed.(1995))第196和1456-1457页。例如，本文提供的化合物的药用盐可以是钠盐。
药物组合
如本文所用，药物组合被理解为用于治疗疾病的至少两种不同的活性化合物或前药(医药化合物或药物)的组合。药物组合可以涉及物理、化学或以其他方式组合(例如，在同一小瓶中)的化合物；包装在一起的化合物(例如，作为同一包装(多部件试剂盒)中的两个单独的物体，用于同时施用或单独施用)；或单独提供但意在一起使用的化合物(例如，该组合在化合物标签或包装插页上明确说明)。在一个实施例中，药物组合由配制用于口服施用的药物化合物和配制用于皮下注射的药物化合物组成。
大约
如本文所用，如应用于一个或多个目标值的术语“大约”或“约”是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指在所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或以下范围内的值的范围，除非另有说明或从上下文可以明显看出(除非该数字超过可能值的100％)。
施用
如本文所用，术语“施用”或“施用”意指以药理学有用的方式(例如，治疗受试者的病症)向受试者提供物质(例如，药物组合或寡核苷酸)。
脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)
如本文所用，术语“脱唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由48kDa主要亚基(ASGPR-1)和40kDa次要亚基(ASGPR-2)形成的二分C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的血窦表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基(脱唾液酸糖蛋白)的循环糖蛋白的结合、内化和随后的清除中起主要作用。
前药
如本文所用，术语“前药”是指化合物的形式或衍生物，其在体内代谢(例如，在施用后由受试者通过生物流体或酶代谢)成化合物的药理学活性形式，以便产生所需的药理作用。前药于例如Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action by RichardB.Silverman,Academic Press,San Diego,2004,Chapter 8Prodrugs and Drug DeliverySystems,pp.497-558中有述。
受试者
如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施例中，受试者为人类或非人类灵长动物。术语“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
治疗
如本文所用，术语“治疗”、“治疗”、“治疗”等通常是指获得所需的药理学和/或生理学效果。就部分或完全治愈疾病和/或归因于该疾病的副作用而言，该效果是治疗性的。通过向受试者施用治疗剂(例如，药物组合或寡核苷酸)来提供效果，以针对现有病症(例如，现有HBV感染)改善受试者的健康和/或幸福感，或预防病症或降低疾症发生的可能性(例如，预防肝纤维化、肝炎、肝癌或其他与HBV感染相关的病症)。如本文所用，术语“治疗”涵盖对受试者HBV感染的任何治疗，包括：(a)抑制疾病，即阻止其发展，如抑制HBsAg和/或HBeAg的增加；或(b)改善(即缓解)疾病，即导致疾病消退，如抑制HBsAg和/或HBeAg产生。因此，改善和/或抑制HBV感染的化合物或化合物组合是本发明的治疗HBV的化合物或化合物组合。优选地，如本文所用，术语“治疗”涉及已经表现出的疾患的医学干预，如已经定义和表现出的HBV感染，特别是慢性HBV感染的治疗。
在一些实施例中，治疗涉及降低受试者经历的病症(例如，HBV感染或相关病症)的至少一种体征、症状或促成因素的频率或严重性。在HBV感染期间，受试者可能表现出诸如皮肤和眼睛发黄(黄疸)、尿色深、极度疲劳、恶心、呕吐和腹痛等症状。因此，在一些实施例中，本文提供的治疗(例如药物组合)可导致一种或多种此类症状的频率或严重性降低。然而，HBV感染可发展成一种或多种肝脏疾病，例如肝硬化、肝纤维化、肝脏炎症或肝癌。因此，在一些实施例中，本文提供的治疗(例如药物组合)可导致一种或多种此类病症的频率或严重性降低，或预防或减弱一种或多种此类病症。
治疗有效量
术语“治疗有效量”是表示本发明的化合物药物组合的量，当将其施用于受试者时，(i)治疗或预防特定疾病、病症或疾患，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或疾患的一种或多种症状的发作。治疗有效量取决于化合物，所治疗的疾病状态，所治疗疾病的严重程度，受试者的年龄和相对健康状况，给药途径和形式，主治医学或兽医的判断和其他因素。
赋形剂
如本文所用，术语“赋形剂”是指可包含在一种或多种组合物中的非治疗剂，用于例如提供或有助于所需的稠度或稳定作用，该组合物包含作为药物组合的一部分的药物。
本发明涉及包含至少两种活性成分的药物组合，包括包含各自在药用载体中的i)治疗性寡核苷酸和ii)TLR7激动剂的组合。本发明的药物组合用于治疗乙型肝炎病毒感染，特别是治疗患有慢性HBV的患者。
下面将分别描述组合中的每一类化合物，然而应当理解，当药物组合包含治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂时，药物组合中存在来自每一类的至少一种化合物。通常，化合物可以同时或单独施用。靶向HBV的治疗性寡核苷酸的类别中的化合物可以肠胃外施用(例如静脉内、皮下或肌肉内)。TLR7激动剂可以肠内施用(例如口服或通过胃肠道)。
在药物组合的一个实施例中，靶向HBV的治疗性寡核苷酸是RNAi寡核苷酸，优选用于降低HBsAg mRNA表达的RNAi寡核苷酸。在另一个实施例中，靶向HBV的治疗性寡核苷酸是反义寡核苷酸，优选地，靶向HBV的GalNAc缀合的反义寡核苷酸。
1.本发明的RNAi寡核苷酸
在一些实施例中，本发明的药物组合中的第一药物是可用于实现治疗益处的针对HBV表面抗原表达的基于寡核苷酸的抑制剂。通过检查HBV表面抗原mRNA和测试不同的寡核苷酸，已开发出强效的寡核苷酸用于降低HBV表面抗原(HBsAg)的表达以治疗HBV感染。在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸被设计为靶向HBsAg mRNA序列，该序列覆盖所有已知基因型中>95％的已知HBV基因组。在一些实施例中，此类寡核苷酸导致肝脏中的HBV前基因组RNA(pgRNA)和HBsAg mRNA减少超过90％。在一些实施例中，HBsAg表达的降低在单个剂量或治疗方案后持续较长时间。
因此，在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸被设计成具有与HBsAg mRNA互补的区域，以用于靶向细胞中的转录物并抑制它们的表达。互补区域通常具有合适的长度和碱基含量，以使得寡核苷酸(或其链)能够与HBsAg mRNA退火而抑制HBsAg mRNA表达。在一些实施例中，互补区域的长度为至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个核苷酸。在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸具有与HBsAg mRNA互补的区域，该区域的长度在12至30(例如，12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至27、或15至30)个核苷酸的范围内。在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸具有与HBsAg mRNA互补的区域，该区域的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸被设计为靶向编码HBsAg的mRNA序列。例如，在一些实施例中，提供了具有反义链的寡核苷酸，该反义链具有与如下所示的序列互补的区域：ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:33)，该N是指任何核苷酸(A、G、T或C)。在一些实施例中，寡核苷酸进一步包含与反义链形成双链体区域的有义链。在一些实施例中，有义链具有与如下所示的序列互补的区域：UUNUUGUGAGGAUUN(SEQ ID NO:34)。在一些实施例中，有义链包含与如下所示的序列(以5′至3′示出)互补的区域：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQID NO:35)。
在一些实施例中，反义链包含如下所示的序列，或由其组成：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO:36)。在一些实施例中，反义链包含如下所示的序列，或由其组成：UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQ ID NO:37)。在一些实施例中，反义链包含如下所示的序列，或由其组成：UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)。在一些实施例中，有义链包含如下所示的序列，或由其组成：ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO:39)。在一些实施例中，有义链包含如下所示的序列，或由其组成：GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:40)。在一些实施例中，有义链包含如下所示的序列，或由其组成：GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)。在一些实施例中，有义链包含如下所示的序列，或由其组成：GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:42)。
在一些实施例中，用于降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中有义链包含如SEQ ID NO:39-42中任一项所示的序列，并且反义链包含如SEQ ID NO:36-38中任一项所示的序列。在一些实施例中，有义链包含2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，有义链与N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。在一些实施例中，反义链包含2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。在一些实施例中，反义链和有义链各自包含2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物，并且有义链与N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
在一些实施例中，包含如SEQ ID NO:40-42中任一项所示的序列的有义链在位置3、8-10、12、13和17处包含2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施例中，有义链在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处包含2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施例中，有义链包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，有义链在位置1和2处的核苷酸之间包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，有义链与N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
在一些实施例中，包含如SEQ ID NO:36-38中任一项所示的序列的反义链在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处包含2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施例中，反义链在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处包含2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施例中，反义链包含三个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，反义链包含在位置1和2处的核苷酸之间、在位置2和3处的核苷酸之间、在位置3和4的核苷酸之间、在位置20和21处的核苷酸之间以及在位置21和22处的核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
I.用于靶向HBsAg mRNA的双链寡核苷酸
有多种寡核苷酸结构可在本公开的药物组合中用于靶向HBsAg mRNA表达，包括RNAi、反义、miRNA等。本文或别处描述的任何该结构都可以用作框架以掺入或靶向本文所述的序列。用于靶向HBV抗原表达(例如，经由RNAi途径)的双链寡核苷酸通常具有彼此形成双链体的有义链和反义链。在一些实施例中，有义链和反义链不是共价连接的。然而，在一些实施例中，有义链和反义链是共价连接的。
在本发明的一些实施例中，用于降低HBsAg mRNA表达的双链寡核苷酸参与RNA干扰(RNAi)。例如，已开发出RNAi寡核苷酸，其每条链的大小为19-25个核苷酸，带有至少一个1至5个核苷酸的3'突出端(参见例如美国专利号8,372,968)。还开发了更长的寡核苷酸，其由Dicer加工以产生活性RNAi产物(参见例如美国专利号8,883,996)。进一步的工作产生了延伸的双链寡核苷酸，其中至少一条链的至少一端延伸超过双链体靶向区域，包括其中一条链包含热力学稳定的四环结构的结构(参见例如美国专利号8,513,207和8,927,705，以及WO2010033225，其关于这些寡核苷酸的公开内容通过引用并入本文)。此类结构可以包括单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸可被Dicer酶裂解。此类寡核苷酸可在有义链的3'端具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。此类寡核苷酸(例如，siRNA)可包含与靶RNA反义的21个核苷酸的指导链，和互补过客链，其中两条链退火形成19-bp双链体和在任一或两个3'端处的2个核苷酸的突出端。更长的寡核苷酸设计也可用，包括具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的过客链的寡核苷酸，其中分子的右侧有平端(过客链的3'-端/指导链的5'-端)并且分子的左侧有两个核苷酸的3'-指导链突出端(过客链的5'-端/指导链的3'-端)。在此类分子中，存在21个碱基对的双链体区域。参见例如US9012138、US9012621和US9193753，其每一个的相关公开内容都被并入本文。
在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸可包含长度均在17至26(例如，17至26、20至25、19至21或21-23)个核苷酸的范围内的有义链和反义链。在一些实施例中，有义链和反义链的长度相等。在一些实施例中，对于具有长度均在21-23个核苷酸的范围内的有义链和反义链的寡核苷酸，在有义链、反义链或有义链和反义链上的3'突出端的长度为1或2个核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的过客链，其中分子的右侧有平端(过客链的3'-端/指导链的5'-端)并且分子的左侧有两个核苷酸的3'-指导链突出端(过客链的5'-端/指导链的3'-端)。在此类分子中，存在21个碱基对的双链体区域。在一些实施例中，寡核苷酸包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当它们被dicer酶作用时产生掺入成熟RISC中的反义链。
用于本文公开的组合物和方法的其他寡核苷酸设计包括：16聚体siRNA(参见例如Nucleic Acids in Chemistry and Biology.Blackburn(ed.),Royal Society ofChemistry,2006)、shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见例如Moore等人MethodsMol.Biol.2010；629:141-158)、平端siRNA(例如，具有19bp长度；参见：例如，Kraynack和Baker,RNA Vol.12,p163-176(2006))、不对称siRN(aiRNA；参见例如Sun等人，Nat.Biotechnol.26,1379–1382(2008))、不对称短双链体siRNA(参见例如Chang等人，MolTher.2009Apr；17(4):725-32)、叉状siRNA(参见例如Hohjoh,FEBS Letters,Vol 557,issues 1-3；Jan 2004,p 193-198)、单链siRNA(Elsner；Nature Biotechnology 30,1063(2012))、哑铃形环状siRNA(参见例如Abe等人，J Am Chem Soc 129:15108-15109(2007))以及内部分段的小干扰RNA(sisiRNA；参见例如Bramsen等人，Nucleic AcidsRes.2007Sep；35(17):5886–5897)。前述参考文献中的每一个的相关公开都通过引用而整体并入本文。可在药物组合的一些实施例中用于降低或抑制HBsAg表达的寡核苷酸结构的其他非限制性示例是微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见例如Hamilton等人，Embo J.,2002,21(17):4671-4679；还参见美国申请号20090099115)。
a.反义链
在一些实施例中，寡核苷酸的反义链可以称为“指导链”。例如，如果反义链可以与RNA诱导的沉默复合物(RISC)联合并与Argonaut蛋白结合，或与一种或多种类似因子联合或结合,并且直接沉默靶基因，则可以将其称为指导链。在一些实施例中，与指导链互补的有义链可以称为“过客链”。
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包含长度为最多50个核苷酸(例如，长度为最多30、最多27、最多25、最多21或最多19个核苷酸)的反义链。在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸包含长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少19、至少21、至少25或至少27个核苷酸)的反义链。在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸的反义链的长度在12至50或12至30个(例如，12至30、11至27、11至25、15至21、15至27、17至21、17至25、19至27或19至30个)核苷酸的范围内。在一些实施例中，本文公开的任一寡核苷酸的反义链的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施例中，反义链包含与如下所示的序列(以5′至3′示出)互补的区域：AATCCTCACA(SEQ ID NO:43)。在一些实施例中，反义链包含如下所示的序列(以5′至3′示出)：UGUGAGGAUU(SEQ ID NO:44)。在一些实施例中，反义链包含如下所示的序列(以5′至3′示出)：TGTGAGGATT(SEQ ID NO:45)。
在一些实施例中，用于降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸可包含反义链，该反义链具有与如SEQ ID NO:43中所示的序列互补的区域，和在其3'末端处的一个或两个非互补核苷酸。在一些实施例中，反义链包含SEQ ID NO:36-38中任一个中所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，用于降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸可包含反义链，该反义链具有与SEQ ID NO:43中所示序列互补的区域，其中该反义链不具有如以下任一个中所示的序列(以5′至3′示出)：
TATTGTGAGGATTCTTGTCA(SEQ ID NO:46)；
CGGTATTGTGAGGATTCTTG(SEQ ID NO:47)；
TGTGAGGATTCTTGTCAACA(SEQ ID NO:48)；
UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAA(SEQ ID NO:49)；
UGCGGUAUUGUGAGGAUUCTT(SEQ ID NO:50)；
ACAGCATTGTGAGGATTCTTGTC(SEQ ID NO:51)；
UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAACA(SEQ ID NO:52)；
AUUGUGAGGAUUUUUGUCAACAA(SEQ ID NO:53)；和
UUGUGAGGAUUUUUGUCAACAAG(SEQ ID NO:54)。在一些实施例中，反义链与如SEQ IDNO:36、37或38中所示的核苷酸序列相差不超过三个核苷酸。
b.有义链
在一些实施例中，双链寡核苷酸可具有长度为最多40个核苷酸(例如，长度为最多40、最多35、最多30、最多27、最多25、最多21、最多19、最多17或最多12个核苷酸)的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸可具有长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12、至少15、至少19、至少21、至少25、至少27、至少30、至少35或至少38个核苷酸)的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸可具有长度在12至50(例如，12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40,25至40或32至40)个核苷酸的范围内的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如，28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)。在一些实施例中，寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如，26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施例中，有义链在其3'端包含茎环。在一些实施例中，有义链在其5'端包含茎环。在一些实施例中，包含茎环的链的长度在2至66个核苷酸的范围内(例如，长,2至66、10至52、14至40、2至30、4至26、8至22、12至18、10至22、14至26或14至30个核苷酸)。在一些实施例中，包含茎环的链的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，茎包含长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施例中，茎环为分子提供更好的抗降解保护(例如，酶促降解)并促进靶向特性以递送至靶细胞。例如，在一些实施例中，环提供添加的核苷酸，可以在其上进行修饰而基本上不影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施例中，本文提供了寡核苷酸，其中有义链包含(例如，在其3'-端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多10个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)的环。
在一些实施例中，茎环的环(L)是四环(例如，在有切口的四环结构内)。四环可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。通常，四环具有4到5个核苷酸。
c.双链体长度
在一些实施例中，有义链与反义链之间形成的双链体的长度为至少12(例如，至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20或至少21)个核苷酸。在一些实施例中，有义链与反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如，长度为12至30、12至27、12至22、15至25、18至30、18至22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施例中，有义链与反义链之间形成的双链体的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，有义链与反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施例中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链或反义链任一者的整个长度。在某些实施例中，有义链与反义链之间的双链体跨越有义链和反义链二者的整个长度。
d.寡核苷酸端部
在一些实施例中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得有义链或反义链任一者或有义链和反义链二者上都有3'-突出端。在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸具有一个5'端，其与另一个5'端相比在热力学上不太稳定。在一些实施例中，提供了不对称寡核苷酸，其包含在有义链3'端处的平端和在反义链3'端处的突出端。在一些实施例中，反义链上的3'突出端长度为1-8个核苷酸(例如,长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。
通常，用于RNAi的寡核苷酸在反义(指导)链的3'端有两个核苷酸的突出端。然而，其他突出端是可能的。在一些实施例中，突出端是包含长度为一到六个核苷酸的3'突出端，任选一到五、一到四、一到三、一到二、二到六、二到五、二到四、二到三、三到六、三到五、三到四、四到六、四到五、五到六个核苷酸，或一、二、三、四、五或六个核苷酸。然而，在一些实施例中，突出端是包含长度为一到六个核苷酸的5'突出端，任选一到五、一到四、一到三、一到二、二到六、二到五、二到四、二到三、三到六、三到五、三到四、四到六、四到五、五到六个核苷酸，或一、二、三、四、五或六个核苷酸。
在一些实施例中，有义链和/或反义链的3'端或5'端的一个或多个(例如，2、3、4个)末端核苷酸被修饰。例如，在一些实施例中，反义链3'端的一个或两个末端核苷酸被修饰。在一些实施例中，反义链的3'端的最后一个核苷酸被修饰，例如，包含2'-修饰，例如，2'-O-甲氧基乙基。在一些实施例中，反义链3'端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施例中，反义链3'端的最后一个或两个核苷酸与靶标不互补。
在一些实施例中，提供了双链寡核苷酸，其在有义链3'端处具有带切口的四环结构，并且在其反义链的3'端处具有两个末端突出核苷酸。在一些实施例中，两个末端突出核苷酸是GG。通常，反义链的两个末端GG核苷酸中的一个或两个与靶标互补或不互补。
在一些实施例中，有义或反义链的5'端和/或3'端具有倒置的帽核苷酸。
在一些实施例中，在有义链和/或反义链的3'端或5'端的末端核苷酸之间提供一个或多个(例如，2、3、4、5、6个)修饰的核苷酸间键。在一些实施例中，在有义链和/或反义链的3'端或5'端处的突出核苷酸之间提供修饰的核苷酸间键。
e.错配
在一些实施例中，寡核苷酸可以在有义链与反义链之间具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5个)错配。如果有义链与反义链之间存在超过一个错配，则它们可以连续定位(例如，2、3个或更多连续)，或散布在整个互补区域中。在一些实施例中，有义链的3'末端包含一个或多个错配。在一个实施例中，在有义链的3'末端处掺入两个错配。在一些实施例中，碱基错配或在寡核苷酸有义链的3'端处的区段的不稳定提高了RNAi中合成双链体的效力，这可能是通过促进Dicer处理。
在一些实施例中，反义链可以具有与HBsAg转录物互补的区域，该区域与相应的转录物序列相比包含一个或多个错配。寡核苷酸上的互补区域可以具有最多1、最多2、最多3、最多4、最多5个错配，等等，只要该寡核苷酸保持在适当的杂交条件下与转录物形成互补碱基对的能力。替代地，寡核苷酸的互补区域可以具有不超过1、不超过2、不超过3、不超过4或不超过5个错配，只要该寡核苷酸保持在适当的杂交条件下与HBsAg mRNA形成互补碱基对的能力。在一些实施例中，如果在互补区域中存在超过一个错配，则它们可以连续定位(例如，2、3、4个或更多个连续)，或散布在整个互补区域中，只要该寡核苷酸保持在适当的杂交条件下与HBsAg mRNA形成互补碱基对的能力。
II.单链寡核苷酸
在一些实施例中，如本文所述的用于降低HBsAg表达的RNAi寡核苷酸是与HBsAgmRNA具有互补性的单链寡核苷酸。这样的结构可以包括但不限于单链RNAi寡核苷酸。最近的工作已经证明了单链RNAi寡核苷酸的活性(参见例如Matsui等人(May 2016),MolecularTherapy,Vol.24(5),946-955)。
虽然这种单链RNAi寡核苷酸在技术上可以被认为是反义寡核苷酸，但它仍然可以通过RNA干扰机制发挥作用，并且将具有本文针对RNAi寡核苷酸所述的特征。
2.本发明的特异性RNAi寡核苷酸
为便于参考，并避免不必要的重复，本文所述的本发明的一些RNAi寡核苷酸的定义也称为以下的“RNAi ID NO”。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是靶向HBV的寡核苷酸。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:1。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是靶向HBsAg mRNA的寡核苷酸。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:2。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:3。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是包含长度为19至30个核苷酸的反义链的寡核苷酸，其中该反义链包含与如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:33)中所示的HBsAg mRNA序列互补的区域。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:4。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是用于降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含长度为19至30个核苷酸的反义链，其中该反义链包含与如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:33)中所示的HBsAg mRNA序列互补的区域。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:5。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
有义链由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGG CUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列组成并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的硫代磷酸酯键，其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNac部分缀合；并且
反义链由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列组成并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间、在位置2和3处的核苷酸之间、在位置3和4处的核苷酸之间、在位置20和21处的核苷酸之间和在位置21和22处的核苷酸之间的硫代磷酸酯键，
其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含甲氧基膦酸酯(MOP)。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:6。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是包含与反义链形成双链体区域的有义链的寡核苷酸，其中：
有义链包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAG GCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNac部分缀合，其中-GAAA-序列包含以下结构：
Figure BDA0003695063620000531
反义链包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在核苷酸1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22的之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure BDA0003695063620000532
该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:7。在一个实施例中，RNAi ID NO:7是用于降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸。在一个实施例中，RNAi ID NO:7的有义链或反义链或反义链和有义链二者由上文针对RNAi ID NO:7中的这些链所述的相应序列组成。在一个实施例中，在RNAi ID NO:7中，SEQ ID NO:41是5’-GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC-3’并且/或者SEQ ID NO:38是5’-UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG-3’。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸具有图29A中所示的结构。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:8。
在一个实施例中，本发明的药物组合中的RNAi寡核苷酸是寡核苷酸HBV(s)-219。该RNAi寡核苷酸在本文中也称为RNAi ID NO:9。
3.本发明的RNAi药剂的寡核苷酸修饰
本节中讨论的修饰特别优选用于在本发明的RNAi寡核苷酸中实施。
寡核苷酸可以以各种方式进行修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、核酸酶降解抗性、免疫原性、碱基配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其他特征。参见例如Bramsen等人,Nucleic Acids Res.,2009,37,2867-2881；Bramsen和Kjems(Frontiers in Genetics,3(2012):1-22)。因此，在一些实施例中，本公开的治疗性寡核苷酸可以包括一种或多种合适的修饰。在一些实施例中，修饰的核苷酸在其碱基(或核碱基)、糖(例如，核糖、脱氧核糖)或磷酸酯基团中具有修饰。
寡核苷酸上的修饰数量和这些核苷酸修饰的位置可能会影响寡核苷酸的性质。例如，寡核苷酸可通过将它们缀合至脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体或将它们包裹在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中而在体内递送。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载体保护时，对其至少一些核苷酸进行修饰可能是有利的。因此，在本文提供的任何治疗性寡核苷酸的某些实施例中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸都被修饰。在某些实施例中，超过一半的核苷酸被修饰。在某些实施例中，少于一半的核苷酸被修饰。通常，通过裸递送，每个糖都在2'-位处进行修饰。这些修改可能是可逆的或不可逆的。在一些实施例中，如本文所公开的寡核苷酸具有足以导致所需特性(例如，防止酶降解、在体内施用后靶向所需细胞的能力和/或热力学稳定性)的修饰核苷酸的数量和类型。
I.糖修饰
在一些实施例中，修饰的糖(在本文中也称为糖类似物)包括修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中一个或多个修饰发生在糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置。在一些实施例中，修饰的糖还可以包括非天然替代碳结构，例如存在于锁定的核酸(“LNA”)(参见例如Koshkin等人(1998),Tetrahedron 54,3607-3630)、未锁定的核苷酸(“UNA”)(参见例如Snead等人(2013),Molecular Therapy–Nucleic Acids,2,e103)和桥接核酸(“BNA”)(参见例如Imanishi and Obika(2002),The Royal Society of Chemistry,Chem.Commun.,1653-1659)中的那些。Koshkin等人、Snead等人以及Imanishi和Obika由于它们关于糖修饰的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，糖中的核苷酸修饰包括2'-修饰。2'-修饰可以是2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸。通常，修饰是2'-氟、2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。在一些实施例中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可以包括糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括将糖的2'-氧连接到糖的1'-碳或4'-碳，或者经由乙烯或亚甲基桥将2'-氧连接到1'-碳或4'-碳。在一些实施例中，修饰的核苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳键的无环糖。在一些实施例中，修饰的核苷酸具有硫醇基团，例如在糖的4'位置。
在一些实施例中，末端3'-端基团(例如，3'-羟基)是磷酸酯基团或其他基团，其可用于例如附着接头、衔接子或标记物或用于直接连接寡核苷酸与另一个核酸。
II.5'末端磷酸酯
在一些实施例中，寡核苷酸的5'-末端磷酸酯基团增强了与Argonaut 2的相互作用。然而，包含5'-磷酸酯基团的寡核苷酸可能易于通过磷酸酶或其他酶降解，这可能会限制它们在体内的生物利用度。在一些实施例中，寡核苷酸包括对这种降解具有抗性的5'磷酸酯类似物。在一些实施例中，磷酸酯类似物可以是氧基甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰膦酸酯。在某些实施例中，寡核苷酸链的5'端附着到模拟天然5'-磷酸酯基团的静电和空间特性的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见例如Prakash等人(2015),Nucleic AcidsRes.,Nucleic Acids Res.2015 Mar 31；43(6):2993–3011，其与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文)。已经开发了许多可以附着到5'端的磷酸酯模拟物(参见例如美国专利号8,927,513，其与磷酸酯类似物相关的内容通过引用并入本文)。已针对寡核苷酸的5'端开发了其他修饰(参见例如WO 2011/133871，其与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。在某些实施例中，羟基基团附着到寡核苷酸的5'端。
在一些实施例中，寡核苷酸在糖的4'-碳位置具有磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。参见例如于2016年9月2日提交的题为4′-Phosphate Analogs andOligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请号62/383,207和于2016年9月12日提交的题为4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请号62/393,401，其每一个与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文。在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸在5'-末端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物。在一些实施例中，磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯，其中氧基甲基基团的氧原子与糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物结合。在其他实施例中，4'-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基基团的硫原子或氨基甲基基团的氮原子与糖部分或其类似物的4'-碳结合。在某些实施例中，4'-磷酸酯类似物是氧基甲基膦酸酯。在一些实施例中，氧基甲基膦酸酯由式–O–CH2–PO(OH)2或–O–CH2–PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基基团、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3或保护基团。在某些实施例中，烷基基团是CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。
在某些实施例中，与寡核苷酸附着的磷酸酯类似物是甲氧基膦酸酯(MOP)。在某些实施例中，与寡核苷酸附着的磷酸酯类似物是5'单甲基保护的MOP。在一些实施例中，可以例如在指导(反义)链的第一个位置处使用以下包含磷酸酯类似物的尿苷核苷酸：
Figure BDA0003695063620000571
该修饰的核苷酸称为[甲基膦酸酯-4O-mU]或5'-甲氧基,膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷。
III.修饰的核苷间键
在一些实施例中，磷酸酯修饰或取代可产生包含至少一个(例如，至少1个、至少2个、至少3个或至少5个)修饰的核苷酸间键的寡核苷酸。在一些实施例中，本文公开的任何一种寡核苷酸包含1至10(例如，1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2)个修饰的核苷酸间键。在一些实施例中，本文公开的任何一种寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸间键。
修饰的核苷酸间键可以是硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代烷基膦酸酯键、硫代烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键或硼酸磷酸酯键。在一些实施例中，本文公开的任何一种寡核苷酸的至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
IV.碱基修饰
在一些实施例中，本文提供的寡核苷酸具有一个或多个修饰的核碱基。在一些实施例中，修饰的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)连接在核苷酸糖部分的1'位置。在某些实施例中，修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施例中，修饰的核碱基不包含氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。在一些实施例中，修饰的核苷酸包含通用碱基。然而，在某些实施例中，修饰的核苷酸不包含核碱基(无碱基的)。
在一些实施例中，通用碱基是位于修饰的核苷酸中核苷酸糖部分的1'位置的杂环部分，或核苷酸糖部分取代中的等效位置，当其存在于双链体中时，可以与超过一种类型的碱基相对放置而不会显著改变双链体的结构。在一些实施例中，相比于与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如，寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体具有比与互补核酸形成的双链体低的Tm。然而，在一些实施例中，相比于其中通用碱基已被碱基替换以产生单一错配的参考单链核酸，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，该双链体具有比与包含错配碱基的核酸形成的双链体更高的Tm。
通用结合核苷酸的非限制性示例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯(Quay等人的美国专利申请公开号20070254362；VanAerschot等人,An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside,Nucleic Acids Res.1995 Nov 11；23(21):4363-70；Loakes等人,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNAsequencing and PCR,Nucleic Acids Res.1995 Jul 11；23(13):2361-6；Loakes和Brown,5-Nitroindole as an universal base analogue,Nucleic Acids Res.1994 Oct 11；22(20):4039-43.前述每一项的与碱基修饰有关的公开内容均通过引用并入本文)。
V.可逆修饰
虽然可以进行某些修饰以在到达靶细胞之前保护寡核苷酸免受体内环境的影响，但一旦寡核苷酸到达靶细胞的胞质溶胶，这些修饰就会降低寡核苷酸的效力或活性。可以进行可逆修饰以使分子在细胞外保留所需的特性，然后在进入细胞的胞质环境时将其去除。例如，可以通过细胞内酶的作用或通过细胞内的化学条件(例如，通过细胞内谷胱甘肽的还原)去除可逆修饰。
在一些实施例中，可逆修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已经用环状二硫键部分进行了化学修饰，以掩盖由核苷酸间二磷酸键产生的负电荷并提高细胞摄取和核酸酶抗性。参见最初转让给Traversa Therapeutics,Inc.(“Traversa”)的美国公开申请号2011/0294869、Solstice Biologics,Ltd.(“Solstice”)的PCT公开号WO 2015/188197、Meade等人，Nature Biotechnology,2014,32:1256-1263(“Meade”)、Merck Sharp&Dohme Corp的PCT公开号WO 2014/088920，其中每一个关于这些修饰的公开内容通过引用并入本文。核苷酸间二磷酸键的这种可逆修饰被设计为在细胞内被胞质溶胶的还原性环境(例如谷胱甘肽)裂解。较早的示例包括中和性磷酸三酯修饰，据报道这些修饰在细胞内是可裂解的(Dellinger等人J.Am.Chem.Soc.2003,125:940-950)。
在一些实施例中，这种可逆修饰允许在寡核苷酸将会暴露于核酸酶和其他恶劣环境条件(例如，pH)的体内施用(例如，通过血液和/或细胞的溶酶体/内体区室的转运)期间提供保护。当释放到与细胞外空间相比谷胱甘肽水平更高的细胞胞质溶胶中时，修饰被逆转，并且结果是裂解的寡核苷酸。与使用不可逆化学修饰的选项相比，使用可逆的谷胱甘肽敏感部分，可以将空间上更大的化学基团引入感兴趣的寡核苷酸中。这是因为这些较大的化学基团将在胞质溶胶中被去除，因此不会干扰细胞胞质溶胶内寡核苷酸的生物活性。因此，可以对这些较大的化学基团进行工程化以赋予核苷酸或寡核苷酸各种优势，例如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施例中，可以对谷胱甘肽敏感部分的结构进行工程化以改变其释放动力学。
在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分附着到核苷酸的糖。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分附着到修饰的核苷酸的糖的2'-碳。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的5'-碳处，特别是当修饰的核苷酸是寡核苷酸的5'-末端核苷酸时。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的3'-碳处，特别是当修饰的核苷酸是寡核苷酸的3'-末端核苷酸时。在一些实施例中，谷胱甘肽敏感部分包含磺酰基基团。参见例如美国临时申请号62/378,635，其题为Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotides andUses Thereof，于2016年8月23日提交，其相关公开内容通过引用并入本文。
IV.靶向配体
在一些实施例中，可能需要将本公开的寡核苷酸靶向一种或多种细胞或一种或多种器官。这样的策略可以帮助避免对其他器官的不良影响，或者可以避免寡核苷酸过度损失于不会受益于寡核苷酸的细胞、组织或器官中。因此，在一些实施例中，本文公开的寡核苷酸可被修饰以促进特定组织、细胞或器官的靶向，例如以促进寡核苷酸向肝脏的递送。在某些实施例中，本文公开的寡核苷酸可以被修饰以促进寡核苷酸递送至肝脏的肝细胞。在一些实施例中，寡核苷酸包含与一种或多种靶向配体缀合的核苷酸。
靶向配体可以包括碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如，抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施例中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽、用于靶向肿瘤脉管系统或造口的CREKA肽、转铁蛋白、乳铁蛋白或用于靶向在CNS脉管系统上表达的转铁蛋白受体的适体，或用于靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施例中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的1个或更多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至单独的靶向配体。在一些实施例中，寡核苷酸的2至4个核苷酸各自缀合至单独的靶向配体。在一些实施例中，靶向配体在有义或反义链的任一端缀合至2至4个核苷酸(例如，配体缀合至有义链或反义链的5'或3'端的2至4个核苷酸突出端或延伸部)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5’或3'端处包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可单独缀合至靶向配体。
在一些实施例中，期望将降低HBV抗原表达的寡核苷酸靶向受试者肝脏的肝细胞。任何合适的肝细胞靶向部分都可以用于此目的。
GalNAc是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的一种高亲和力配体，该受体主要在肝细胞的血窦表面上表达，并且在含有末端半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺残基(脱唾液酸糖蛋白)的循环糖蛋白的结合、内化和随后的清除中起主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的(间接或直接)缀合可用于将这些寡核苷酸靶向在这些肝细胞上表达的ASGPR。
在一些实施例中，本公开的寡核苷酸直接或间接缀合至单价GalNAc。在一些实施例中，寡核苷酸直接或间接缀合至超过一个单价GalNAc(即，缀合至2、3或4个单价GalNAc部分，并且通常缀合至3或4个单价GalNAc部分)。在一些实施例中，本公开的寡核苷酸缀合至一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分。
在一些实施例中，寡核苷酸的1个或多个(例如，1、2、3、4、5或6个)核苷酸各自缀合至GalNAc部分。在一些实施例中，茎环的环(L)的2至4个核苷酸各自缀合至单独的GalNAc。在一些实施例中，靶向配体在有义或反义链的任一端缀合至2至4个核苷酸(例如，配体缀合至有义链或反义链的5'或3'端的2至4个核苷酸突出端或延伸部)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛并且寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5’或3'端处包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可单独缀合至GalNAc部分。在一些实施例中，GalNAc部分缀合至有义链的核苷酸。例如，四个GalNAc部分可以缀合至有义链的四环中的核苷酸，其中每个GalNAc部分缀合至一个核苷酸。
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包含附着至胍核苷酸的单价GalNAc，称为[ademG-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所示：
Figure BDA0003695063620000611
在一些实施例中，本文的寡核苷酸包含附着至腺嘌呤核苷酸的单价GalNAc，称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示。
Figure BDA0003695063620000612
下面针对环显示了此类缀合的示例，该环从5'到3'包含核苷酸序列GAAA(L＝接头，X＝杂原子)，显示了茎附着点。例如，此类环可能存在于图20所示分子的位置27-30。在化学式中，
Figure BDA0003695063620000623
是寡核苷酸链的附着点。
Figure BDA0003695063620000621
可以使用适当的方法或化学法(例如，点击化学法)将靶向配体连接到核苷酸。在一些实施例中，靶向配体使用点击接头缀合至核苷酸。在一些实施例中，基于缩醛的接头用于将靶向配体缀合至本文所述的任何一种寡核苷酸的核苷酸。例如，在2016年6月23日公开的国际专利申请公开号WO2016100401A1中公开了基于缩醛的接头，并且其与此类接头相关的内容通过引用并入本文。在一些实施例中，接头是不稳定的接头。然而，在其他实施例中，接头相当稳定。
下面显示了包含5'到3'核苷酸GAAA的环的示例，其中GalNAc部分使用缩醛接头附着到环的核苷酸。例如，此类环可能存在于图20所示分子的位置27-30。在化学式中，
Figure BDA0003695063620000622
是寡核苷酸链的附着点。
Figure BDA0003695063620000631
4.其他靶向HBV的GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸
在某一实施例中，本发明的寡核苷酸是靶向HBV mRNA的治疗性寡核苷酸，其通过缀合至脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)靶向缀合物(例如二价、三价或四价GalNAc簇)改善了向肝脏的递送，特别是向肝细胞的递送(图1中的说明性示例)。WO2015/173208描述了这种靶向HBV mRNA(SEQ ID NO:1)的GalNAc缀合的反义寡核苷酸及其生产。
本发明的药物组合中的GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸能够降低HBV mRNA(靶核酸)的表达，特别是乙型肝炎病毒的HBsAg和HBx(二者均由SEQ ID NO:1编码)的表达。此外，本发明的GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸优选能够降低来自染色体整合的HBV片段的HBsAg表达。
在一些实施例中，本发明的GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸与靶核酸结合并与正常表达水平相比降低表达至少10％或20％，更优选与正常表达水平(例如在没有GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸的情况下的表达水平)相比降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一个实施例中，本发明的GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸能够下调(例如抑制、降低或去除)HBx或HBsAg基因的表达。这种下调通常可以发生在靶细胞中，例如哺乳动物细胞，例如人类细胞，例如肝脏细胞，例如肝细胞，特别是HBV感染的肝细胞。在一些实施例中，本发明的GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸与靶核酸结合并与正常表达水平相比影响至少50％的表达抑制，更优选与正常表达水平(例如在没有GalNAc缀合的治疗性寡核苷酸的情况下的表达水平)相比至少60％、70％、80％、90％或95％抑制。HBV mRNA和HBsAg以及HBVDNA表达水平的调节可以使用材料和方法部分中描述的方法来确定。
本发明的一方面涉及治疗性寡核苷酸，其包含长度为12至30个核苷酸的连续核苷酸序列，该序列与SEQ ID NO:1的位置1530至1602至少90％互补。
在本发明的一个实施例中，治疗性寡核苷酸与选自以下的序列互补：SEQ ID NO:1的位置1530至1602；1530至1598；1530-1543；1530-1544；1531-1543；1551-1565；1551-1566；1577-1589；1577-1591；1577-1592；1578-1590；1578-1592；1583-1598；1584-1598；1585-1598和1583-1602。特别地，与来自位置1530-1544、1531-1543、1583-1602和1583-1598的靶序列具有100％互补性的治疗性寡核苷酸是有利的。
在一些实施例中，治疗性寡核苷酸包含长度为12至30个核苷酸的连续序列，其与靶核酸的区域或靶序列至少91％互补，诸如至少92％、诸如至少93％、诸如至少94％、诸如至少95％、诸如至少96％、诸如至少97％、诸如至少98％、99％或100％互补。
如果连续核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1的位置1530至1602；1530至1598；1530-1543；1530-1544；1531-1543；1551-1565；1551-1566；1577-1589；1577-1591；1577-1592；1578-1590；1578-1592；1583-1598；1584-1598；1585-1598或1583-1602的靶序列中的连续序列完全互补(100％互补)，则是有利的，或者在一些实施例中，可以包括治疗性寡核苷酸与靶标之间的一个或两个错配。
在本发明的某一实施例中，GalNAc缀合的反义寡核苷酸的长度为13至20个核苷酸，具有与来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:28的位置1530至1602的连续序列100％互补的至少12个核苷酸的连续核苷酸序列。应当理解，该化合物与TLR7激动剂组合，如关于TLR7激动剂的部分中所述。
在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸包含长度为13至24个的核苷酸，诸如长度为13至22个、诸如14至20个的连续核苷酸，或由其组成。在优选的实施例中，反义寡核苷酸包含长度为13至18个(诸如15至18个)的核苷酸或由其组成。
在一些实施例中，其连续核苷酸序列包含12-20个核苷酸，诸如12至18个、诸如13至17个、诸如13至15个核苷酸长度，诸如13、14、15、16或17个核苷酸长度，或由其组成。应当理解，连续核苷酸序列总是等于或短于反义寡核苷酸的总长度，因为反义寡核苷酸可以包含额外的核苷，该核苷用作例如在连续核苷酸序列与缀合物之间的可生物裂解接头。还应当理解的是，本文中给出的任何范围均包括范围的端点。据此，如果称反义寡核苷酸包括12至30个核苷酸，则12个和30个核苷酸均包含在内。
在一些实施例中，连续核苷酸序列包含选自由以下项组成的组的序列或由其组成：
gcgtaaagagagg(SEQ ID NO:2)；
gcgtaaagagaggt(SEQ ID NO:3)；
cgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO 4)；
agaaggcacagacgg(SEQ ID NO 5)；
gagaaggcacagacgg(SEQ ID NO 6)；
agcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 7)；
gaagtgcacacgg(SEQ ID NO 8)；
gcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 9)；
agcgaagtgcacacg(SEQ ID NO:10)；
cgaagtgcacacg(SEQ ID NO 11)；
aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:12)；
aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO:13)；
aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)；和
gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:29)。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列具有至少90％同一性、优选100％同一性：
gcgtaaagagagg(SEQ ID NO:2)；
gcgtaaagagaggt(SEQ ID NO:3)；和
cgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO 4)。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自以下的序列具有至少90％同一性、优选100％同一性：
agaaggcacagacgg(SEQ ID NO 5)；或
gagaaggcacagacgg(SEQ ID NO 6)。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列具有至少90％同一性、优选100％同一性：
agcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 7)；
gaagtgcacacgg(SEQ ID NO 8)；
gcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 9)；
agcgaagtgcacacg(SEQ ID NO:10)；
cgaagtgcacacg(SEQ ID NO 11)；
aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:12)
aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO:13)；
aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)；和
gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:29)。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的序列具有至少90％同一性、优选100％同一性：
aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:12)
aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO:13)；
aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)；和
gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:29)。
5.本发明的反义寡核苷酸的寡核苷酸修饰
本节中讨论的修饰特别优选用于在本发明的反义寡核苷酸中实施。
应理解的是，邻接核碱基序列(基序序列)可经修饰以例如增加核酸酶抗性和/或对靶核酸的结合亲和力。
在一个实施例中，寡核苷酸的连续核碱基序列包含至少一个修饰的核苷间键。合适的核苷间修饰描述于“定义”章节的“修饰的核苷间键”下。如果连续核苷酸序列内的至少75％(诸如所有)的核苷间键是核苷间键，则是有利的。在一些实施例中，寡核苷酸的邻接序列中的所有核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
本发明的寡核苷酸设计有经修饰的核苷和DNA核苷。有利地，使用高亲和力修饰的核苷。
在某一实施例中，寡核苷酸包含至少3个修饰的核苷，诸如至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个修饰的核苷。在某一实施例中，寡核苷酸包含3至8个修饰的核苷，诸如4至6个修饰的核苷、诸如4、5或6个修饰的核苷、诸如5个或6个修饰的核苷。合适的修饰在“定义”章节的“修饰的核苷”、“高亲和力修饰的核苷”、“糖修饰”、“2′糖修饰”和“锁定的核酸(LNA)”下进行了描述。
在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个糖修饰的核苷，例如2’糖修饰的核苷。优选地，本发明的寡核苷酸包含一个或多个2’糖修饰的核苷，其独立地选自2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、阿拉伯糖核酸(ANA)、2'-氟-ANA和LNA核苷。如果一个或多个或所有的修饰的核苷是锁定的核酸(LNA)，则是优选的。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸(诸如连续核苷酸序列)包含至少一个LNA核苷，诸如1、2、3、4、5、6、7或8个LNA核苷，诸如2至6个LNA核苷，诸如3至6个LNA核苷、4至6个LNA核苷或4、5或6个LNA核苷。
在一些实施例中，寡核苷酸中至少75％的修饰的核苷是LNA核苷，诸如至少80％、诸如至少85％、诸如至少90％的修饰的核苷是LNA核苷。在另一个实施例中，寡核苷酸中所有修饰的核苷均为LNA核苷。在其他实施例中，LNA核苷选自β-D-氧基-LNA、硫代-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、ScET和/或为β-D构型或为α-L构型的ENA或其组合。在其他实施例中，所有LNA核苷都是β-D-氧基LNA。在其他实施例中，胞嘧啶单元是5-甲基胞嘧啶。对于寡核苷酸或连续核苷酸序列的核酸酶稳定性而言，优选的是在核苷酸序列的5’端具有至少1个LNA核苷并且在核苷酸序列的3’端具有至少2个LNA核苷。
6.用于RNA酶H募集的反义寡核苷酸设计
在本发明的某一实施例中，其中治疗性寡核苷酸是反义寡核苷酸，本发明的寡核苷酸在与靶核酸杂交时能够募集RNA酶H。
将修饰的核苷(例如高亲和力修饰的核苷)掺入寡核苷酸序列中的模式通常称为寡核苷酸设计。
在本发明的某一实施例中，其中治疗性寡核苷酸是反义寡核苷酸，有利的结构设计是如“定义”部分中所述的缺口聚物设计，例如“缺口聚物”、“LNA缺口聚物”、“MOE缺口聚物”和“混合型翼缺口聚物”。缺口聚物设计包括具有均匀侧翼和混合翼侧翼的缺口聚物。在本发明中，如果本发明的连续核苷酸序列是具有F-G-F’设计的缺口聚物，则是优选的。在一些实施例中，缺口聚物是LNA或MOE缺口聚物，其具有以下均匀的侧翼设计：3-7-3、3-8-2、3-8-3、2-9-4、3-9-3、3-10-3或5-10-5。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO:2)；
GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO:2)；
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO:3)；
CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO:4)；
AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO:5)；
GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO:6)；
AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:7)；
GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO:8)；
GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO:8)；
GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:9)；
AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO:10)；
CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO:11)；
AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO:12)；
AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO:13)
AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO:13)；和
AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO:14)；
其中大写字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，并且小写字母表示DNA核苷。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO:2)；
GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO:2)；
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO:3)；和
CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO:4)；
其中大写字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，并且小写字母表示DNA核苷。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中连续核苷酸序列由下各项组成：
AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO:5)；或
GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO:6)；
其中大写字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，并且小写字母表示DNA核苷。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:7)；
GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO:8)；
GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO:8)；
GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:9)；
AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO:10)；
CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO:11)；
AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO:12)；
AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO:13)
AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO:13)；和
AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO:14)；
其中大写字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，并且小写字母表示DNA核苷。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为12至22个的核苷酸或由其组成，其中连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO:12)；
AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO:13)
AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO:13)；和
AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO:14)；
其中大写字母表示LNA核苷，例如β-D-氧基-LNA，并且小写字母表示DNA核苷。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含长度为20至24个的核苷酸或由其组成，其中连续核苷酸序列为：
GCAGAggtgaagcgaAGTGC(SEQ ID NO:29)
其中带下划线的大写字母表示MOE核苷，并且小写字母表示DNA核苷。
下表1总结了靶向SEQ ID NO:1的位置1530至1602的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列的基序序列以及旨在用于本发明的这些的缺口聚物设计。
表1
Figure BDA0003695063620000701
Figure BDA0003695063620000711
在表1的设计栏中，大写字母表示2'-糖修饰的核苷，特别是LNA核苷，诸如β-D-氧基-LNA或MOE核苷，并且小写字母表示DNA核苷。核苷间键可以是磷酸二酯或硫代磷酸酯。在一些实施例中，所有核苷间键均为硫代磷酸酯。
在所有情况下，反义寡核苷酸还可包括在F-G-F’设计的5’或3’端处的区域D’和/或D”，如“定义”章节中“寡核苷酸中的区域D’或D””下所述。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸在缺口聚物区域的5’或3’端处具有1至5个，例如1、2或3个磷酸二酯连接的核苷单元，例如DNA单元。DNA核苷通常具有核碱基定义中定义的核碱基，例如具有选自嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)的核碱基的天然存在的DNA核苷。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸由两个5’磷酸二酯连接的DNA核苷和随后的如“定义”章节中所定义的F-G-F’缺口聚物区域组成。在5’或3’端含有磷酸二酯连接的DNA单元的寡核苷酸适用于缀合，并且可以进一步包含本文所述的缀合物部分。对于递送至肝脏，ASGPR靶向部分作为缀合物部分是特别优选的。
在一些实施例中，反义寡核苷酸包含选自由以下项组成的组的序列或由其组成：
cagcgtaaagagagg(SEQ ID NO:15)
cagcgtaaagagaggt(SEQ ID NO:16)
cacgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO:17)
caagaaggcacagacgg(SEQ ID NO:18)
cagagaaggcacagacgg(SEQ ID NO:19)
caagcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO:20)
cagaagtgcacacgg(SEQ ID NO:21)
cagcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO:22)
caagcgaagtgcacacg(SEQ ID NO:23)
cacgaagtgcacacg(SEQ ID NO:24)
caaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:25)
caaggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO:26)
caaggtgaagcgaagt(SEQ ID NO:27)
其中从位置1到3(从5'端开始)的核苷之间的核苷间键是磷酸二酯键，并且位置3和4中的核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯键(其中位置3的核苷是连续核苷酸序列的5'端)。如果寡核苷酸的位置4之后到3'端的所有核苷间键都是硫代磷酸酯键，则是有利的。在一个实施例中，连续核苷酸序列具有表1中的相应序列的设计。
7.与脱唾液酸糖蛋白结合的缀合物
能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的缀合物对于靶向肝脏中的肝细胞特别有用。包含至少两个碳水化合物部分的缀合物通常能够结合ASGPR，该碳水化合物部分选自半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基-半乳糖胺和N-异丁酰基半乳糖胺。N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分已显示在靶向ASGPR方面具有优势，但也可以使用上面列表中的替代品，例如半乳糖。在一个实施例中，缀合物由连接至间隔物的二至四个末端GalNAc部分组成，该间隔物将每个GalNAc部分连接至支链分子，由此形成可与治疗性寡核苷酸缀合的簇。
GalNAc簇可以例如通过将GalNAc部分通过其C-1碳连接到间隔物来产生。优选的间隔物是柔性亲水性间隔物(美国专利5885968；Biessen等人J.Med.Chem.1995Vol.39p.1538-1546)。优选的柔性亲水性间隔物是PEG间隔物。优选的PEG间隔物是PEG3间隔物。分支点可以是允许两个至三个GalNAc部分(或其他脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分)附着，并进一步允许分支点附着至寡核苷酸的任何小分子，此类构建体称为GalNAc簇或GalNAc缀合物。示例性的分支点基团是二赖氨酸。二赖氨酸分子包含三个胺基团和羧基反应性基团，三个GalNAc部分或其他脱唾液酸糖蛋白受体靶向部分可以通过所述三个胺基团连接，而二赖氨酸可通过羧基反应性基团连接至寡聚物。Khorev,et al2008Bioorg.Med.Chem.Vol 16第5216页也描述了合适的三价支化剂(brancher)的合成。其他可商购获得的支化剂是1,3-双-[5-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)戊基氨基]丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]亚磷酰胺(Glen Research目录号：10-1920-xx)；tris-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙基氧甲基]乙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research目录号：10-1922-xx)；和tris-2,2,2-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲氧基)丙氧基甲基]亚甲氧基丙基-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺；和1-[5-(4,4'-二甲氧基-三苯甲氧基)戊酰胺基]-3-[5-芴甲氧基-羰基-氧基-戊酰胺基]-丙基-2-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺(Glen Research目录号：10-1925-xx)。其他GalNAc簇可能是附着有GalNAc部分的小肽，例如Tyr-Glu-Glu-(氨基己基GalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；与肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体结合的糖三肽，参见例如Duff,等人，Methods Enzymol,2000,313,297；基于赖氨酸的半乳糖簇(例如，L3G4；Biessen,等人，Cardovasc.Med.,1999,214)；和基于胆烷的半乳糖簇(例如，脱唾液酸糖蛋白受体的碳水化合物识别基序)。
在本发明的某一实施例中，本发明的治疗性寡核苷酸与GalNAc簇缀合以改善寡核苷酸的药理学，例如通过影响细胞分布，特别是寡核苷酸在肝细胞中的细胞摄取。
合适的GalNAc缀合物是那些能够与脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合的缀合物，例如二价、三价或四价GalNAc簇。特别地，三价N-乙酰基半乳糖胺缀合物适用于与ASGPR结合，参见例如WO 2014/076196、WO 2014/207232、WO 2014/179620、WO 2016/055601和W O2017/178656(通过引用在此并入)。图1是合适的GalNAc缀合物的图示，它们至少经过了体外测试。然而，如果替代的GalNAc缀合物能够结合脱唾液酸糖蛋白受体，则它们也可以是合适的。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄取，同时减少寡核苷酸在肾脏中的存在，从而与相同寡核苷酸的非缀合形式相比，增加GalNAc缀合的寡核苷酸的肝脏/肾脏比率。
可以使用本领域已知的方法将GalNAc簇附着于寡核苷酸的3’端或5’端。在一个实施例中，GalNAc簇连接至寡核苷酸的5’端。
一个或多个接头可以插入在缀合物(例如在缀合物部分的支链部分)与寡核苷酸之间。在缀合物部分与治疗性寡核苷酸之间具有可生物裂解接头是有利的，任选地与不可裂解接头如C6接头组合。接头可以选自在“接头”下的“定义”章节中描述的接头，特别地，可生物裂解区域D'或D”接头是有利的。在缀合物与缺口聚物或连续核苷酸序列之间具有可生物裂解接头的GalNAc缀合的寡核苷酸是有效的前药，因为GalNAc簇和可生物裂解PO接头在进入细胞时从缺口聚物或连续核苷酸序列去除。
在一个实施例中，缀合物部分是三价N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)，例如图1所示。
在一个实施例中，其中GalNAc缀合的反义寡核苷酸选自由以下项组成的组：
Figure BDA0003695063620000741
Figure BDA0003695063620000751
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物。
在一个实施例中，其中GalNAc缀合的反义寡核苷酸选自由以下项组成的组：
Figure BDA0003695063620000752
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物。
在一个实施例中，其中GalNAc缀合的反义寡核苷酸是
Figure BDA0003695063620000753
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物。
在一个实施例中，其中GalNAc缀合的反义寡核苷酸选自由以下项组成的组：
Figure BDA0003695063620000761
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物。
在一个实施例中，其中GalNAc缀合的反义寡核苷酸选自由以下项组成的组：
Figure BDA0003695063620000762
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物。
在一个实施例中，其中GalNAc缀合的反义寡核苷酸选自由以下项组成的组：
Figure BDA0003695063620000771
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物。
在下表2中，显示了在5端具有可生物裂解CA接头(如果存在)的反义寡核苷酸序列，以及显示了靶向SEQ ID NO:1的位置1530至1602的GalNAc缀合的反义寡核苷酸。
表2：本发明的GalNAc缀合的反义寡核苷酸用单独的化合物识别号(CMP ID NO)标识。
Figure BDA0003695063620000772
Figure BDA0003695063620000781
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；大写下划线字母表示MOE；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物(图1D)。化合物15_至27_1均描述于WO2015/173208中，而化合物29_1描述于WO2014/179627中，一些化合物也如表2所示在图中呈现。
8.TLR7激动剂
本发明的TLR7激动剂是具有Toll样受体激动活性的3-取代的5-氨基-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮化合物及其前药。WO 2006/066080、WO 2016/055553和WO 2016/091698描述了此类TLR7激动剂及其前药及其制备方法(通过引用在此并入)。
在本发明的一个方面，本发明的药物组合中的TLR7激动剂由式(I)表示：
Figure BDA0003695063620000791
其中X为CH2或S；
R1为-OH或-H并且
R2为1-羟基丙基或羟基甲基；
或式(II)：
Figure BDA0003695063620000792
其中X为CH2或S；
R1为-OH或-H或乙酰氧基并且
R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基，
或其药用盐、对映体或非对映体。
式(I)化合物为活性TLR7激动剂。
在本发明的一个实施例中，式(I)的活性TLR7激动剂的子集由式(V)表示：
Figure BDA0003695063620000793
其中R1为-OH并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
或其药用盐、对映体或非对映体。
在本发明的一个实施例中，式(I)或(V)中R2处的取代基选自：
Figure BDA0003695063620000801
式(II)化合物为TLR7激动剂前药。在一个实施例中，前药是在R2处具有选自以下的取代基的单一前药：
Figure BDA0003695063620000802
在另一个实施例中，前药是在R2处具有选自以下的取代基的双重前药：
Figure BDA0003695063620000803
式(II)的TLR7激动剂前药的子集由式(III)表示：
Figure BDA0003695063620000804
其中R1为–OH或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或
Figure BDA0003695063620000805
或其药用盐、对映体或非对映体；
或式(IV)：
Figure BDA0003695063620000806
其中R1为乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基或
Figure BDA0003695063620000811
或其药用盐、对映体或非对映体。
式(IV)化合物与式(III)化合物一样是双前药，其中R1为OH并且R2为1-乙酰氧基丙基。式(III)化合物其中的R1为乙酰氧基并且R2为三前药。
施用后，式(II)、(III)或式(IV)化合物被代谢成它们的活性形式，这些活性形式是有用的TLR7激动剂。
在一个实施例中，用于本发明的药物组合的TLR7激动剂选自由以下项组成的组：
[(1S)-1-[(2S,4R,5R)-5-(5-氨基-2-氧代-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-羟基-四氢呋喃-2-基]丙基]乙酸酯(CMP ID NO:VI)；
5-氨基-3-[(2R,3R,5S)-3-羟基-5-[(1S)-1-羟基丙基]四氢呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO:VII)；
5-氨基-3-[(2R,3R,5S)-3-羟基-5-[(1S)-1-羟基丙基]四氢呋喃-2-基]噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO:VIII)；
5-氨基-3-(3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP IDNO:IX)；
5-氨基-3-(2’-O-乙酰基-3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO:X)；
5-氨基-3-(3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO:XI)；
[(S)-[(2S,5R)-5-(5-氨基-2-氧代-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-基]-环丙基-甲基]乙酸酯(CMP ID NO:XII)；和
(1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-氨基-2-氧代-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-基]丁-2-炔基]乙酸酯(CMP ID NO:XIII)
及其药用盐、对映体或非对映体。
表3列出了本发明中的TLR7激动剂，包括对描述其制备的文件的参考。
表3：TLR7激动剂化合物用单个化合物识别号(CMP ID NO)标识
Figure BDA0003695063620000821
Figure BDA0003695063620000831
在特别优选的实施例中，TLR7激动剂为CMP ID NO:VI。
9.药物组合物
在另一方面，本发明提供了包含本发明的药物组合的药物组合物，包括包含任何上述治疗性寡核苷酸或TLR7激动剂或其盐以及药用稀释剂、载体、盐和/或佐剂的药物组合。在某一实施例中，本发明的药物组合中的活性成分(例如治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂)在单独的组合物中施用。在本发明的药物组合的某一实施例中，治疗性寡核苷酸被配制在磷酸盐缓冲盐水中用于皮下施用，并且TLR7激动剂被配制为用于口服施用的片剂。
本发明的药物组合中的活性成分(例如治疗性寡核苷酸)可与药用活性或惰性物质混合，用于制备药物组合物或制剂。药物组合物的组成和配制方法取决于许多标准，包括但不限于施用途径、疾病程度或施用剂量。药用稀释剂，特别治疗性寡核苷酸的药用稀释剂，包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而药用盐包括但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药用稀释剂，特别治疗性寡核苷酸的药用稀释剂，是无菌磷酸盐缓冲盐水。在一些实施例中，寡核苷酸以50-150mg/ml溶液的浓度在药用稀释剂中使用。治疗性寡核苷酸或包含治疗性寡核苷酸的药物组合物通过肠胃外途径施用，包括静脉内、动脉内、皮下或肌肉内注射或输注。在一个实施例中，寡核苷酸缀合物静脉内施用。对于治疗性寡核苷酸，其皮下施用是有利的。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸缀合物或药物组合物以0.5–6.0mg/kg，诸如0.75–5.0mg/kg、诸如1.0–4mg/kg的剂量施用。施用可以是每周一次、每2周一次(两周一次)、每三周一次、每月一次或更长的间隔。当本发明的药物组合包含其他活性成分时，每种活性成分可以通过该活性成分的优选途径施用。
对于本发明的药物组合中的TLR7激动剂，药物有效量的本发明化合物通过肠内施用(例如口服或通过胃肠道)。本发明中的TLR7激动剂化合物可以以任何方便的施用形式的单位剂量施用，例如片剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、分散剂、混悬剂、糖浆剂、喷雾剂、栓剂、凝胶剂、乳剂。特别地，可以使用口服单位剂型，例如片剂和胶囊。在一个实施例中，本发明的TLR7激动剂化合物的药物有效量将在每剂量约75-250mg，诸如100-200mg、诸如150-170mg的范围内。施用可以是每天、每隔一天(QOD)或每周(QW)。
适合的载体和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且在例如Ansel,Howard C.等人，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems.Philadelphia:Lippincott,Williams和Wilkins,2004；Gennaro,Alfonso R.等人Remington:The Science and Practice of Pharmacy.Philadelphia:Lippincott,Williams&Wilkins,2000；以及Rowe,Raymond C.Handbook of PharmaceuticalExcipients.Chicago,Pharmaceutical Press,2005中有详细描述。
这些组合物可以通过常规的灭菌技术进行灭菌，或者可以进行无菌过滤。所得的水溶液可以包装后直接使用或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性载体混合。制剂的pH通常为介于3至11之间，更优选地介于5和9之间或介于6和8之间，并且最优选地介于7和8之间，诸如7至7.5。可以将固体形式的所得组合物包装在多个单剂量单元中，每一个单元包含固定量的一种或多种上述试剂，诸如在片剂或胶囊的密封包装中。
10.制剂
已经开发了多种制剂以促进治疗性寡核苷酸使用，它们可适用于本发明的药物组合中使用的治疗性寡核苷酸。例如，可以使用最小化降解、促进递送和/或摄取或为制剂中的寡核苷酸提供另一有益特性的制剂将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在一些实施例中，本文提供了包含第一药物的药物组合，该第一药物是包含寡核苷酸(例如，单链或双链寡核苷酸)以降低HBV抗原(例如，HBsAg)的表达的组合物。此类组合物可以适当地配制，使得当施用于受试者的靶细胞的直接环境中还是全身性地施用于受试者时，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低HBV抗原表达。多种合适的寡核苷酸制剂中的任一种可用于递送寡核苷酸以减少如本文所公开的HBV抗原。在一些实施例中，本发明的药物组合的寡核苷酸被配制在缓冲溶液例如磷酸盐缓冲盐溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中。
寡核苷酸与阳离子脂质的制剂可用于促进寡核苷酸转染到细胞中。例如，可以使用阳离子脂质，例如lipofectin、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，所有这些都可以根据制造商的说明使用。
因此，在一些实施例中，寡核苷酸制剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施例中，赋形剂包括脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制用于施用于有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体(参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,22nd edition,Pharmaceutical Press,2013)。
在一些实施例中，如本文公开的制剂包含赋形剂。在一些实施例中，赋形剂赋予组合物改进的稳定性、改进的吸收、改进的溶解度和/或活性成分的治疗增强。在一些实施例中，赋形剂是缓冲剂(例如，柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或媒介物(例如，缓冲溶液、凡士林、二甲亚砜或矿物油)。在一些实施例中，将活性成分如寡核苷酸冻干以延长其保质期，然后在使用前制成溶液(例如，施用于受试者)。因此，包含本文所述的任何一种寡核苷酸的组合物中的赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或瘪塌温度调节剂(例如，葡聚糖、聚蔗糖或明胶)。
在本发明的药物组合的一些实施例中，将包含活性成分如寡核苷酸的组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的示例包括肠胃外，例如，静脉内、皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠施用。在本发明的药物组合中的活性成分是RNAi寡核苷酸的情况下，用于皮下的制剂是特别有利的。
适合注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是水或溶剂或分散介质。溶剂或分散介质可以包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选在组合物中将包括等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨糖醇以及氯化钠。无菌可注射溶液可以通过将活性成分如寡核苷酸以需要的量与上面列举的成分的一种或组合(根据需要)一起掺入选定的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。
在本发明的药物组合的一些实施例中，组合中的组合物可以包含至少约0.1％的治疗剂(例如，用于降低HBV抗原表达的寡核苷酸)或更多，但活性成分的百分比也可以是总组合物的重量或体积的约1％至约80％或更多。制备此类药物制剂的本领域技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑的因素，因此，各种剂量和治疗方案可能是可取的。
尽管许多实施例涉及本文公开的任何寡核苷酸的肝脏靶向递送，但也考虑靶向其他组织。
11.药物组合和多部件试剂盒
本发明的一个方面涉及一种药物组合，其包含本文所述的两种活性成分，各自配制在药用载体中。在某一实施例中，药物组合包含靶向HBV的治疗性寡核苷酸和本文所述的TLR7激动剂，各自配制在药用载体中。
本发明的药物组合可用于比单一活性成分(例如单独包含的治疗性寡核苷酸或TLR7激动剂)更有效地治疗HBV感染。在某一实施例中，本发明的药物组合可用于更快速地抑制HBV、抑制HBV更长的持续时间和/或以比单一活性成分(例如单独包含的治疗性寡核苷酸或TLR7激动剂)更有效地抑制HBV。这些效果可以通过HBsAg滴度的降低来衡量。在某一实施例中，本发明的药物组合比单一活性成分(例如单独包含的治疗性寡核苷酸或TLR7激动剂)更迅速地导致HBsAg滴度降低。在某一实施例中，本发明的药物组合比单一活性成分(例如单独包含的治疗性寡核苷酸或TLR7激动剂)更长期地导致HBsAg滴度降低。在某一实施例中，本发明的药物组合比单一活性成分(例如单独包含的治疗性寡核苷酸或TLR7激动剂)导致HBsAg滴度下降更多。
在本发明的某一优选实施例中，药物组合包含如本文所述的RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂，或由其组成。
在本发明的某一实施例中，药物组合包含RNAi寡核苷酸和式(I)或(II)的TLR7激动剂，或由其组成：
Figure BDA0003695063620000871
其中X为CH2或S；
对于式(I)，R1为-OH或-H并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
对于式(II)，R1为-OH或-H或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基，
或其药用盐、对映体或非对映体。
本发明的RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂已在上文单独描述，例如在上文第1-3节和第8节中。
在本发明的一个实施例中，药物组合可以选自表4中垂直列中的化合物和水平列中的化合物。每个可能的组合都用“x”表示。
表4：可能的RNAi寡核苷酸、TLR7激动剂组合
Figure BDA0003695063620000881
下面的表5和6显示了RNAi寡核苷酸(垂直)和TLR7激动剂(水平)的选定组合。
表5
Figure BDA0003695063620000882
表6
Figure BDA0003695063620000891
在本发明的一个实施例中，药物组合选自由以下项组成的组：
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:2和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:VI；RNAi IDNO:6和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:8和CMP ID NO:VI；RNAiID NO:9和CMP ID NO:VI；
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:VII,RNAi ID NO:2和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:VII；RNAiID NO:6和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:8和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:9和CMP ID NO:VII；
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:VIII,RNAi ID NO:2和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:6和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:8和CMPID NO:VIII；RNAi ID NO:9和CMP ID NO:VIII；
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:XIII,RNAi ID NO:2和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:6和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:8和CMPID NO:XIII；RNAi ID NO:9和CMP ID NO:XIII；
或其药用盐、对映体或非对映体。
在一个实施例中，本发明的药物组合的治疗性寡核苷酸由RNAi寡核苷酸组成，该RNAi寡核苷酸为RNAi ID NO:7：
一种用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，该寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
有义链包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNac部分缀合，其中-GAAA-序列包含以下结构：
Figure BDA0003695063620000911
反义链包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在核苷酸1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22的之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure BDA0003695063620000912
并且TLR7激动剂为CMP ID NO:VI:
Figure BDA0003695063620000921
或其药用盐、对映体或非对映体。
在包含RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂的药物组合的特别优选的实施例中，TLR7激动剂为CMP ID NO:VI。
在某一实施例中，本发明的包含RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂的药物组合进一步包含CpAM(核心蛋白变构调节剂)。
在优选的实施例中，CpAM是根据化合物(CpAM1)。化合物(CpAM1)是一种通过靶向HBV衣壳来治疗和/或预防人类的HBV的CpAM，其在WO2015132276中公开。化合物(CpAM1)的结构如下所示：
Figure BDA0003695063620000922
其中
R1为氢、卤素或C1-6烷基；
R2为氢或卤素；
R3为氢或卤素；
R4为C1-6烷基；
R5为氢、羟基C1-6烷基、氨基羰基、C1-6烷氧基羰基或羧基；
R6为氢、C1-6烷氧基羰基或羧基-CmH2m-,
X为羰基或磺酰基；
Y为-CH2-、-O-或-N(R7)-,
其中R7为氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基-CmH2m-、C1-6烷氧基羰基-CmH2m-、-CtH2t-COOH、-卤代C1-6烷基-COOH、-(C1-6烷氧基)C1-6烷基-COOH、-C1-6烷基-O-C1-6烷基-COOH、-C3-7环烷基-CmH2m-COOH、-CmH2m-C3-7环烷基-COOH、羟基-CtH2t-、羧螺[3.3]庚基或羧基苯基-CmH2m-、羧基吡啶基-CmH2m-；
W为-CH2-、-C(C1-6烷基)2-、-O-或羰基；
n为0或1；
m为0-7；
t为1-7；
或其药用盐，或对映体，或非对映体。
在进一步优选的实施例中，CpAM是根据化合物(CpAM2)或其药用盐、对映体或非对映体。化合物(CpAM2)是一种通过靶向HBV衣壳来治疗和/或预防人类的HBV的CpAM，其在WO2015132276的实例76中公开，并且可以相应地制备。化合物(CpAM2)的结构如下所示：
Figure BDA0003695063620000931
在进一步优选的实施例中，CpAM是3-[(8aS)-7-[[(4S)-5-乙氧基羰基-4-(3-氟-2-甲基-苯基)-2-噻唑-2-基-1,4-二氢嘧啶-6-基]甲基]-3-氧代-5,6,8,8a-四氢-1H-咪唑并[1,5-a]吡嗪-2-基]-2,2-二甲基-丙酸，其在WO2015132276的实例76中公开，并且可以相应地制备。
本发明的另一实施例中，药物组合包含长度为13至22个核苷酸的GalNAc缀合的反义寡核苷酸，其中至少12个核苷酸的连续核苷酸序列与来自SEQ ID NO:1的位置1530至1602的连续序列100％互补；和式(I)或(II)的TLR7激动剂，或由它们组成：
Figure BDA0003695063620000941
其中X为CH2或S；
对于式(I)，R1为-OH或-H并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
对于式(II)，R1为-OH或-H或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基，
或其药用盐、对映体或非对映体。
靶向HBV的GalNAc缀合的反义寡核苷酸和本发明的TLR7激动剂已在上文单独描述，例如在上文第4-6节和第8节中。
在本发明的一个实施例中，药物组合可以选自表7中垂直列中的化合物和水平列中的化合物。每个可能的组合都用“x”表示。
表7：可能的GalNAc缀合的反义寡核苷酸、TLR7激动剂组合
Figure BDA0003695063620000942
下面的表8和9显示了GalNAc缀合的反义寡核苷酸(垂直)和TLR7激动剂(水平)的选定组合。
表8
Figure BDA0003695063620000951
表9
Figure BDA0003695063620000952
在本发明的一个实施例中，药物组合选自由以下项组成的组：
CMP ID NO:15_1和VI、CMP ID NO:15_2和VI；CMP ID NO:16_1和VI；CMP ID NO:20_1和VI；CMP ID NO:23_1和VI；CMP ID NO:26_1和VI；CMP ID NO:29_1和VI；
CMP ID NO:15_1和VII、CMP ID NO:15_2和VII；CMP ID NO:16_1和VII；CMP IDNO:20_1和VII；CMP ID NO:23_1、VII；CMP ID NO:26_1和VII；CMP ID NO:29_1和VII；
CMP ID NO:15_1和VIII、CMP ID NO:15_2和VIII；CMP ID NO:16_1和VIII；CMP IDNO:20_1和VIII；CMP ID NO:23_1和VII；CMP ID NO:26_1和VIII；CMP ID NO:29_1和VIII；和
CMP ID NO:15_1和XIII、CMP ID NO:15_2和XIII；CMP ID NO:16_1和XIII；CMP IDNO:20_1和XIII；CMP ID NO:23_1和XIII；CMP ID NO:26_1和XIII和CMP ID NO:29_1和XIII；
或其药用盐、对映体或非对映体。
在一个实施例中，药物组合由如图5所示的CMP ID NO:15_1的GalNAc缀合的反义寡核苷酸组成，并且TLR7激动剂为CMP ID NO:VI：
Figure BDA0003695063620000961
或其药用盐、对映体或非对映体。
在包含反义寡核苷酸的药物组合的特别优选的实施例中，TLR7激动剂为CMP IDNO:VI。
术语“试剂盒”或“多部件试剂盒”是指用于对HBV感染个体进行治疗的材料组装体，包括对如何进行治疗的描述。
本发明的一个方面是包含一种、两种或多种治疗有效成分(例如医疗组分或药物)的多部件试剂盒，其中有效成分中的两种选自如本文所述的治疗性寡核苷酸和如本文所述的TLR7激动剂。
本发明的一个实施例是一种多部件试剂盒，其包含如本文所述的治疗性寡核苷酸和如本文所述的TLR7激动剂作为医疗组分。
在一个实施例中，本发明的试剂盒包含第一药物和第二药物，该第一药物是如本文所述的配制用于皮下注射的治疗性寡核苷酸，而该第二药物是如本文所述的配制用于口服施用的TLR7激动剂。治疗性寡核苷酸可以在小瓶中以一剂或多剂配制为液体，或在预装注射器中以一个药学有效剂量配制。替代地，治疗性寡核苷酸可以是冻干粉末的形式，并且试剂盒包含用于制备用于注射的治疗性寡核苷酸的溶剂。应理解，所有注射用药物都是无菌的。试剂盒中的TLR7激动剂可以是片剂形式(或用于口服施用的替代单位剂量形式，例如胶囊和凝胶)，每片剂具有单一药学有效剂量，试剂盒可以包含多个片剂。
在进一步的实施例中，本发明的多部件试剂盒进一步包含包装插页，该包装插页指导治疗性寡核苷酸与TLR7激动剂的组合的施用以治疗乙型肝炎病毒感染。特别是，包装插页描述了慢性乙型肝炎病毒感染的治疗。
试剂盒可仅包含一种医疗组分和指导其与其他医疗组分结合使用的包装插页。在一个实施例中，本发明的多部件试剂盒包括或包含作为本文所述的治疗性寡核苷酸的第一药物和指导其与作为第二药物的本文所述的TLR7激动剂组合使用的包装插页，但该第二药物单独购买。在另一实施例中，本发明的多部件试剂盒包括或包含作为本文所述的TLR7激动剂的第一药物和指导其与作为第二药物的本文所述的治疗性寡核苷酸组合使用的包装插页，但该第二药物单独购买。
在一些实施例中，本发明的药物组合可与第三种或其他治疗剂组合使用，该第三种或其他治疗剂可包括在部件试剂盒中或单独供给。其他治疗剂可以例如是用于治疗HBV感染，特别是慢性HBV感染的标准护理。
12.进一步的药物组合
根据本文实例中关于抗病毒化合物和免疫调节化合物如何协同作用以治疗HBV的发现，认为上述优选的药物组合可用于治疗HBV。随着这一点的确立，以下进一步的药物组合也是本发明的实施例，其被设想在HBV的治疗中具有一些用途。
在本发明的这个方面，进一步的药物组合包含至少两种选自如本文所述的抗病毒化合物和免疫调节剂化合物的活性成分。
在第一个实施例中，药物组合包含至少一种抗病毒化合物和至少一种免疫调节剂化合物。如本文所用，“抗病毒化合物”是指靶向HBV以治疗HBV的任何化合物。如本文所用，“免疫调节剂化合物”是指靶向免疫系统并且可用于治疗HBV的任何化合物，例如通过启动免疫系统以靶向HBV。
在第二实施例中，药物组合包括作为衣壳抑制剂的第一抗病毒化合物和作为基因表达抑制剂的第二抗病毒化合物。衣壳抑制剂和基因表达抑制剂是可用于治疗HBV的两种特定类型的抗病毒化合物。如本文所用，“衣壳抑制剂”是指可用于治疗HBV并且靶向HBV衣壳的任何化合物，例如通过靶向衣壳蛋白(如核心HBV抗原)和抑制衣壳组装。如本文所用，“基因表达抑制剂”是指可用于治疗HBV并靶向HBV基因表达的任何化合物，例如siRNA HBV(s)-219。最优选地，包含衣壳抑制剂和基因表达抑制剂的药物组合包含不超过一种类型的基因表达抑制剂。
任选地，在第二个实施例中，药物组合进一步包含至少一种免疫调节剂。换言之，药物组合包含至少一种衣壳抑制剂、至少一种基因表达抑制剂和至少一种免疫调节剂。仍然最优选该药物组合仅包含一种基因表达抑制剂。
在本节中进一步的药物组合的特别优选的实施例中，包含在药物组合中的抗病毒化合物选自以下：KL060332、ABI-H2158、ABI-H0731、QL-007、GLS4、JNJ-6379、HBV(s)-219、Y101、帕拉德福韦、HH-003、APG-1387、异硫氟啶、盐酸艾咪朵尔、贺普拉肽和HS-10234。
在本节中进一步的药物组合的特别优选的实施例中，包含在药物组合中的免疫调节剂选自以下：P1101、HLX10、TQ-A3334、ASC22、GS-9620、GS-9688、T101、双质粒DNA治疗性疫苗和抗原抗体复合疫苗。
在本节中进一步的药物组合的特别优选的实施例中，包含在药物组合中的衣壳抑制剂选自以下：KL060332、ABI-H2158、ABI-H0731、QL-007、GLS4和JNJ-6379。
在这些进一步的药物组合的特别优选的实施例中，基因表达抑制剂为HBV(s)-219。
这些化合物中的大多数都处于临床或临床前试验中，并且下面将进一步详细描述。为便于参考，每种化合物都已被指定并称为抗病毒化合物ID(AV ID)或免疫调节剂化合物ID(IM ID)。
KL060332(AV ID:A)
KL060332是一种小分子衣壳抑制剂，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:A。
任选地，KL060332可以如WO2019137201A1中所述地制备。在任选的实施例中，KL060332/AV ID:A在本文中可以称为WO2019137201A1的化合物92。
任选地，AV ID:A为其药用盐。
ABI-H2158(AV ID:B)
ABI-H2158也已知为ABI-2158，是一种小分子衣壳抑制剂，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:B。
例如，ABI-H2158在EASL数字国际肝脏会议(2020年8月27-29日)上发表的AgarwalK,Niu J,Gane E,Nguyen TT,Alves K,Evanchik M,Zayed H,Huang Q,Knox SJ,Stamm LM,Colonno R.Antiviral activity,pharmacokinetics,and safety of the second-generation hepatitis B core inhibitor ABI-H2158in a phase 1b study ofpatients with HBeAg positive chronic hepatitis B infection中有述。
任选地，AV ID:B为其药用盐。
ABI-H0731(AV ID:C)
ABI-H0731是一种小分子衣壳抑制剂，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:C。
例如，ABI-H0731在Huang等人，Preclinical Profile and Characterization ofthe HBV Core Protein Inhibitor ABI-H0731,Antimicrob.Agents Chemother.(2020),doi:10.1128/AAC.01463-20中有述。
ABI-H0731的结构如下：
Figure BDA0003695063620001001
任选地，AV ID:C为其药用盐。
QL-007(AV ID:D)
QL-007是一种小分子衣壳抑制剂，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:D。
任选地，AV ID:D为其药用盐。
GLS4(AV ID:E)
GLS4是一种小分子衣壳抑制剂，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:E。
例如，GLS4在Wu G等人，Preclinical characterization of GLS4,an inhibitorof hepatitis B virus core particle assembly,Antimicrobial Agents andChemotherapy 57(11):5344-5354(2013)中有述。
GLS4的结构如下：
Figure BDA0003695063620001002
任选地，AV ID:E为其药用盐。
JNJ-6379(AV ID:F)
JNJ-6379是一种小分子衣壳抑制剂，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:F。
JNJ-6379也已知为JNJ-56136379或JNJ-379，并且在例如Zoulim等人，JNJ-56136379,an HBV Capsid Assembly Modulator,Is Well-Tolerated and Has AntiviralActivity in a Phase 1Study of Patients With Chronic Infection,Gastroenterology 159(2):521-533.e9(2020)中有述。JNJ-6379的其他信息也可见于WO2014033176中。
任选地，AV ID:F为其药用盐。
HBV(s)-219(AV ID:G)
HBV(s)-219已在本文中详细描述，以各种方式定义，并已被具体称为RNAi ID NO:8或RNAi ID NO:9。图29A中显示了该化合物的结构。在本节中为便于参考，该化合物被称为AV ID:G。
任选地，AV ID:G为其药用盐。
Y101(AV ID:H)
Y101是一种抗病毒化合物，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:H。
Y101也已知为替芬泰，并且在例如Hu等人，Identification,synthesis,andstrategy for minimization of potential impurities in the preclinical anti-HBVdrug Y101,Organic Process Research&Development.17(9):1156-1167(2013)中有述。还参见Hu等人，Process development of clinical anti-HBV drug Y101:identificationand synthesis of novel impurities,Research on Chemical Intermediates 42:2577-2595(2016)。
Y101的结构如下：
Figure BDA0003695063620001021
任选地，AV ID:H为其药用盐。
帕拉德福韦(AV ID:I)
帕拉德福韦是一种抗病毒化合物，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:I。
帕拉德福韦是公知的并且可见于例如PubChem数据库(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/9604654，2020年11月2日访问)中。
帕拉德福韦的结构如下：
Figure BDA0003695063620001022
任选地，AV ID:I为其药用盐。
HH-003(AV ID:J)
HH-003是一种抗病毒化合物，人源化单克隆抗体，其通常由注射施用并且在本文中称为AV ID:J。
在任选的实施例中，HH-003/AV ID:J可以为抗-pre-S1HBV抗体。
任选地，AV ID:J为其药用盐。
APG-1387(AV ID:K)
APG-1387是一种抗病毒化合物，其通常静脉内施用并且在本文中称为AV ID:K。
例如，APG-1387在WO2014031487中有述，其具体结构列于第22-30页。还参见Li等人，A novel Smac mimetic APG-1387 demonstrates potent antitumor activity innasopharyngeal carcinoma cells by inducing apoptosis,Cancer Letters 381(1):14-22(2016)。还参见Ji等人，XIAP Limits Autophagic Degradation of Sox2 and Is ATherapeutic Target in Nasopharyngeal Carcinoma Stem Cells,Theranostics 8(6):1494-1510(2018)。还参见Pan等人，A novel SMAC mimetic APG-1387exhibits dualantitumor effect on HBV-positive hepatocellular carcinoma with highexpression of cIAP2 by inducing apoptosis and enhancing innate anti-tumorimmunity,Biochemical Pharmacology 154:127-135(2018)。还参见Liu等人，(2018)Targeting cIAPs,a New Option for Functional Cure of Chronic Hepatitis BInfection？,Virologica Sinica 33(5):459-461。
APG-1387的结构如下：
Figure BDA0003695063620001041
任选地，AV ID:K为其药用盐。
异硫氟啶(AV ID:L)
异硫氟啶也已知为NZ-4，是一种抗病毒化合物，其通常静脉内施用并且在本文中称为AV ID:L。
异硫氟啶是公知的并且可见于例如PubChem数据库(https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/substance/404620031，2020年11月2日访问)中。
异硫氟啶的结构如下：
Figure BDA0003695063620001042
任选地，AV ID:L为其药用盐。
盐酸艾咪朵尔(AV ID:M)
盐酸艾咪朵尔是一种抗病毒化合物，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:M。
例如，盐酸艾咪朵尔在Liu等人，A pharmacokinetic study on a novel anti-HBV agent Imidol hydrochloride in rats,International Journal of Pharmaceutics461:514-518(2014)中有述。
盐酸艾咪朵尔的结构如下：
Figure BDA0003695063620001051
贺普拉肽(AV ID:N)
贺普拉肽是一种抗病毒化合物，其通常皮下施用并且在本文中称为AV ID:N。
例如，贺普拉肽在WO2015000371和US20170112898中有述(氨基酸序列参见US20170112898的SEQ ID NO:1)。
任选地，AV ID:N为其药用盐。
HS-10234(AV ID:O)
HS-10234是一种抗病毒化合物(核苷类似物)，其通常口服施用并且在本文中称为AV ID:O。
例如，HS-10234在US20170204125A1中有述(参见式I)。
HS-10234的结构如下：
Figure BDA0003695063620001061
P1101(IM ID:α)
P1101也已知为Ropeginterferon alfa-2b，是一种免疫调节剂化合物(干扰素)，其通常由注射施用并且在本文中称为IM ID:α。
P1101是一种聚乙二醇化脯氨酸-干扰素α-2b，其中40kDa支化聚乙二醇链主要在其N末端处与一个主要位置异构体缀合。
P1101的结构可见于PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ compound/Ropeginterferon-ALFA-2B)并且如下:
Figure BDA0003695063620001062
任选地，IM ID:α为其药用盐。
HLX10(IM ID:β)
HLX10也已知为赛普利单抗，是一种免疫调节剂化合物(抗PD-1单克隆抗体)，其通常由注射施用并且在本文中称为IM ID:β。
例如，HLX10在NCATS“Inxight”药物开发信息数据库(https://drugs.ncats.io/ substance/S3GQZ2K36V，2020年11月2日访问)中有述。
任选地，IM ID:α为其药用盐。
TQ-A3334(IM ID:γ)
TQ-A3334也已知为AL-034、JNJ-4964和JNJ-64794964，是一种免疫调节剂化合物，其通常口服施用并且在本文中称为IM ID:γ。
例如，TQ-A3334在Gane等人，FRI-198 A Phase 1,double-blind,randomized,placebo-controlled,first-in-human study of the safety,tolerability,pharmacokinetics and pharmacodynamics of oral JNJ-64794964,a toll-likereceptor-7agonist,in healthy adults Journal of Hepatology 70(Supp1):e478(2019)中有述。
任选地，IM ID:β为其药用盐。
ASC22(IM ID:δ)
ASC22也已知为恩弗利单抗和KN035，是一种免疫调节剂化合物，具体是纳米抗体，其通常由注射施用并且在本文中称为IM ID:δ。
例如，ASC22在Zhang等人，Structural basis of a novel PD-L1 nanobody forimmune checkpoint blockade,Cell Discovery 3；17004(2017)中有述。
还参见PubChem数据库
(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/substance/387065574，2020年11月2日访问)。
任选地，IM ID:δ为其药用盐。
GS-9620(IM ID:ε)
GS-9620也已知为维托莫德，是一种免疫调节剂化合物，其通常口服施用并且在本文中称为IM ID:ε。
例如，GS-9620在Tumas等人，Preclinical characterization of GS-9620,apotent and selective oral TLR7 agonist,Journal of Hepatology 56:S180(2011)中有述。还参见Lopatin等人，Safety,pharmacokinetics and pharmacodynamics of GS-9620,an oral Toll-like receptor 7 agonist,Antiviral Therapy 18:409-418(2013)。
GS-9620的结构如下：
Figure BDA0003695063620001081
任选地，IM ID:ε为其药用盐。
GS-9688(IM ID:ζ)
GS-9688也已知为Selgantolimod，是一种免疫调节剂化合物，其通常口服施用并且在本文中称为IM ID:ζ。
例如，GS-9688在Mackman等人，Discovery of GS-9688(Selgantolimod),as aPotent and Selective Oral Toll-like Receptor 8 Agonist for the Treatment ofChronic Hepatitis B,Journal of Medicinal Chemistry 63(18):10188-10203(2020)中有述。还参见WO2016141092。
GS-9688的结构如下：
Figure BDA0003695063620001091
任选地，IM ID:ζ为其药用盐。
T101(IM ID:η)
T101也已知为TG1050，是一种免疫调节剂化合物，其通常由注射施用并且在本文中称为IM ID:η。
T101是一种基于非复制性腺病毒5载体的免疫治疗药物，该载体编码独特的大型融合蛋白，该融合蛋白由修饰的HBV核心和聚合酶以及Env蛋白的选定结构域组成。例如，T101在Martin等人，TG1050,an immunotherapeutic to treat chronic hepatitis B,induces robust T cells and exerts an antiviral effect in HBV-persistent mice,Gut 64(12):1961-1971(2015)中有述。
任选地，IM ID:η为其药用盐。
双质粒DNA治疗性疫苗(IM ID:θ)
由Guangzhou Baiyunshan Baidi研制的双质粒DNA治疗性疫苗是一种免疫调节剂化合物，其通常由注射施用并且在本文中称为IM IDθ。双质粒包含编码HBV包膜中间蛋白的pS2.S HBV DNA疫苗质粒和含有人IL-2(hIL-2)和人IFN-γ的融合序列的pFP辅助质粒(pcDNA3.1-/IL2+IFN-γ)。
例如，双质粒DNA治疗性疫苗在Yang等人，Phase IIb trial of in vivoelectroporation mediated dual-plasmid hepatitis B virus DNA vaccine inchronic hepatitis B patients under lamivudine therapy,World Journal ofGastroenterology23(2):306-317(2017)中有述。
双质粒DNA治疗性疫苗的构建在He等人，Construction and identification oftherapeutic double plasmid HBV DNA vaccine,Med J Chin PLA,28(6):493-6(2003)中有述。
任选地，IM ID:θ为其药用盐。
抗原抗体复合疫苗(IM ID:λ)
由HaiTai Pharma研发的抗原抗体复合物疫苗，也已知为酵母源性HBsAg-HBIG复合物、酵母源性免疫原性复合物或YIC，是一种免疫调节剂化合物，其通常由注射施用，并且在本文中简称为IM ID:λ。
例如，抗原抗体复合疫苗在Xu等人，Vaccination with recombinant HBsAg-HBIGcomplex in healthy adults,Vaccine 23:2658-2664(2005)中有述。
任选地，IM ID:λ为其药用盐。
优选的进一步药物组合
参考上面阐述的AV ID和IM ID，以下是本节的进一步药物组合的优选实施例。
表10：包含抗病毒药物和免疫调节剂的药物组合。
Figure BDA0003695063620001101
表11：包含衣壳抑制剂和基因表达抑制剂的药物组合。基因表达抑制剂为HBV(s)-219(AV ID:G)。
Figure BDA0003695063620001111
表12：包含衣壳抑制剂、基因表达抑制剂和免疫调节剂的药物组合。
基因表达抑制剂为HBV(s)-219(AV ID:G)。
Figure BDA0003695063620001112
表10-12显示了根据本节中的进一步药物组合的优选实施例的某些抗病毒化合物和免疫调节剂化合物的选定组合。每个单元格中的相邻ID是指包含具有这些ID的化合物的药物组合物。例如，“Hε”是指包含药物组合，其包含被指代为AV ID:H(Y101)的抗病毒化合物和被指代为IM ID:ε(GS-9620)的免疫调节剂。在表12中，第一列(例如“B+G”)表示包含的衣壳抑制剂和基因表达抑制剂的AV ID(例如AV ID:B和AV ID:G)，并且表12中的每个单元格因此是指包含这些抗病毒化合物以及IM ID所指代的免疫调节剂的药物组合。例如，在表12中，“BGα”是指包含AV ID:B(ABI-H2158)、AV ID:G(HBV(s)-219)和IM ID:α(P1101)的药物组合。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:α、AV ID:B和IM ID:α、AV ID:C和IM ID:α、AV ID:D和IM ID:α、AV ID:E和IM ID:α、AV ID:F和IM ID:α、AV ID:G和IM ID:α、AV ID:H和IM ID:α、AV ID:I和IM ID:α、AV ID:J和IM ID:α、AV ID:K和IM ID:α、AV ID:L和IM ID:α、AV ID:M和IM ID:α、AV ID:N和IM ID:α、AV ID:O和IM ID:α。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:β、AV ID:B和IM ID:β、AV ID:C和IM ID:β、AV ID:D和IM ID:β、AV ID:E和IM ID:β、AV ID:F和IM ID:β、AV ID:G和IM ID:β、AV ID:H和IM ID:β、AV ID:I和IM ID:β、AV ID:J和IM ID:β、AV ID:K和IM ID:β、AV ID:L和IM ID:β、AV ID:M和IM ID:β、AV ID:N和IM ID:β、AV ID:O和IM ID:β。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:γ、AV ID:B和IM ID:γ、AV ID:C和IM ID:γ、AV ID:D和IM ID:γ、AVID:E和IM ID:γ、AV ID:F和IM ID:γ、AV ID:G和IM ID:γ、AV ID:H和IM ID:γ、AV ID:I和IM ID:γ、AV ID:J和IM ID:γ；AV ID:K和IM ID:γ、AV ID:L和IM ID:γ、AV ID:M和IMID:γ；AV ID:N和IM ID:γ、AV ID:O和IM ID:γ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:δ、AV ID:B和IM ID:δ、AV ID:C和IM ID:δ、AV ID:D和IM ID:δ、AV ID:E和IM ID:δ、AV ID:F和IM ID:δ、AV ID:G和IM ID:δ、AV ID:H和IM ID:δ、AV ID:I和IM ID:δ、AV ID:J和IM ID:δ、AV ID:K和IM ID:δ、AV ID:L和IM ID:δ、AV ID:M和IM ID:δ、AV ID:N和IM ID:δ、AV ID:O和IM ID:δ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:ε、AV ID:B和IM ID:ε、AV ID:C和IM ID:ε、AV ID:D和IM ID:ε、AV ID:E和IM ID:ε、AV ID:F和IM ID:ε、AV ID:G和IM ID:ε、AV ID:H和IM ID:ε、AV ID:I和IM ID:ε、AV ID:J和IM ID:ε、AV ID:K和IM ID:ε、AV ID:L和IM ID:ε、AV ID:M和IM ID:ε、AV ID:N和IM ID:ε、AV ID:O和IM ID:ε。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：ID:A和IM ID:ζ、AV ID:B和IM ID:ζ、AV ID:C和IM ID:ζ、AV ID:D和IM ID:ζ、AV ID:E和IMID:ζ、AV ID:F和IM ID:ζ、AV ID:G和IM ID:ζ、AV ID:H和IM ID:ζ、AV ID:I和IM ID:ζ、AVID:J和IM ID:ζ、AV ID:K和IM ID:ζ、AV ID:L和IM ID:ζ、AV ID:M和IM ID:ζ、AV ID:N和IMID:ζ、AV ID:O和IM ID:ζ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:η、AV ID:B和IM ID:η、AV ID:C和IM ID:η、AV ID:D和IM ID:η、AV ID:E和IM ID:η、AV ID:F和IM ID:η、AV ID:G和IM ID:η、AV ID:H和IM ID:η、AV ID:I和IM ID:η、AV ID:J和IM ID:η、AV ID:K和IM ID:η、AV ID:L和IM ID:η、AV ID:M和IM ID:η、AV ID:N和IM ID:η、AV ID:O和IM ID:η。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:θ、AV ID:B和IM ID:θ、AV ID:C和IM ID:θ、AV ID:D和IM ID:θ、AV ID:E和IM ID:θ、AV ID:F和IM ID:θ、AV ID:G和IM ID:θ、AV ID:H和IM ID:θ、AV ID:I和IM ID:θ、AV ID:J和IM ID:θ、AV ID:K和IM ID:θ、AV ID:L和IM ID:θ、AV ID:M和IM ID:θ、AV ID:N和IM ID:θ、AV ID:O和IM ID:θ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和IM ID:λ、AV ID:B和IM ID:λ、AV ID:C和IM ID:λ、AV ID:D和IM ID:λ、AV ID:E和IM ID:λ、AV ID:F和IM ID:λ、AV ID:G和IM ID:λ、AV ID:H和IM ID:λ、AV ID:I和IM ID:λ、AV ID:J和IM ID:λ、AV ID:K和IM ID:λ、AV ID:L和IM ID:λ、AV ID:M和IM ID:λ、AV ID:N和IM ID:λ、AV ID:O和IM ID:λ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A和AV ID:G、AV ID:B和AV ID:G、AV ID:C和AV ID:G、AV ID:D和AV ID:G、AV ID:E和AV ID:G、AV ID:F和AV ID:G、AV ID:H和AV ID:G、AV ID:I和AV ID:G、AV ID:J和AV ID:G、AV ID:K和AV ID:G、AV ID:L和AV ID:G、AV ID:M和AV ID:G、AV ID:N和AV ID:G、AV ID:O和AV ID:G。
在以下列出的实施例中，分号分隔化合物的每种组合。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:α；AVID:D、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:α；AVID:H、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:α；AVID:K、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:α；AVID:N、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:α。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:β；AVID:D、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:β；AVID:H、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:β；AVID:K、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:β；AVID:N、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:β。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:F、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:J、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:M、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:γ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:δ；AVID:D、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:δ；AVID:H、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:δ；AVID:K、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:δ；AVID:N、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:δ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:ε；AVID:D、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:ε；AVID:H、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:ε；AVID:K、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:ε；AVID:N、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:ε。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：ID:A、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:D、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:H、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:K、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:N、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:ζ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:η；AVID:D、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:η；AVID:H、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:η；AVID:K、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:η；AVID:N、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:η。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:θ；AVID:D、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:θ；AVID:H、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:θ；AVID:K、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:θ；AVID:N、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:θ。
在某一实施例中，药物组合包含选自由以下项组成的组的组合，或由该组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:λ；AVID:D、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:λ；AVID:H、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:λ；AVID:K、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:λ；AVID:N、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:λ。
13.应用
本发明的药物组合用于治疗乙型肝炎病毒感染，特别是治疗患有慢性HBV的患者。
本发明的药物组合可用作治疗剂并用于预防。
本发明的药物组合可以作为乙型肝炎病毒靶向疗法和免疫治疗的联合用药。特别地，当用于治疗感染细胞中的HBV时，本发明的药物组合能够影响以下HBV感染参数中的一种或多种：i)减少细胞HBV mRNA，ii)减少血清中的HBV DNA和/或iii)减少HBV病毒抗原，例如HBsAg和HBeAg。在本发明的某一实施例中，对这些参数中的一个或多个的影响与当使用药物组合的单个医学组分进行治疗时所获得的效果相比得到改善。
可以使用HBV感染的原代人肝细胞或HBV感染的HepaRG细胞或ASGPR-HepaRG细胞在体外测量对HBV感染的影响(参见例如PCT/EP2018/078136)。对HBV感染的影响还可以使用感染携带HBV基因组(AAV/HBV)的重组腺相关病毒(AAV)的小鼠的AAV/HBV小鼠模型(DanYang,等人，2014 Cellular&Molecular Immunology 11,71–78)或HBV小圆鼠(可在CovanceShanghai获得，还参见Guo等人2016 Sci Rep 6:2552和Yan等人2017 J Hepatology 66(6):1149-1157)或人源化肝细胞PXB小鼠模型(可在PhoenixBio获得，还参见Kakuni等人2014Int.J.Mol.Sci.15:58-74)在体外测量。对HBsAg和/或HBeAg分泌的抑制可以通过ELISA测定，例如使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic)根据制造商的说明进行。HBV mRNA和pgRNA的减少可通过qPCR测定，例如，如“材料和方法”章节所述。评估测试化合物是否抑制HBV感染的其他方法是通过例如WO 2015/173208中所述的qPCR测量HBV DNA的分泌，或使用Northern印迹杂交、原位杂交或免疫荧光测量。
在本发明的一个实施例中，(例如如本文所述的靶向HBV mRNA的治疗性寡核苷酸和如本文所述的TLR7激动剂的)药物组合提供优于单一化合物治疗(例如单独的治疗性寡核苷酸或单独的TLR7激动剂)的优势。例如，优势可以是i)与单一疗法相比，血清HBV-DNA减少时间延长；ii)与单一疗法相比，HBsAg反弹延迟和/或iii)治疗窗增加。与药物有关的术语“治疗窗口”或“药物窗口”是指可以有效治疗疾病而不会产生毒性作用的药物剂量范围。在本发明的一个实施例中，与单一疗法相比，可以通过组合治疗实现治疗窗的增加。
在本申请的研究中已经观察到，与使用单一疗法时所需的剂量相比，使用组合治疗时采用低3-5倍的剂量可以获得显著改善的效果，并且与高剂量的相同组合相比，采用低3-5倍剂量的组合治疗可以实现基本相同的效果。例如，已经表明，对于单一疗法，当在需要高剂量(7.5mg/kg抗HBV反义寡核苷酸或每2天(QOD)100mg TLR7激动剂)来实现HBsAg的有效减少，当使用更低剂量(1.5mg/kg和100mg每周(QW))的组合时，HBsAg减少至低于检测限，并且到达反弹的时间与更高剂量的单一疗法相比显著延长。此外，当使用低5倍剂量(1.5mg/kg相比于7.5mg/kg)的抗HBV治疗性寡核苷酸与TLR7激动剂的药物组合每周施用一次而不是每隔一天施用一次(对应于剂量减少4倍)时，病毒参数HBsAg的反弹可以延迟到相同程度。针对HBV-DNA减少观察到类似结果。
本发明提供了用于治疗或预防HBV感染的方法，其包括将治疗或预防有效量的本发明的药物组合施用于患有或易受HBV感染的受试者。
本发明的另一方面涉及本发明的药物组合在抑制慢性HBV感染的发展或治疗慢性HBV感染中的用途。
本发明的一个方面是治疗感染HBV的个体，例如患有慢性HBV感染的个体的方法，其包括向感染HBV的个体施用药物有效量的如本文定义的治疗性寡核苷酸和药物有效量的式(I)或(II)的TLR7激动剂：
Figure BDA0003695063620001181
其中X为CH2或S；
对于式(I)，R1为-OH或-H并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
对于式(II)，R1为-OH或-H或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基。
本发明还涉及如在本申请中描述的用作组合治疗中的药物的治疗性寡核苷酸。本发明还涉及在本申请中描述的用作组合治疗中的药物的TLR7激动剂。
特别地，如本文定义的治疗性寡核苷酸，和式(I)或(II)的TLR7激动剂：
Figure BDA0003695063620001182
其中X为CH2或S；
对于式(I)，R1为-OH或-H并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
对于式(II)，R1为-OH或-H或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基；
用于治疗乙型肝炎病毒感染。
本发明的一个实施例是治疗性寡核苷酸在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染(例如慢性HBV病毒感染)的第一药物中的用途，其中第一药物是如本申请中所述的治疗性寡核苷酸并且其中第一药物与第二药物组合施用，其中第二药物是如本申请中所述的TLR7激动剂。
在本发明的一个实施例中，含有治疗性寡核苷酸的药物组合物将作为皮下剂量施用。在本发明的进一步实施例中，TLR7激动剂将以口服剂量施用。由于药物组合物将通过两种不同的施用途径来施用，因此它们可以遵循不同的施用方案。
根据本发明的药物组合通常以有效量施用。
在一个实施例中，如在本申请中所述的治疗性寡核苷酸以1mg/kg至4mg/kg的剂量范围皮下施用，在24至72周(例如在36至60周，例如48周)中每周或每月给药，并且如本申请中所述的TLR7激动剂以每隔一天(QOD)150至170mg范围的单位剂量口服施用8至26周(例如10至24周，例如12或13周)，然后每周施用(QW)持续24至48周(例如30至40周，例如35周)。在每隔一天施用的时期中，可能有10至14周(例如12周)的停药期。所施用的TLR7激动剂的剂数在整个治疗期间为60至100剂之间，例如75至90剂之间，例如81、82、83或84剂。所施用的治疗性寡核苷酸的剂数为6至72之间，例如9至15之间，例如12或48剂。
为了最佳组合效果，活性成分例如治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂的施用间隔小于一个月，例如间隔小于一周，例如间隔两天，例如在同一天。
14.使用方法
I.减少HBsAg表达
在一些实施例中，提供了用于向细胞递送有效量的任一种本发明的药物组合的方法，例如包含本文公开的寡核苷酸(特别是本文公开的RNAi寡核苷酸)的那些药物组合，目的是降低HBsAg的表达。本文提供的方法可用于任何合适的细胞类型。在一些实施例中，细胞是表达HBV抗原的任何细胞(例如，肝细胞、巨噬细胞、单核细胞衍生的细胞、前列腺癌细胞，脑、内分泌组织、骨髓、淋巴结、肺、胆囊、肝脏、十二指肠、小肠、胰腺、肾脏、胃肠道、膀胱、脂肪和软组织及皮肤的细胞)。在一些实施例中，细胞是从受试者获得的并且可能已经经历了有限的传代次数的原代细胞，使得细胞基本上保持其天然表型特性。在一些实施例中，寡核苷酸被递送至的细胞是离体或体外的(即，可被递送至培养中的细胞或细胞所在的生物体)。在具体的实施例中，提供了用于向细胞递送药物组合的方法，所述药物组合例如包含有效量的本文公开的任一种寡核苷酸，特别是本文公开的RNAi寡核苷酸，目的是仅在肝细胞中降低HBsAg的表达。
在一些实施例中，本文公开的药物组合中的寡核苷酸可以使用合适的核酸递送方法引入，包括注射含有寡核苷酸的溶液、用寡核苷酸覆盖的粒子轰击、将细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的溶液，或在寡核苷酸存在下对细胞膜进行电穿孔。可以使用将寡核苷酸递送至细胞的其他适当方法，例如脂质介导的载体转运、化学介导的转运和阳离子脂质体转染(例如磷酸钙)等。
抑制的结果可以通过评估细胞或受试者的一种或多种特性的适当测定来确认，或通过评估指示HBV抗原表达的分子(例如RNA、蛋白质)的生化技术来确认。在一些实施例中，本文提供的药物组合的寡核苷酸或基因表达抑制剂降低HBV抗原表达水平的程度通过将HBV抗原的表达水平(例如，mRNA或蛋白质水平)与适当的对照(例如，未向其递送药物组合或已向其递送阴性对照的细胞或细胞群中的HBV抗原表达水平)进行比较来评估。在一些实施例中，HBV抗原表达的适当对照水平可以是预定水平或值，使得不需要每次都测量对照水平。预定水平或值可以采取多种形式。在一些实施例中，预定水平或值可以是单个截止值，例如中值或平均值。
在一些实施例中，施用本发明的药物组合(例如包含如本文所述的寡核苷酸，特别是本文所述的RNAi寡核苷酸的药物组合)导致细胞中HBV抗原(例如，HBsAg)表达水平降低。在一些实施例中，HBV抗原表达水平的降低可以是与HBV抗原的适当对照水平相比降低至1％或更低、5％或更低、10％或更低、15％或更低、20％或更低、25％或更低、30％或更低、35％或更低、40％或更低、45％或更低、50％或更低、55％或更低、60％或更低、70％或更低、80％或更低、或90％或更低。适当的对照水平可以是未与本发明的药物组合(例如包含如本文所述的寡核苷酸，特别是RNAi寡核苷酸的药物组合)接触的细胞或细胞群中的HBV抗原表达水平。在一些实施例中，根据本文公开的方法将活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)递送至细胞的效果在有限的时间段后进行评估。例如，可以在向细胞中引入活性成分(例如寡核苷酸)后的至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少一、二、三、四、五、六、七、十四、二十一、二十八、三十五、四十二、四十九、五十六、六十三、七十、七十七、八十四、九十一、九十八、105、112、119、126、133、140或147天在细胞中分析HBV抗原的水平。
在一些实施例中，HBV抗原(例如，HBsAg)表达水平的降低在施用后持续延长的时间。在一些实施例中，可检测的HBsAg表达降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后7至70天的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。例如，在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如寡核苷酸)后10至70、10至60、10至50、10至40、10至30或10至20天的时期内持续存在。在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后20至70、20至60、20至50、20至40或20至30天的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后30至70、30至60、30至50或30至40天的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后40至70、40至60、40至50、50至70、50至60或60至70天的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。
在一些实施例中，可检测的HBsAg表达降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后2至21周的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。例如，在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后2至20、4至20、6至20、8至20、10至20、12至20、14至20、16至20或18至20周的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后2至16、4至16、6至16、8至16、10至16、12至16或14至16周的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后2至12、4至12、6至12、8至12或10至12周的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。在一些实施例中，可检测的降低在施用活性成分(例如本发明的药物组合的寡核苷酸)后2至10、4至10、6至10或8至10周的时期内持续存在，特别是当寡核苷酸是反义寡核苷酸时。
在一些实施例中，本发明的药物组合的寡核苷酸(特别是在寡核苷酸是反义寡核苷酸的情况下)以经工程化以在细胞中表达寡核苷酸(例如，其有义链和反义链)的转基因的形式递送。在一些实施例中，本发明的药物组合的寡核苷酸(特别是在寡核苷酸是反义寡核苷酸的情况下)使用经工程化以表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送。可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如，质粒或合成的mRNA)来递送转基因。在一些实施例中，可以将本发明的药物组合的转基因直接注射给受试者。
II.治疗方法
本公开的方面涉及用于治疗受试者的HBV感染的降低HBsAg表达(例如，降低HBsAg表达)的方法。在一些实施例中，方法可以包括向有需要的受试者施用药物组合，所述药物组合包含有效量的本文公开的活性成分，例如本文公开的任一种寡核苷酸。本公开提供了治疗处于HBV感染和/或与HBV感染相关的疾病或病症的风险中(或对其易感)的受试者的预防性法和治疗性方法二者。
在某些方面，本公开提供了一种用于通过向受试者施用治疗剂(例如，治疗组合、寡核苷酸或载体或编码它们的转基因)来在受试者中预防本文所述的疾病或病症的方法。在一些实施例中，特别是在治疗组合的寡核苷酸是RNAi寡核苷酸的情况下，待治疗的受试者是将会从例如肝脏中的HBsAg蛋白的量减少中治疗性受益的受试者。可以通过例如本领域已知的诊断或预后测定中的一种或组合(例如，鉴定肝硬化和/或肝脏炎症)来鉴定处于疾病或病症风险中的受试者。预防剂的施用可以在疾病或病症的特征性症状的检测或表现之前发生，使得疾病或病症得到预防，或者替代地，延迟其进展。
本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量(即能够产生所需治疗结果的量)的治疗组合。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病或病症的量。针对任一位受试者的合适剂量将取决于某些因素，包括受试者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。例如，剂量可以在0.1mg/kg至12mg/kg的范围内。剂量也可以在0.5至10mg/kg的范围内。替代地，剂量可以在1.0至6.0mg/kg的范围内。剂量也可以在3.0至5.0mg/kg的范围内。
在一些实施例中，通过肠内(例如，口服、通过胃饲管、通过十二指肠饲管、经由胃造口术或直肠)、肠胃外(例如，皮下注射、静脉内注射或输注、动脉内注射或输注、骨内输注、肌肉内注射、脑内注射、脑室内注射、鞘内注射)、局部(例如，表皮、吸入、经由滴眼剂或通过粘膜)，或通过直接注射到靶器官(例如，受试者的肝脏)而向受试者施用本文公开的治疗组合的组合物中的任一种。通常，本文公开的治疗组合的寡核苷酸通过静脉内或皮下施用。
作为一组非限制性示例，本公开的治疗组合的寡核苷酸通常将每季度(每三个月一次)、每两个月(每两个月一次)、每月或每周施用。例如，寡核苷酸可以每一周、两周或三周施用。寡核苷酸可以每天施用。
在优选的实施例中，本发明的RNAi化合物是靶向HBV的siRNA，其以0.1mg/kg至7mg/kg之间，优选0.5mg/kg至6.5mg/kg之间，最优选1mg/kg和6mg/kg之间的剂量皮下施用。在某一实施例中，每两周一次、每四周一次或每六周一次施用剂量。在优选的实施例中，剂量每月施用一次。在特别优选的实施例中，每月一次施用1mg/kg与6mg/kg之间的剂量。一个月一次被理解为意味着以大约一个日历月的长度的间隔施用连续剂量。
在一些实施例中，待治疗的受试者是人或非人灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物，例如狗和猫；牲畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠等动物。
实施例
本发明的以下实施例可以与本文描述的任何其他实施例联合使用。
1.一种药物组合，所述药物组合包含治疗性寡核苷酸和式(I)或(II)的TLR7激动剂，或由其组成：
Figure BDA0003695063620001241
其中X为CH2或S；
对于式(I)，R1为-OH或-H并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基，
对于式(II)，R1为-OH或-H或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基或乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基，
或其药用盐、对映体或非对映体。
2.如实施例1所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸为RNAi寡核苷酸。
3.如实施例2所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸为靶向HBV的寡核苷酸(RNAi ID NO:1)。
4.如实施例2或3所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸为靶向HBsAg mRNA的寡核苷酸(RNAi ID NO:2)。
5.如实施例2-4中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸为降低HBsAgmRNA的表达的寡核苷酸(RNAi ID NO:3)。
6.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸是包含长度为19至30个核苷酸的反义链的寡核苷酸(RNAi ID NO:4)，其中所述反义链包含与如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:33)中所示的HBsAg mRNA序列互补的区域。
7.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸是用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表达的寡核苷酸(RNAi ID NO:5)，所述寡核苷酸包含长度为19至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含与如ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ IDNO:33)中所示的HBsAg mRNA序列互补的区域。
8.如实施例6或7所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸进一步包括长度为19至50个核苷酸的有义链,其中所述有义链与所述反义链形成双链体区域。
9.如实施例8所述的药物组合，其中所述有义链包括与如UUNUUGUGAGGAUUN(SEQID NO:34)中所示的序列互补的区域。
10.如实施例8或9所述的药物组合，其中所述有义链包括与如5′-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQ ID NO:35)中所示的序列互补的区域。
11.如实施例9所述的药物组合，其中所述反义链包括如UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO:36)中所示的序列。
12.如实施例9所述的药物组合，其中所述反义链由如UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQ ID NO:37)中所示的序列组成。
13.如实施例9所述的药物组合，其中所述反义链由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列组成。
14.如实施例8至12中任一项所述的药物组合，其中所述有义链包括如ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO:39)中所示的序列。
15.如实施例8至14中任一项所述的药物组合，其中所述有义链包括如GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:40)中所示的序列。
16.如实施例8至14中任一项所述的药物组合，其中所述有义链由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列组成。
17.如实施例8至14中任一项所述的药物组合，其中所述有义链由如GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:42)中所示的序列组成。
18.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸是用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中所述有义链包括如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQID NO:41)中所示的序列，其中所述反义链包括如UUAUUGUGAGGAUUUUUGU CGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列，
其中所述反义链和所述有义链各自包含一个或多个2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物，并且其中所述有义链与一个或多个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
19.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸是用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
所述有义链由包括如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸；在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链与一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合；并且
所述反义链包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，和至少三个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
20.如实施例19所述的药物组合，其中所述有义链在位置1和2处的核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。
21.如实施例19或20所述的药物组合，其中所述反义链在核苷酸1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22之间包含五个硫代磷酸酯键。
22.如实施例19至21中任一项所述的药物组合，其中所述反义链的5'-核苷酸具有以下结构：
Figure BDA0003695063620001271
23.如实施例19至22中任一项所述的药物组合，其中所述有义链上-GAAA-序列的一个或多个核苷酸与单价GalNAc部分缀合。
24.如实施例23所述的药物组合，其中所述有义链上-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNAc部分缀合。
25.如实施例24所述的药物组合，其中-GAAA-基序包括以下结构：
Figure BDA0003695063620001281
其中：
L代表键、点击化学手柄，或长度为1至20个(包括端点)连续的共价键合原子的接头，其选自由以下项组成的组：取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代和未取代的亚杂烷基、取代和未取代的亚杂烯基、取代和未取代的亚杂炔基以及它们的组合；并且
X为O、S或N。
26.如实施例25所述的药物组合，其中L为缩醛接头。
27.如实施例25或26所述的药物组合，其中X为O。
28.如实施例20所述的药物组合，其中所述-GAAA-序列包括以下结构：
Figure BDA0003695063620001291
29.如实施例8所述的药物组合，其中所述有义链在其3'-端包含如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1与S2之间形成长度为最多6个核苷酸的环。
30.如实施例29所述的药物组合，其中L为四环。
31.如实施例29或30所述的药物组合，其中L在S1与S2之间形成长度为4个核苷酸的环。
32.如实施例29至31中任一项所述的药物组合，其中L包括如GAAA所示的序列。
33.如实施例29至32中任一项所述的药物组合，其中所述茎环的L的最多4个核苷酸分别与单独的GalNAc缀合。
34.如实施例6至16中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷酸。
35.如实施例34所述的药物组合，其中所述修饰的核苷酸包括2'-修饰。
36.如实施例35所述的药物组合，其中所述2'-修饰为选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸。
37.如实施例6至16中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸的所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
38.如实施例6至16中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸包括至少一个修饰的核苷酸间键。
39.如实施例38所述的药物组合，其中所述至少一个修饰的核苷酸间键为硫代磷酸酯键。
40.如实施例6至16中任一项所述的药物组合，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
41.如实施例6至16中任一项所述的药物组合，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与靶向配体缀合。
42.如实施例41所述的药物组合，其中所述靶向配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
43.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸是用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
所述有义链由如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列组成并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的硫代磷酸酯键，其中所述有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNAc部分缀合；并且
反义链由如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列组成并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间、在位置2和3处的核苷酸之间、在位置3和4处的核苷酸之间、在位置20和21处的核苷酸之间和在位置21和22处的核苷酸之间的硫代磷酸酯键，
其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含甲氧基膦酸酯(MOP)(RNAi ID NO:6)。
44.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸是用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
所述有义链包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸；在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNAc部分缀合，其中所述-GAAA-序列包含以下结构：
Figure BDA0003695063620001321
所述反义链包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在核苷酸1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22的之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure BDA0003695063620001322
(RNAi ID NO:7)。
45.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸具有图29A中描述的结构(RNAi ID NO:8)。
46.如实施例2-5中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸为寡核苷酸HBV(s)-219(RNAi ID NO:9)。
47.如实施例1所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸是长度为13至22个核苷酸的GalNAc缀合的反义寡核苷酸，具有与来自SEQ ID NO:1的位置1530至1602的连续序列100％互补的至少12个核苷酸的连续核苷酸序列。
48.如实施例47所述的药物组合，其中所述连续核苷酸序列与选自由以下项组成的组的靶序列100％互补：SEQ ID NO:1的1530至1598；1530-1543；1530-1544；1531-1543；1551-1565；1551-1566；1577-1589；1577-1591；1577-1592；1578-1590；1578-1592；1583-1598；1584-1598；1585-1598和1583-1602。
49.如实施例47或48所述的药物组合，其中所述连续核苷酸序列的长度在12与16个核苷酸之间。
50.如实施例47至49中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
gcgtaaagagagg(SEQ ID NO:2)；
gcgtaaagagaggt(SEQ ID NO:3)；
cgcgtaaagagaggt(SEQ ID NO 4)；
agaaggcacagacgg(SEQ ID NO 5)；
gagaaggcacagacgg(SEQ ID NO 6)；
agcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 7)；
gaagtgcacacgg(SEQ ID NO 8)；
gcgaagtgcacacgg(SEQ ID NO 9)；
agcgaagtgcacacg(SEQ ID NO:10)；
cgaagtgcacacg(SEQ ID NO 11)；
aggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:12)
aggtgaagcgaagtg(SEQ ID NO:13)；
aggtgaagcgaagt(SEQ ID NO 14)；和
gcagaggtgaagcgaagtgc(SEQ ID NO:29)，或其药用盐。
51.如实施例47至50中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列是式5'-F-G-F'-3'的缺口聚物，其中区域F和F'独立地由2-5个经2'糖修饰的核苷酸组成且限定所述F和F'区域的5'和3'端，并且G为能够募集RNA酶H的介于6个与10个DNA核苷之间的区域。
52.如实施例51所述的药物组合，其中所述经2’糖修饰的核苷独立地选自由2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧基乙基-RNA、2'-氨基-DNA、2'-氟-DNA、2'-氟-ANA和LNA核苷组成的组。
53.如实施例51或52所述的药物组合，其中一或多个经2'糖修饰的核苷为MOE核苷。
54.如实施例51或52所述的药物组合，其中一或多个经2'糖修饰的核苷为LNA核苷。
55.如实施例54所述的药物组合，其中经修饰的LNA核苷选自氧基-LNA、氨基-LNA、硫代-LNA、cET和ENA。
56.如实施例54或55所述的药物组合，其中所述经修饰的LNA核苷为具有以下2'-4'桥–O-CH2-的氧基-LNA。
57.如实施例56所述的药物组合，其中所述氧基-LNA为β-D-氧基-LNA。
58.如实施例54或55所述的药物组合，其中所述经修饰的LNA核苷为具有以下2'-4'桥–O-CH(CH3)-的cET。
59.如实施例58所述的药物组合，其中所述cET为(S)cET，即6'(S)甲基-β-D-氧基-LNA。
60.如实施例54或55所述的药物组合，其中所述LNA为ENA，具有以下2'–4'桥–O-CH2-CH2-。
61.如实施例47至60中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列选自由以下项组成的组：
GCGtaaagagaGG(SEQ ID NO:2)；
GCGtaaagagAGG(SEQ ID NO:2)；
GCGtaaagagaGGT(SEQ ID NO:3)；
CGCgtaaagagaGGT(SEQ ID NO:4)；
AGAaggcacagaCGG(SEQ ID NO:5)；
GAGaaggcacagaCGG(SEQ ID NO:6)；
AGCgaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:7)；
GAAgtgcacacGG(SEQ ID NO:8)；
GAAgtgcacaCGG(SEQ ID NO:8)；
GCGaagtgcacaCGG(SEQ ID NO:9)；
AGCgaagtgcacACG(SEQ ID NO:10)；
CGAagtgcacaCG(SEQ ID NO:11)；
AGGtgaagcgaagTGC(SEQ ID NO:12)；
AGGtgaagcgaaGTG(SEQ ID NO:13)
AGgtgaagcgaAGTG(SEQ ID NO:13)；
AGGtgaagcgaAGT(SEQ ID NO:14)；和
GCAGAGgtgaagcgaAGTGC(SEQ ID NO:29)
其中大写字母表示LNA或MOE核苷并且小写字母表示DNA核苷。
62.如实施例47至61中任一项所述的药物组合，其中所述连续核苷酸序列内至少50％的核苷间键为硫代磷酸酯核苷间键。
63.如实施例47至62中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的连续核苷酸序列内的所有核苷间键都为硫代磷酸酯核苷间键。
64.如实施例47至63中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的GalNAc缀合物为二价、三价或四价GalNAc簇。
65.如实施例64所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合物选自图1B、1D或1J。
66.如实施例47至65中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的所述GalNAc缀合物和所述连续核苷酸序列通过包含两个、三个、四个或五个磷酸二酯连接的DNA核苷的PO接头共价连接。
67.如实施例66所述的药物组合，其中所述PO接头是所述反义寡核苷酸的部分，并且由胞嘧啶和腺嘌呤(CA)的二核苷酸序列组成，其中至少有两个磷酸二酯键，一个在C与A之间，一个在GalNAc簇上。
68.如实施例47至67中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸的长度为12至18个核苷酸。
69.如实施例47至68中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸选自由以下项组成的组：
Figure BDA0003695063620001361
其中大写粗体字母表示β-D-氧基-LNA单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键；上标m表示含有5-甲基胞嘧啶碱基的DNA或β-D-氧基-LNA单元；GN2-C6表示具有C6接头的GalNAc2缀合物；或其药用盐。
69.如实施例47至68中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸为5’-图1J-o G s C s A s G s A sgsgstsgsasasgscsgsas A s G s T s G sC-3’(图2)，其中带下划线的大写字母表示MOE单元；小写字母表示DNA单元；下标“o”表示磷酸二酯键；下标“s”表示硫代磷酸酯键。
70.如实施例1至69中任一项所述的药物组合，其中所述TLR7激动剂为式(III)：
Figure BDA0003695063620001371
其中R1为–OH或乙酰氧基并且R2为1-乙酰氧基丙基或1-羟基丙基或1-羟基甲基
或其药用盐、对映体或非对映体。
71.如实施例1至69中任一项所述的药物组合，其中所述TLR7激动剂为式(IV)：
Figure BDA0003695063620001372
其中R1为乙酰氧基(环丙基)甲基或乙酰氧基(丙炔-1-基)甲基。
72.如实施例1至69中任一项所述的药物组合，其中所述TLR7激动剂为式(V)：
Figure BDA0003695063620001373
其中R1为-OH并且R2为1-羟基丙基或羟基甲基
或其药用盐、对映体或非对映体。
73.如实施例0至72中任一项所述的药物组合，其中所述TLR7激动剂选自由以下项组成的组：
[(1S)-1-[(2S,4R,5R)-5-(5-氨基-2-氧代-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-4-羟基-四氢呋喃-2-基]丙基]乙酸酯(CMP ID NO:VI)；
5-氨基-3-[(2R,3R,5S)-3-羟基-5-[(1S)-1-羟基丙基]四氢呋喃-2-基]-6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO:VII)；
5-氨基-3-[(2R,3R,5S)-3-羟基-5-[(1S)-1-羟基丙基]四氢呋喃-2-基]噻唑并
[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO:VIII)；
5-氨基-3-(3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP IDNO:IX)；
5-氨基-3-(2’-O-乙酰基-3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2-酮(CMP ID NO:X)；
5-氨基-3-(3’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3H,6H-噻唑并[4,5-d]嘧啶-2,7-二酮(CMP ID NO:XI)；
[(S)-[(2S,5R)-5-(5-氨基-2-氧代-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-基]-环丙基-甲基]乙酸酯(CMP ID NO:XII)；和
(1S)-1-[(2S,5R)-5-(5-氨基-2-氧代-噻唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-1,3-氧硫杂环戊烷-2-基]丁-2-炔基]乙酸酯(CMP ID NO:XIII)；
或其药用盐、对映体或非对映体。
74.如实施例2-46和70-73中任一项所述的药物组合，其中包含RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂的所述组合选自由以下组合组成的组：
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:2和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:VI；RNAi IDNO:6和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:VI；RNAi ID NO:8和CMP ID NO:VI；RNAiID NO:9和CMP ID NO:VI；
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:VII,RNAi ID NO:2和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:VII；RNAiID NO:6和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:8和CMP ID NO:VII；RNAi ID NO:9和CMP ID NO:VII；
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:VIII,RNAi ID NO:2和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:6和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:VIII；RNAi ID NO:8和CMPID NO:VIII；RNAi ID NO:9和CMP ID NO:VIII；
RNAi ID NO:1和CMP ID NO:XIII,RNAi ID NO:2和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:3和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:4和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:5和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:6和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:7和CMP ID NO:XIII；RNAi ID NO:8和CMPID NO:XIII，或RNAi ID NO:9和CMP ID NO:XIII；
或其药用盐、对映体或非对映体。
75.如实施例2-46至70-73中任一项所述的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸为RNAi ID NO:7：
一种寡核苷酸，其包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
有义链包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNac部分缀合，其中-GAAA-序列包含以下结构：
Figure BDA0003695063620001401
反义链包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在核苷酸1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22的之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure BDA0003695063620001402
并且TLR7激动剂为CMP ID NO:VI:
Figure BDA0003695063620001411
或其药用盐、对映体或非对映体。
76.如实施例47至73中任一项所述的药物组合，其中包含GalNAc缀合的反义寡核苷酸和TLR7激动剂的所述组合选自由以下组合组成的组：CMP ID NO:15_1和VI、CMP IDNO:15_2和VI；CMP ID NO:16_1和VI；CMP ID NO:20_1和VI；CMP ID NO:23_1和VI；CMP IDNO:26_1和VI；CMP ID NO:29_1和VI；CMP ID NO:15_1和VII、CMP ID NO:15_2和VII；CMP IDNO:16_1和VII；CMP ID NO:20_1和VII；CMP ID NO:23_1和VII；CMP ID NO:26_1和VII；CMPID NO:29_1和VII；CMP ID NO:15_1和VIII、CMP ID NO:15_2和VIII；CMP ID NO:16_1和VIII；CMP ID NO:20_1和VIII；CMP ID NO:23_1和VII；CMP ID NO:26_1和VIII；CMP ID NO:29_1和VIII；CMP ID NO:15_1和XIII、CMP ID NO:15_2和XIII；CMP ID NO:16_1和XIII；CMPID NO:20_1和XIII；CMP ID NO:23_1和XIII；CMP ID NO:26_1和XIII；和CMP ID NO:29_1和XIII；或其药用盐、对映体或非对映体。
77.如实施例47至73中任一项所述的药物组合，其中所述GalNAc缀合的反义寡核苷酸是如图5中所示的CMP ID NO:15_1，并且所述TLR7激动剂是CMP ID NO:VI：
Figure BDA0003695063620001412
或其药用盐、对映体或非对映体。
78.如实施例1至77中任一项所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸与药用盐一起配制。
79.如实施例78所述的药物组合物，其中所述药用盐为金属阳离子，优选地其中所述药用盐为Na+或K+。
80.如实施例1至79中任一项所述的药物组合，其中根据实施例1至79中任一项所述的治疗性寡核苷酸和TLR7激动剂与药用载体一起配制。
81.如实施例80所述的药物组合，其中所述药用载体为水。
82.如实施例1至81中任一项所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸配制在磷酸盐缓冲盐水中。
83.如实施例1至82中任一项所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸配制用于皮下注射并且所述TLR7激动剂配制用于口服施用。
84.如实施例1至82中任一项所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸配制用于静脉内注射并且所述TLR7激动剂配制用于口服施用。
85.如实施例2至46、74、75和78-82中任一项所述的药物组合，其中所述治疗性寡核苷酸是配制用于皮下注射的siRNA并且所述TLR7激动剂配制用于口服施用。
86.如实施例1至85中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包含RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂，其中所述药物组合进一步包含CpAM(核心蛋白变构调节剂)。
87.如实施例86所述的药物组合，其中所述CpAM具有根据如下所示的化合物(CpAM1)的式：
Figure BDA0003695063620001421
其中
R1为氢、卤素或C1-6烷基；
R2为氢或卤素；
R3为氢或卤素；
R4为C1-6烷基；
R5为氢、羟基C1-6烷基、氨基羰基、C1-6烷氧基羰基或羧基；
R6为氢、C1-6烷氧基羰基或羧基-CmH2m-,
X为羰基或磺酰基；
Y为-CH2-、-O-或-N(R7)-,
其中R7为氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C3-7环烷基-CmH2m-、C1-6烷氧基羰基-CmH2m-、-CtH2t-COOH、-卤代C1-6烷基-COOH、-(C1-6烷氧基)C1-6烷基-COOH、-C1-6烷基-O-C1-6烷基-COOH、-C3-7环烷基-CmH2m-COOH、-CmH2m-C3-7环烷基-COOH、羟基-CtH2t-、羧螺[3.3]庚基或羧基苯基-CmH2m-、羧基吡啶基-CmH2m-；
W为-CH2-、-C(C1-6烷基)2-、-O-或羰基；
n为0或1；
m为0-7；
t为1-7；
或其药用盐，或对映体，或非对映体。
88.如实施例86或87所述的药物组合，其中所述CpAM为化合物(CpAM2)
Figure BDA0003695063620001431
或其药用盐、对映体或非对映体。
89.一种包含RNAi寡核苷酸、TLR7激动剂和CpAM的药物组合，其中所述RNAi寡核苷酸为RNAi ID NO:7：
一种寡核苷酸，其包含与反义链形成双链体区域的有义链，其中：
所述有义链包含如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGA AAGGCUGC(SEQ ID NO:41)中所示的序列并且包含在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在位置1和2处的核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链上的-GAAA-序列的每个核苷酸与单价GalNAc部分缀合，其中所述-GAAA-序列包含以下结构：
Figure BDA0003695063620001441
反义链包含如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:38)中所示的序列并且包含在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸、在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸和在核苷酸1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22的之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure BDA0003695063620001451
其中所述TLR7激动剂为CMP ID NO:VI：
Figure BDA0003695063620001452
或其药用盐、对映体或非对映体；
并且其中所述CpAM为化合物(CpAM2)：
Figure BDA0003695063620001453
或其药用盐、对映体或非对映体。
90.一种药物组合物，其包括根据实施例1-89中任一项所述的药物组合。
91.一种多部件试剂盒，其包括根据实施例1至89中任一项所述的治疗性寡核苷酸以及包装插页，所述包装插页具有与TLR7激动剂一起用于治疗乙型肝炎病毒感染的施用说明。
92.如实施例91所述的多部件试剂盒，其中所述包装插页中提及的所述TLR7激动剂是根据实施例1至89中任一项所述的TLR7激动剂。
93.如实施例91或92所述的多部件试剂盒，其中所述试剂盒包括根据实施例1至89中任一项所述的治疗性寡核苷酸和根据实施例1至89中任一项所述的TLR7激动剂。
94.如实施例91至93中任一项所述的多部件试剂盒，其中所述治疗性寡核苷酸配制用于皮下注射并且所述TLR7激动剂配制用于口服施用。
95.如实施例91至94中任一项所述的多部件试剂盒，其中所述包装插页描述慢性乙型肝炎病毒感染的治疗。
96.如实施例1至95中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒，其中所述治疗性寡核苷酸为转基因的形式，所述转基因被工程化为在细胞中表达所述寡核苷酸。
97.如实施例1至96中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途。
98.如实施例97所述的用途，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
99.如实施例97或98所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂以药物有效量施用。
100.如实施例97至99中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸每周施用并且所述TLR7激动剂每隔一天施用。
101.如实施例97至100中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸每次施用1至4mg/kg的剂量，并且所述TLR7激动剂每次施用150至170mg的剂量。
102.如实施例97至101中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸施用48周，并且施用84剂TLR7激动剂。
103.如实施例97至102中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂的所述施用在同一周开始。
104.如实施例97至103中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸是用于皮下注射的剂型并且所述TLR7激动剂是用于口服施用的剂型。
105.如实施例97至104中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸的剂量为100至150mg/ml并且所述TLR7激动剂的剂量为150至170mg。
106.如实施例97至105中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸在没有用靶向编码HBV mRNA转录物的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治疗的情况下施用。
107.如实施例97至106中任一项所述的用途，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
108.如实施例97至107中任一项所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
109.如实施例97至108中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在细胞中表达所述寡核苷酸。
110.如实施例1至96中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在药物中的使用。
111.如实施例1至96中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在治疗乙型肝炎病毒感染中的使用。
112.如实施例110或111所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
113.如实施例110至112中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂以药物有效量施用。
114.如实施例110至113中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸每周施用并且所述TLR7激动剂每隔一天施用。
115.如实施例110至114中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸每次施用1至4mg/kg的剂量，并且所述TLR7激动剂每次施用150至170mg的剂量。
116.如实施例110至115中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸施用48周，并且施用84剂TLR7激动剂。
117.如实施例110至116中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂的所述施用在同一周开始。
118.如实施例110至117中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸是用于皮下注射的剂型并且所述TLR7激动剂是用于口服施用的剂型。
119.如实施例110至118中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸的剂量为100至150mg/ml并且所述TLR7激动剂的剂量为150至170mg。
120.如实施例110至119中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸在没有用靶向编码HBV mRNA转录物的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治疗的情况下施用。
121.如实施例110至120中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
122.如实施例110至121中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
123.如实施例110至122中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述治疗性寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在细胞中表达所述寡核苷酸。
124.治疗性寡核苷酸在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的第一药物中的用途，其中所述第一药物是根据实施例1至96中任一项所述的治疗性寡核苷酸并且其中所述第一药物与第二药物组合施用，其中所述第二药物是根据实施例1至96中任一项所述的TLR7激动剂。
125.如实施例1至96中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在制备药物中的用途。
126.如实施例1至96中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
127.如实施例124至126中任一项所述的用途，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
128.如实施例124至127中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂以药物有效量施用。
129.如实施例124至128中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸每周施用并且所述TLR7激动剂每隔一天施用。
130.如实施例124至129中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸每次施用1至4mg/kg的剂量，并且所述TLR7激动剂每次施用150至170mg的剂量。
131.如实施例124至130中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸施用48周，并且施用84剂TLR7激动剂。
132.如实施例124至131中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂的所述施用在同一周开始。
133.如实施例124至132中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸是用于皮下注射的剂型并且所述TLR7激动剂是用于口服施用的剂型。
134.如实施例124至133中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸的剂量为100至150mg/ml并且所述TLR7激动剂的剂量为150至170mg。
135.如实施例124至134中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸在没有用靶向编码HBV mRNA转录物的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治疗的情况下施用。
136.如实施例124至135中任一项所述的用途，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
137.如实施例124至136中任一项所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
138.如实施例124至137中任一项所述的用途，其中所述治疗性寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在细胞中表达所述寡核苷酸。
139.一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向患有乙型肝炎病毒感染的受试者施用治疗有效量的根据实施例1至96中任一项所述的治疗性寡核苷酸与治疗有效量的根据实施例1至90或93至96中任一项所述的TLR7激动剂的组合。
140.一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向患有乙型肝炎病毒感染的受试者施用治疗有效量的根据实施例1至96中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒。
141.如实施例139或140所述的方法，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
142.如实施例139至141中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂以药物有效量施用。
143.如实施例139至142中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸每周施用并且所述TLR7激动剂每隔一天施用。
144.如实施例139至143中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸每次施用1至4mg/kg的剂量，并且所述TLR7激动剂每次施用150至170mg的剂量。
145.如实施例139至144中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸施用48周，并且施用84剂TLR7激动剂。
146.如实施例139至145中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸和所述TLR7激动剂的所述施用在同一周开始。
147.如实施例139至146中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸是用于皮下注射的剂型并且所述TLR7激动剂是用于口服施用的剂型。
148.如实施例139至147中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸的剂量为100至150mg/ml并且所述TLR7激动剂的剂量为150至170mg。
149.如实施例139至148中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸在没有用靶向编码HBV mRNA转录物的非表面抗原的RNAi寡核苷酸治疗的情况下施用。
150.如实施例139至149中任一项所述的方法，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
151.如实施例139至150中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
152.如实施例139至151中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在细胞中表达所述寡核苷酸。
153.一种降低细胞中的乙型肝炎病毒表面抗原的表达的方法，所述方法包括向所述细胞递送根据实施例1至90中任一项所述的药物组合或组合物。
154.如实施例153所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
155.如实施例153或154所述的方法，其中所述细胞是体内的。
156.如实施例153或154所述的方法，其中所述细胞是体外的。
157.如实施例153至156中任一项所述的方法，其中所述治疗性寡核苷酸以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在所述细胞中表达所述寡核苷酸。
158.基本上如本文并参照附图所述的药物组合、组合物、试剂盒、用途或方法。
进一步的实施例
1.一种用于治疗HBV的药物组合，其包括至少两种活性成分或前药，所述至少两种活性成分或前药选自抗病毒化合物、免疫调节剂化合物及它们的前药。
2.根据实施例1所述的药物组合，其中所述药物组合包括抗病毒化合物和免疫调节剂化合物。
3.根据实施例2所述的药物组合，其中所述抗病毒化合物选自KL060332(AV ID:A)、ABI-H2158(AV ID:B)、ABI-H0731(AV ID:C)、QL-007(AV ID:D)、GLS4(AV ID:E)、JNJ-6379(AV ID:F)、HBV(s)-219(AV ID:G)、Y101(AV ID:H)、帕拉德福韦(AV ID:I)、HH-003(AVID:J)、APG-1387(AV ID:K)、异硫氟啶(AV ID:L)、盐酸艾咪朵尔(AV ID:M)、贺普拉肽(AVID:N)和HS-10234(AV ID:O)。
4.根据实施例1或2所述的药物组合，其中所述免疫调节剂化合物选自P1101(IMID:α)、HLX10(IM ID:β)、TQ-A3334(IM ID:γ)、ASC22(IM ID:δ)、GS-9620(IM ID:ε)、GS-9688(IM ID:ζ)、T101(IM ID:η)、双质粒DNA治疗性疫苗(IM ID:θ)和抗原抗体复合疫苗(IMID:λ)。
5.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:α、AV ID:B和IM ID:α、AV ID:C和IM ID:α、AV ID:D和IM ID:α、AV ID:E和IM ID:α、AV ID:F和IM ID:α、AV ID:G和IM ID:α、AV ID:H和IM ID:α、AV ID:I和IM ID:α、AV ID:J和IM ID:α、AV ID:K和IM ID:α、AV ID:L和IM ID:α、AV ID:M和IM ID:α、AV ID:N和IM ID:α、AV ID:O和IM ID:α。
6.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:β、AV ID:B和IM ID:β、AV ID:C和IM ID:β、AV ID:D和IM ID:β、AV ID:E和IM ID:β、AV ID:F和IM ID:β、AV ID:G和IM ID:β、AV ID:H和IM ID:β、AV ID:I和IM ID:β、AV ID:J和IM ID:β、AV ID:K和IM ID:β、AV ID:L和IM ID:β、AV ID:M和IM ID:β、AV ID:N和IM ID:β、AV ID:O和IM ID:β。
7.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:γ、AV ID:B和IM ID:γ、AV ID:C和IM ID:γ、AV ID:D和IM ID:γ、AV ID:E和IM ID:γ、AV ID:F和IM ID:γ、AV ID:G和IMID:γ、AV ID:H和IM ID:γ、AV ID:I和IM ID:γ、AV ID:J和IM ID:γ；AV ID:K和IM ID:γ、AV ID:L和IM ID:γ、AV ID:M和IM ID:γ；AV ID:N和IM ID:γ、AV ID:O和IM ID:γ。
8.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:δ、AV ID:B和IM ID:δ、AV ID:C和IM ID:δ、AV ID:D和IM ID:δ、AV ID:E和IM ID:δ、AV ID:F和IM ID:δ、AV ID:G和IM ID:δ、AV ID:H和IM ID:δ、AV ID:I和IM ID:δ、AV ID:J和IM ID:δ、AV ID:K和IM ID:δ、AV ID:L和IM ID:δ、AV ID:M和IM ID:δ、AV ID:N和IM ID:δ、AV ID:O和IM ID:δ。
9.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:ε、AV ID:B和IM ID:ε、AV ID:C和IM ID:ε、AV ID:D和IM ID:ε、AV ID:E和IM ID:ε、AV ID:F和IM ID:ε、AV ID:G和IM ID:ε、AV ID:H和IM ID:ε、AV ID:I和IM ID:ε、AV ID:J和IM ID:ε、AV ID:K和IM ID:ε、AV ID:L和IM ID:ε、AV ID:M和IM ID:ε、AV ID:N和IM ID:ε、AV ID:O和IM ID:ε。
10.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：ID:A和IM ID:ζ、AV ID:B和IM ID:ζ、AV ID:C和IMID:ζ、AV ID:D和IM ID:ζ、AV ID:E和IM ID:ζ、AV ID:F和IM ID:ζ、AV ID:G和IM ID:ζ、AVID:H和IM ID:ζ、AV ID:I和IM ID:ζ、AV ID:J和IM ID:ζ、AV ID:K和IM ID:ζ、AV ID:L和IMID:ζ、AV ID:M和IM ID:ζ、AV ID:N和IM ID:ζ、AV ID:O和IM ID:ζ。
11.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:η、AV ID:B和IM ID:η、AV ID:C和IM ID:η、AV ID:D和IM ID:η、AV ID:E和IM ID:η、AV ID:F和IM ID:η、AV ID:G和IM ID:η、AV ID:H和IM ID:η、AV ID:I和IM ID:η、AV ID:J和IM ID:η、AV ID:K和IM ID:η、AV ID:L和IM ID:η、AV ID:M和IM ID:η、AV ID:N和IM ID:η、AV ID:O和IM ID:η。
12.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:θ、AV ID:B和IM ID:θ、AV ID:C和IM ID:θ、AV ID:D和IM ID:θ、AV ID:E和IM ID:θ、AV ID:F和IM ID:θ、AV ID:G和IM ID:θ、AV ID:H和IM ID:θ、AV ID:I和IM ID:θ、AV ID:J和IM ID:θ、AV ID:K和IM ID:θ、AV ID:L和IM ID:θ、AV ID:M和IM ID:θ、AV ID:N和IM ID:θ、AV ID:O和IM ID:θ。
13.根据实施例1-3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:λ、AV ID:B和IM ID:λ、AV ID:C和IM ID:λ、AV ID:D和IM ID:λ、AV ID:E和IM ID:λ、AV ID:F和IM ID:λ、AV ID:G和IM ID:λ、AV ID:H和IM ID:λ、AV ID:I和IM ID:λ、AV ID:J和IM ID:λ、AV ID:K和IM ID:λ、AV ID:L和IM ID:λ、AV ID:M和IM ID:λ、AV ID:N和IM ID:λ、AV ID:O和IM ID:λ。
14.根据实施例1所述的药物组合，其中所述药物组合包括作为衣壳抑制剂的第一抗病毒化合物和作为基因表达抑制剂的第二抗病毒化合物。
15.根据实施例14所述的药物组合，其中所述衣壳抑制剂选自KL060332(AV ID:A)、ABI-H2158(AV ID:B)、ABI-H0731(AV ID:C)、QL-007(AV ID:D)、GLS4(AV ID:E)、JNJ-6379(AV ID:F)。
16.根据实施例14或15所述的药物组合，其中所述基因表达抑制剂为HBV(s)-219(AV ID:G)。
17.根据实施例14-16中任一项所述的药物组合，其中包含在所述组合中的唯一的所述基因表达抑制剂由HBV(s)-219(AV ID:G)。
18.根据实施例14-17中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和AV ID:G、AV ID:B和AV ID:G、AV ID:C和AV ID:G、AV ID:D和AV ID:G、AV ID:E和AV ID:G、AV ID:F和AV ID:G、AV ID:H和AV ID:G、AV ID:I和AV ID:G、AV ID:J和AV ID:G、AV ID:K和AV ID:G、AV ID:L和AV ID:G、AV ID:M和AV ID:G、AV ID:N和AV ID:G、AV ID:O和AV ID:G.19。根据实施例14-18中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合进一步包括免疫调节剂化合物。
20.根据实施例19所述的药物组合，其中所述免疫调节剂化合物选自P1101(IMID:α)、HLX10(IM ID:β)、TQ-A3334(IM ID:γ)、ASC22(IM ID:δ)、GS-9620(IM ID:ε)、GS-9688(IM ID:ζ)、T101(IM ID:η)、双质粒DNA治疗性疫苗(IM ID:θ)和抗原抗体复合疫苗(IMID:λ)。
21.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:K、AV ID:G和IMID:α；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:N、AV ID:G和IMID:α；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:α。
22.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:B、AV ID:G和IMID:β；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:E、AV ID:G和IMID:β；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:I、AV ID:G和IMID:β；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:L、AV ID:G和IMID:β；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:O、AV ID:G和IMID:β。
23.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:B、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:E、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:I、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:L、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:O、AV ID:G和IMID:γ。
24.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:B、AV ID:G和IMID:δ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:E、AV ID:G和IMID:δ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:I、AV ID:G和IMID:δ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:L、AV ID:G和IMID:δ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:O、AV ID:G和IMID:δ。
25.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:B、AV ID:G和IMID:ε；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:E、AV ID:G和IMID:ε；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:I、AV ID:G和IMID:ε；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:L、AV ID:G和IMID:ε；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:O、AV ID:G和IMID:ε。
26.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：ID:A、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:J、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:M、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:ζ。
27.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:B、AV ID:G和IMID:η；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:E、AV ID:G和IMID:η；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:I、AV ID:G和IMID:η；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:L、AV ID:G和IMID:η；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:O、AV ID:G和IMID:η。
28.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:B、AV ID:G和IMID:θ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:E、AV ID:G和IMID:θ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:I、AV ID:G和IMID:θ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:L、AV ID:G和IMID:θ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:O、AV ID:G和IMID:θ。
29.根据实施例19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:B、AV ID:G和IMID:λ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:E、AV ID:G和IMID:λ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:I、AV ID:G和IMID:λ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:L、AV ID:G和IMID:λ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:O、AV ID:G和IMID:λ。
30.根据实施例1所述的药物组合，其中所述药物组合包括从表10、表11和表12中所示的组合中选择的组合，或由从表10、表11和表12中所示的组合中选择的组合组成。
31.如实施例1至30中任一项所述的药物组合，其中所述活性成分的至少一种被配制为药用盐。
32.如实施例31所述的药物组合，其中所述药用盐包括Na+或K+。
33.如实施例1至32中任一项所述的药物组合，其中所述活性成分的至少一种与药用载体一起配制。
34.如实施例33所述的药物组合，其中所述药用载体为水。
35.如实施例1至34中任一项所述的药物组合，其中所述活性成分的至少一种被配制在磷酸盐缓冲盐水中。
36.一种药物组合物，其包括根据实施例1至35中任一项所述的药物组合。
37.一种多部件试剂盒，其包括根据实施例1至36中任一项所述的药物组合或组合物以及包装插页，所述包装插页具有用于治疗乙型肝炎病毒感染的施用说明。
38.如实施例37所述的多部件试剂盒，其中所述包装插页描述慢性乙型肝炎病毒感染的治疗。
39.如实施例1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途。
40.如实施例39所述的用途，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
41.如实施例39或40所述的用途，其中所述活性成分各自以药物有效量施用。
42.如实施例39至41中任一项所述的用途，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
43.如实施例39至42中任一项所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
44.如实施例1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在药物中的使用。
45.如实施例1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在治疗乙型肝炎病毒感染中的使用。
46.如实施例44或45所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
47.根据实施例44至46中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述活性成分以药物有效量施用。
48.如实施例44至47中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
49.如实施例44至48中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒的使用，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
50.如实施例1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在制备药物中的用途。
51.如实施例1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
52.如实施例50或51所述的用途，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
53.如实施例50至52中任一项所述的用途，其中所述活性成分各自以药物有效量施用。
54.如实施例50至53中任一项所述的用途，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
55.如实施例50至54中任一项所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
56.一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向患有乙型肝炎病毒感染的受试者施用治疗有效量的根据实施例1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒。
57.如实施例56所述的方法，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
58.如实施例56或57所述的方法，其中所述活性成分各自以药物有效量施用。
59.如实施例56至58中任一项所述的方法，其中未向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
60.如实施例56至58中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
61.一种降低细胞中的乙型肝炎病毒表面抗原的表达的方法，所述方法包括向所述细胞递送根据实施例1至36中任一项所述的药物组合或组合物。
62.如实施例61所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
63.如实施例61或62所述的方法，其中所述细胞是体内的。
64.如实施例61或62所述的方法，其中所述细胞是体外的。
65.如实施例39至64中任一项所述的用途、方法、或药物组合、组合物或试剂盒的使用，其中所述基因表达抑制剂以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在所述细胞中表达所述寡核苷酸。
66.基本上如本文并参照附图所述的药物组合、组合物、试剂盒、用途或方法。
实例
A部分：RNAi寡核苷酸的作用
实例A1.开发针对HBsAg表达的有效寡核苷酸抑制剂
HBV表面抗原被鉴定为用于治疗HBV感染的基于RNAi的疗法的靶标。如图20中所示的HBV基因组排布所描述的，HBsAg由从单个ORF转录的三个RNA分子编码。寡核苷酸的设计目的是沉默一种或多种有助于HBsAg组装的RNA转录物(例如图20中用“X”表示的RNAi靶位点)。设计了HBsAg靶向寡核苷酸HBV-254，并在体外和体内进行了评估。HBV-254的选择和设计是基于直接靶向四种HBV RNA种类的mRNA转录物的能力。实验中使用的HBV-254双链体寡核苷酸包括有义链，其序列如下所示(显示为5'至3')：GUGGUGGACUUCUCUCAAUAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:55)；和反义链，其序列如下所示(显示为5'至3')：UAUUGAGAGAAGUCCACCACGG(SEQ ID NO:56)。
在HDI小鼠中进行了寡核苷酸HBV-254的单剂量评估，证明了皮下靶向HBsAg病毒转录物的能力(图20)。如图所示，随着剂量的增加，HBV-254系统地降低了小鼠的HBsAg水平。在其中以3mg/kg皮下施用HBV-254的QW×3给药方案后，在小鼠中进一步评估了临床前效力(图23)。施用点在图中用箭头表示。在寡核苷酸处理的小鼠和未处理的对照小鼠二者中监测HBsAg水平达147天。在整个研究中，经处理小鼠的HBsAg水平降低是持续的，在第一次施用后约两个月，表达水平(相对于对照)似乎稳定在降低的基线处。
使用未修饰四环形式的寡核苷酸的psiCHECK报告基因测定，通过体外筛选鉴定了其他有效的HBsAg靶向寡核苷酸。三个不同板的结果如图14中所示。使用基于荧光的报告基因测定在HeLa细胞中以三种浓度(1、10和100pM)评估每种寡核苷酸，包括HBV-254。与阳性对照(8、40和200pM)、阴性对照(1nM)和模拟转染相比，进一步显示了每个板报告的结果。用方框突出显示的寡核苷酸按比例放大用于体内测试，其中发现HBV-219和HBV-258是HBV-254和从筛选确定的寡核苷酸中最有效的寡核苷酸。与HBV-254相比，HBV-219的效力有多对数的提高，因此被选择用于额外评估。
实例A2.序列保守分析和工程化错配以增加全球治疗效用
将实例A1中评估的几种最有效的寡核苷酸与HBV基因型A-I的基因组序列进行了比较。初步保守分析的结果列于表13中。如图所示，HBV-219在这些基因组中的保守百分比相对较低。然而，如果在指导链的位置15引入错配(MM)，则保守百分比显著增加(从66％到96％)。来自GenBank公共数据库的基因分型的乙型肝炎病毒(HBV)序列数据被用于生物信息学管理和比对，其以引用方式并入本文。
表13.最佳HBV序列的初步保守分析
Figure BDA0003695063620001611
随后进行了保守分析，其聚焦于来自表13的几种寡核苷酸并涉及更广泛的搜索参数。例如，虽然初始分析仅包括全长基因组序列，但聚焦分析包括全长和部分(与靶位点的同一性>80％)序列。此外，所检查的基因组数量从初始分析中的5,628个增加到聚焦分析中的超过17,000个基因组。聚焦分析的结果与初步分析中观察到的趋势基本一致(表14)。如图15中显示且进一步说明的，预计HBV-219对HBV基因型B、E、F、H和I无活性，除非指导链的位置15处的错配是可容忍的。
表14.聚焦的保守分析
Figure BDA0003695063620001621
*保守百分比报告为(完美匹配/MM)，其中<90％的值以粗体显示；[总计N#]
使用psiCHECK-2双荧光素酶报告基因系统来评估在HBV-217、HBV-219、HBV-254、HBV-255和HBV-258的每一个中选定位置处的错配的影响。psiCHECK载体能够监测与报告基因融合的靶基因的表达变化，其中活性RNAi会降解融合构建体，以产生报告基因信号的相应减少。图16中的图表概括地描绘了这些测定中使用的载体。亲本部分报告序列包含来自基因型A(GenBank:AM282986.1)的120个碱基对片段，它们位于S ORF中感兴趣的靶位点周围。亲本寡核苷酸双链体序列在图16中所示的相应位点处与报告质粒具有100％的同源性，而错配寡核苷酸双链序列与报告质粒具有单一错配。所测试的寡核苷酸的亲本序列和错配序列显示在图17中，与相应的亲本部分报告序列比对。
对于示例错配测定，所测试的寡核苷酸包括相同的修饰模式。根据图17中针对每个寡核苷酸所示的编号方案，修饰如下：在位置1处的5'-甲氧基,膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷；在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸；在位置1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22处的核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。每个亲本集和错配集的错配位置不同，并且如图17中的方框所示。
使用在HeLa细胞中从1nM转染开始的6点、5倍连续稀释液，在三天内对每种寡核苷酸进行psiCHECK2报告基因测定。第1天，将10,000个HeLa细胞/孔(96孔)接种在黑壁透明底板(80-90％汇合)中。第2天，将载体DNA和RNAi分子稀释在适量的
Figure BDA0003695063620001631
I培养基(不含血清)中并轻轻混合。在轻轻混合
Figure BDA0003695063620001632
2000后，将0.2μL稀释到25μL的
Figure BDA0003695063620001633
I培养基(不含血清)中进行每次反应。将稀释液轻轻混合并在室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将等体积的稀释的DNA和RNAi分子与稀释的
Figure BDA0003695063620001634
2000合并。将合并的混合物轻轻混合并在室温下孵育20分钟以允许形成复合物。随后，将DNA-RNAi分子-
Figure BDA0003695063620001635
2000复合物添加到各自含有细胞和培养基的孔中，并通过来回摇动板而轻轻混合。然后将细胞在CO2培养箱中于37℃孵育，直到细胞准备好用于收获并测定靶基因。第3天，将100μL Dual-Glo Reagent添加到每个孔中，混合并孵育10分钟，然后读取发光值。再向每个孔中加入100μL Dual-Glo Stop&Glo，混合并孵育10分钟，然后读取发光值。为每个亲本和错配寡核苷酸生成剂量反应曲线，以评估错配对活性的影响。为每个寡核苷酸确定的EC50值显示在表15中，并有另外说明。
表15.HBsAg靶向寡核苷酸的错配评估
Figure BDA0003695063620001636
Figure BDA0003695063620001641
如相对EC50值所证明的，HBV-219双链体的体外剂量反应曲线显示，在指导链的位置15处存在单一错配时没有活性损失。随后的体内分析比较了HBV-219亲本(本文中称为HBV(s)-219P1)和错配寡核苷酸(本文中称为HBV(s)-219P2)，证实错配的引入没有产生活性损失(图18)。如图19所描绘的单剂量滴定图所示，HBV-219错配寡核苷酸双链体(HBV(s)-219P2)在施用后的70天内在体内是耐受的。
图20说明了HBV-219的修饰双链体结构的示例，其中掺入了错配(本文中称为HBV(s)-219)。根据图17中针对每个寡核苷酸显示的编号方案，有义链跨越核苷酸1到36，而反义链跨越寡核苷酸1到22，后者的链以从右到左的方向编号。显示了双链体形式，其在有义链中的位置36和反义链中的位置1处的核苷酸之间有切口。有义链中的修饰如下：在位置3、8-10、12、13和17处的2'-氟修饰的核苷酸；在位置1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36处的2'-O-甲基修饰的核苷酸；在位置1和2处的核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；在位置27-30处的2'-OH核苷酸；在位置27处的2'-氨基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc；以及在位置28、29和30中的每一个处的2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc。反义链中的修饰如下：在位置1处的5'-甲氧基,膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯；在位置2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸；在位置1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22处的2'-O-甲基修饰的核苷酸；在位置1和2、2和3、3和4、20和21以及21和22处的核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。反义链在位置15处包含掺入的错配。另外如所示，双链体的反义链包括跨越位置21-22的“GG”突出端。
关于HBV(s)-219和上述两种前体(HBV(s)-219P1和HBV(s)-219P2)的详细信息显示在表16中。
表16.HBV(s)-219和前体
Figure BDA0003695063620001651
实例A3：HBV(s)-219前体的抗病毒活性
评估了用HBV(s)-219前体治疗对HBV核心抗原(HBcAg)亚细胞定位的影响。NODscid小鼠经受HBV基因组的头尾二聚体的流体动力学注射(HDI)。在HDI后2周开始用寡核苷酸进行治疗。治疗后从小鼠分离的肝细胞的免疫组织化学染色显示HBV核心抗原(HBcAg)表达急剧减少。
进行RNA测序以检查HBsAg敲低对HBV病毒转录物整体表达的影响。在三次、每周一次、每次3mg/kg的剂量后四天从HDI小鼠中分离肝细胞。从肝细胞中提取总RNA，并使用HiSeq平台使总RNA经历Illumina测序。图21B描绘了RNA测序结果，其中检测到的RNA转录物序列被映射到HBV RNA。还描绘了HBV(s)-219及其前体的靶位点，表明寡核苷酸靶向pgRNA(3.5kb)、S1(2.4kb)和S2(2.1kb)转录物。结果表明，与媒介物对照相比，用HBV(s)-219P1治疗导致所有HBV病毒转录物超过90％沉默。
在两种不同的HBV小鼠模型中检查了HBV(s)-219P1寡核苷酸的持续时间效应，这两种模型中的一种是cccDNA依赖性HDI模型，另一种是cccDNA非依赖性AAV模型。与HBV的HDI模型中的媒介物对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸相比，在涉及三次、每周一次3mg/kg剂量的靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219P1寡核苷酸的治疗背景下进行了HBsAg mRNA表达的时间过程(12周)分析(图22A)。HBV(s)-219P1寡核苷酸产生≥3.9log减少，相对较长的活性持续时间大于7周；而相比之下，靶向HBV(x)的寡核苷酸产生了约3.0log减少，持续时间较短。
与AAV-HBV模型中的媒介物对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸相比，在涉及三次、每周一次3mg/kg剂量的靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219P2寡核苷酸的治疗背景下进行了HBsAg mRNA表达的另外时间过程(12周)分析(图22B)。在该模型中，HBV(s)-219P2寡核苷酸产生了与HBV(x)靶向寡核苷酸相当的对数减少和持续时间。图22A和22B中使用的靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸具有有义链序列UGCACUUCGCGUCACCUCUAGCAGCCGAAAGGCUGC和反义链序列UAGAGGUGACGCGAAGUGCAGG。这种靶向HBxAg的RNAi寡核苷酸在本文中称为GalXC-HBVX。
如上所述，进行免疫组织化学染色以检查经以下处理后从AAV-HBV模型和HBV的HDI模型中获得的肝细胞中HBcAg的亚细胞分布比较：与媒介物对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸相比的靶向HBsAg mRNA的如上所示的HBV(s)-219前体寡核苷酸。(图23)在两种RNAi寡核苷酸之间，治疗后的残留核心蛋白(HBcAg)在HDI模型中表现出亚细胞定位的显著差异，但在AAV模型中则没有显著差异。
实例A4：在PXB-HBV嵌合人肝模型基因型C中评估HBV(s)-219P1
在PXB-HBV模型中评估了HBV(s)-219P1的抗病毒活性，该模型在HBV文献中也称为嵌合人肝模型。该技术基于将人类肝细胞移植到严重免疫功能受损的小鼠中，然后使用遗传机制毒害宿主鼠肝细胞(Tateno等人，2015)。这一过程导致小鼠的肝脏的>70％衍生自人体组织，与野生型小鼠不同，该小鼠可以感染HBV(Li等人，2014)。PXB-HBV模型在HBV(s)-219药理学方面有多种用途：(1)确认寡核苷酸可以在体内参与人RNAi机制(RISC)，(2)确认GalNAc靶向配体构型可以在体内经由人ASGR内化到肝细胞中，以及(3)(与HBV表达的工程模型相反)在真实的HBV感染模型中确认功效。尽管存在移植的人类肝细胞会导致不规则的嵌合肝生理学这一局限性(Tateno等人，2015)，但在该模型中可以观察到显著的抗病毒功效。
在小鼠初次感染HBV基因型C后大约8周，收集每只小鼠的血浆作为基线HBsAg测量值。然后，9只小鼠的群组(对于PK，n＝3，对于PD，n＝6)每周接受3次SC注射0(PBS)或3mg/kgHBV(s)-219P1。给药的第一天被认为是第0天。每周进行非终末采血以确定每只小鼠的血清HBsAg和循环HBV DNA水平(图24A-24D)。在第28天对小鼠实施安乐死以达到终末组织终点。分析第28天肝脏样品的肝内HBV DNA和cccDNA水平。在对用HBV(s)-219P1治疗的小鼠进行分析的所有终点中观察到显著的抗病毒活性，包括HBsAg降低>80％，以及循环HBV DNA、肝内HBV DNA和cccDNA显著降低(图24A-24D)。这些数据表明，HBV(s)-219治疗在全身施用后在受感染的人肝细胞中产生抗病毒活性。
实例A5：HBV(s)-219P2增强恩替卡韦的抗病毒活性
目前的护理标准，核苷酸(核苷)类似物(例如恩替卡韦)可有效降低循环HBV基因组DNA，但不能降低循环HBsAg。虽然这导致在进行此类治疗时病毒血症得到控制，但需要终生治疗，并且很少实现功能性治愈。靶向S抗原的RNAi寡核苷酸影响病毒聚合酶和HBsAg蛋白二者。在这项研究中，在表达HBV的小鼠(HDI模型)中针对抗病毒活性探索了HBV(s)-219P2作为单一疗法和与恩替卡韦组合治疗的组合作用。
小鼠每天口服500ng/kg恩替卡韦(ETV)，持续14天。进行了HBV(s)-219P2的单次皮下施用。通过qPCR测量循环病毒载量(HBV DNA)(图25A)，通过ELISA测量血浆HBsAg水平(图25B)，并通过qPCR测量肝HBV mRNA和pgRNA水平。采用HBV(s)-219P2和ETV组合疗法观察到明显的累加效应。结果显示，单独的ETV疗法显示了对循环HBsAg或肝病毒RNA没有效果。此外，如通过HBsAg或HBV RNA测量的HBV(s)-219P2的抗病毒活性不受ETV共同给药的影响(图25B-25C)。
如图25A-25C中所示的，相对于PBS处理的小鼠(n＝6)，每天口服给药500ng/kg恩替卡韦的14天单一疗法导致血浆中检测到的HBV DNA平均降低约1.6log。未观察到循环HBsAg或肝病毒RNA的显著降低。相对于PBS，在第0天单次1mg/kg或3mg/kg皮下剂量的HBV(s)-219P2的单一疗法分别导致血浆中检测到的HBV DNA平均下降约0.8log或约1.8log(n＝7)。在第0天单次6mg/kg皮下剂量的HBV(s)-219P2的单一疗法导致血浆中HBV DNA平均下降约2.5log，并且两只小鼠的该水平低于检测限(n＝7)。在第0天单次皮下剂量的HBV(s)-219P2的单一疗法导致循环HBsAg以及肝病毒RNA二者的剂量依赖性降低。每天口服给药500ng/kg恩替卡韦共14天和第0天单次1mg/kg皮下剂量的HBV(s)-219P2的组合疗法导致血浆中检测到的HBV DNA平均减少约2.3log。采用单次1mg/kg皮下剂量的HBV(s)-219P2单一疗法观察到血浆HBsAg和肝病毒转录物水平的类似降低，表明可累加降低血浆HBV DNA，但不会降低循环HBsAg或肝病毒转录物。
实例A6.HBV(s)-219P2和GalXC-HBVX的抗病毒活性比较
在这项研究中，表达HBV的小鼠(HDI模型)被施用HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX(与图22A和22B中使用的GalXC-HBVX的序列相同)或两种RNAi寡核苷酸的组合，并且监测给药后两周或九周的血浆HBsAg水平。如图26B所示，在用单次饱和9mg/kg皮下剂量的HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或二者的组合治疗后2周观察到相似水平的HBsAg抑制。在用靶向S的HBV(s)-219P2治疗的小鼠中观察到HBsAg的延长抑制，而用GalXC-HBVX或二者的组合治疗的小鼠在治疗后9周HBsAg明显恢复(n＝3)。
还在接受HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或两种RNAi寡核苷酸的组合的小鼠中评估了HBV核心抗原(HBcAg)在表达HBV的小鼠中的亚细胞定位。用单次饱和剂量(9mg/kg，皮下)的HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或1:1组合来治疗表达HBV的小鼠(HDI模型)。在图27A中所示的时间点，对肝切片进行HBcAg染色；显示了代表性的肝细胞。用HBV(s)-219P2作为单一疗法或与GalXC-HBVX组合治疗的群组以核HBcAg为特征。仅用GalXC-HBVS治疗的群组只显示HBcAg的细胞溶质定位，据报道这是治疗反应的有利预后指标(Huang等人J.Cell.Mol.Med.2018)。图27B中显示了每只动物中具有核染色的HBcAg阳性细胞的百分比(n＝3/组，每只动物计数50个细胞，给药后2周)。为了确认对HBcAg亚细胞定位的影响是由于HBV转录组的区域，而不是由于RNAi序列的未知特性，设计和测试了靶向X和S开放阅读框内的替代序列(参见图27C)。图27C中使用了HBV-254。HBV-254的序列描述于实例A1中。图27C中使用的靶向HBxAg的替代寡核苷酸具有有义链序列GCACCUCUCUUUACGCGGAAGCAGCCGAAAGGCUGC和反义序列UUCCGCGUAAAGAGAGGUGCGG。与图26B中使用的RNAi寡核苷酸相比，两种替代的RNAi寡核苷酸在S或X抗原中具有不同的RNAi靶序列。然而，它们对血浆HBcAg水平表现出同样的差异效果，表明该效果对靶向S抗原本身是特异性的，而对所用寡核苷酸不是特异性的。
实例A7 HBV(s)-219在健康人类受试者中的安全性、耐受性和在HBV患者中的疗效的评估
本研究旨在评估HBV(s)-219在健康受试者(A组)中的安全性和耐受性以及在HBV患者(B组)中的疗效。图28显示了按群组信息划分的剂量。HBV(s)-219的分子结构如图20、图29A中显示示，也如下所示：
有义链：5′mG-S-mA-fC-mA-mA-mA-mA-fA-fU-fC-mC-fU-fC-mA-mC-mA-fA-mU-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-[ademG-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC 3′
杂交至：
反义链：5′[甲基膦酸酯-4O-mU]-S-fU-S-fA-S-mU-fU-mG-fU-fG-mA-fG-mG-fA-mU-fU-mU-fU-mU-mG-fU-mC-S-mG-S-mG 3′
图例：
mX：2′-O-甲基核糖核苷酸
fX：2′-氟-脱氧核糖核苷酸
[ademA-GalNAc]：2′-修饰-GalNAc腺苷
[ademG-GalNAc]：2′-修饰-GalNAc腺苷
[甲基膦酸酯-4O-mU]：4′-O-单甲基膦酸酯-2′-O-甲基尿苷
Linkages：“-”表示磷酸二酯
键：“-S-”表示硫代磷酸酯
患者选择标准如下所示。
A组——健康受试者
纳入标准：
1.签署知情同意书时年龄为18岁(或法定同意年龄，以较大者为准)至65岁(含)。
2.如通过包括病史、体格检查和实验室测试在内的医学评估确定的筛选时明显健康
a.没有进行中疾病的症状
b.体温、脉搏、呼吸频率、血压无临床显著异常
c.没有临床显著的心血管或肺部疾病，也没有需要药物治疗的心血管或肺部疾病。
3.12导联心电图(ECG)在正常限值内，或研究者认为在筛选和第-1天时没有临床显著异常
4.在筛选访视1和入院(第-1天)时的酒精或药物滥用筛选为阴性
5.在筛选访视1前至少5年不吸烟，筛选访视1时尿可替宁浓度为阴性
6.体重指数(BMI)在18.0–32.0kg/m2(含)范围内。
7.男性或女性：
a.男性参与者：
男性参与者必须同意在治疗期间和研究干预剂量后至少两周内使用避孕措施，并在此期间避免捐献精子。
b.女性参与者：
女性参与者如果没有怀孕、没有哺乳，并且至少符合以下条件之一，便是合格的：不是有生育能力的女性(WOCBP)，或者，取决于地区；是WOCBP但同意遵循避孕指导，从筛选后研究登记开始，持续整个治疗期以及在研究干预剂量后至少12周。
8.能够签署知情同意书1，包括遵守要求和限制。
排除标准，A组
1.可能干扰研究药物的吸收、分布或消除或可能干扰本研究中的临床和实验室评估的任何医疗状况的历史，包括(但不限于)：慢性或复发性肾脏疾病、功能性肠道疾病(例如，频繁腹泻或便秘)、胃肠道疾病、胰腺炎、癫痫发作、皮肤黏膜或肌肉骨骼病症、有自杀企图或自杀意念，或有临床意义的抑郁症或其他需要药物干预的神经精神疾病的历史
2.控制不佳或不稳定的高血压；或筛选时持续的收缩压>150mmHg或舒张压>95mmHg
3.接受过胰岛素或降糖药治疗的糖尿病史
4.过去12个月内有需要住院的哮喘病史
5.如由中心研究实验室的筛选结果确定的G-6-PD缺乏的证据
6.目前控制不佳的内分泌状况，甲状腺状况(甲状腺功能亢进/甲状腺功能减退等)除外，其中不包括任何经药物治疗的甲状腺状况
7.如果参与者的恶性肿瘤在化疗后完全缓解且在过去三年内未接受额外的医疗或手术干预，则允许有恶性肿瘤史
8.多种药物过敏史或对寡核苷酸或GalNAc过敏史
9.对皮下注射不耐受或可能阻碍研究干预施用或局部耐受性评估的明显腹部瘢痕形成的历史
10.临床相关的手术史
11.过去3年内持续酗酒(>40gm乙醇/天)或非法药物使用史。
12.在施用研究干预前7天内出现临床显著疾病
13.在施用研究干预前2个月内捐献超过500mL血液或在筛选前7天内捐献血浆
14.筛选时正在进行的显著感染或已知炎症过程(由研究者判定)
15.慢性或复发性尿路感染(UTI)史或筛选前一个月内有UTI
16.计划在本研究进行期间进行选择性外科手术
17.在施用研究干预前4周内使用处方药
18.在首次给药后7天内使用非处方(OTC)药物或草药补充剂(不包括常规维生素)，除非经研究者和赞助者同意为不具有临床相关性。
19.在给药前3个月内接受过研究药物，或在研究入组前正在进行另一项临床研究的随访。
20.筛选时HBV、HIV、HCV或HDV抗体呈血清阳性(可使用在筛选前3个月内进行的历史检测)
21.筛选访视时或入选时(第-1天)丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、总胆红素、碱性磷酸酶(ALP)或白蛋白在参考范围之外
22.研究者认为临床相关且不可接受的全血细胞计数异常；血红蛋白<12.0g/dL(相当于120g/L)；血小板超出正常范围。
23.血红蛋白A1C(HbA1C)>7％
24.研究者认为具有临床意义且不可接受的任何其他安全实验室测试结果
25.从进入临床研究中心前48小时到研究结束，已经进行或计划进行运动水平的显著变化。
26.研究者认为会使参与者不适合入组或可能干扰参与或完成研究的任何状况。
B组，患有乙型肝炎的成人
纳入标准，B组
1.签署知情同意书时年龄为18岁(或法定同意年龄，以较大者为准)至65岁(含)。
2.慢性乙型肝炎感染，如下证明：
a.基于符合的临床信息，符合CHB的临床病史，以及之前对HBsAg和可能的其他HBV血清学标记物(HBeAg,HBV DNA)呈血清阳性
b.HBeAg阳性患者筛选时血清HBsAg>1000IU/mL，或HBeAg阴性患者筛选时血清HBsAg>500IU/mL
c.初治患者筛选时血清HBV DNA>20,000IU/mL，如由中心研究实验室的TaqManTMHBV DNA v2.0测定确定的
d.血清IgM抗HBc阴性
3.符合代偿性肝病的临床病史，无肝硬化证据：
a.无食管或胃肠道静脉曲张的出血史
b.无腹水史
c.无慢性肝病引起的黄疸史
d.无肝性脑病史
e.无门静脉高压症的身体特征——蜘蛛痣等
f.无既往肝活检、肝成像研究或弹性成像结果表明肝硬化
4.未接受过乙型肝炎治疗：未接受过既往乙型肝炎抗病毒疗法(未接受过既往含HBV核苷(核苷酸)或干扰素的治疗)，也未在筛选访视之前持续接受核苷(核苷酸)疗法(恩替卡韦或替诺福韦)至少12周，具有令人满意的耐受性和顺应性
5.血清ALT>60U/L(男性)或>38U/L(女性)(美国肝病研究协会(AASLD)HBV指导标准的2x ULN，Terrault等人，2016)
6.12导联心电图在筛选和第-1天时没有临床显著异常(由研究者判定)
7.没有其他已知的肝病原因
8.除了控制良好的高血压和高胆固醇血症的他汀类药物管理外，没有其他需要持续医疗管理或长期或反复药物干预的医学状况
9.BMI在18.0–32.0kg/m2(含)范围内
10.男性或女性
a.男性参与者：
男性参与者必须同意在治疗期间和最后一次研究干预剂量后至少12周内使用避孕措施，并在此期间避免捐献精子。
b.女性参与者：
女性参与者如果没有怀孕、没有哺乳，并且至少符合以下条件之一，便是合格的：不是WOCBP，或者，取决于地区，是WOCBP但同意在研究干预剂量后至少12周遵循避孕指导。
11.能够签署知情同意书，包括遵守要求和限制。
排除标准，B组
1.可能干扰研究药物的吸收、分布或消除或可能干扰本研究中的临床和实验室评估的任何医疗状况的历史，包括(但不限于)：慢性或复发性肾脏疾病、功能性肠道疾病(例如，频繁腹泻或便秘)、胃肠道疾病、胰腺炎、癫痫发作、皮肤黏膜或肌肉骨骼病症、有自杀企图或自杀意念，或有临床意义的抑郁症或其他需要药物干预的神经精神疾病的历史
2.控制不佳或不稳定的高血压
3.接受过胰岛素或降糖药治疗的糖尿病史
4.过去12个月内有需要住院的哮喘病史
5.如由中心研究实验室的筛选结果确定的G-6-PD缺乏的证据
6.目前控制不佳的内分泌状况，甲状腺状况(例如，甲状腺功能亢进/甲状腺功能减退等)除外，其中不包括任何经药物治疗的甲状腺状况
7.慢性或复发性UTI史或筛选前一个月内有UTI
8.HCC史
9.如果患者的恶性肿瘤在化疗后完全缓解且在过去三年内未接受额外的医疗或手术干预，则可允许有除HCC之外的恶性肿瘤史
10.过去3年内持续酗酒(>40gm乙醇/天)或非法药物使用史。
11.对皮下注射不耐受或可能阻碍研究干预施用或局部耐受性评估的明显腹部瘢痕形成的历史。
12.在疗法前的最近6周内接受输血，或通过试验后随访有预期的输血。
13.在筛选前2个月内捐献或损失>500mL血液或在筛选前7天内捐献血浆
14.筛选的3个月内采用抗病毒疗法(恩替卡韦或替诺福韦除外)或过去3年内用干扰素治疗
15.在过去6个月内使用(或预期需要)抗凝剂、全身施用的皮质类固醇、全身施用的免疫调节剂或全身施用的免疫抑制剂
16.在PI或赞助者看来，会干扰研究进行的在施用研究干预之前14天内的处方药使用。可以接受没有全身吸收的局部产品、他汀类药物(除了瑞舒伐他汀)、高血压药物、OTC和处方止痛药或激素避孕药(女性)。
17.在施用研究干预之前的3个月内进行任何药物的长效注射或植入，注射/植入式避孕措施除外。
18.持续使用草药补充剂或全身性非处方药；参与者必须愿意在研究期间停用
19.在给药前3个月内接受过研究药物，或在研究入组前正在进行另一项临床研究的随访。
20.筛选时肝弹性成像(即
Figure BDA0003695063620001741
)kPa>10.5
21.筛选时，仰卧休息10分钟后，收缩压>150mmHg且舒张压>95mmHg。
22.筛选时确认的肝转氨酶(ALT或AST)>7 x ULN
23.持续或复发性高胆红素血症史，除非已知为Gilbert病或Dubin-Johnson综合征
24.对人类免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)或丁型肝炎病毒(HDV)的抗体呈血清阳性
25.Hgb<12g/dL(男性)或<11g/dL(女性)
26.筛选时血清白蛋白<3.5g/dL。
27.筛选时总WBC计数<4,000个细胞/μL或绝对中性粒细胞计数(ANC)<1800个细胞/μL。
28.筛选时血小板计数≤100,000/μL。
29.筛选时国际标准化比率(INR)或凝血酶原时间(PT)高于正常参考范围(根据当地实验室参考范围)的上限。
30.血清BUN或肌酐>ULN
31.血清淀粉酶或脂肪酶>1.25 x ULN
32.血清HbA1c>7.0％
33.血清甲胎蛋白(AFP)值>100ng/mL。如果筛查时的AFP>ULN但<100ng/mL，且如果肝脏影像学研究显示没有疑似可能的HCC的病变，则患者符合条件
34.研究者认为具有临床意义且不可接受的任何其他安全实验室测试结果
35.从进入临床研究中心前48小时到研究结束，已经进行或计划进行运动水平的显著变化。
36.研究者认为会使参与者不适合入组或可能干扰参与或完成研究的任何状况。
B部分：GalNAc缀合的反义寡核苷酸的作用
材料与方法
AAV/HBV小鼠模型
AAV-HBV小鼠模型是通过给C57BL/6小鼠注射携带可复制HBV基因组(AAV-HBV)的重组腺相关病毒而产生的。rAAV8-1.3HBV ayw病毒原液购自Beijing FivePlus MolecularMedicine Institute(Beijing,China)。动物(雄性，到达时4-5周龄)购自SLAC LaboratoryAnimal Co.Ltd(Shanghai,China)，在动物设施中适应5-7天，然后通过尾静脉注射1×1011个AAV-HBV载体基因组(在200μL PBS中稀释)。HBV基因组的持续表达可在三周后建立，小鼠血清中具有高水平的HBV病毒标记物，包括HBV DNA、HBsAg和HBeAg。在C57BL/6小鼠的HBV病毒血症稳定且免疫系统正常的情况下，使用AAV-HBV小鼠模型评估化合物的体内抗HBV功效。AAV-HBV研究的活体部分是通过Covance Pharmaceutical Research and Development(Shanghai)Co.Ltd.(Covance Shanghai)的合同服务进行的，而使用血清的死后分析在Roche Innovation Center Shanghai(RICS)内部进行。
化合物治疗前7天，采集血液样品来制备血清(约15μL)，并且根据HBV DNA、血清中HBsAg水平和体重，将感染AAV-HBV的动物分层为不同的治疗组。
盐水(01组)和1.5或7.5mg/kg的CMP ID NO:15_1的抗HBV ASO皮下给药，在第0-49天期间每周一次，即在第0、7、14、21、28、35、42和49天。100mg/kg CMP ID NO:VI的TLR7激动剂通过经口灌胃施用，在第0-55天期间每隔一天(QOD)，或在第0-49天期间每周一次(QW)，即在第0、7、14、21、28、35、42和49天。在整个研究过程中，每周经由眶后窦对动物进行采血以收集样品。
寡核苷酸合成
寡核苷酸合成是本领域公知的。以下是可以实施的方案。就设备、载体和所用浓度而言，本发明的寡核苷酸可以通过略有变化的方法来产生。
使用亚磷酰胺方法在Oligomaker 48上以1μmol规模在尿苷通用载体上合成寡核苷酸。合成结束时，使用氨水在60℃下将寡核苷酸从固体支持物上裂解5-16小时。通过反相HPLC(RP-HPLC)或通过固相萃取纯化寡核苷酸，通过UPLC进行表征，并通过ESI-MS进一步确认分子量。
寡核苷酸的延伸：
通过使用5'-O-DMT保护的亚酰胺在乙腈中的0.1M溶液和作为活化剂的在乙腈中的DCI(4,5-二氰基咪唑)(0.25M)，进行β-氰基乙基-亚磷酰胺的偶联(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-甲基-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)或LNA-T)。对于最后的循环，可以使用具有所需修饰的亚磷酰胺，例如，用于连接缀合物基团或这样的缀合物基团的C6接头。通过使用氢化黄原素(0.01M，在乙腈/吡啶9:1中)进行硫醇化以引入硫代磷酸酯键。可利用0.02摩尔的碘于THF/吡啶/水7:2:1引入磷酸二酯键。其余试剂是通常用于寡核苷酸合成的试剂。
对于固相合成后的缀合，可以在固相合成的最后一个循环中使用可商购的C6氨基接头亚磷酰胺，并且在脱保护并从固体支持物上裂解后，分离出氨基连接的脱保护的寡核苷酸。使用标准合成方法通过官能团的活化来引入缀合物。
通过RP-HPLC纯化：
粗制化合物在Phenomenex Jupiter C18 10μ150x10mm色谱柱上通过制备型RP-HPLC纯化。0.1M醋酸铵pH 8和乙腈以5mL/min的流速用作缓冲液。将收集的级分冻干以给出纯化的化合物，通常为白色固体。
缩写：
DCI： 4,5-二氰基咪唑
DCM： 二氯甲烷
DMF： 二甲基甲酰胺
DMT： 4,4’-二甲氧基三苯甲基
THF： 四氢呋喃
Bz： 苯甲酰基
Ibu： 异丁酰基
RP-HPLC：反相高效液相层析
Tm测定
将寡核苷酸和RNA靶标(磷酸酯连接的，PO)双链体在500ml无核糖核酸酶的水中稀释至3mM，并与500ml 2x Tm缓冲液(200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mM磷酸钠、pH 7.0)混合。将溶液加热3分钟到95℃，然后在室温下退火30分钟。使用PE Templab软件在配备有Peltier温度编程器PTP6的Lambda 40 UV/VIS分光光度计(Perkin Elmer)上测量双链体解链温度(Tm)。温度从20℃上升到95℃，然后下降到25℃，记录在260nm处的吸收。使用一阶导数以及解链和退火的局部最大值来评估双链体Tm。
组织特异性体外接头裂解测定
使用相关组织(例如肝脏或肾脏)的匀浆和血清，使带有待测试的可生物裂解接头(例如DNA磷酸二酯接头(PO接头))的FAM标记的寡核苷酸经历体外裂解。
从合适的动物(例如小鼠、猴、猪或大鼠)收集组织和血清样品并在匀浆缓冲液(0.5％Igepal CA-630、25mM Tris pH 8.0、100mM NaCl、pH 8.0(用1N NaOH调整))中均质化。在组织匀浆和血清中加入寡核苷酸至200μg/g组织的浓度。样品在37℃下孵育24小时，然后用苯酚-氯仿萃取样品。使溶液在Dionex Ultimate 3000上经历AIE HPLC分析，该分析使用Dionex DNApac p-100柱和在10mM–1M高氯酸钠(pH 7.5)范围内的梯度。使用615nm的荧光检测器和260nm的UV检测器二者，对照标准来确定裂解和未裂解的寡核苷酸的含量。
S1核酸酶裂解测定
带有S1核酸酶敏感接头(例如DNA磷酸二酯接头(PO接头))的FAM标记的寡核苷酸在S1核酸酶提取物或血清中经历体外裂解。
100μM寡核苷酸经历通过在核酸酶缓冲液(60U pr.100μL)中的S1核酸酶的体外裂解，持续20和120分钟。通过将EDTA添加到缓冲溶液中来停止酶活性。使溶液在DionexUltimate 3000上经历AIE HPLC分析，该分析使用Dionex DNApac p-100柱和在10mM–1M高氯酸钠(pH 7.5)范围内的梯度。使用615nm的荧光检测器和260nm的UV检测器二者，对照标准来确定裂解和未裂解的寡核苷酸的含量。
HBsAg抗原测量
根据制造商的方案，使用HBsAg化学发光免疫测定法(CLIA)(Autobiodiagnostics Co.Ltd.,Zhengzhou,China,Cat.no.CL0310-2)来确定感染的AAV-HBV小鼠的血清中的血清HBsAg水平。简而言之，将50μl血清转移到抗体包被的微量滴定板，并添加50μl酶缀合试剂。将该板于室温下在摇床上孵育60分钟，然后使用自动洗濯器用洗涤缓冲液将所有孔洗涤六次。先后将25μl底物A和25μl底物B添加到每个孔。在使用Envision发光读数器(Perkin Elmer)测量发光之前，将板于室温下孵育10分钟。HBsAg以单位IU/ml给出；其中1ng HBsAg＝1.14IU。
HBeAg水平同样可以使用CLIA ELISA试剂盒(Autobio Diagnostic#CL0310-2)根据制造商的方案和上面对HBsAg给出的简要说明进行测量。
对来自HBV感染细胞的细胞内HBV mRNA的实时PCR
以两次技术重复，使用QuantStudio 12K Flex(Applied Biosystems)、TaqManRNA-to-CT 1-Step试剂盒(Applied Biosystems,#4392938)、人ACTB内源性对照(AppliedBiosystems,#4310881E)通过qPCR来量化HBV mRNA。Taqman试剂与以下商用ThermoFisherScientific引物一起使用(HBV Pa03453406_s1,ACTB 4310881E)。使用比较周期阈值2-ΔΔCt方法分析mRNA表达，该方法针对参考基因ACTB和经PBS处理的细胞进行了归一化。
HBV DNA提取和qPCR
最初，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将小鼠血清稀释10倍(1:10)。使用MagNA Pure 96(Roche)机器人提取DNA。将50μl稀释的血清在处理盒中与200ul MagNA Pure 96外部裂解缓冲液(Roche，目录号06374913001)混合并孵育10分钟。然后使用“MagNA Pure 96DNA和病毒核酸小容量试剂盒”(Roche，目录号06543588001)和“病毒NA血浆SV外部裂解2.0”方案提取DNA。DNA洗脱体积为50μl。
使用Taqman qPCR机器(ViiA7,life technologies)对提取的HBV DNA进行定量。在PCR中对每个DNA样品进行一式两份测试。在384孔板中，将5μl DNA样品添加到15μl PCRmastermix中，其中包含10μl TaqMan Gene Expression Master Mix(AppliedBiosystems，目录号4369016)、0.5μl PrimeTime XL qPCR引物/探针(IDT)和4.5μl蒸馏水，并且使用以下设置进行PCR：UDG孵育(2min,50℃)、酶活化(10min,95°C)和PCR(15秒，95℃变性和1min，60℃退火和延伸，40个循环)。DNA拷贝数由ViiA7软件基于HBV质粒DNA标准曲线从Ct值计算。
TaqMan引物的序列在表17中显示。
表17：HBV核心特异性TaqMan探针
Figure BDA0003695063620001801
ZEN是内部猝灭剂
实例B1
本研究旨在提供证据表明，使用HBV体内效力小鼠模型，靶向HBV的GalNAc缀合的反义寡核苷酸(抗-HBV ASO)和TLR7激动剂的组合将具有有益的抗病毒作用。
在慢性HBV治疗中，直接作用的抗病毒药物(例如靶向HBV的GalNAc缀合的反义寡核苷酸(抗-HBV ASO))与免疫调节剂(例如toll样受体7的激动剂(TLR7激动剂))的组合可能以一种无法从每个单独的化合物的单一疗法的活性中预测的方式影响组合效果。
为了评估体内系统中抗HBV ASO和TLR7激动剂的组合，使用了慢性HBV感染的小鼠模型。在材料和方法中描述的AAV/HBV小鼠模型中，建立了持续的HBV感染，导致血浆中可检测到病毒标记物(HBsAg、HBeAg、HBV DNA)的表达。在用以1.5mg/kg or 7.5mg/kg给药的CMPID NO:15_1的抗-HBV ASO(表2和图4)和以100mg给药的CMP ID NO:VI(表3)的TLR7激动剂以每隔一天(QOD)或每周一次(QW)的单一疗法或组合疗法治疗后，评估了对这些病毒标记物的影响。
表18至21显示了用不同剂量治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBV-DNA水平。数据也在图9A至9D中表示。
表18：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBV-DNA水平：盐水(媒介物)、以1.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每隔一天(QOD)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与抗-HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7QOD相比，计算组合的p值；*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著；
Figure BDA0003695063620001813
低于定量的限值。
Figure BDA0003695063620001811
表19：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBV-DNA水平：盐水(媒介物)、以1.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每周(QW)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与抗-HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7QW相比，计算组合的p值。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著；
Figure BDA0003695063620001812
低于定量的限值。
Figure BDA0003695063620001821
表20：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBV-DNA水平：盐水(媒介物)、以7.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每隔一天(QOD)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与抗-HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7QOD相比，计算组合的p值；*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著；
Figure BDA0003695063620001822
低于定量的限值。
Figure BDA0003695063620001831
表21：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBV-DNA水平：盐水(媒介物)、以7.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每周(QW)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与抗-HBV ASO 1.5mg/kg和TLR7QW相比，计算组合的p值；*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著；
Figure BDA0003695063620001832
低于定量的限值。
Figure BDA0003695063620001841
表18至21和图9A-D显示了对于CMP ID NO:15_1和CMP ID NO:VI的施用的指定组合，在研究期间病毒标志物HBV-DNA的变化。对于在1.5mg/kg和在7.5mg/kg二者处的CMP IDNO:15_1(抗-HBV ASO)单一疗法(图9A和9C)，以及对于含有任何浓度的抗-HBV ASO的任何组合(图9A-D，实线)，可见HBV-DNA中快速降低至低于测定的低定量水平(LLOQ)。相比之下，当单独用TLR7激动剂(CM ID NO:VI)治疗时，HBV-DNA的降低仅在每隔一天给药(QOD)时达到LLOQ(图9A和9C)。在QW给药时(图9B和9D)，使用TLR7激动剂单一疗法可最大减少约1.5-log。
给药结束后，所有治疗组的HBV-DNA水平都有部分反弹，在1.5mg/kg剂量单一疗法中抗-HBV ASO的绝对反弹幅度最大(图9A和9B)。该组中的HBV DNA血浆水平恢复到对照组的1/2log以内。同样，TLR7激动剂治疗的动物，无论是QOD还是QW单一疗法给药，在随访期间的反弹都回到了对照组的1log以内。这种反弹虽然与抗-HBV ASO的幅度不同，但在治疗结束后比抗-HBV ASO治疗组发生得更早。
与使用每种单一化合物的治疗相比，在使用抗-HBV ASO和TLR7激动剂组合治疗的组中，如通过HBV DNA测量的反弹总是延迟的。值得注意的是，对于高剂量抗-HBV-ASO的发作延迟和反弹动力学在TLR7激动剂的频繁与不频繁给药的组合之间类似，反弹分别从第91天和第84天开始。有趣的是，在最低组合剂量(图8B)下，反弹似乎开始于第84天，这晚于在第77天观察到反弹的低抗-HBV ASO和高TLR7激动剂剂量(图8A)。因此，似乎当抗-HBV ASO和TLR7激动剂组合使用时，TLR7的治疗窗口增加，因为与使用TLR7激动剂单一治疗观察到的相比，减少3倍的剂量不会对观察到反弹的时间产生负面影响。
表22至25显示了用不同剂量治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBsAg水平。数据也在图10A至10D中表示。
表22：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBsAg水平：盐水(媒介物)、以1.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每隔一天(QOD)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与a)抗-HBV ASO 1.5mg/kg和b)TLR7QOD相比，计算组合的p值。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著。
Figure BDA0003695063620001851
Figure BDA0003695063620001861
表23：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBsAg水平：盐水(媒介物)、以1.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每周(QW)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与a)抗-HBV ASO 1.5mg/kg和b)TLR7QW相比，计算组合的p值。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著。
Figure BDA0003695063620001862
Figure BDA0003695063620001871
表24：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBsAg水平：盐水(媒介物)、以7.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每隔一天(QOD)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与a)抗-HBV ASO 7.5mg/kg和b)TLR7QOD相比，计算组合的p值。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著。
Figure BDA0003695063620001872
Figure BDA0003695063620001881
表25：以下治疗后血清AAV/HBV小鼠中的HBsAg水平：盐水(媒介物)、以7.5mg/kg每周给药的CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)、以100mg/kg每周(QW)施用的CMP ID NO:VI(TLR7)、或二者的组合；与a)抗-HBV ASO 7.5mg/kg和b)TLR7激动剂QW相比，计算组合的p值。*p值≤0.05；**p值≤0.01；***p值≤0.001；ns不显著。
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还测量了HBeAg水平，但未观察到单一治疗与组合治疗之间的市场差异。
表22至25和图10A至10D显示，对HBsAg的影响通常类似于对HBV-DNA的影响。与HBVDNA不同，用1.5mg/kg抗-HBV ASO(CMP ID NO:15)的治疗不能将HBsAg抑制到低于检测限的水平(图10A和10B)，任何这些剂量的TLR7激动剂(CMP ID NO：VI)(图10A-10D)也是如此。另一方面，抗-HBV ASO和TLR7激动剂的组合能够在所有剂量下将HBsAg降低至低于检测限，并与单一治疗相比延迟反弹。与HBV DNA类似，也观察到至少TLR7激动剂的治疗窗增加与HBsAg降低有关，并且对于HBsAg，这甚至更明显，因为最低剂量的组合(图10B)基本上与最高剂量的组合(图10C)无论是在HBsAg降低还是反弹延迟方面一样有效，这表明抗-HBV ASO的治疗窗口也可能增加。
研究结论
研究中的数据显示了抗-HBV ASO和TLR7激动剂组合在慢性HBV感染体内模型中的益处。如通过HBV DNA和HBsAg二者测量的，这些益处可以最清楚地被观察为治疗结束后反弹的延迟。没有迹象表明该组合会改变这些化合物的风险特征，并且临床环境中每种活性成分的较低剂量可以达到与较高剂量组合相同的抗病毒效果。该组合的治疗窗口的这种积极增加对患者来说是明显的好处。
C部分：比较RNAi寡核苷酸和反义寡核苷酸的效果
实例C1
本研究的目的是评估某些化合物在AAV-HBV小鼠模型中的体内药理学和功效。
测试的化合物：阴性对照siRNA(DCR-AUD1，一种不靶向HBV基因组的siRNA)；HBV(s)-219(抗-HBV siRNA)；和CMP ID NO:15_1(抗-HBV ASO)。
携带乙型肝炎病毒(HBV)基因组rAAV8-1.3HBV ayw的重组腺相关病毒(AAV)(批号：2019032703)购自Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute，并且在使用前于-70℃保存。
获得了一百一十五(115)只雄性C57BL/6小鼠。在给药前第0天，所有动物通过尾静脉经历1×1011个AAV-HBV载体基因组的注射以进行模型诱导。基于给药前第24天的基线血清病毒标记物和体重，选择了80只合格的HBV感染小鼠。
选择的80只小鼠随机分为4组进行化合物治疗。无菌水、DCR-AUD1、DCR-S219(9mg/kg)和CMP ID NO:15_1(6.6mg/kg)在第0天以5mL/kg皮下注射一次。给药体积为2mL。
在第0～21天期间每周测量一次体重。在研究阶段，研究组之间没有观察到体重增长的显著差异。
在第0～21天期间每周两次收集全血以制备血清(每只小鼠15μL)。在第21天，对小鼠实施安乐死。除了用于病毒标记物测定的血清样品外，还制备了额外的血清样品(每只小鼠120μL)并储存在-70℃。收集整个肝脏，切成两半，速冻并储存在-70℃。剩余的给药配方以及终末血清和组织样品分别于2019年11月16日和20日处置。
HBsAg的基线血清水平由ARCHITECT i2000(Abbott Laboratories,Lake Bluff,IL,USA)和支持试剂确定。通过使用ABI7500(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)和检测试剂盒(Sansure Biotech Inc.,Changsha,Hunan,China)测量基线血清HBV DNA水平。
结果如图30中所示：抗HBV ASO(HBV-LNA)使HBsAg水平迅速下降，并一直维持到大约10天，之后HBsAg水平反弹。靶向HBV的siRNA化合物(DCR-S219)使得HBsAg水平的初始降低稍慢但仍然非常快。此外，使用siRNA化合物，在21天的实验中保持了令人印象深刻的降低水平，没有反弹的迹象。在图30中可以看到siRNA化合物的更进一步的益处，即，使用比LNA化合物低得多的摩尔剂量获得了优异的结果。图30显示了被给予9mg/kg siRNA和6.6mg/kg LNA的小鼠的结果，然而，由于这些化合物之间的分子量不同，siRNA的摩尔剂量仅为LNA的0.3倍左右(DCR-S219的Mw为22262Da，而CMP ID NO:15_1的Mw为6638Da)。因此，远低于反义寡核苷酸的摩尔剂量的本发明的siRNA的摩尔剂量可以获得优异的结果。
当结合抗-HBV ASO和TLR7激动剂的数据时，例如如实例B和图9中所示，该数据表明将TLR7激动剂与RNAi寡核苷酸(如靶向HBV的siRNA)组合的益处。
如图10A中所示，单独的TLR7激动剂提供HBsAg降低，但HBsAg的初始降低速度较慢(在第42天观察到最低HBsAg)。因此，使用RNAi寡核苷酸(如靶向HBV的siRNA)与TLR7激动剂存在协同，因为实例C/图30中靶向HBV的siRNA实现了快速有效的HBsAg敲低，即10天。此外，如图30所示，靶向HBV的siRNA提供了非常有效的长期敲低，优于抗-HBV ASO。
根据本文公开的数据，可以确定包含1)RNAi寡核苷酸(如靶向HBV的siRNA)和2)TLR7激动剂的组合的效果将因此是快速诱导的长时间有效的HBsAg敲低，表明长期有效的抗病毒控制。因此，包含RNAi寡核苷酸和TLR7激动剂的组合是本发明最优选的组合。
在发现本文公开的实例的部分A、B和C之前，无法预料到这种有益效果。
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Claims (66)

1.一种用于治疗HBV的药物组合，其包括至少两种活性成分或前药，所述至少两种活性成分或前药选自抗病毒化合物、免疫调节剂化合物及它们的前药。
2.根据权利要求1所述的药物组合，其中所述药物组合包括抗病毒化合物和免疫调节剂化合物。
3.根据权利要求2所述的药物组合，其中所述抗病毒化合物选自KL060332(AV ID:A)、ABI-H2158(AV ID:B)、ABI-H0731(AV ID:C)、QL-007(AV ID:D)、GLS4(AV ID:E)、JNJ-6379(AV ID:F)、HBV(s)-219(AV ID:G)、Y101(AV ID:H)、帕拉德福韦(AV ID:I)、HH-003(AV ID:J)、APG-1387(AV ID:K)、异硫氟啶(AV ID:L)、盐酸艾咪朵尔(AV ID:M)、贺普拉肽(AV ID:N)和HS-10234(AV ID:O)。
4.根据权利要求1或2所述的药物组合，其中所述免疫调节剂化合物选自P1101(IM ID:α)、HLX10(IM ID:β)、TQ-A3334(IM ID:γ)、ASC22(IM ID:δ)、GS-9620(IM ID:ε)、GS-9688(IM ID:ζ)、T101(IM ID:η)、双质粒DNA治疗性疫苗(IM ID:θ)和抗原抗体复合疫苗(IM ID:λ)。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:α、AV ID:B和IM ID:α、AV ID:C和IM ID:α、AV ID:D和IM ID:α、AV ID:E和IM ID:α、AV ID:F和IM ID:α、AV ID:G和IM ID:α、AV ID:H和IM ID:α、AV ID:I和IM ID:α、AV ID:J和IM ID:α、AV ID:K和IM ID:α、AV ID:L和IM ID:α、AV ID:M和IM ID:α、AV ID:N和IM ID:α、AV ID:O和IM ID:α。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:β、AV ID:B和IM ID:β、AV ID:C和IM ID:β、AV ID:D和IM ID:β、AV ID:E和IM ID:β、AV ID:F和IM ID:β、AV ID:G和IM ID:β、AV ID:H和IM ID:β、AV ID:I和IM ID:β、AV ID:J和IM ID:β、AV ID:K和IM ID:β、AV ID:L和IM ID:β、AV ID:M和IM ID:β、AV ID:N和IM ID:β、AV ID:O和IM ID:β。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:γ、AV ID:B和IM ID:γ、AV ID:C和IM ID:γ、AV ID:D和IM ID:γ、AV ID:E和IM ID:γ、AV ID:F和IM ID:γ、AV ID:G和IMID:γ、AV ID:H和IM ID:γ、AV ID:I和IM ID:γ、AV ID:J和IM ID:γ、AV ID:K和IM ID:γ、AV ID:L和IM ID:γ、AV ID:M和IM ID:γ、AV ID:N和IM ID:γ、AV ID:O和IM ID:γ。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:δ、AV ID:B和IM ID:δ、AV ID:C和IM ID:δ、AV ID:D和IM ID:δ、AV ID:E和IM ID:δ、AV ID:F和IM ID:δ、AV ID:G和IM ID:δ、AV ID:H和IM ID:δ、AV ID:I和IM ID:δ、AV ID:J和IM ID:δ、AV ID:K和IM ID:δ、AV ID:L和IM ID:δ、AV ID:M和IM ID:δ、AV ID:N和IM ID:δ、AV ID:O和IM ID:δ。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:ε、AV ID:B和IM ID:ε、AV ID:C和IM ID:ε、AV ID:D和IM ID:ε、AV ID:E和IM ID:ε、AV ID:F和IM ID:ε、AV ID:G和IM ID:ε、AV ID:H和IM ID:ε、AV ID:I和IM ID:ε、AV ID:J和IM ID:ε、AV ID:K和IM ID:ε、AV ID:L和IM ID:ε、AV ID:M和IM ID:ε、AV ID:N和IM ID:ε、AV ID:O和IM ID:ε。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：ID:A和IM ID:ζ、AV ID:B和IM ID:ζ、AV ID:C和IMID:ζ、AV ID:D和IM ID:ζ、AV ID:E和IM ID:ζ、AV ID:F和IM ID:ζ、AV ID:G和IM ID:ζ、AVID:H和IM ID:ζ、AV ID:I和IM ID:ζ、AV ID:J和IM ID:ζ、AV ID:K和IM ID:ζ、AV ID:L和IMID:ζ、AV ID:M和IM ID:ζ、AV ID:N和IM ID:ζ、AV ID:O和IM ID:ζ。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:η、AV ID:B和IM ID:η、AV ID:C和IM ID:η、AV ID:D和IM ID:η、AV ID:E和IM ID:η、AV ID:F和IM ID:η、AV ID:G和IM ID:η、AV ID:H和IM ID:η、AV ID:I和IM ID:η、AV ID:J和IM ID:η、AV ID:K和IM ID:η、AV ID:L和IM ID:η、AV ID:M和IM ID:η、AV ID:N和IM ID:η、AV ID:O和IM ID:η。
12.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:θ、AV ID:B和IM ID:θ、AV ID:C和IM ID:θ、AV ID:D和IM ID:θ、AV ID:E和IM ID:θ、AV ID:F和IM ID:θ、AV ID:G和IM ID:θ、AV ID:H和IM ID:θ、AV ID:I和IM ID:θ、AV ID:J和IM ID:θ、AV ID:K和IM ID:θ、AV ID:L和IM ID:θ、AV ID:M和IM ID:θ、AV ID:N和IM ID:θ、AV ID:O和IM ID:θ。
13.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和IM ID:λ、AV ID:B和IM ID:λ、AV ID:C和IM ID:λ、AV ID:D和IM ID:λ、AV ID:E和IM ID:λ、AV ID:F和IM ID:λ、AV ID:G和IM ID:λ、AV ID:H和IM ID:λ、AV ID:I和IM ID:λ、AV ID:J和IM ID:λ、AV ID:K和IM ID:λ、AV ID:L和IM ID:λ、AV ID:M和IM ID:λ、AV ID:N和IM ID:λ、AV ID:O和IM ID:λ。
14.根据权利要求1所述的药物组合，其中所述药物组合包括作为衣壳抑制剂的第一抗病毒化合物和作为基因表达抑制剂的第二抗病毒化合物。
15.根据权利要求14所述的药物组合，其中所述衣壳抑制剂选自KL060332(AV ID:A)、ABI-H2158(AV ID:B)、ABI-H0731(AV ID:C)、QL-007(AV ID:D)、GLS4(AV ID:E)、JNJ-6379(AV ID:F)。
16.根据权利要求14或15所述的药物组合，其中所述基因表达抑制剂为HBV(s)-219(AVID:G)。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的药物组合，其中包含在所述组合中的唯一的所述基因表达抑制剂由HBV(s)-219(AV ID:G)组成。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A和AV ID:G、AV ID:B和AV ID:G、AV ID:C和AV ID:G、AV ID:D和AV ID:G、AV ID:E和AV ID:G、AV ID:F和AV ID:G、AV ID:H和AV ID:G、AV ID:I和AV ID:G、AV ID:J和AV ID:G、AV ID:K和AV ID:G、AV ID:L和AV ID:G、AV ID:M和AV ID:G、AV ID:N和AV ID:G、AV ID:O和AV ID:G。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的药物组合，其中所述药物组合进一步包括免疫调节剂化合物。
20.根据权利要求19所述的药物组合，其中所述免疫调节剂化合物选自P1101(IM ID:α)、HLX10(IM ID:β)、TQ-A3334(IM ID:γ)、ASC22(IM ID:δ)、GS-9620(IM ID:ε)、GS-9688(IM ID:ζ)、T101(IM ID:η)、双质粒DNA治疗性疫苗(IM ID:θ)和抗原抗体复合疫苗(IM ID:λ)。
21.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:H、AV ID:G和IMID:α；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:K、AV ID:G和IMID:α；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:α；AV ID:N、AV ID:G和IMID:α；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:α。
22.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:β；AVID:J、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:β；AVID:M、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:β；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:β。
23.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:B、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:E、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:I、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:J、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:L、AV ID:G和IMID:γ；AV ID:M、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:γ；AV ID:O、AV ID:G和IMID:γ。
24.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:δ；AVID:J、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:δ；AVID:M、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:δ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:δ。
25.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:ε；AVID:J、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:ε；AVID:M、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:ε；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:ε。
26.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：ID:A、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:F、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:J、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:ζ；AVID:M、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:ζ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:ζ。
27.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:η；AVID:J、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:η；AVID:M、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:η；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:η。
28.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:θ；AVID:J、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:θ；AVID:M、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:θ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:θ。
29.根据权利要求19或20所述的药物组合，其中所述药物组合包括选自以下各项的组合或由选自以下各项的组合组成：AV ID:A、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:B、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:C、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:D、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:E、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:F、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:H、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:I、AV ID:G和IM ID:λ；AVID:J、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:K、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:L、AV ID:G和IM ID:λ；AVID:M、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:N、AV ID:G和IM ID:λ；AV ID:O、AV ID:G和IM ID:λ。
30.根据权利要求1所述的药物组合，其中所述药物组合包括从表10、表11和表12中所示的组合中选择的组合，或由从表10、表11和表12中所示的组合中选择的组合组成。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的药物组合，其中所述活性成分中的至少一种被配制为药用盐。
32.根据权利要求31所述的药物组合，其中所述药用盐包括Na+或K+。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的药物组合，其中所述活性成分中的至少一种与药用载体一起配制。
34.根据权利要求33所述的药物组合，其中所述药用载体为水。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的药物组合，其中所述活性成分中的至少一种被配制在磷酸盐缓冲盐水中。
36.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至35中任一项所述的药物组合。
37.一种多部件的试剂盒，其包括根据权利要求1至36中任一项所述的药物组合或组合物，以及包装插页，所述包装插页具有用于治疗乙型肝炎病毒感染的施用说明。
38.根据权利要求37所述的多部件的试剂盒，其中所述包装插页描述慢性乙型肝炎病毒感染的治疗。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒用于治疗乙型肝炎病毒感染的用途。
40.根据权利要求39所述的用途，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
41.根据权利要求39或40所述的用途，其中所述活性成分各自以药学有效量施用。
42.根据权利要求39至41中任一项所述的用途，其中不向受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录本的RNAi寡核苷酸。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
44.根据权利要求1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒，其用在医药中。
45.根据权利要求1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒，其用在乙型肝炎病毒感染的治疗中。
46.根据权利要求44或45所述使用的药物组合、组合物或试剂盒，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
47.根据权利要求44至46中任一项所述使用的药物组合、组合物或试剂盒，其中所述活性成分以药学有效量施用。
48.根据权利要求44至47中任一项所述使用的药物组合、组合物或试剂盒，其中不向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录本的RNAi寡核苷酸。
49.根据权利要求44至48中任一项所述使用的药物组合、组合物或试剂盒，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
50.根据权利要求1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在制备药物中的用途。
51.根据权利要求1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒在制备用于治疗乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
52.根据权利要求50或51所述的用途，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的用途，其中所述活性成分各自以药学有效量施用。
54.根据权利要求50至53中任一项所述的用途，其中不向受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录本的RNAi寡核苷酸。
55.根据权利要求50至54中任一项所述的用途，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
56.一种用于治疗乙型肝炎病毒感染的方法，其包括向感染有乙型肝炎病毒感染的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至38中任一项所述的药物组合、组合物或试剂盒。
57.根据权利要求56所述的方法，其中待治疗的所述乙型肝炎病毒感染为慢性乙型肝炎病毒感染。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述活性成分各自以药学有效量施用。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其中不向所述受试者施用选择性地靶向HBxAg mRNA转录本的RNAi寡核苷酸。
60.根据权利要求56至58中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
61.一种降低细胞中的乙型肝炎病毒表面抗原的表达的方法，所述方法包括向所述细胞递送根据权利要求1至36中任一项所述的药物组合或组合物。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞为肝细胞。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述细胞是在体内的。
64.根据权利要求61或62所述的方法，其中所述细胞是在体外的。
65.根据权利要求39至64中任一项所述使用的用途、方法、或药物组合、组合物或试剂盒，其中所述基因表达抑制剂以转基因的形式递送，所述转基因被工程化为在所述细胞中表达所述寡核苷酸。
66.基本上如本文并参照附图所述的药物组合、组合物、试剂盒、用途或方法。
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