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CN114807015B - 一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用 - Google Patents

一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用 Download PDF

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CN114807015B CN202210557363.XA CN202210557363A CN114807015B CN 114807015 B CN114807015 B CN 114807015B CN 202210557363 A CN202210557363 A CN 202210557363A CN 114807015 B CN114807015 B CN 114807015B
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Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用，所述诱导方法在传统诱导方法的基础上，在诱导分化第35天时，更换为胰岛α细胞转化为β细胞的培养基，同时添加蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394诱导至第40天。经验证发现，本发明所述的诱导方法能够显著提高胰岛β细胞的表达量，适合规模化细胞制剂的生产和临床应用。

Description

一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用。
背景技术
糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是由于胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗引起的以高血糖为特征的一组慢性代谢性疾病，主要分为1型糖尿病(Type 1diabetes mellitus，T1DM)、2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus，T2DM)、妊娠糖尿病(Gestational diabetesmellitus，GDM)和单基因糖尿病。据统计，截止至2019年全球糖尿病患者超4.63亿，预计2045年将增至7亿。其中，1型糖尿病是一种由T淋巴细胞介导的自身免疫性疾病。由于胰岛细胞受损而导致胰岛素分泌不足，1型糖尿病患者需要完全依赖外源胰岛素治疗。虽然胰岛素治疗已从过去的“每日餐前一针”发展到“人工智能控制的胰岛泵”，但并不能根治，也不能防止包括视网膜病变、神经病变等一系列并发症的发生。近年来，胰岛移植结合免疫抑制已成功应用于1型糖尿病的治疗中，但由于供体器官严重缺乏、需要终身免疫抑制以及胰岛移植后难以长期存活等问题限制了其临床应用。多能干细胞在解决供体胰岛短缺方面有着巨大的潜力，多能干细胞诱导分化胰岛类器官，在胰岛类器官中分化为能够分泌胰岛素的胰岛β细胞可以为糖尿病替代治疗提供无限的细胞来源。然而与天然成人胰岛β细胞相比，体外生成的胰岛β细胞在转录和功能上并不成熟。因此，成熟胰岛β细胞功能性是至关重要的。
胰岛β细胞的再生和替代治疗被认为有望成为治愈1型糖尿病的有效途径。目前，在实验室水平上用于1型糖尿病治疗的干细胞有胚胎干细胞、诱导性多能干细胞(Inducedpluripotent stem cell，iPSCs)、间充质干细胞(Mesenchymal stemcell，MSCs)、骨髓来源的造血干细胞(Hematopoietic stem cell，HSCs)、胰腺内的多能前体细胞以及存在于胰腺外(脾脏、肝脏、子宫内膜)的β细胞前体细胞。干细胞治疗1型糖尿病是基于干细胞的自我更新功能和潜在的定向分化功能，相较于完全异体胰腺组织移植，移植前能够在分子水平进行严格的质量控制，并能对移植细胞质量和免疫排斥反应进行有效评估，因而干细胞疗法可以部分或完全避免免疫排斥反应所导致的移植失败和移植术后并发症。其中，iPSCs治疗1型糖尿病属于再生医学范畴，在治疗1型糖尿病方面具有巨大的潜力，其基本原理是将患者自体细胞逆转为早期未分化的多能干细胞，再经各种细胞因子处理以模仿胚胎细胞的生长发育过程，诱导其成为具有分泌胰岛素功能的胰岛β细胞。与胚胎干细胞不同，iPSCs只能形成新的组织和器官，而不能形成新的个体，所以能够避免潜在的医学伦理问题，且因细胞来源于患者本身，所以还可减少或完全避免免疫排斥反应。
现阶段有多种方法能够使多能干细胞成功诱导转分化为胰岛，所述方法中胰岛的形成基本均是通过内胚层、原肠管、后前肠、胰腺祖细胞、胰腺内分泌前体、未成熟的β细胞、成熟的β细胞这一过程实现的，然而通过目前已经开发的众多多能干细胞诱导分化胰岛细胞的技术诱导转分化得到的胰岛细胞大多数为胰岛多激素细胞，也即同时表达胰岛α细胞、胰岛β细胞、胰岛γ细胞、胰岛PP细胞等，其中，胰岛β细胞表达激素有限且不稳定，胰岛α细胞的表达量显著高于胰岛β细胞，且大部分胰岛β细胞处于未成熟状态，胰高血糖素的表达量明显高于胰岛素的表达量，严重限制了其在1型糖尿病治疗中的应用。因此，目前本领域仍亟需一种能够大量并稳定的获得功能性胰岛β样细胞的标准诱导方法。基于此，本发明提供了一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用，所述诱导方法中包含蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394，目前，尚未有将蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394两者联合应用于促进胰岛α细胞转化为β细胞的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用，所述诱导方法在传统诱导方法的基础上，在诱导分化第35天时，更换为胰岛α细胞转化为β细胞的培养基，同时添加蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394诱导至第40天。经验证发现，采用本发明所述的诱导方法能够显著提高胰岛β细胞的表达量，在1型糖尿病治疗中的应用前景广阔。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化剂。
进一步，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂、第五阶段诱导分化剂、第六阶段诱导分化剂、第七阶段诱导分化剂、第八阶段诱导分化剂；
优选地，所述第一阶段诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂A、第一阶段诱导分化剂B；
更优选地，所述第一阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8、CHIR-99021；
更优选地，所述第一阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8；
优选地，所述第二阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7；
优选地，所述第三阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、TPPB；
优选地，所述第四阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、TPPB；
优选地，所述第五阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；
优选地，所述第六阶段诱导分化剂包括第六阶段诱导分化剂A、第六阶段诱导分化剂B；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、肝素；
更优选地，所述第六阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；
优选地，所述第七阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸、水溶性维生素E、R428；
优选地，所述第八阶段诱导分化剂包含蒿甲醚和NS11394；
更优选地，所述第八阶段诱导分化剂还包含谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、Necrostatin-1、Pefabloc；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500)ng/mLGDF8、(0.5-20)μM CHIR-99021、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100ng/mL GDF8、3μMCHIR-99021、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠；
更优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(10-100)ng/mL FGF-7、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠；
更优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(10-100)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄酸、(10-500)nMLDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500)nM TPPB、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、2.5g/L碳酸氢钠；
更优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄酸、(10-500)nMLDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500)nM TPPB、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、2ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、2.5g/L碳酸氢钠；
更优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄酸、(10-500)nM LDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50)μM ALK5iII、(1-50)μM硫酸锌、(1-50)μg/mL肝素、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT-1、0.1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、10μg/mL肝素、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500)nMLDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(10-500)nM GSi XX、(1-50)μg/mL肝素、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、100nM GSi XX、10μg/mL肝素、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；
更优选地，所述第七阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(1-50)μg/mL肝素、(0.01-10)mM乙酰-l-半胱氨酸、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-10)μM R428、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第七阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、10μg/mL肝素、1mM乙酰-l-半胱氨酸、10μM水溶性维生素E、2μMR428、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；
更优选地，所述第八阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)mM烟酰胺、(1-50)μg/mL肝素、(0.01-10)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(10-500)μM Necrostatin-1、(0.01-5)μM Pefabloc、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-10)mM二水氯化钙、(0.1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(1-50)μM蒿甲醚、(1-50)μM NS11394；
最优选地，所述第八阶段诱导分化培养剂中各成分的浓度分别为：0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL肝素、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin-1、0.1μM Pefabloc、2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、10mMN-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、10μM蒿甲醚、10μM NS11394。
本发明的第二方面提供了一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基。
进一步，所述诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基、第二阶段诱导分化培养基、第三阶段诱导分化培养基、第四阶段诱导分化培养基、第五阶段诱导分化培养基、第六阶段诱导分化培养基、第七阶段诱导分化培养基、第八阶段诱导分化培养基；
优选地，所述第一阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第一阶段诱导分化剂；
优选地，所述第二阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第二阶段诱导分化剂；
优选地，所述第三阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第三阶段诱导分化剂；
优选地，所述第四阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第四阶段诱导分化剂；
优选地，所述第五阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第五阶段诱导分化剂；
优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第六阶段诱导分化剂；
优选地，所述第七阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、本发明第一方面中所述的第七阶段诱导分化剂；
优选地，所述第八阶段诱导分化培养基包括50％Ham’s F-12medium、50％medium199、本发明第一方面中所述的第八阶段诱导分化剂。
本发明的第三方面提供了一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化方法；
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)提供诱导多能干细胞并在完全培养基中进行培养；
(2)第一阶段诱导分化，采用第一阶段诱导分化培养基诱导步骤(1)得到的诱导多能干细胞向定型内胚层细胞分化；
(3)第二阶段诱导分化，采用第二阶段诱导分化培养基诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化；
(4)第三阶段诱导分化，采用第三阶段诱导分化培养基诱导原始肠管细胞向后前肠细胞分化；
(5)第四阶段诱导分化，采用第四阶段诱导分化培养基诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化；
(6)第五阶段诱导分化，采用第五阶段诱导分化培养基诱导胰腺祖细胞向内分泌祖细胞分化；
(7)第六阶段诱导分化，采用第六阶段诱导分化培养基诱导内分泌祖细胞向未成熟胰岛β细胞分化；
(8)第七阶段诱导分化，采用第七阶段诱导分化培养基诱导未成熟胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化；
(9)第八阶段诱导分化，采用第八阶段诱导分化培养基进一步诱导胰岛β细胞的成熟，得到功能性胰岛β细胞。
进一步，步骤(1)中所述的完全培养基为E8完全培养基；
优选地，所述E8完全培养基中含有ROCK抑制剂；
更优选地，所述ROCK抑制剂包括Y-27632、GSK429286A、RKI-1447、Y-33075dihydrochloride、Thiazovivin、K-115、SLx-2119、Chroman1、SAR407899和/或SR-3677；
最优选地，所述ROCK抑制剂为Y-27632；
最优选地，所述Y-27632的浓度为0.001-100μM；
最优选地，所述Y-27632的浓度为10μM；
优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞的细胞密度为0.1-10.0×105cells/cm2；
更优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞的细胞密度为1.8-2.2×105cells/cm2；
优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于哺乳动物；
更优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于人类、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、猪、猫、兔、狗、狼、马、或牛；
最优选地，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于人类；
优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、生长分化因子、GSK-3抑制剂；
更优选地，所述生长分化因子包括GDF8、GDF15、GDF9、GDF11、GDF8、GDF5、GDF1、GDF9B、GDF6；
最优选地，所述生长分化因子为GDF8；
更优选地，所述GSK-3抑制剂包括CHIR-99021、CHIR-98014、AZD-2858、SB-216763、AT-7519、TW-S119、KY-19382(A3051)、NP-031112、SB-415286、AZD-1080、AR-A014418、TDZD-8、LY-2090314；
最优选地，所述GSK-3抑制剂为CHIR-99021；
更优选地，步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基A、第一阶段诱导分化培养基B；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8、CHIR-99021；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8；
更优选地，所述第一阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第1天，采用第一阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第2-3天，采用第一阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，在诱导第2-3天，每天更换新鲜培养基；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500)ng/mLGDF8、(0.5-20)μM CHIR-99021、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100ng/mLGDF8、3μM CHIR-99021、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠。
进一步，步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子；
优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(10-100)ng/mL FGF-7、(0.01-5)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.5％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第二阶段诱导分化的时间为2天；
最优选地，在诱导第4-5天，采用所述第二阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，在诱导第4-5天，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(4)中所述的第三阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、SANT-1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
最优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
更优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
最优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
更优选地，所述蛋白激酶C活化物包括TPPB、PMA；
最优选地，所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
最优选地，所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(10-100)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄酸、(10-500)nMLDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500)nM TPPB、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、50ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、2.5g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第三阶段诱导分化的时间为2天；
最优选地，在诱导第6-7天，采用所述第三阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，在诱导第6-7天，每天更换新鲜培养基。
进一步，步骤(5)中所述的第四阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、SANT-1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物；
优选地，所述成纤维细胞生长因子包括FGF-7、FGF-2、FGF-6、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-21、FGF-5、FGF-1、FGF-3、FGF-4、FGF-8、FGF-9、FGF-19、FGF-20；
更优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
更优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
优选地，所述蛋白激酶C活化物包括TPPB、PMA；
更优选地，所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
最优选地，所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)mM抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5)μM SANT-1、(0.01-10)μM视黄酸、(10-500)nMLDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500)nM TPPB、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(0.05-10)g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25mM抗坏血酸、2ng/mL FGF-7、0.25μM SANT-1、1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200nM TPPB、2％胎牛血清白蛋白、10mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、2.5g/L碳酸氢钠；
最优选地，所述第四阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第8-10天，采用所述第四阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，在诱导第8-10天，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(6)中所述的第五阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、SANT-1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂、硫酸锌、肝素；
更优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
最优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
更优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
最优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
最优选地，所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)μMSANT-1、(0.01-10)μM视黄酸、(10-500)nM LDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50)μMALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(1-50)μg/mL肝素、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25μM SANT-1、0.1μM视黄酸、100nM LDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、10μg/mL肝素、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第五阶段诱导分化的时间为3天；
最优选地，在诱导第11天，将细胞铺种到低亲附性培养板中，在诱导第11-13天，采用所述第五阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，在诱导第11-13天，每天更换新鲜培养基。
进一步，步骤(7)中所述的第六阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂、肝素；
优选地，所述BMP抑制剂包括LDN193189、LDN212854、UK383367、LDN214117、GW788388、SM1-71、ER50891、DMH-1、LDN193189、K02288、PD161570；
更优选地，所述BMP抑制剂为LDN193189；
优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
更优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
优选地，所述γ-分泌酶抑制剂包括GSi XX、GSi IX、GSi XI、GSi XII、GSi XIII、GSi XIV、GSi XVI、GSi XIX、GSi XVII、GSi XXI、RO4929097、LY450139、MK-0752、BMS-708163、LY411575、LY3039478；
更优选地，所述γ-分泌酶抑制剂为GSi XX；
优选地，所述第六阶段诱导分化培养基包括第六阶段诱导分化培养基A、第六阶段诱导分化培养基B；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、肝素；
更优选地，所述第六阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；
最优选地，所述第六阶段诱导分化的时间为14天；
最优选地，在诱导第14-20天，采用第六阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
最优选地，在诱导第21-27天，采用第六阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
最优选地，在诱导第14-27天，每天更换新鲜培养基；
最优选地，所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500)nMLDN193189、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50)μM ALK5i II、(1-50)μM硫酸锌、(10-500)nM GSi XX、(1-50)μg/mL肝素、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100nMLDN193189、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5iII、10μM硫酸锌、100nM GSi XX、10μg/mL肝素、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；
优选地，步骤(8)中所述的第七阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸、水溶性维生素E、Axl抑制剂；
更优选地，所述ALK5抑制剂包括ALK5i II、R-268712、SB505124、GW788388、SD208、SB431542、ITD-1、LY2109761、A83-01、LY2157299、TGF-β受体抑制剂V、TGF-β受体抑制剂I、TGF-β受体抑制剂IV、TGF-β受体抑制剂VII、TGF-β受体抑制剂VIII、TGF-β受体抑制剂II、TGF-β受体抑制剂VI和TGF-β受体抑制剂III；
最优选地，所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
更优选地，所述Axl抑制剂包括R428、BMS-907351、BMS-777607、XL184、TP-0903、XL092、LDC1267、LY2801653、CEP-40783、RU-301、S49076、ONO-7475、Ningetinib；
最优选地，所述Axl抑制剂为R428；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10)μM三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50)μM ALK5iII、(1-50)μM硫酸锌、(1-50)μg/mL肝素、(0.01-10)mM乙酰-l-半胱氨酸、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-10)μM R428、(0.05-10)g/L碳酸氢钠、(0.05-10)mM谷氨酰胺、(1-50)mM葡萄糖、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第七阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1μM三碘甲状腺原氨酸、10μM ALK5i II、10μM硫酸锌、10μg/mL肝素、1mM乙酰-l-半胱氨酸、10μM水溶性维生素E、2μM R428、1.5g/L碳酸氢钠、2mM谷氨酰胺、20mM葡萄糖、2％胎牛血清白蛋白；
最优选地，所述第七阶段诱导分化的时间为13天；
最优选地，在诱导第28-34天，采用所述第七阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，在诱导第28-34天，每天更换新鲜培养基；
优选地，步骤(9)中所述的第八阶段诱导分化培养基包含胰岛α细胞转β细胞培养基、蒿甲醚、GABAA激活剂；
更优选地，所述胰岛α细胞转β细胞培养基包含Ham’s F-12medium、medium 199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂；
最优选地，所述坏死性凋亡抑制剂包括Necrostatin-1、Necrostatin-2；
最优选地，所述坏死性凋亡抑制剂为Necrostatin-1；
最优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂包括Pefabloc、Benzamidine、MBTI、PMSF、LBTI；
最优选地，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为Pefabloc；
更优选地，所述GABAA激活剂包括NS11394、R-16659、Muscimol、Arbaclofen、Propofol、Baclofen、Isoguvacine hydrochloride；
最优选地，所述GABAA激活剂为NS11394；
最优选地，所述第八阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、(0.01-5)％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(1-50)μM水溶性维生素E、(1-50)mM烟酰胺、(1-50)μg/mL肝素、(0.01-10)U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(10-500)μM Necrostatin-1、(0.01-5)μM Pefabloc、(0.01-10)mM谷氨酰胺、(0.01-10)mM二水氯化钙、(0.1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.05-10)％胎牛血清白蛋白、(1-50)μM蒿甲醚、(1-50)μM NS11394；
最优选地，所述第八阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、0.5％胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、10μM水溶性维生素E、10mM烟酰胺、10μg/mL肝素、1U/mL脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100μM Necrostatin-1、0.1μMPefabloc、2mM谷氨酰胺、2.5mM二水氯化钙、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2％胎牛血清白蛋白、10μM蒿甲醚、10μM NS11394；
最优选地，所述第八阶段诱导分化的时间为6天；
最优选地，在诱导第35-40天，采用所述第八阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
最优选地，在诱导第35-40天，每天更换新鲜培养基。
本发明的第四方面提供了一种诱导多能干细胞来源的功能性胰岛β细胞或细胞群体。
进一步，所述细胞或细胞群体为采用本发明第三方面所述的方法诱导分化得到的；
优选地，所述胰岛β细胞或细胞群体为功能性的、稳定的胰岛β细胞或细胞群体。
本发明的第五方面提供了一种用于治疗和/或预防糖尿病的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第四发明所述的细胞或细胞群体；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料；
优选地，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、单基因糖尿病；
更优选地，所述糖尿病为1型糖尿病。
本发明的第六方面提供了如下任一方面的应用：
(1)蒿甲醚和NS11394联合在促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞中的应用；
(2)蒿甲醚和NS11394联合在诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(3)本发明第一方面所述的诱导分化剂在制备诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基中的应用；
(4)本发明第一方面所述的诱导分化剂在诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(5)本发明第二方面所述的诱导分化培养基在诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞中的应用；
(6)本发明第四方面所述的细胞或细胞群体在制备治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用；
(7)本发明第五方面所述的药物组合物在治疗和/或预防糖尿病中的应用；
优选地，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病、单基因糖尿病；
更优选地，所述糖尿病为1型糖尿病。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明提供了一种新型的促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法，所述诱导方法在传统诱导方法的基础上，在诱导分化第35天时，更换为胰岛α细胞转化为β细胞的培养基，同时添加蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394诱导至第40天。经验证发现，经过本发明提供的诱导方法制备得到的胰岛β细胞的标志性分子的表达量显著升高，表明了本发明提供的诱导方法能够显著提高胰岛β细胞的表达量，为临床上1型糖尿病的治疗提供了科学依据。
附图说明
图1为qPCR检测胰岛成熟标志基因mRNA的表达情况的结果统计图，其中，A组(对照组)：在诱导第35-40天使用第七阶段诱导分化培养基；B组：在诱导第35-40天使用α细胞转β细胞培养基；C组：在诱导第35-40天使用α细胞转β细胞培养基，并同时添加蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 iPSCs诱导分化为胰岛的方法
1、实验材料
本发明实施例中涉及到的实验材料见表1。
表1实验材料
Figure BDA0003655439530000191
Figure BDA0003655439530000201
2、iPSCs诱导分化为胰岛β细胞的方法
来源于人类的iPSCs(来源于北京呈诺医学科技有限公司，根据本公司在先申请的专利(201910110768.7)中所述的方法制备)聚合度达到70％-80％后用DPBS磷酸盐缓冲液清洗2遍，随后在37℃的条件下，用TrypLE Express消化酶消化3-5min。用DMEM/F12培养基按5:1的比例中和后离心，离心条件为200g，5min。用E8完全培养基+10μM Y-27632(ROCK抑制剂)重悬铺种，密度约为1.8-2.2×105cells/cm2，12孔细胞板提前24-48小时用0.13-0.2mg/mL Matrigel包被。
(1)第一阶段：诱导iPSCs向定型内胚层细胞分化
所述第一阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、GDF8和CHIR-99021组成。
在该培养基中，GDF8的浓度为100ng/mL，CHIR-99021的浓度为3μM，胎牛血清白蛋白(BSA)的浓度为0.5％，葡萄糖的浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为2mM，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L。
所述第一阶段诱导的时间为3天。其中，在诱导第1天(D1)，培养基中GDF8的浓度为100ng/mL；CHIR-99021的浓度为3μmol/L。在诱导第2-3天(D2-D3)，培养基中GDF8的浓度为100ng/mL。即：诱导第1天使用第一阶段培养基A，所述第一阶段培养基A由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、GDF8和CHIR-99021组成；诱导第2-3天，使用第一阶段培养基B，所述第一阶段培养基B由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)和GDF8组成。每天更换新鲜培养基。
(2)第二阶段：诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化
所述第二阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、抗坏血酸和成纤维细胞生长因子7(FGF-7)组成。
在该培养基中，抗坏血酸的浓度为0.25mM，成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的浓度为50ng/mL，胎牛血清白蛋白(BSA)的浓度为0.5％，葡萄糖的浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为2mM，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L。
所述第二阶段诱导的时间为2天。其中，在诱导第4-5天(D4-D5)，培养基中抗坏血酸的浓度为0.25mM；成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的浓度为50ng/mL；即：诱导第4-5天使用所述第二阶段的诱导分化培养基。每天更换新鲜培养基。
(3)第三阶段：诱导原始肠管细胞向后前肠细胞分化
所述第三阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和蛋白激酶C活化物TPPB组成。
在该培养基中，抗坏血酸的浓度为0.25mM，成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的浓度为50ng/mL，SANT-1的浓度为0.25μM，视黄酸的浓度为1μM，LDN193189的浓度为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，蛋白激酶C活化物TPPB的浓度为200nM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，葡萄糖的浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为2mM，碳酸氢钠的浓度为2.5g/L。
所述第三阶段诱导的时间为2天，在诱导第6-7天(D6-D7)，培养基中抗坏血酸的浓度为0.25mM；成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的浓度为50ng/mL；SANT-1的浓度为0.25μM；视黄酸的浓度为1μM；LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，蛋白激酶C活化物TPPB的浓度为200nM，即：诱导第6-7天使用第三阶段的诱导分化培养基，每天更换新鲜培养基。
(4)第四阶段：诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化
所述第四阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子7(FGF-7)、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂和蛋白激酶C活化物TPPB组成。
在该培养基中，抗坏血酸的浓度为0.25mM，成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的浓度为2ng/mL，SANT-1的浓度为0.25μM，视黄酸的浓度为1μM，LDN193189的浓度为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，蛋白激酶C活化物TPPB的浓度为200nM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，葡萄糖的浓度为10mM，谷氨酰胺的浓度为2mM，碳酸氢钠的浓度为2.5g/L。
所述第四阶段诱导的时间为3天，在诱导第8-10天(D8-D10)，培养基中抗坏血酸的浓度为0.25mM；成纤维细胞生长因子7(FGF-7)的浓度为2ng/mL；SANT-1的浓度为0.25μM；视黄酸的浓度为1μM；LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％；蛋白激酶C活化物TPPB的浓度为200nM，即：诱导第8-10天使用所述第四阶段的诱导分化培养基，每天更换新鲜培养基。
(5)第五阶段：诱导胰腺祖细胞向内分泌祖细胞分化
所述第五阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌和肝素组成。
在该培养基中，SANT-1的浓度为0.25μM，视黄酸的浓度为0.1μM，LDN193189的浓度为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM，ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10μM，硫酸锌的浓度为10μM，肝素的浓度为10μg/mL，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，谷氨酰胺的浓度为2mM，葡萄糖的浓度为20mM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％。
所述第五阶段诱导的时间为3天，在诱导第11天(D11)，采用细胞刮将细胞铺种到低亲附性培养板中，在诱导第11-13天(D11-D13)，培养基中SANT-1的浓度为0.25μM；视黄酸的浓度为0.1μM；LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10μM；硫酸锌的浓度为10μM；肝素的浓度为10μg/mL，即：诱导第11-13天使用所述第五阶段的诱导分化培养基，每天更换新鲜培养基。
(6)第六阶段：诱导内分泌祖细胞向未成熟胰岛β细胞分化
所述第六阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi XX和肝素组成。
在该培养基中，LDN193189的浓度为100nM，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM，ALK5抑制剂ALK5iII的浓度为10μM，硫酸锌的浓度为10μM，γ-分泌酶抑制剂GSi XX的浓度为100nM，肝素的浓度为10μg/mL，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，谷氨酰胺的浓度为2mM，葡萄糖的浓度为20mM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％。
所述第六阶段诱导的时间为14天，在诱导第14-20天(D14-D20)，培养基中LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10μM；硫酸锌的浓度为10μM；γ-分泌酶抑制剂GSi XX为100nM，肝素的浓度为10μg/mL。在诱导第21-27(D21-D27)天，培养基中LDN193189的浓度为100nM；胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10μM；硫酸锌的浓度为10μM；肝素的浓度为10μg/mL，即：诱导第14-20天，使用第六阶段培养基A，所述第六阶段培养基A由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂GSi XX和肝素组成；诱导第21-27天使用第六阶段培养基B，所述第六阶段培养基B由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌和肝素组成。每天更换新鲜培养基。
(7)第七阶段：诱导未成熟胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化
所述第七阶段的诱导分化培养基由基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺(GlutaMax)、葡萄糖、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂ALK5i II、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)、水溶性维生素E和Axl抑制剂R428组成。
在该培养基中，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM，ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10μM，硫酸锌的浓度为10μM，肝素的浓度为10μg/mL，乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)的浓度为1mM，水溶性维生素E的浓度为10μM，Axl抑制剂R428的浓度为2μM，碳酸氢钠的浓度为1.5g/L，谷氨酰胺的浓度为2mM，葡萄糖的浓度为20mM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％。
所述第七阶段诱导的时间为13天，在诱导第28-34天(D28-D34)，培养基中胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％；三碘甲状腺原氨酸的浓度为1μM；ALK5抑制剂ALK5i II的浓度为10μM；硫酸锌的浓度为10μM；肝素的浓度为10μg/mL；乙酰-l-半胱氨酸(N-Cys)的浓度为1mM；水溶性维生素E的浓度为10μM；Axl抑制剂R428的浓度为2μM，即：诱导第28-34天使用第七阶段的诱导分化培养基。每天更换新鲜培养基。
(8)第八阶段：进一步诱导胰岛β细胞的成熟
所述第八阶段的诱导分化培养基使用了胰岛a细胞转β细胞培养基，该培养基中包括50％Ham’s F-12medium、50％medium 199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、脱脂BSA(胎牛血清白蛋白)(BSA)、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1、丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc组成，蒿甲醚、GABAA激活剂NS11394为额外添加的小分子。
在该培养基中，胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％，水溶性维生素E的浓度为10μM，烟酰胺的浓度为10mM，肝素的浓度为10μg/mL，脱氧核糖核酸酶Ⅰ的浓度为1U/mL，坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1的浓度为100μM，丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc的浓度为0.1μM，谷氨酰胺的浓度为2mM，二水氯化钙为2.5mM，N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸的浓度为10mM，胎牛血清白蛋白的浓度为2％，蒿甲醚的浓度为10μM，GABAA激活剂NS11394的浓度为10μM。
所述第八阶段诱导的时间6天，在诱导第35-40天(D35-D40)，培养基中胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂的浓度为0.5％；水溶性维生素E的浓度为10μM；烟酰胺的浓度为10mM；肝素的浓度为10μg/mL；脱氧核糖核酸酶Ⅰ的浓度为1U/mL；坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1的浓度为100μM；丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc的浓度为0.1μM，额外添加的小分子蒿甲醚的浓度为10μM；GABAA激活剂NS11394的浓度为10μM；即：诱导第35-40天使用第八阶段的诱导分化培养基。每天更换新鲜培养基。
实施例2 qPCR检测胰岛成熟标志基因mRNA的表达情况
1、实验方法
iPSCs经诱导后，用Insulin(INS)、Glucagon(GCG)、MAFA作为胰岛标记物，检测经iPSCs诱导分化得到的胰岛细胞中胰岛标记物mRNA的表达情况。
其中，Insulin(INS)是指胰岛素，由胰岛β细胞分泌的一种α和β双链构成的多肽激素，由51个氨基酸组成，分子量约5800Da。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素。为胰岛β细胞的标志基因；
Glucagon(GCG)是指胰高血糖素，由胰岛α细胞分泌的一种由29个氨基酸组成的直链多肽激素，分子量为3485Da。在体内具有升高血糖的作用；
MAFA是指肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A基因(v-maf musculoaponeuroticfibrosarcoma oncogene homologue A)，是一种具有亮氨酸拉链结构的转录因子。MAFA是目前发现的唯一一种胰岛β细胞胰岛素基因活化转录因子。胰腺β细胞的成熟和功能的维持都有赖于MAFA蛋白的正常表达。因此，MAFA为胰岛β细胞的成熟标志基因。
具体实验方法如下：
1.1总RNA提取及反转
(1)细胞培养皿中细胞样品用PBS洗两次后，用1mL枪将PBS吸干净，加入1mLTrizol(Invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5mL RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5分钟；
(2)每1mL Trizol加0.2mL氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟；
(3)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
(4)加入1倍体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇！)，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管；
(5)加500μL去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液；
(6)加入700μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；
(7)加入500μL漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；
(8)将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(9)取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μL RNase free water，事先在65-70℃水浴中加热效果更好；
(10)室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1分钟，或者另外再加30μL RNase free water，离心1分钟，合并两次洗脱液；
(11)洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要RNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积最好不少于30μL，体积过小降低RNA洗脱效率，减少RNA产量。
1.2总RNA纯度和完整性检测
(1)纯度检测：取1μL RNA样品，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值为2，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染；
(2)总RNA完整性检测：取RNA样品6μL，1％琼脂糖凝胶电泳150V×10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。
1.3RNA反转
(1)使用分光光度计测量RNA浓度并进行计算，按500ng浓度进行反转；
(2)按照如下体系将试剂与总RNA进行预混：Total RNA 500ng，Oligo dT 1μL，2XTS Reaction Mix 10μL，RI/RT Enzyme MiX 1μL，gDNA Remover 1μL，RNase-free Water调整Total volume为20μL；
(3)将预混液转移至PCR仪中，使用cDNA模板进行反应(42℃孵育30min，85℃孵育5s)；
(4)迅速将反转完成的cDNA转移置冰上1min进行降温；
(5)-20℃保存，使用前可按所需浓度进行稀释。
1.4荧光定量PCR(qPCR)实验方法
qPCR检测基因INS、GCG、MAFA的引物序列信息见下表2；
表2 qPCR检测基因INS、GCG、MAFA的引物序列信息
Figure BDA0003655439530000281
模板如下：Forward Primer(10μM)0.4μL，Reverse Primer(10μM)0.4μL，2xTransStar Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μL，Nuclease-free Water 8.2μL，cDNA 1μL，Total volume 20μL。
(1)首先将试剂与引物按如上模板进行预混，加入八连管中，每孔18μL；
(2)迅速在八连管中加入cDNA 2μL，盖上盖子进行瞬离；
(3)放入Light cycler仪器中按照3步法进行反应，循环数为40；
(4)模板如下Temp Time 94℃30s 94℃5s 45cycles 55℃15s 72℃10s。
1.5具体分组方式如下：
A组(对照组)：在诱导第35-40天使用第七阶段的诱导分化培养基；
B组：在在诱导第35-40天使用a转β培养基；
C组：在诱导第35-40天使用a转β培养基，同时添加蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394，其中，蒿甲醚的浓度为10μM，GABAA激活剂NS11394的浓度为10μM。
2、实验结果
qPCR检测结果见图1，结果显示，C组INS、GCG、MAFA基因的mRNA表达水平显著高于其它组(p<0.05)。C组经诱导后获得的胰岛细胞INS基因的mRNA表达水平较A组增加27.76倍，GCG基因的mRNA表达水平较A组增加14.82倍，MAFA基因的mRNA表达水平较A组增加4.34倍，表明了在胰岛成熟阶段，采用α细胞转β细胞培养基联合蒿甲醚和GABAA激活剂NS11394对iPSCs进行诱导，可促进β细胞成熟，获得更多数量的胰岛β细胞，即诱导效率更高。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 呈诺再生医学科技（北京）有限公司
<120> 一种促进胰岛α细胞转化为β细胞的诱导方法及其应用
<141> 2022-05-20
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggctgttgtc atacttctca tgg 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcacacctg gtggaagctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agctggtaga gggagcagat 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggcaacgtt cccttcaaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaatgtgccc tgtgaatggc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagagcgaga agtgccaact 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctccttgt acaggtcccg 20

Claims (12)

1.一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化剂，其特征在于，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂、第五阶段诱导分化剂、第六阶段诱导分化剂、第七阶段诱导分化剂、第八阶段诱导分化剂；
所述第一阶段诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂A、第一阶段诱导分化剂B；
所述第一阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8、CHIR-99021；
所述第一阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8；
所述第二阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7；
所述第三阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、TPPB；
所述第四阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、FGF-7、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、TPPB；
所述第五阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、SANT-1、视黄酸、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；
所述第六阶段诱导分化剂包括第六阶段诱导分化剂A、第六阶段诱导分化剂B；
所述第六阶段诱导分化剂A包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、肝素；
所述第六阶段诱导分化剂B包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；
所述第七阶段诱导分化剂包含碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸、水溶性维生素E、R428；
所述第八阶段诱导分化剂包含蒿甲醚和NS11394；
所述第八阶段诱导分化剂还包含谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、Necrostatin-1、Pefabloc；
所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500) ng/mL GDF8、(0.5-20) μM CHIR-99021、(0.01-5)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM 抗坏血酸、(10-100)ng/mL FGF-7、(0.01-5)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM 抗坏血酸、(10-100)ng/mL FGF-7、(0.01-5) μM SANT-1、(0.01-10) μM 视黄酸、(10-500) nM LDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500) nM TPPB、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM 抗坏血酸、(0.01-10)ng/mL FGF-7、(0.01-5) μM SANT-1、(0.01-10) μM 视黄酸、(10-500) nM LDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500) nM TPPB、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5) μM SANT-1、(0.01-10) μM 视黄酸、(10-500) nM LDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10) μM 三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50) μM ALK5i II、(1-50) μM 硫酸锌、(1-50) μg/mL 肝素、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白；
所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(10-500) nM LDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10) μM 三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50) μM ALK5i II、(1-50) μM 硫酸锌、(10-500) nM GSi XX、(1-50) μg/mL 肝素、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白；
所述第七阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10) μM 三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50) μM ALK5i II、(1-50) μM 硫酸锌、(1-50) μg/mL 肝素、(0.01-10) mM 乙酰-l-半胱氨酸、(1-50) μM 水溶性维生素E、(1-10) μM R428、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白；
所述第八阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(1-50) μM 水溶性维生素E、(1-50) mM 烟酰胺、(1-50) μg/mL 肝素、(0.01-10) U/mL 脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(10-500) μM Necrostatin-1、(0.01-5) μMPefabloc、(0.01-10) mM 谷氨酰胺、(0.01-10) mM 二水氯化钙、(0.1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) μM 蒿甲醚、(1-50) μM NS11394。
2.根据权利要求1所述的诱导分化剂，其特征在于，所述第一阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100 ng/mL GDF8、3 μM CHIR-99021、0.5% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠；
所述第二阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25 mM 抗坏血酸、50 ng/mL FGF-7、0.5% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠；
所述第三阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25 mM 抗坏血酸、50 ng/mL FGF-7、0.25 μM SANT-1、1 μM 视黄酸、100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200 nM TPPB、2% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、2.5 g/L 碳酸氢钠；
所述第四阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25 mM 抗坏血酸、2 ng/mL FGF-7、0.25 μM SANT-1、1 μM 视黄酸、100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200 nM TPPB、2% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、2.5 g/L 碳酸氢钠；
所述第五阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.25 μM SANT-1、0.1 μM 视黄酸、100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1 μM 三碘甲状腺原氨酸、10 μM ALK5i II、10 μM 硫酸锌、10 μg/mL 肝素、1.5 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20mM 葡萄糖、2% 胎牛血清白蛋白；
所述第六阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1 μM 三碘甲状腺原氨酸、10 μM ALK5i II、10 μM 硫酸锌、100 nM GSi XX、10 μg/mL 肝素、1.5 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20 mM 葡萄糖、2% 胎牛血清白蛋白；
所述第七阶段诱导分化剂中各成分的浓度分别为：0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1 μM 三碘甲状腺原氨酸、10 μM ALK5i II、10 μM 硫酸锌、10 μg/mL 肝素、1 mM乙酰-l-半胱氨酸、10 μM 水溶性维生素E、2 μM R428、1.5 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20 mM 葡萄糖、2% 胎牛血清白蛋白；
所述第八阶段诱导分化培养剂中各成分的浓度分别为：0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、10 μM 水溶性维生素E、10 mM 烟酰胺、10 μg/mL 肝素、1 U/mL 脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100 μM Necrostatin-1、0.1 μM Pefabloc、2 mM 谷氨酰胺、2.5 mM 二水氯化钙、10mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2% 胎牛血清白蛋白、10 μM 蒿甲醚、10 μM NS11394。
3.一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基、第二阶段诱导分化培养基、第三阶段诱导分化培养基、第四阶段诱导分化培养基、第五阶段诱导分化培养基、第六阶段诱导分化培养基、第七阶段诱导分化培养基、第八阶段诱导分化培养基；
所述第一阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第一阶段诱导分化剂；
所述第二阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第二阶段诱导分化剂；
所述第三阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第三阶段诱导分化剂；
所述第四阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第四阶段诱导分化剂；
所述第五阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第五阶段诱导分化剂；
所述第六阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第六阶段诱导分化剂；
所述第七阶段诱导分化培养基包括基础培养基MCDB131、权利要求1或2中所述的第七阶段诱导分化剂；
所述第八阶段诱导分化培养基包括50% Ham’s F-12 medium、50% medium 199、权利要求1或2中所述的第八阶段诱导分化剂。
4.一种诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1) 提供诱导多能干细胞并在完全培养基中进行培养；
(2) 第一阶段诱导分化，采用第一阶段诱导分化培养基诱导步骤(1)得到的诱导多能干细胞向定型内胚层细胞分化；
(3) 第二阶段诱导分化，采用第二阶段诱导分化培养基诱导定型内胚层细胞向原始肠管细胞分化；
(4) 第三阶段诱导分化，采用第三阶段诱导分化培养基诱导原始肠管细胞向后前肠细胞分化；
(5) 第四阶段诱导分化，采用第四阶段诱导分化培养基诱导后前肠细胞向胰腺祖细胞分化；
(6) 第五阶段诱导分化，采用第五阶段诱导分化培养基诱导胰腺祖细胞向内分泌祖细胞分化；
(7) 第六阶段诱导分化，采用第六阶段诱导分化培养基诱导内分泌祖细胞向未成熟胰岛β细胞分化；
(8) 第七阶段诱导分化，采用第七阶段诱导分化培养基诱导未成熟胰岛β细胞向成熟胰岛β细胞分化；
(9) 第八阶段诱导分化，采用第八阶段诱导分化培养基进一步诱导胰岛β细胞的成熟，得到功能性胰岛β细胞；
步骤(1)中所述的完全培养基为E8完全培养基；
所述E8完全培养基中含有ROCK抑制剂；
所述ROCK抑制剂为Y-27632；
所述Y-27632的浓度为0.001-100 μM；
步骤(1)中所述的诱导多能干细胞的细胞密度为0.1-10.0×105 cells/cm2；
步骤(1)中所述的诱导多能干细胞来源于人类；
步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、生长分化因子、GSK-3抑制剂；
所述生长分化因子为GDF8；
所述GSK-3抑制剂为CHIR-99021；
步骤(2)中所述的第一阶段诱导分化培养基包括第一阶段诱导分化培养基A、第一阶段诱导分化培养基B；
所述第一阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8、CHIR-99021；
所述第一阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、GDF8；
所述第一阶段诱导分化的时间为3天；
在诱导第1天，采用第一阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
在诱导第2-3天，采用第一阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500) ng/mL GDF8、(0.5-20) μM CHIR-99021、(0.01-5)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
步骤(3)中所述的第二阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子；
所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM 抗坏血酸、(10-100) ng/mL FGF-7、(0.01-5)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第二阶段诱导分化的时间为2天；
在诱导第4-5天，采用所述第二阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
步骤(4)中所述的第三阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、SANT-1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物；
所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
所述BMP抑制剂为LDN193189；
所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM 抗坏血酸、(10-100) ng/mL FGF-7、(0.01-5) μM SANT-1、(0.01-10) μM 视黄酸、(10-500) nMLDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500) nM TPPB、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第三阶段诱导分化的时间为2天；
在诱导第6-7天，采用所述第三阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
步骤(5)中所述的第四阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、抗坏血酸、成纤维细胞生长因子、SANT-1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、蛋白激酶C活化物；
所述成纤维细胞生长因子为FGF-7；
所述BMP抑制剂为LDN193189；
所述蛋白激酶C活化物为TPPB；
所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) mM 抗坏血酸、(0.01-10) ng/mL FGF-7、(0.01-5) μM SANT-1、(0.01-10) μM 视黄酸、(10-500) nMLDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(50-500) nM TPPB、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠；
所述第四阶段诱导分化的时间为3天；
在诱导第8-10天，采用所述第四阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
步骤(6)中所述的第五阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、SANT-1、视黄酸、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂、硫酸锌、肝素；
所述BMP抑制剂为LDN193189；
所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5) μM SANT-1、(0.01-10) μM 视黄酸、(10-500) nM LDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10) μM 三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50) μM ALK5i II、(1-50) μM 硫酸锌、(1-50) μg/mL 肝素、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白；
所述第五阶段诱导分化的时间为3天；
在诱导第11天，将细胞铺种到低亲附性培养板中，在诱导第11-13天，采用所述第五阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
步骤(7)中所述的第六阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、BMP抑制剂、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂、硫酸锌、γ-分泌酶抑制剂、肝素；
所述BMP抑制剂为LDN193189；
所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
所述γ-分泌酶抑制剂为GSi XX；
所述第六阶段诱导分化培养基包括第六阶段诱导分化培养基A、第六阶段诱导分化培养基B；
所述第六阶段诱导分化培养基A包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、GSi XX、肝素；
所述第六阶段诱导分化培养基B包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、LDN193189、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5i II、硫酸锌、肝素；
所述第六阶段诱导分化的时间为14天；
在诱导第14-20天，采用第六阶段诱导分化培养基A进行诱导分化；
在诱导第21-27天，采用第六阶段诱导分化培养基B进行诱导分化；
所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(10-500) nM LDN193189、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10) μM 三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50) μM ALK5i II、(1-50) μM 硫酸锌、(10-500) nM GSi XX、(1-50) μg/mL 肝素、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白；
步骤(8)中所述的第七阶段诱导分化培养基包含基础培养基MCDB131、碳酸氢钠、谷氨酰胺、葡萄糖、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、三碘甲状腺原氨酸、ALK5抑制剂、硫酸锌、肝素、乙酰-l-半胱氨酸、水溶性维生素E、Axl抑制剂；
所述ALK5抑制剂为ALK5i II；
所述Axl抑制剂为R428；
所述第七阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(0.01-10) μM 三碘甲状腺原氨酸、(0.01-50) μM ALK5i II、(1-50) μM硫酸锌、(1-50) μg/mL 肝素、(0.01-10) mM 乙酰-l-半胱氨酸、(1-50) μM 水溶性维生素E、(1-10) μM R428、(0.05-10) g/L 碳酸氢钠、(0.05-10) mM 谷氨酰胺、(1-50) mM 葡萄糖、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白；
所述第七阶段诱导分化的时间为13天；
在诱导第28-34天，采用所述第七阶段诱导分化培养基进行诱导分化；
步骤(9)中所述的第八阶段诱导分化培养基包含胰岛α细胞转β细胞培养基、蒿甲醚、GABAA激活剂；
所述胰岛α细胞转β细胞培养基包含Ham’s F-12 medium、medium 199、谷氨酰胺、二水氯化钙、N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、胎牛血清白蛋白、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、水溶性维生素E、烟酰胺、肝素、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、坏死性凋亡抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂；
所述坏死性凋亡抑制剂为Necrostatin-1；
所述丝氨酸蛋白酶抑制剂为Pefabloc；
所述GABAA激活剂为NS11394；
所述第八阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：50% Ham’s F-12 medium、50%medium 199、(0.01-5)% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、(1-50) μM 水溶性维生素E、(1-50) mM 烟酰胺、(1-50) μg/mL 肝素、(0.01-10) U/mL 脱氧核糖核酸酶Ⅰ、(10-500) μMNecrostatin-1、(0.01-5) μM Pefabloc、(0.01-10) mM 谷氨酰胺、(0.01-10) mM 二水氯化钙、(0.1-50)mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、(0.05-10)% 胎牛血清白蛋白、(1-50) μM 蒿甲醚、(1-50) μM NS11394；
所述第八阶段诱导分化的时间为6天；
在诱导第35-40天，采用所述第八阶段诱导分化培养基进行诱导分化。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Y-27632的浓度为10 μM。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的诱导多能干细胞的细胞密度为1.8-2.2×105 cells/cm2。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100 ng/mL GDF8、3 μM CHIR-99021、0.5% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2mM 谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠；
所述第二阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25 mM 抗坏血酸、50 ng/mLFGF-7、0.5% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠；
所述第三阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25 mM 抗坏血酸、50 ng/mLFGF-7、0.25 μM SANT-1、1 μM 视黄酸、100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200 nM TPPB、2% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、2.5 g/L碳酸氢钠；
所述第四阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25 mM 抗坏血酸、2 ng/mLFGF-7、0.25 μM SANT-1、1 μM 视黄酸、100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、200 nM TPPB、2% 胎牛血清白蛋白、10 mM 葡萄糖、2 mM 谷氨酰胺、2.5 g/L碳酸氢钠；
所述第五阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.25 μM SANT-1、0.1 μM 视黄酸、100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1 μM 三碘甲状腺原氨酸、10 μM ALK5i II、10 μM 硫酸锌、10 μg/mL 肝素、1.5 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20 mM 葡萄糖、2% 胎牛血清白蛋白；
所述第六阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：100 nM LDN193189、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1 μM 三碘甲状腺原氨酸、10 μM ALK5i II、10 μM 硫酸锌、100 nM GSi XX、10 μg/mL 肝素、1.5 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20 mM 葡萄糖、2%胎牛血清白蛋白；
所述第七阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、1 μM 三碘甲状腺原氨酸、10 μM ALK5i II、10 μM 硫酸锌、10 μg/mL 肝素、1mM 乙酰-l-半胱氨酸、10 μM 水溶性维生素E、2 μM R428、1.5 g/L 碳酸氢钠、2 mM 谷氨酰胺、20 mM 葡萄糖、2% 胎牛血清白蛋白；
所述第八阶段诱导分化培养基中各成分的浓度分别为：50% Ham’s F-12 medium、50%medium 199、0.5% 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺添加剂、10 μM 水溶性维生素E、10 mM 烟酰胺、10 μg/mL 肝素、1 U/mL 脱氧核糖核酸酶Ⅰ、100 μM Necrostatin-1、0.1 μMPefabloc、2 mM 谷氨酰胺、2.5 mM 二水氯化钙、10 mM N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、2%胎牛血清白蛋白、10 μM 蒿甲醚、10 μM NS11394。
8.蒿甲醚和NS11394联合在促进胰岛α细胞转化为胰岛β细胞中的应用。
9.蒿甲醚和NS11394联合在诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞中的应用。
10.权利要求1或2所述的诱导分化剂在制备诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞的诱导分化培养基中的应用。
11.权利要求1或2所述的诱导分化剂在诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞中的应用。
12.权利要求3所述的诱导分化培养基在诱导多能干细胞分化为功能性胰岛β细胞中的应用。
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