CN114796285A - 嗜黏蛋白阿克曼氏菌在缓解高尿酸血症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了嗜黏蛋白阿克曼氏菌在缓解高尿酸血症中的应用，属于微生物技术领域。本发明提供了活的和巴氏灭菌的嗜蛋白阿克曼氏菌在预防和/或治疗高尿酸血症方面的新用途。活的或巴氏灭菌的嗜蛋白阿克曼氏菌能够降低血清尿酸水平、降低肝脏的黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，降低尿酸合成；并且能减轻肾脏和肠道的病理损伤；降低尿酸的重吸收，促进尿酸排泄；以及促进肠道紧密连接蛋白的表达，维持肠道屏障，提高肠道内短链脂肪酸含量。本发明提供的活的或巴氏杀菌灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌能够替代或部分替代现有的化合物药物，具有广泛的应用前景。

Description

嗜黏蛋白阿克曼氏菌在缓解高尿酸血症中的应用

技术领域

本发明涉及嗜黏蛋白阿克曼氏菌在缓解高尿酸血症中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

高尿酸血症是体内嘌呤代谢紊乱导致尿酸合成过多或者排泄过少所引发的。近些年随着人们生活水平的提高以及富含嘌呤的食物摄入量增多，高尿酸血症发病率不断提高，同时该病发病年龄也有降低的趋势。由于高尿酸血症与痛风高度相关，因此探索控制高尿酸血症的有效方法具有重要的意义。目前治疗高尿酸血症的药物有非布司他(黄嘌呤氧化酶抑制剂)、丙磺舒(促尿酸排泄剂)以及拉布立酶(将尿酸分解)等，这些药物大都有副作用，主要集中在肝肾功能损伤和心脑血管方面。如何研究副作用小的药物或者辅助降尿酸的保健品等是科研的热点，已有很多研究表明活性物质比如黄酮、多糖、萜类等存在降尿酸的功效。随着人们对肠道菌群的关注，学者们发现肠道微生物对人体健康至关重要，通过粪便移植高尿酸血症小鼠肠道菌群给无肠道菌群的小鼠，发现被移植的小鼠最终会表现出高尿酸血症的症状。表明肠道菌群与高尿酸血症息息相关，同时学者们发现某些肠道菌群也能有效缓解小鼠高尿酸血症如乳酸菌JL-3、酪酸梭菌等。嗜黏蛋白阿克曼氏菌于2004年首度被分离，是一种厌氧菌，以黏蛋白作为氮源。据该菌分离至今，发现其对肥胖、心理疾病、肠道癌症、炎症以及糖尿病、高血脂等代谢性疾病有缓解功效，但尚未有人探究其对高尿酸血症的作用。而且嗜黏蛋白阿克曼氏菌的膜蛋白Amuc_1100有多重功效，能修复肠道屏障、调节机体免疫反应，减轻高脂饮食引发的肥胖、糖尿病、高血脂等问题。同时巴氏杀菌的和活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌都能改善高脂饮食诱导的肥胖，改变小鼠肠道菌群。肠道菌群产生的代谢物质如短链脂肪酸等，能通过体循环进入人体，调节体内代谢，从头参与尿酸代谢。肝脏是尿酸合成的场所，黄嘌呤氧化酶能催化尿酸前体物质合成尿酸；肾脏和肠道是人体尿酸排泄的主要器官，其中已有研究表明肠道和肾脏中都存在GLUT9和ABCG2的表达，与尿酸重吸收和转运息息相关。

随着人们对肠道菌群的关注，越来越多肠道菌被定义为肠道益生菌，发现它们普遍具有抗肥胖、糖尿病、高血脂等特性，加之其对人体无毒副作用。嗜黏蛋白阿克曼氏菌是近年来新兴的肠道益生菌，在治疗肠炎、糖尿病、心脑血管疾病等方面发挥出色，但是尚未有人研究其对高尿酸的影响，有望成为新的缓解和治疗高尿酸血症的手段。

发明内容

本发明提供了嗜蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA-835和/或其组合物在预防和/或治疗高尿酸血症和/或痛风中的应用。

在一种实施方式中，所述应用是将嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835和/或其组合物用于制备预防和/或治疗高尿酸血症的药物。

在一种实施方式中，所述嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835获取自美国模式培养物集存库(ATCC)。

在一种实施方式中，所述嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835是具有生物活性的活细胞，或经灭活处理的死细胞，或二者的组合物。

在一种实施方式中，所述灭活处理的方式包括但不限于巴氏杀菌。

在一种实施方式中，所述巴氏杀菌是在62℃～65℃处理25～35min，或在75℃～90℃处理15s-16s。

在一种实施方式中，所述组合物中经巴氏杀菌的或活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的数量≥1×10⁹CFU/mL或1×10⁹CFU/g。

在一种实施方式中，所述组合物还含有黏蛋白。

在一种实施方式中，所述组合物的制备方法为：将嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835在含黏蛋白和L-半胱氨酸的BHI培养基中，于37℃、厌氧环境下(N₂/CO₂ 80:20v/v)培养至少48h。

在一种实施方式中，所述组合物包括含嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835的药物。

在一种实施方式中，所述组合物中含有所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的活菌株、干菌株、菌株代谢物或灭活的菌株。

在一种实施方式中，所述应用包括但不限于如下至少一种作用：

(1)降低高尿酸血症哺乳动物血清尿酸水平；

(2)降低高尿酸血症哺乳动物肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性和表达；

(3)降低高尿酸血症哺乳动物的肾脏和肠道病理损伤；

(4)降低高尿酸血症哺乳动物中肾脏和结肠尿酸重吸收蛋白GLUT9的表达；

(5)提高高尿酸血症哺乳动物肾脏和结肠尿酸转运蛋白ABCG2的表达；

(6)提高高尿酸血症哺乳动物结肠中肠道紧密连接蛋白的表达；

(7)促进高尿酸血症哺乳动物肠道短链脂肪酸的产生。

在一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人类。

在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的载体。

在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述填充剂为微晶纤维素、乳糖、甘露醇、淀粉或糊精中的一种或多种；所述润湿剂为乙醇或甘油中的一种或多种；所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、交联羧甲基淀粉钠、交联聚维酮或低取代羟丙基纤维素中的一种或多种；所述粘合剂为淀粉糊、糖浆、饴糖、炼蜜或液状葡萄糖中的一种或多种；所述润滑剂为硬脂酸镁、硬脂酸富马酸钠、滑石粉或二氧化硅中的一种或多种。

本发明还要求保护所述嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835和/或其组合物在替代或部分替代治疗痛风的化合物药物方面的应用。

在一种实施方式中，所述化合物药物包括但不限于别嘌醇。

本发明的有益效果：本发明提供的活的或巴氏杀菌灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌能够将高尿酸血症小鼠的血清尿酸水平分别降低13.87％和17.17％，使高尿酸血症小鼠肝脏中黄嘌呤氧化酶(XOD)活性分别下降11.34％和11.60％，减少痛风的发生；并能缓解高尿酸血症小鼠肾脏和肠道病理损伤，保护器官功能，减少患者病痛；并能够降低尿酸重吸收蛋白GLUT9和促进尿酸转运蛋白ABCG2在肾脏和结肠中的表达，促进尿酸排泄，降低血清尿酸水平；并能够促进肠道紧密连接蛋白表达，维持肠道屏障和保护肠道环境；以及提高小鼠粪便短链脂肪酸水平，促进小鼠健康。本发明提供的活的或巴氏杀菌灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌能够替代或部分替代现有的化合物药物，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响；

图2是嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活力(a)和表达(b)的影响；

图3是嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠肾脏(a)和结肠(b，c)组织病理损伤的影响；

图4是嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠肾脏和结肠中GLUT9和ABCG2的表达情况；

图5是嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠紧密连接蛋白表达的影响，其中，a，Cluadin；b，Occludin；c，ZO1；

图6是嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠粪便短链脂肪酸的影响；其中显著性水平为，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835获取自ATCC，在不做特别说明的情况下，下述实施例中使用的嗜黏蛋白阿克曼氏菌均为嗜黏蛋白阿克曼氏菌模式菌株ATCC BAA-835。

实施例涉及的试剂盒和抗体等购自索莱宝科技有限公司、碧云天生物技术有限公司、南京建成生物科技有限公司、Proteintech、Cell Signaling Technology

实施例1：嗜黏蛋白阿克曼氏菌的培养

(1)纯化黏蛋白

黏蛋白购自Sigma试剂公司，货号为M2378(100g)，用醇沉的方法纯化黏蛋白，12.5g黏蛋白粉末可得到100mL黏蛋白的纯化液。

(2)菌种复苏

将购买来嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835加入到含有10％黏蛋白和0.03％的L-半胱氨酸的BHI培养基中，于37℃、厌氧环境下(N₂/CO₂ 80:20v/v)活化48h。

(3)菌种培养

将步骤(2)得到的菌液进行离心(8000g/min，10min)，重复两次，将菌种用无菌PBS重新悬浮，等量加入BHI培养基中，于37℃、厌氧环境下(N₂/CO₂ 80:20v/v)培养48h，获得菌体数量≥10⁸CFU/mL的嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养液。将得到的培养液于8000g/min离心10min，然后用无菌PBS重新悬浮，重复离心和洗涤三次，用无菌PBS调节浓度为10⁹CFU/mL，获得活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌菌悬液，现配现用。

实施例2：巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌样品制备

将实施例1制备的嗜黏蛋白阿克曼氏菌培养液于8000g/min离心10min，然后用无菌PBS悬浮，重复离心和洗涤三次，用无菌PBS调节浓度为10⁹CFU/mL，然后放入70℃水浴锅中，水浴30min，获得巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌悬液。

实施例3：活的和巴氏灭菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌在降低小鼠血清尿酸中的应用

取体重25-28g的健康雄性ICR小鼠32只，适应性培养1周后，随机分为4组，分别为空白组(CON)、高尿酸血症模型组(Model)、活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预组(L-AKK)和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预组(P-AKK)。除空白组(正常饮食)外，其余组(20％酵母膏饲料)每天早上灌胃100mg/kg_体重的次黄嘌呤和280mg/kg_体重的氧嗪酸钾；在早上灌胃结束6h后，空白组和模型组灌胃无菌PBS，L-AKK和P-AKK分别灌胃活的和巴氏杀菌的嗜蛋白阿克曼氏菌。实验分组及处理方法见表1；其中，羧甲基纤维素钠、氧嗪酸钾、次黄嘌呤等药品溶于0.05％羧甲基纤维素钠；具有细胞活性或经巴氏杀菌灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌悬浮在无菌PBS中。

表1动物实验分组情况

实验结束前一天收集小鼠粪便贮存于-80℃，实验结束时，小鼠禁食不禁水8h，摘眼球取血并辅以脱颈，血液样品常温静置1h后以常温、3000g/min离心10min，取上清保存于-20℃，取部分肝脏、肾脏以及肠道用无菌PBS清洗，放入液氮中后转移置-80℃冰箱保存，部分肾脏和肠道用4％多聚甲醛固定。血清尿酸检测方法严格按照试剂盒操作，试剂盒购自索莱宝，货号为BC1360。

活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠血清尿酸的影响如图1，模型组小鼠尿酸值高达312.2μmol/L，活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌组分别为268.9μmol/L和258.6μmol/L，与模型组相比分别降低了13.87％和17.17％，由此可见，嗜黏蛋白阿克曼氏菌活细胞和灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌均能预防和/或缓解高尿酸血症。

实施例4：活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌在降低高尿酸血症小鼠肝脏中XOD活性中的应用

动物实验和分组同实施例3，使用保存于-80℃的肝脏组织，严格按照XOD检测试剂盒进行操作；称取质量大约为20mg样品按照裂解液说明书操作，提取组织蛋白。使用BCA试剂盒调节蛋白浓度为2mg/mL。配制完成后，金属浴10min(100℃)，将金属浴后样本分装保存在-80℃，然后根据凝胶制备试剂盒配制凝胶，进行电泳，取出完成电泳的凝胶，以纱网、厚滤纸、凝胶、NC膜、厚滤纸、纱网的“三明治”结构组装好转膜样本，进行转膜，将蛋白从凝胶转印到硝酸纤维膜(NC膜)上，转膜时间约为1h-1.5h，将转印好的NC膜放置在封闭液中，摇床上封闭2h，然后进行一抗孵育，于4℃过夜，进行二抗孵育(辣根过氧化物酶)常温放置摇床上孵育2h，再次使用TBST清洗；使用极超敏ECL发光试剂盒，按照说明书配制发光液，在凝胶成像系统中曝光观察。

结果如图2所示，与高尿酸血症小鼠相比，活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预后的小鼠XOD活性分别下降了11.34％和11.60％；XOD蛋白表达量分别下降了35.71％和42.80％，表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌活细胞和灭活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌能通过抑制XOD活性和表达来减少体内尿酸合成，从而缓解高尿酸血症。

实施例5：活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌用于减轻高尿酸血症小鼠肾脏和肠道病理损伤

动物实验方案和分组同实施例3，首先进行组织固定：用4％的多聚甲醛固定肾脏和肠道，固定时长约为24-48h；然后进行切片制作：用石蜡包埋固定完成的组织，石蜡包埋好的组织切成厚度接近5μm的切片；对切片使用苏木精伊红染色法(HE染色)进行染色：

按照索莱宝苏木精伊红染色试剂盒进行操作，首先将切片脱蜡水化：二甲苯1中脱蜡5min，再次使用二甲苯2再次脱蜡5min，然后使用梯度乙醇(95％、80％、70％)依次浸泡2min，最后使用蒸馏水浸泡2min，水化完成后用苏木素染液染色15min，用流水缓慢冲洗干净切片，然后使用温水浸泡15min；最后将切片脱水、透明、封片：依次使用95％、95％、100％、100％、二甲苯石碳酸(二甲苯：石碳酸＝3:1)、二甲苯1和二甲苯2浸泡1min；最后用中性树胶封固，切片制作完成。

活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠肾脏病理损伤的影响如图3所示，模型组肾脏损伤明显，出现了肾小球萎缩和空泡化、肾间质和肾小球炎性细胞浸润、肾小管扩张和管腔增大等病变，经过嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预后两组均有所好转；肠道病理切片显示模型组肠绒毛长度降低，嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预后这些病变均有所恢复，表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌干预能减轻高尿酸造成的肾脏和肠道损伤。

实施例6：活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠尿酸重吸收蛋白GLUT9和尿酸转运蛋白ABCG2表达的作用

动物实验方案和分组同实施例3，样品处理同实施例4中XOD表达；

以对照组的表达量为1计算其它组的表达量相对于对照组的百分比，结果如图4所示。相较于模型组，活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理后的GLUT9表达显著降低，在肾脏中的相对表达量由模型组的189.6％分别降低至84.71％和124.7％；在肠道中的相对表达量由模型组的122.9％分别降低至85.37％和98.38％；活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理后的ABCG2表达显著提高，在肾脏中的相对表达量由模型组的55.35％分别提高至145.6％和141.8％；在肠道中的相对表达量由模型组的51.24％分别提高至143.4％和102.2％。GLUT9和ABCG2与尿酸排泄相关，活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌能促进高尿酸血症小鼠尿酸排泄，减轻体内尿酸负担。

实施例7：活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠肠道紧密连接蛋白表达的作用

动物实验方案和分组同实施例3，样本制作以及实验方法同实施例4中XOD表达；

活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠肠道紧密连接蛋白表达影响如图5，相较于模型组，活的和巴氏杀菌嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理后小鼠肠道紧密连接蛋白Cluadin由模型组的59.76％分别提高至93.15％和101.8％、Occludin由模型组的58.03％分别提高至162.0％和112.3％)以及ZO1由模型组的60.27％分别提高至153.7％和100.1％。肠道紧密连接蛋白与肠屏障以及肠道健康息息相关，嗜黏蛋白阿克曼氏处理后可有效保护肠道屏障，促进肠道健康。

实施例8：巴氏杀菌的和活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠粪便中短链脂肪酸含量的作用

动物实验方案和分组同实施例3，样品制备：取粪便样品将近100mg，置于试管内，加入一定量的破碎珠；加入995μL无水乙醚，加入20μL稀硫酸酸化；加入1μL的内标(2-乙基丁酸)，涡旋震荡3min(重复两次)，冰水浴超声30min，离心(10000rpm、15min、4℃)；取上清液，加入250mg无水硫酸钠除去内部水分；使用注射器经0.22μm有机滤膜将样品过滤加入液相小瓶中，将样品上机检测。

巴氏杀菌的和活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌对高尿酸血症小鼠粪便中短链脂肪酸的影响如图6，高尿酸导致粪便中短链脂肪酸含量出现下降，活的和巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌处理后粪便中短链脂肪酸含量有所提高，其中乙酸由模型组的1.679分别提高至L-AKK组的2.555和P-AKK组的2.219，丙酸由模型组的0.5534分别提高至L-AKK组的0.9211和P-AKK组的0.6671，丁酸由模型组的0.3691分别提高至L-AKK的0.7540和P-AKK组的0.4478，戊酸由模型组的0.03578分别提高至L-AKK组的0.04774和P-AKK组的0.02822。尤其是活的嗜黏蛋白阿克曼氏菌组提高显著，乙酸、丙酸以及戊酸甚至高于正常组。以上结果表明，嗜黏蛋白阿克曼氏菌恢复了高尿酸血症导致的粪便中短链脂肪酸含量的下降。

对比例1：

具体实施方式同实施例3，区别在于，采用15mg/kg_体重剂量的药物别嘌醇处理小鼠，结果显示，可使高尿酸血症小鼠血清尿酸值降低为209.4μmol/L，相较于模型组的312.2μmol/L降低了32.95％，而L-AKK和P-AKK分别降低了13.87％和17.17％，表明L-AKK和P-AKK分别相当于0.42和0.52倍的别嘌醇作用效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.嗜蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)ATCC BAA-835和/或其组合物在制备预防和/或治疗高尿酸血症和/或痛风的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835是具有生物活性的活细胞，或经灭活处理的死细胞，或二者的组合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述灭活处理的方式为巴氏杀菌。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物中活的或经巴氏杀菌的嗜黏蛋白阿克曼氏菌的数量≥1×10⁹CFU/mL或1×10⁹CFU/g。

5.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述组合物还含有黏蛋白。

6.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述组合物的制备方法为：将嗜黏蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835在含黏蛋白和L-半胱氨酸的BHI培养基中，于厌氧环境下培养至少48h。

7.根据权利要求1或4所述的应用，其特征在于，所述组合物是指含嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835的药物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物还含有药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1～8任一所述的应用，其特征在于，所述应用包括但不限于如下至少一种作用：

(1)降低高尿酸血症哺乳动物血清尿酸水平；

(2)降低高尿酸血症哺乳动物肝脏黄嘌呤氧化酶活性和表达；

(3)降低高尿酸血症哺乳动物的肾脏和肠道病理损伤；

(4)降低高尿酸血症哺乳动物中肾脏和结肠尿酸重吸收蛋白GLUT9的表达；

(5)提高高尿酸血症哺乳动物肾脏和结肠尿酸转运蛋白ABCG2的表达；

(6)提高高尿酸血症哺乳动物结肠中肠道紧密连接蛋白的表达；

(7)促进高尿酸血症哺乳动物肠道短链脂肪酸的产生。

10.嗜蛋白阿克曼氏菌ATCC BAA-835和/或其组合物在替代或部分替代治疗痛风的化合物药物方面的应用。

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