CN114778737A - 可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，包括以下步骤：1)预先获取待测样品中含水量的体积百分比Ws％；2)取体积为xμL的待测样品，加入体积为yμL的有机相沉淀剂，混合均匀；3)预先称量空容器的重量，然后取上清液zμL于该容器中，在对该容器和上清液构成的整个体系进行重量监测的情况下进行氮吹，当整个体系的重量‑空容器的重量＝d时，停止氮吹；
4)加入体积为tμL的有机相进行复溶，得到测试样，
液相梯度流动相的初始比例为水相：有机相＝a：b。本发明提供的样品前处理方法，在不加热的情况下能将氮吹时间减少80％以上，既保证进样测试样本的峰型和灵敏度，又可以有效减少前处理的时间。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，特别涉及一种可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法。
背景技术
近年来，质谱技术由于其高灵敏度、高准确、不受抗体或特殊生化反应限制等优势被广泛应用于食品安全、中药研究、农药残留、代谢组学分析以及临床检测领域，由于质谱是通过直接检测物质质量的特性来分析目标物的含量，使样本的高效净化、富集成为影响/制约临床质谱检测的关键因素，样本前处理体系也成为质谱试剂的核心组成，直接影响质谱检测性能及检测应用范围。常用实验室前处理方式如蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等，蛋白沉淀法相对来说处理简单，在血药浓度监测领域应用最为广泛，但是蛋白沉淀法存在以下几点缺陷：(1)蛋白沉淀后的上清液需要加水稀释为初始流动相比例之后，进样测试后才能得到比较满意的峰型，原因在于目前使用的沉淀剂多为有机溶剂，如甲醇、乙腈、乙醇等，上清液中有机相比例高达60％以上，而在反向色谱中液相梯度的初始比例有机相比例多为30％以下，如果直接取上清进样测试，会造成严重的容积效应，导致色谱峰型拖尾或者分叉等；这时需要加入一定比例的水使得上清液比例接近于初始流动相比例，峰型会变好，但是随之而来的一个问题是样本被稀释了，对于一些人体内含量较低的分析物，所建立的参考区间或许无法满足临床要求；(2)针对蛋白沉淀法(1)的缺陷，研究者们会在取完上清液后加一步氮吹吹干后再使用初始流动相比例的复溶液进行复溶的步骤，这种方法在得到良好峰型的同时还可以对分析物进行浓缩富集，但是沉淀剂多与水互溶，在上清液中含有大约20％-40％的水，在氮吹过程中，有机溶剂先被挥干，但是要吹干剩余的水需要花费大量时间，通常占用了样本预处理的大部分时间。加热可以加快水挥干的速度，但是对于一些热稳定性较差的物质，加热容易破坏分析物的结构导致无法分析。所以如果可以减少蛋白沉淀后氮吹的时间，无论对于研发实验室还是临床检验科室都会极大的提高工作效率。但现在缺少可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，该方法用于将待测样品进行前处理制备成测试样，以供液相色谱检测；该方法包括以下步骤：
1)预先获取待测样品中含水量的体积百分比，记为Ws％；
2)取体积为xμL的待测样品，加入体积为yμL的有机相沉淀剂，混合均匀；
3)预先称量空容器的重量，然后取步骤2)得到的混合液中的上清液zμL于该容器中，在对该容器和上清液构成的整个体系进行重量监测的情况下进行氮吹，当整个体系的重量-空容器的重量＝d时，停止氮吹；
其中，d的单位为g；
4)向步骤3)得到的上清液中加入体积为tμL的有机相进行复溶，得到测试样；
记液相色谱检测中，液相梯度流动相的初始比例为水相：有机相＝a：b；则t按照下式计算得到：
优选的是，所述步骤3)为：预先称量空孔板的重量，取步骤2)得到的混合液中的上清液zμL，向孔板的N个样品孔中分别滴加zμL步骤2)得到的混合液中的上清液，将孔板置于天平上在进行重量监测的情况下实施氮吹，当孔板与上清液整体的重量-空孔板的重量＝d时，停止氮吹；
其中，d的单位为g，N即为检测所需的测试样的数量。
优选的是，其中，公式(1)通过如下方法得到：
计算待测样品中含水的体积为：Ws％xμL；
计算步骤2)得到的混合液中的上清液中水与有机相沉淀剂的体积比，水：有机相沉淀剂＝Ws％x：y；
计算zμL该上清液中含水的体积为：
则zμL该上清液中含水的质量为：
当容器和上清液构成的整个体系的重量-空容器的重量＝d时，说明该上清液体系中的所有有机相已经被吹干，剩余全部为水，无需继续氮吹。
优选的是，所述待测样品为血液样品，其中，含水量的体积百分比记为90％；则针对该血液样品
本发明的有益效果是：本发明提供了一种可有效缩短时间的用于液相色谱检测的样品前处理方法，在不加热的情况下能将氮吹时间减少80％以上，既保证进样测试样本的峰型和灵敏度，又可以有效减少前处理的时间，该方法适用于前处理只有一步蛋白沉淀的样本，例如血药浓度检测、胆汁酸检测、同型半胱氨酸检测等，本发明提供的方法可以在不牺牲灵敏度的基础上有效减少前处理时间，在一些实施例中，本发明提供的方法得到的分析物响应较无氮吹步骤的方法高出2-3倍；与有氮吹步骤的方法响应相当，但是前处理耗费的时间减少了3-4倍；对于一些临床治疗窗较窄的药物，本发明所具备的可更快得到检测结果的优势对于患者的治疗意义重大。
附图说明
图1为本发明的实施例1中方法a的结果；
图2为本发明的实施例1中方法b的结果；
图3为本发明的实施例1中方法c的结果；
图4为本发明的实施例2中方法a的结果；
图5为本发明的实施例2中方法b的结果；
图6为本发明的实施例2中方法c的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供了一种可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，该方法用于将待测样品进行前处理制备成测试样，以供液相色谱检测；其原理说明如下：
增加氮吹时间的原因是上清液中少量水分难以挥干，而传统前处理在氮吹后需要加入初始流动相比例的复溶液，复溶液中水含量仍然较高，换句话说，我们花费了大量的时间将水挥干，而后又加入了含水量较高的复溶液去复溶，中间做了许多无用功，浪费了很多时间，本发明提出了一种方法，通过理论计算得到上清液中水分含量，从而无须将上清液中水分挥干，在挥干有机溶剂后直接取出上清液加入一定量的有机流动相，使测试样本的有机溶剂与水的比例与液相初始梯度相匹配。
具体的，该方法包括以下步骤：
1)预先获取待测样品中含水量的体积百分比，记为Ws％；
2)取体积为xμL的待测样品，加入体积为yμL的有机相沉淀剂，混合均匀；
3)预先称量空孔板的重量，然后取步骤2)得到的混合液中的上清液zμL于该孔板中，在对该孔板和上清液构成的整个体系进行重量监测的情况下进行氮吹，当整个体系的重量-空容器的重量＝d时，停止氮吹；
其中，d的单位为g；
4)向步骤3)得到的上清液中加入体积为tμL的有机相进行复溶，得到测试样；
记液相色谱检测中，液相梯度流动相的初始比例为水相：有机相＝a：b；则t按照下式计算得到：
本发明至少可应用于单独的液相色谱检测或者是液相色谱串联质谱检测。
本发明的主要原理为：
在一种实施例中，针对于通常情况下，在一个孔板上处理获取多个测试样的情况，起所述步骤3)为：预先称量空孔板的重量，取步骤2)得到的混合液中的上清液zμL，向孔板的N个样品孔中分别滴加zμL步骤2)得到的混合液中的上清液，将孔板置于天平上在进行重量监测的情况下实施氮吹，当孔板与上清液整体的重量-空孔板的重量＝d时，停止氮吹；
其中，d的单位为g，N即为检测所需的测试样的数量。
其中，公式(1)的推导过程为：
(1)计算待测样品中含水的体积为：Ws％xμL；
(2)计算步骤2)得到的混合液中的上清液中水与有机相沉淀剂的体积比，水：有机相沉淀剂＝Ws％x：y；
(3)计算zμL该上清液中含水的体积为：
则zμL该上清液中含水的质量为：
当容器和上清液构成的整个体系的重量-空容器的重量＝d时，说明该上清液体系中的所有有机相已经被吹干，剩余全部为水，无需继续氮吹。
在一种优选的实施例中，所述待测样品为血液样品，其中，含水量的体积百分比记为90％；则针对该血液样品
在一种优选的实施例中，采用的容器为96孔板。
以上为本发明的总体构思，以下再提供更为具体的实施例，并将本发明的方法与传统样品前处理方法进行对比，以对本发明做进一步说明。
实施例1液相色谱检测胆汁酸的前处理方法及结果对比
1、处理方法：
液相梯度初始水相：有机相＝7:3；
取100μL血液样本10个进行前处理，加入200μL沉淀剂(甲醇乙腈1:1)；充分混匀离心，随后按照以下3种方法进行前处理：
方法a、取上清液40μL，加入60μL水稀释，使得进样前样本的水相占70％，进样测试。
方法b、取上清液200μL转移至96孔收集板中，进行氮吹吹干；吹干后使用100μL的30％有机相的水溶液复溶，进样测试.
方法c、使用本发明的方法，即采用公式(3)
计算总水量d；其中，x＝100、y＝200、z＝200、c＝10、a＝7、b＝3；计算得到d＝0.62g。然后根据公式(2)
计算得到复溶时加入有机相的体积t＝26.6μL；从而得到测试样。
即在取上清液之前使用天平称量空白96孔板的重量，向96孔板的10个样品孔中分别加入200μL上清液，取完上清进行氮吹开始后10分钟左右，再次测量96孔板，若此时重量较空板时重量增加了0.62g，说明此时存留在96孔板中的全部为水，无须继续吹干，取下96孔板；然后向每个样品孔中分别加入26.6μL的有机相(乙腈溶液)，此时一个样品孔中获得一个测试样，每个测试样体积约为88μL，共10个测试样，进行测试。
使用相同的液相梯度及质谱参数测试上述3种方法处理的样本，进样量为10μL。
2、实验结果：
由于进样测试的样本比例均与液相初始梯度的比例相同，故3种方法的峰型无较大差异，主要比较前处理时间及分析物的响应：
以胆酸(CA)响应为例进行分析，方法a的结果如图1所示，方法b的结果如图2所示，方法c的结果如图3所示；具体对比数据如下表1所示：
表1
通过实施例2的结果可以看出，对于液相色谱检测同型半胱氨酸的前处理，使用本发明的前处理方法的分析物响应较无氮吹步骤的方法高出2-3倍；且与有氮吹步骤的方法响应相当，本发明的前处理方法耗费的时间减少了3-4倍。
实施例2液相色谱检测同型半胱氨酸的前处理方法及结果对比
1、处理方法：
液相梯度初始水相：有机相＝1:1；
取100μL血液样本20个进行前处理，加入20uL二硫苏糖醇(DTT)充分混匀后静置15min后，加入300μL沉淀剂(0.1％甲酸、0.05％三氯乙酸(0.1g/mL水溶液)的乙腈溶液)；充分混匀离心，随后按照以下3种方法进行前处理：
方法a:取上清液60μL，加入40μL水稀释，使得进样前样本的水相占50％，进样测试。
方法b：取上清液300μL转移至96孔收集板中，进行氮吹吹干；吹干后使用100μL的50％有机相的水溶液复溶，进样测试。
方法c：使用本发明的方法，即采用公式(3)
计算总水量d；其中，x＝100、y＝300、z＝300、c＝20、a＝1、b＝1；计算得到d＝1.38g。然后根据公式(2)
计算得到复溶时加入有机相的体积t＝69.2μL；从而得到测试样。
即在取上清液之前使用天平称量空白96孔板的重量，向96孔板的20个样品孔中分别加入300μL上清液，取完上清进行氮吹开始后10分钟左右，再次测量96孔板，若此时重量较空板时重量增加了1.38g，说明此时存留在96孔板中的全部为水，无须继续吹干，取下96孔板；然后向每个样品孔中分别加入69.2μL的有机相(乙腈溶液)，此时一个样品孔中获得一个测试样，每个测试样体积约为138.4μL，共20个测试样，进行测试。
使用相同的液相梯度及质谱参数测试上述3种方法处理的样本，进样量为10μL。
2、实验结果：
由于进样测试的样本比例均与液相初始梯度的比例相同，故3种方法的峰型无较大差异，主要比较前处理时间及分析物的响应：
对同型半胱氨酸的响应进行分析，方法a的结果如图4所示，方法b的结果如图5所示，方法c的结果如图6所示；具体对比数据如下表2所示：
表2
| 前处理方法 | CA峰面积 | 前处理时间 |
| a | 1.94e5 | 20min |
| b | 4.21e5 | 100min |
| c | 4.49e6 | 30min |
通过实施例2的结果可以看出，对于液相色谱检测同型半胱氨酸的前处理，使用本发明的前处理方法的分析物响应较无氮吹步骤的方法高出2-3倍；且与有氮吹步骤的方法响应相当，本发明的前处理方法耗费的时间减少了3-4倍。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (4)
1.一种可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，其特征在于，该方法用于将待测样品进行前处理制备成测试样，以供液相色谱检测；该方法包括以下步骤：
1)预先获取待测样品中含水量的体积百分比，记为Ws％；
2)取体积为xμL的待测样品，加入体积为yμL的有机相沉淀剂，混合均匀；
3)预先称量空容器的重量，然后取步骤2)得到的混合液中的上清液zμL于该容器中，在对该容器和上清液构成的整个体系进行重量监测的情况下进行氮吹，当整个体系的重量-空容器的重量＝d时，停止氮吹；
其中，d的单位为g；
4)向步骤3)得到的上清液中加入体积为tμL的有机相进行复溶，得到测试样；
记液相色谱检测中，液相梯度流动相的初始比例为水相：有机相＝a：b；则t按照下式计算得到：
2.根据权利要求1所述的可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，其特征在于，所述步骤3)为：预先称量空孔板的重量，取步骤2)得到的混合液中的上清液zμL，向孔板的N个样品孔中分别滴加zμL步骤2)得到的混合液中的上清液，将孔板置于天平上在进行重量监测的情况下实施氮吹，当孔板与上清液整体的重量-空孔板的重量＝d时，停止氮吹；
其中，d的单位为g，N即为检测所需的测试样的数量。
3.根据权利要求1所述的可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，其特征在于，其中，公式(1)通过如下方法得到：
计算待测样品中含水的体积为：Ws％xμL；
计算步骤2)得到的混合液中的上清液中水与有机相沉淀剂的体积比，水：有机相沉淀剂＝Ws％x：y；
计算zμL该上清液中含水的体积为：
则zμL该上清液中含水的质量为：
当容器和上清液构成的整个体系的重量-空容器的重量＝d时，说明该上清液体系中的所有有机相已经被吹干，剩余全部为水，无需继续氮吹。
4.根据权利要求2所述的可缩短时间的液相色谱检测样品前处理方法，其特征在于，所述待测样品为血液样品，其中，含水量的体积百分比记为90％；则针对该血液样品
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