CN114755415B - 组合因子诱导降解型内皮细胞，治疗肝纤维化疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了组合因子诱导降解型内皮细胞，治疗肝纤维化疾病的方法，具体地，本发明公开了一种筛选因子降解细胞外基质能力的方法，所述方法包括1)将待测细胞接种于胶原表面，所述胶原结合荧光分子，2)将步骤1)中的细胞进行培养；3)用待测因子对细胞进行处理；4)将步骤3)中培养液的上清液进行荧光检测，所述检测的激发光为546nm，发射光为575nm，检测所得到的荧光值表征细胞的降解能力。根据该方法，可以筛选出具有高降解能力的细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及化学因子刺激内皮细胞及治疗肝纤维化疾病，具体涉及一种筛选细胞降解能力的方法及治疗肝纤维化疾病的药物。
背景技术
慢性炎症往往会导致纤维化，涉及各个器官或组织，包括皮肤，肾，肝，肺等。在纤维化发展中，不同的细胞类型都能合成1型胶原，包括肌成纤维细胞，巨噬细胞等，细胞的过度分泌导致了I型胶原的沉积。
纤维化是细胞外基质蛋白的过度积累，伴随着炎症，大多数发生在慢性疾病中。过度累积的细胞外基质的降解，主要是金属基质蛋白酶所介导的。随着肝纤维化的程度越来越严重，星形细胞的MMP13基因逐渐低表达，MMP3基因先升高后降低，炎性巨噬细胞，kuffer细胞，激活的星形细胞的MMP9，MMP12基因高表达。成肌纤维细胞也成为了合成细胞外基质的主要细胞。
目前对于纤维化疾病的治疗手段仍需改进。
发明内容
本发明首次提出了筛选细胞降解细胞外基质能力的方法，根据该方法，可以筛选出具有高降解能力的细胞，这些细胞在体外甚至在体内降解细胞外基质，从而逆转肝纤维化疾病，发明人首次将这种内皮细胞疗法(即筛选出的具有降解能力的细胞用于疾病治疗)用于治疗肝纤维化与相关疾病。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种筛选因子降解细胞外基质能力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)将待测细胞接种于胶原表面，所述胶原结合荧光分子，2)将步骤1)中的细胞进行培养；3)用待测因子对细胞进行处理；4)将步骤3)中处理后培养液的上清液进行荧光检测，所述检测的激发光为546nm，发射光为575nm，检测所得到的荧光值表征细胞的降解能力。本发明首次提出了筛选细胞降解细胞外基质能力的方法，根据该方法，可以筛选出具有高降解能力的待测因子(可以是因子组合，也可以是单独的因子)，这些待测因子在体外甚至在体内降解细胞外基质，从而逆转肝纤维化疾病。需要说明的是，这里的接种等操作，如无特殊说明，均可采用常规的技术手段。
根据本发明的实施例，上述方法进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述荧光分子选自5(6)-TAMRA SE、FITC、CY3和CY7等。需要说明是是，荧光分子没有特别要求，可以根据实际需要选择需要的荧光分子。
根据本发明的实施例，所述培养是37℃的条件下暗培养两天进行的。需要说明的是，这里的培养物特别要求，可根据不同细胞的培养条件进行调整。
根据本发明的实施例，所述荧光检测是通过酶标仪检测的。
根据本发明的实施例，所述荧光值大于纯培养基与胶原材料孵育后上清的荧光值，代表细胞有降解细胞外基质能力。
根据本发明的实施例，所述待测细胞选自内皮细胞、免疫细胞和星形细胞的至少一种。需要说明的是，待测细胞无特别限制，发明人可根据需要选择不同的细胞。发明人采用了肝血窦内皮细胞，人脐静脉内皮细胞等细胞进行了相应的测试。
在本发明的另一方面，本发明还提出了药物组合物在制备用于治疗纤维化疾病、炎症、硬化性疾病或癌症药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括PMA因子。发明人发现，PMA因子可以刺激肝血窦内皮细胞和人脐静脉内皮细胞等细胞，使其具有极强的降解细胞外基质的能力，极大减缓、改善了肝、肺、肾等器官炎症、纤维化、硬化和癌变的进程。
根据本发明的实施例，所述用途进一步包括如下技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括选自Accutase、一型免疫因子和二型免疫因子的至少之一。发明人发现，Accutase一型免疫因子和二型免疫因子的至少之一和PMA因子(简称P)的组合(如IL4+P、IL13+P、IL1β+P、IL6+P、IFNγ+P、TNFα+P等组合)可以刺激肝血窦内皮细胞和人脐静脉内皮细胞等细胞，使其具有极强的降解细胞外基质的能力，极大缓解和改善了肝、肺、肾等器官的炎症、纤维化、硬化、癌变的疾病。
根据本发明的实施例，所述Accutase为100X-1000Xaccuatse(A1110501)，所述PMA因子为50ng/ml。发明人发现，在该组合下，降解能力更强。
根据本发明的实施例，所述纤维化疾病选自肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化。
根据本发明的实施例，所述纤维化疾病是四氯化碳诱导的。
根据本发明的实施例，所述硬化性疾病选自肝硬化。
根据本发明的实施例，所述癌症选自肝癌。
根据本发明的实施例，所述炎症选自肝炎。
根据本发明的实施例，所述药物组合物是通过前面所述的方法筛选获得的。Accutase和PMA因子是发明人根据前面所述的方法筛选获得的，这两因子的组合物的荧光值为550。
在本发明的再一方面，本发明还提出了一种治疗纤维化、炎症、硬化性疾病或癌症疾病的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对患有纤维化、炎症、硬化性疾病或癌症的患者施用药物组合物，所述药物组合物包括PMA因子。发明人发现，PMA因子的组合可以刺激肝血窦内皮细胞，使其具有极强的降解细胞外基质的能力，极大减缓、改善了器官炎症、纤维化、硬化和癌变的进程。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括如下技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括选自Accutase、一型免疫因子和二型免疫因子的至少之一。发明人发现，Accutase一型免疫因子和二型免疫因子的至少之一和PMA因子的组合可以刺激肝血窦内皮细胞和人脐静脉内皮细胞等细胞，使其具有极强的降解细胞外基质的能力，极大缓解和改善了肝、肺、肾等器官的炎症、纤维化、硬化、癌变的疾病。
根据本发明的实施例，所述Accutase为100X-1000Xaccuatse(A1110501)，所述PMA因子为50ng/ml。发明人发现，在该组合下，降解能力更强。
根据本发明的实施例，所述纤维化疾病选自肝纤维化、肾纤维化和肺纤维化。
根据本发明的实施例，所述纤维化疾病是四氯化碳诱导的。
根据本发明的实施例，所述药物组合物是通过前面所述的方法筛选获得的。例如，Accutase和PMA因子是发明人根据前面所述的方法筛选获得的，这两因子的组合物的荧光值为550。
根据本发明的实施例，所述硬化性疾病选自肝硬化。
根据本发明的实施例，所述癌症选自肝癌。
根据本发明的实施例，所述炎症选自肝炎。
定义和一般术语
现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
除非另外说明，应当应用本文所使用的下列定义。出于本发明的目的，化学元素与元素周期表CAS版，和《化学和物理手册》，第75版，1994一致。此外，有机化学一般原理可参考"Organic Chemistry",Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和"March's Advanced Organic Chemistry”by Michael B.Smith and Jerry March,JohnWiley&Sons,New York:2007中的描述，其全部内容通过引用并入本文。
除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。
本发明所使用的术语“受试对象”是指动物。典型地所述动物是哺乳动物。受试对象，例如也指灵长类动物(例如人类，男性或女性)、牛、绵羊、山羊、马、犬、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述受试对象是灵长类动物。在其他实施方案中，所述受试对象是人。
本发明所使用的术语“患者”是指人(包括成人和儿童)或者其他动物。在一些实施方案中，“患者”是指人。
术语“包含”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
如本发明所使用的术语“治疗”任何疾病或病症，在其中一些实施方案中指改善疾病或病症(即减缓或阻止或减轻疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一些实施方案中，“治疗”指缓和或改善至少一种身体参数，包括可能不为患者所察觉的身体参数。在另一些实施方案中，“治疗”指从身体上(例如稳定可察觉的症状)或生理学上(例如稳定身体的参数)或上述两方面调节疾病或病症。在另一些实施方案中，“治疗”指预防或延迟疾病或病症的发作、发生或恶化。
本发明提供的药物组合物可以配制成立即或改性释放剂型，包括延迟-、缓释-、脉冲-、控制-、靶向-和程序化释放形式。
本发明提供的药物组合物可以与不会损害预期的治疗作用的其它活性成分共同配制，或者与补充预期的作用的物质共同配制。
本发明提供的药物组合物可以通过注射、输注或植入肠胃外给药，用于局部或全身给药。如本发明使用的肠胃外给药包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜内和皮下给药。
本发明提供的药物组合物可以配制成适于肠胃外给药的任何剂型，包括溶液、混悬剂、乳剂、胶束、脂质体、微球、纳米体系和适于在注射前在液体中制成溶液或混悬液的固体形式。这样的剂型可以根据药物科学领域的技术人员已知的常规方法来制备(参见Remington:The Science和Practice of Pharmacy,同上)。
本发明所述内皮细胞疗法是指肝血窦内皮细胞治疗肝纤维化疾病等。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的高通量筛选结果；
图2是根据本发明实施例的dLSEC与nLSEC的细胞形貌图和在胶原上降解两天后的形貌图；
图3是根据本发明实施例的dLSEC和nLSEC的降解基质能力检测图；
图4是根据本发明实施例的SEM表征dLSEC与nLSEC对于胶原的降解情况图；
图5是根据本发明实施例的qPCR表征MMPs基因图；
图6是根据本发明实施例的经脾注射的dLSEC和nLSEC体内分布情况图；
图7是根据本发明实施例的天狼星红染色，免疫荧光染色，原位明胶酶谱法染色对比图；
图8是根据本发明实施例的体内ACTA2基因检测图；
图9是根据本发明实施例的体内MMPs基因表达情况图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
本发明所采用的原材料均来源于商业购买，Accutase：A1110501,Gibco。PMA：植物源重组人血清白蛋白OsrHSA(培养基级别),HYC002M01，oryzogen/武汉禾元。5(6)-TAMRASE：HY-D0723，MCE。鼠尾Ⅰ型胶原100mg：354236，BD。PMA：V1171，Promega。
一般方法
1.荧光胶制备：
将1mL 3.17mg/mL的Ⅰ型胶原，3.17mg/mL)加入到10kDa透析袋中，放入至1L提前预冷的标记缓冲液(0.25M NaHCO3，0.4M NaCl，溶剂：去离子水，PH＝9.5)，4℃透析过夜；室温下将1mg荧光分子(5(6)-TAMRA SE)溶解于100μL DMSO，随后加入900μL标记缓冲液(0.22μm滤膜过滤)混匀，置于冰上预冷(避光)；挤出透析后的胶原，加入上述荧光分子溶液混匀，每管500μL分装，4℃避光旋转混匀过夜；将混匀后的collagen加入到透析袋中，放入至1L提前预冷的标记缓冲液，4℃避光透析过夜；将透析袋放入至1L提前预冷的PH＝4的0.2％醋酸溶液，4℃避光透析过夜。
2.荧光胶成胶：
按照如下剂量准备试剂：Ⅰ型胶原27.55μl,荧光胶2.75μl，DMEM基础培养基19μl，1M氢氧化钠0.6969μl。将DMEM培养基与NaOH溶液混合，置于冰上预冷；将collagen与荧光胶混合；在96孔板上成胶周围的孔中加PBS保湿，将96孔板放在冰上；吹吸均匀后迅速加在96孔板的孔中，每孔50μL；将96孔板避光移入37℃培养箱；1h 30min后取出备用。
3.荧光胶降解实验
将2×104个细胞以150μL的体积加入孔中，移入37℃培养箱；降解2天后避光取出；将孔中的上清液移至黑色孔板；检测上清的荧光值，激发光为546nm，发射光为575nm，荧光值即可定量表征细胞的降解能力。
4.免疫荧光染色
培养基吸去,PBS洗2遍。PFA固定30min，PBS洗2遍。破膜封闭液blocking 1h。一抗稀释液稀释一抗，4℃过夜。PBS洗3遍。二抗(1:400,二抗溶在PBS里),RT，1h。PBS洗3遍。DAPI(1：2000)，F-actin(1：200)，15min，RT。PBS洗3遍。
5.天狼星红染色
冰冻切片室温恢复5-10min。PFA固定30min。流水冲洗1-min。天狼星红染液染色3min。3min后，用去离子水中止染液。脱水，70％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇5min，二甲苯I，二甲苯II。自然风干后封片(中性树脂封片)。
6.原位明胶酶谱法
将GENMED胶体液(Reagent A)置于60℃水浴溶化。小心移取40微升GENMED胶体液(Reagent A)到1.5毫升离心管。放进37℃恒温水槽孵育10分钟。同时37℃瞬时预热GENMED染色液(Reagent B)，不能长时间在37度。加入5微升37℃预热的GENMED染色液(ReagentB)，混匀。加入0.1微升hochest进入A+B的混合液。再次混匀，即刻分别加上40微升上述液体到未固定的冰冻切片的样品上。盖上盖玻片(注意：避免气泡)。放进4℃冰箱里孵育10分钟，避免光照。放进37℃培养箱里孵育60分钟，避免光照。即刻在荧光显微镜下观察：激发波长480nm，散发波长530nm。
7.肝纤维化动物模型
雄性Balb/c nu小鼠，6周龄，10％CCL4，1.5μl/g，一周两次，诱导4周。
8.LSEC-Akaluc的体内生物发光监测
用于脾内注射的间充质干细胞通过慢病毒介导的基因转移(LSEC-Akaluc)工程稳定表达荧光素酶。为观察LSEC Akaluc，小鼠在成像前5分钟腹腔注射40μL 15mg/mLTokeOni(808350,Sigma)。肝纤维化小鼠经脾注射100μL PBS或4×105LSECs，悬浮在100μLPBS中。使用IVIS Lumina II成像系统(Caliper Life Sciences)对小鼠进行成像，观察LSECs在体内的分布。
9.qPCR分析
细胞或组织(如肝脏)在RNA ISOLATORTRIZOL试剂(R401-01,Vazyme)中均质后再提取RNA。用逆转录酶(R211-01,Vazyme)将1μg无dna的总RNA合成cDNA。在CFX96仪器(Bio-Rad)上使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Q121-02,Vazyme)进行三次重复的基因特异性转录分析。所有基因均归一化为GAPDH。相对表达量采用2ΔΔCT法计算。
10.SEM表征细胞与材料的交互作用
将表面有dLSEC，nLSEC胶原材料，加入2.5％戊二醛固定2小时。固定后，用PBS洗涤3次，然后进行70％、80％、90％和100％的一系列乙醇溶液梯度脱水，每步持续10分钟。采用临界点干燥(Tousimis samdrii-795)对样品进行冷冻干燥。干燥后的样品在扫描电镜(FEIQuanta 200)成像前，将样品镀金90秒，以进行微观结构评价。
实施例1：
将结合荧光分子的一型胶原在96孔板中均匀成胶，然后将细胞种在胶原表面，两天后吸取孔板中的细胞培养液上清，然后通过酶标仪检测细胞培养液上清的荧光值，记录为采样(激发光为546nm，发射光为575nm，荧光值即代表细胞的降解能力)。同时，发明人会用检测纯培养基与胶原材料孵育两天后的荧光值，记录为标准1，以及检测0.5mg/ml MMP1(溶剂为纯培养基)与胶原材料孵育两天后的荧光值(即完全降解胶原材料的荧光值)，记录为标准2。细胞降解胶原材料的比例计算公式为：降解胶原材料百分比＝(采样-标准1)/(标准2-标准1)*100％
实施例2
利用实施例1中的方法，发明人对内皮细胞，免疫细胞，星形细胞等进行了筛选，具体结果见图1，图中A代表Accutase，P代表PMA。
发明人发现，Accutase和PMA因子的组合可以刺激肝血窦内皮细胞，使其具有极强的降解细胞外基质的能力。
下表中，细胞类型有Raw264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)，PM为小鼠骨髓中提取的原代巨噬细胞，THP1为人髓系白血病单核细胞，ESC-LSEC，ESC-MSC为人胚胎干细胞分化出的肝血窦内皮细胞，人胚胎干细胞分化出的间充质干细胞，LX2为人肝星状细胞，C166为卵黄囊内皮细胞，3T3为小鼠成纤维细胞，HL60为人早幼粒急性白血病细胞。Serumfree为无血清培养(basic medium,100x glutamax，0.5mg/ml albumin)。
A+P可以刺激LSEC出现最强的降解能力，A+P也可以刺激ESC-LSEC出现较强的降解能力，其余组合均较弱。
因子有IL4(50ng/ml)，IL13(50ng/ml)，LPS(20ng/ml)，A(200X)，fMLP(2μM)，TGFβ(3ng/ml)，P(50ng/ml)。
结果见下表1：
表1
实施例3
dLSEC是Acccutase和PMA刺激后的LSEC。nLSEC是正常的LSEC。
发明人在培养皿上用Accutase+PMA诱导细胞一天后，在显微镜下观察到dLSEC出现拉长的细胞形态，nLSEC是卵圆形的细胞形态。将此细胞消化后种在一型胶原上，dLSEC在两天后可以将其降解为细胞和胶原混合的团状物，nLSEC分散地铺展在胶原，见图2。
通过荧光胶细胞降解能力检测，两天内，dLSEC可以降解80％的一型胶原，nLSEC降解5％的一型胶原，见图3。
通过扫描电镜观察，dLSEC可以降解周围的一型胶原，出现较大的空洞，nLSEC周围未出现很大的空洞，见图4。
通过qPCR,检测了dLSEC和nLSEC的MMPs相关基因表达情况，发明人发现dLSEC的MMP2，8，9，10，14表达均高于nLSEC，其中MMP9高达200倍，见图5。
将dLSEC-akaluc经脾注射入诱导4周的肝纤维化模型内，在第一天，第三天，第五天分别进行成像。结果表明，dLSEC-akaluc,nLSEC-akaluc在第一天，第三天聚集在肝；第五天时，注射入体内的细胞基本检测不出信号，见图6。
天狼星红染色中，颜色较深的为胶原在体内的沉积情况。胶原沉积越多，肝纤维化程度越严重。从图7中可以看到dLSEC组使肝纤维化程度明显改善。发明人通过组织切片免疫荧光染色aSMA，col1a1(肝纤维化标志蛋白)结果来看，相对于nLSEC组，fibrotic mice组，dLSEC组aSMA，col1a1表达较低，说明缓解了肝纤维化。根据原位明胶酶谱法结果，dLSEC组绿色荧光高表达，说明体内基质金属蛋白酶含量较高，说明dLSEC在体内通过降解细胞外基质改善了肝纤维化的进程。
ACTA2基因是表征肝纤维化严重程度的关键基因。一般而言，ACTA2表达越高，肝纤维化越严重。从图8中(Normal mice为正常鼠，Fibrotic mice为4w肝纤维化小鼠不治疗组，dLSEC为经脾注射dLSEC治疗组，nLSEC为经脾注射nLSEC治疗组。)可以看到，dLSEC组的ACTA2基因表达明显低于Fibrotic mice组，说明dLSEC对于肝纤维化疾病具有一定的治疗作用。
发明人也表征了肝纤维化疾病治疗后，体内MMPs基因的表达情况，从图9中可以看到，dLSEC组的MMP2,8,9,10,14基因表达量高于nLSEC组和fibrotic mice组。从基因水平说明了dLSEC是通过MMPs介导的基质降解，缓解了肝纤维化疾病的进程。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.药物组合物在制备用于治疗肝纤维化疾病的药物中的用途，所述药物组合物包括PMA因子和Accutase。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物能提高内皮细胞降解细胞外基质的能力。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述内皮细胞为肝血窦内皮细胞和人脐静脉内皮细胞。
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