CN114705858A - 用于评估癌症发生的风险的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于评价个体中癌症发生的风险的方法。
Description
本申请是申请号为201780005401.8(发明名称：用于评估癌症发生的风险的组合物和方法，申请日为2017年1月2日)的中国专利申请的分案申请。
引言
癌症是一种多元化的疾病，其中，一组细胞显示出不受控制的生长，侵入和破坏相邻组织的入侵，并且有时经由淋巴或血液转移或扩散到身体内的其他位置。癌症的这三个恶性特性将它们与不入侵或转移的良性肿瘤区分开来。
目前有一些方法用来治疗各种类型的癌症，包括外科手术、放射疗法、化学疗法和靶向疗法。成功的癌症治疗针对临床可见的或显微镜可见的原发性肿瘤和任何转移。
选择适当的治疗对于患者来说是重要的。必须知道何时即刻使用重的和积极治疗方案以防止侵袭性癌症的扩散。相反，当患者携带的肿瘤不必须需要时，进行重的和积极治疗对患者也是不利的。实际上，重的或积极治疗总是导致可严重影响患者的生活质量的不良毒性。例如，它们中的大多数是诱变物质并且因此易于诱导继发性肿瘤。另外，这些重的和积极治疗通常非常昂贵，并且因此应该仅在需要时进行。
目前，对于实体瘤的治疗选择基于肿瘤分期，其通常使用来自美国癌症联合委员会(AJCC)的肿瘤/结节/转移(TNM)测试进行。TNM系统基于三个种类分配编号。“T”指肿瘤大小，“N”指淋巴结受累的程度并且“M”指转移的程度。癌症的更广泛的阶段经常被引用为由通过预后分组的TNM值得到的编号I、II、III、IV；越高的编号表示越晚期的癌症和可能更坏的结果。
普遍承认的是，虽然该测试和分期系统提供关于在患者中已经诊断出实体瘤的阶段的一些有价值的信息，但是这不精确也不充分。特别是，局限于实体瘤。另一方面，脂质瘤主要通过鉴定细胞遗传学的改变来表征。
最重要地，TNM测试不能鉴别肿瘤进展的最早期阶段。这些早期阶段为治疗提供了最有希望的窗口。在癌症发展的最开始检测到癌症，允许靶向的、有效的治疗，并减小副作用。因此，重要的是在尽可能最早的阶段，将患者鉴定为筛查整个人群的一部分。因此，癌症可在社区中提早鉴定，使得能够更早干预和管理以减少致命性和患有所述疾病。存在更好的对癌症发生的预后测试的真正需要，目的不但是改善患者的全球存活率，而且是改善他们的生活质量，并使得真正受益的患者免于积极且昂贵的化学疗法。特别是，存在对评估受试者患癌症的风险的测试的需要。
说明
本发明提供了一种用于在以前未被诊断出患有癌症的受试者中预测癌症发生的简单和有效的方法。本发明的发明人已经表明，受试者的样品中存在前胃泌素是所述受试者是否会患癌症的良好和可靠的指示。这种关系与年龄或任何其他参数无关。因此，前胃泌素提供了一种用于确定受试者患癌症的风险的简单和有效的工具。因此，前胃泌素是癌症的最早期阶段的标志物。
以前已经描述了基于前胃泌素水平的预后测试。然而，这样的测试局限于预测具有增生性息肉的患者在切除所述增生性息肉后患结肠肿瘤的风险(WO 2012/164035；Do etal.,Cancer Prev Res,5(4):675-684,2012)。因此，这样的测试用途有限，因为它们局限于预测已经已知存在的癌症。它们不能用来评价没有癌症的任何迹象的受试者患该病的风险。
在第一个方面，本发明涉及一种在以前尚未被诊断出患有癌症的受试者中评价癌症发生的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的样品中的前胃泌素的水平；
b)基于步骤a)的水平，确定所述受试者会患癌症的风险。
临床数据的ROC(受试者工作特征)分析已经显示出前胃泌素的存在是高度特异性和灵敏性的标志物。前胃泌素在不患癌症的受试者的样品中基本上没有检测不到。另一方面，如果前胃泌素在从未被诊断患有癌症的受试者的样品中是可检测到的，则他/她未来具有不可忽略的患癌症的风险。
本发明的方法使容易地和可靠地评价以前没有被诊断患有癌症的受试者患癌症的风险成为可能。换言之，该方法还能够鉴定会患癌症的受试者，即使他们目前无症状显示。尽管这样的患者没有感觉到症状，但他们已经患有癌症。
措辞“评价受试者中癌症发生的风险”指确定给定的受试者在未来显示出癌症症状的相对可能性。根据本发明的方法表示与其它方法或指示物评价所述风险的工具，所述其它方法或指示物诸如临床检查、活组织检查和确定癌症的已知生物标志物(诸如，例如CA125和/或OVA1)的水平。
可能经受本文所述的方法的“受试者”可以是任何哺乳动物，包括人、狗、猫、牛、山羊、猪(pig)、猪(swine)、绵羊和猴。人受试者可称为“患者”。优选地，“受试者”为不患癌症并且没有被怀疑患癌症并且尚未被诊断患癌症的哺乳动物。如本文所使用的，“患癌症的受试者”指患癌症并显示出癌症症状或已经被诊断患癌症的哺乳动物。当由医师进行的医学测试揭示出癌症的存在时，受试者被“诊断患癌症”。如本文所使用的，“症状”是疾病(例如，癌症)的任何主观证据。“症状”是被患者注意到的从正常功能和感觉的偏离，其反应了异乎寻常的状态或疾病(例如，癌症)的存在。如果患者是疾病的携带者，但是没有经历症状，则认为该疾病是无临床症状的。物临床症状的病症可能不被发现，直至患者经历医学测试，诸如例如测量前胃泌素水平。
本方法还特别有用，因为它允许鉴定受试者中的癌症，即使当受试者从未被诊断患有癌症和/或没有经历癌症的任何症状时。前胃泌素是高度特异性和灵敏性的癌症标志物。在受试者中检测到前胃泌素指示很有可能所述受试者会患癌症。因此前胃泌素是用于鉴定会患癌症的受试者的特别重要的生物标志物，即使他们尚未显示出任何症状。本发明特别地有利，因为它允许筛选表面看来健康(即从未被诊断患有癌症和/或尚未经历癌症的任何症状)的受试者人群并且鉴定会患癌症的那些。“筛选”在本文中指用于在人群中鉴定在没有迹象或症状的个体中可能存在尚未被诊断的疾病。这可包括患有症状前疾病或具有未识别症状的疾病的个体。技术人员会明白，因此，筛查测试有些独特，在于他们对看来身体健康的人进行测试。癌症筛查的最近目标是，在人出现症状之前和在疾病轨迹中当治疗可能导致治愈时的某一点，鉴定早期阶段癌症或癌前病变。
在另一方面，本发明提供了一种在以前尚未被诊断患有癌症的受试者中预测癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的样品中的前胃泌素的水平；
b)基于步骤a)的水平，预测癌症。
如本文所使用的“预后”意指从疾病恢复的可能性或预测疾病的可能发展或结果。例如，如果来自受试者的样品对于前胃泌素的存在是阴性的，则对该受试者的“预后”比如果样品对前胃泌素是阳性的更好。
“前胃泌素”，在本文中指哺乳动物前胃泌素肽。前胃泌素通过从前胃泌素原(101个氨基酸的肽(氨基酸序列参考号：AAB19304.1)，其为胃泌素基因的初级翻译产物)切割前21个氨基酸(信号肽)而形成。前胃泌素的80个氨基酸的链通过切割和修饰酶被进一步处理成一些生物活性的胃泌素激素形式：包含前胃泌素的第38-71位氨基酸的胃泌素34(G34)和甘氨酸延伸的胃泌素34(G34-Gly)，包含前胃泌素的第55-71位氨基酸的胃泌素17(G17)和甘氨酸延伸的胃泌素17(G17-Gly)。
在一个优选的实施方案中，本发明的前胃泌素肽是人前胃泌素。更优选的，措辞“人前胃泌素”指序列SEQ ID No.1的人PG。人前胃泌素明显包含N末端和C末端结构域，该N末端和C末端在上文提及的生物活性胃泌素激素形式中不存在。优选地，所述N末端结构域的序列由SEQ ID NO.2表示。在另一个优选的实施方案中，所述C末端结构域的序列由SEQID NO.3表示。
本发明提供了用于检测样品尤其是生物学样品(诸如生物液体和细胞、组织、活组织检查样品和器官切片等)中的前胃泌素的方法。
“生物样品”在本文中指可以从受试者中取得的任何样品。这样的样品必须允许确定前胃泌素的表达水平。已知前胃泌素为分泌性蛋白。因此，用于确定前胃泌素蛋白的水平的优选的生物样品包括生物液体。如本文所使用的“生物液体”意指包含生物来源的物质的任何液体。用于本发明的优选的生物液体包括动物(例如哺乳动物，优选人受试者)的体液。体液可以是任何体液，包括但不限于血液、血浆、血清、淋巴液、脑脊髓液(CSF)、唾液、汗液和尿液。优选地，所述优选的液体生物样品包括诸如血液样品、血浆样品或淋巴液样品的样品。更优选地，生物样品为血液样品。实际上，这样的血液样品可通过完全无害地从患者中进行血液收集而获得，并且因此允许非侵入性评估受试者发生肿瘤的风险。
当癌症是实体癌症时，如本文所使用的“生物样品”还包括待测试的患者的实体癌症样品。这样的实体癌症样品允许本领域技术人员对本发明的生物标志物的水平进行任何类型的测量。在一些情况下，根据本发明的方法可进一步包括从患者中取得实体癌症样品的预备步骤。“实体癌症样品”指肿瘤组织样品。甚至在癌性患者中，肿瘤位置的组织仍包含非肿瘤的健康组织。因此“癌症样品”应该局限于从患者中取得的肿瘤组织。所述“癌症样品”可以是活组织检查样品或从外科手术切除治疗中取得的样品。
根据一方面，来自患者的样品是癌细胞或癌组织。
该样品可以根据本领域技术人员已知的方法取得和制备(如果需要的话)。特别地，本领域中公知的是样品应该从禁食受试者中取得。
本发明的癌细胞和癌组织没有特别限制。
如本文所使用的术语“癌症”指或描述了通常由不受控制的细胞增殖表征的哺乳动物的生理状况。如本文所使用的术语“癌症”和“癌性”意指涵盖该疾病的所有阶段。如本文所使用的“癌症”是由生物体中的受损细胞的不希望的生长、入侵和在某些条件下转移而导致的任何恶性赘生物。导致癌症的细胞是遗传上受损的并且通常已经失去了他们的控制细胞分裂、细胞迁移行为、分化状态和/或细胞死亡机制的能力。大多数癌症形成肿瘤，但是一些造血系统癌症(诸如白血病)不形成肿瘤。
因此，如本文所使用的“癌症”可包括良性和恶性的癌症。癌症的实例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。更具体地，根据本发明的癌症选自包含以下的组：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)，肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)，口咽癌，鼻咽癌，喉癌，腹膜癌，食管癌，肝细胞癌，胃(gastric或stomach)癌(包括胃肠癌和胃肠间质癌)，胰腺癌，成胶质细胞瘤，脑癌，神经系统癌症，宫颈癌，卵巢癌，肝癌(liver cancer)，膀胱癌，泌尿道癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，涎腺癌，肾癌(kidney或renal cancer)，前列腺癌，胆囊癌，外阴癌，睾丸癌，甲状腺癌，卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)，肝癌(hepaticcarcinoma)，肛管癌，阴茎癌，非黑素瘤皮肤癌，黑素瘤，皮肤黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤，恶性雀斑样痣黑素瘤，肢端雀斑性黑素瘤，结节性黑素瘤，多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)；非霍奇金淋巴瘤，诸如例如低度/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小无裂细胞性NHL；肿块性病变NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病(CML)；急性成髓细胞白血病(AML)；和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)，以及与斑痣性错构瘤病(phakomatoses)相关的异常血管增生，水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)，Meigs综合征，脑癌以及头颈癌，包括唇和口腔癌，和相关的转移。
在一个优选的实施方案中，所述癌症是肺癌，唇和口腔癌，口咽癌，鼻咽癌，喉癌，前列腺癌，食道癌，胆囊癌，肝癌(liver cancer)，肝细胞癌，胃癌(gastric或stomachcancer)(包括胃肠癌和胃肠间质癌)，胰腺癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，白血病，多发性骨髓瘤，卡波西肉瘤，肾癌，膀胱癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，肝细胞瘤，肝癌(hepatic carcinoma)，肛管癌，甲状腺癌，非黑素瘤皮肤癌，皮肤黑素瘤，脑癌，神经系统癌，睾丸癌，宫颈癌，子宫癌，子宫内膜癌，卵巢癌或乳腺癌。
在一个更优选的实施方案中，所述癌症是食道癌，肝癌(liver cancer)，肝细胞癌，胃癌(gastric或stomach caner)(包括胃肠癌和胃肠间质癌)，胰腺癌，霍奇金淋巴瘤，结肠癌，直肠癌，结直肠癌，肝细胞瘤，肝癌(hepatic carcinoma)，肛管癌，非黑素瘤皮肤癌，皮肤黑素瘤，宫颈癌，子宫癌，子宫内膜癌，卵巢癌或乳腺癌。
优选地，所述受试者会患癌症的风险在步骤b)中通过比较步骤a)的水平与参考水平而确定。
本文所使用的术语“参考水平”指在参考样品中考虑的癌症标志物(即前胃泌素)的表达水平。如本文所使用的“参考样品”意指从已知不患有所述疾病的受试者，优选两个或更多个受试者，或可选地从一般群体中获得的样品。癌症标志物的合适的参考表达水平可通过在一些合适的受试者中测量所述癌症标志物的表达水平来确定，并且这样的参考水平可被调整到特定受试者群体。参考值或参考水平可以是绝对值；相对值；具有上限或下限的值；值的范围；平均值；中位值、平均值或与特定对照或基线值比较的值。参考值可以基于个体样品值，诸如例如从来自正在被测试的受试者但是是更早的时间点的样品中获得的值。参考值可以基于大量样品，诸如来自实足年龄(chronological age)匹配组的受试者的群体，或基于包括或排除待测试的样品的样品池(pool)。
有利地，“参考水平”是从来自具有已知关于癌症的特定状态的受试者的生物样品中获得的预先确定的前胃泌素水平。在具体的实施方案中，用于与步骤(b)中的测试样品比较的参考水平可从来自健康受试者的生物样品或从来自患有癌症的受试者的生物样品获得；应该理解的是参考表达概况也可以从健康受试者的生物样品池或从来自患有癌症的受试者的样品池中获得。本发明的发明人已经显示了禁食健康受试者中前胃泌素的水平是0pM。在一个优选的实施方案中，参考水平是0pM。
前胃泌素的水平可通过对本领域技术人员已知的任何方法来测量。
优选地，确定样品中前胃泌素的水平包括使所述样品与前胃泌素结合分子接触，并测量所述前胃泌素结合分子与前胃泌素的结合。
当在蛋白质水平测量表达水平时，尤其可以使用特异性前胃泌素结合分子，诸如例如抗体，具体地使用公知的技术，诸如使用生物素化的细胞膜染色或其他相当的技术，然后用特异性抗体免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA或ELISPOT、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)、抗体微阵列或组织微阵列联合免疫组织化学进行。其他合适的技术包括FRET或BRET，其使用单个或多个激发波长的单细胞显微术或组织化学方法，并应用任何适应的光学方法，诸如电化学方法(伏安法和电流分析技术)，原子力显微镜和射频方法，例如，多极共振谱，共焦和非共焦，检测荧光、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率和双折射率或折射率(例如，表面等离子共振、椭圆偏振法、共振镜面法、光栅耦合器波导法或干涉测量法)的检测，细胞ELISA，流式细胞术，放射性同位素，磁共振成像，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析；HPLC-质谱法；液相色谱/质谱/质谱(LC-MS/MS)。所有这些技术是本领域公知的，并且在此不需要进一步详述。这些不同技术可用来测量前胃泌素水平。
本发明的前胃泌素结合分子，尤其是抗前胃泌素抗体，在免疫测定中特别有用。免疫测定可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫扩散测定或免疫检测测定，诸如表面等离子电阻测定(例如
测定)、ELISPOT、DNA狭缝杂交(slot-blot)或蛋白质印迹。作为这样的技术的一般指南，参见例如，Ausubel et al.(eds)(1987)in“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons,New York,N.Y。
抗体是用于医疗、兽医和其他免疫检测领域的许多测定技术中的关键试剂。这样的测试包括许多常规使用的免疫测定技术，诸如例如，酶联的ELISA、RIA、IHC和IF测定。前胃泌素的水平优选使用针对所述蛋白质的抗体通过本领域技术人员已知的任何方法来测定。优选地，前胃泌素的水平使用免疫酶测定，优选地基于在RIA和ELISA之间选择的技术，使用至少一种前胃泌素结合分子来确定。最优选地，所述水平通过ELISA使用至少一种前胃泌素结合分子来确定。更优选地，前胃泌素的水平使用免疫酶测定，最优选ELISA测定，使用一种前胃泌素结合分子来测量。
在一个特别有用的实施方案中，根据本发明的用于评价癌症发生的风险的方法包括使用免疫酶测定，优选基于在RIA和ELISA之间选择的技术，使用前胃泌素结合分子，来确定来自受试者的生物样品中前胃泌素的水平。
这些技术特别有用，因为它们允许技术人员通过简单、可重复和可靠的测试而测定前胃泌素的存在。现有技术的方法依赖于半定量测试，即，整个息肉中的上皮细胞的IHC染色。这样的方法有些不可靠。具体地，由于与测定相关的主观性的程度，难以比较由不同病理学工作者获得的结果。相反，本发明的方法是完全定量的、客观的和高度灵敏的。
在另一个特别有用的实施方案中，根据本发明的方法包括使用免疫酶测定，优选基于在RIA和ELISA之间选择的技术，使用前胃泌素结合分子，来确定来自受试者的生物样品中前胃泌素的水平。
因此，前胃泌素的水平在本发明的步骤a)中通过确定被前胃泌素结合分子，优选被识别前胃泌素的抗体结合的前胃泌素的量来确定。
“前胃泌素结合分子”在本文中指结合前胃泌素但是不结合胃泌素-17(G17)、胃泌素-34(G34)、甘氨酸延伸的胃泌素-17(G17-Gly)或甘氨酸延伸的胃泌素-34(G34-Gly)的任何分子。本发明的前胃泌素结合分子可以是任何前胃泌素结合分子，诸如，例如，抗体分子或受体分子。优选地，前胃泌素结合分子是抗前胃泌素抗体或其抗原结合片段。
“结合(binding，binds)”及类似词语在本中意指抗体或其抗原结合片段，与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。用于确定两个分子是否彼此结合的方法是本领域公知的并且包括，例如，平衡透析、表面等离子共振等。在一个具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段与前胃泌素结合，该亲和力比其与非特异性分子诸如BSA或酪蛋白结合的亲和力大至少两倍。在一个更具体的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段仅与前胃泌素结合。
在一个具体的实施方案中，来自受试者的生物样品与至少一种与前胃泌素结合的分子接触，其中，所述剂对于前胃泌素的亲和力是至少100nM、至少90nM、至少80nM、至少70nM、至少60nM、至少50nM、至少40nM、至少30nM、至少20nM、至少10nM、至少5nM、至少1nM、至少100pM、至少10pM或至少1pM，如通过诸如上述方法确定的。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于在以前尚未被诊断患有癌症的受试者中评价癌症发生的风险的方法，其包括检测来自尚未被诊断患有癌症的受试者的生物样品中的前胃泌素的浓度，其中，所述生物样品与抗hPG抗体或其抗原结合片段接触。
在一个具体的实施方案中，本发明涉及一种用于预测癌症的方法，其包括检测在来自尚未被诊断患有癌症的受试者的生物样品中的前胃泌素的浓度。
如本文所使用的术语“抗体”意欲包括多克隆和单克隆抗体。抗体(或“免疫球蛋白”)由糖蛋白组成，所述糖蛋白至少包含由二硫键互相连接的两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链包含重链可变区(或结构域)(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为具有超可变性的区，称为“互补决定区”(CDR)或“超变区”，其主要负责结合抗原的表位，并且其与更保守的区域(称为框架区(FR))散置在一起。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端以以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)和典型补体系统的第一组分(Clq))的结合。抗体可以具有不同的同种型(即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)。
在一个更具体的实施方案中，所述生物样品与选自下组的前胃泌素结合抗体或其抗原结合片段接触：多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化的抗体、单链抗体、骆驼化抗体、IgA1抗体、IgA2抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体和IgM抗体。
另外，生成抗体领域的普通技术人员会容易地选择和实施用于生成针对给定的抗原的多克隆和/或单克隆抗体的方法。并且，本领域技术人员知晓确定抗体的轻链和重链中的CDR的方法。
“多克隆抗体”是在一种或多种其他不相同的抗体中或在一种或多种其他不相同的抗体存在下产生的抗体。一般，在产生不相同的抗体的一些其他B淋巴细胞的存在下从一种B淋巴细胞中产生多克隆抗体。通常，直接从免疫动物中获得多克隆抗体。
术语“单克隆抗体”指从几乎同种的抗体群体中产生的抗体，其中除了可小比例发现的少数可能天然存在的突变之外，群体包含相同抗体。单克隆抗体从单细胞克隆(诸如杂交瘤)的生长产生，并且由一类和一个亚类的重链和一种类型的轻链表征。抗人前胃泌素(抗hPG)单克隆抗体和其用于诊断或治疗的用途是本领域已经知晓的，参见例如，用于结肠直肠癌的WO 2011/083088、用于乳腺癌的WO 2011/083 090、用于胰腺癌的WO 2011/083091、用于结肠直肠癌和胃肠癌的WO 2011/116 954，以及用于肝脏病理的WO 2012/013 609和WO 2011/083089。
措辞抗体的“抗原结合片段”意欲表示任何肽、多肽或蛋白质，它们保持与所述抗体的靶标(一般还称为抗原)(一般是相同表位)结合的能力，并且包含抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、或至少200个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
在一个具体的实施方案中，所述抗原结合片段包含其来源的抗体的至少一个CDR。仍然在一个优选的实施方案中，所述抗原结合片段包含其来源的抗体的2、3、4或5个CDR，更优选地6个CDR。
“抗原结合片段”可选自但不限于下组：Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或双抗体，或具有无序肽诸如XTEN(延伸的重组多肽)或PAS基序的融合蛋白，或会通过化学修饰，添加诸如聚(亚烷基)醇诸如聚乙二醇(“PEG化”)(称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的PEG化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，或通过并入脂质体来增加半衰期的任何片段，所述片段具有根据本发明的抗体的至少一个特征性CDR。优选地，所述“抗原结合片段”是构建的，或包含它们来源的抗体的了重可变链或轻可变链的部分序列，所述部分序列足以保持与其来源的抗体相同的结合特异性和足够的亲和力，所述亲和力，相对于靶标而言，优选至少等于其来源的抗体的亲和力的1/100，在更优选的方式中等于至少1/10。
在另一个具体的实施方案中，来自受试者的生物样品与至少一种与前胃泌素结合的抗体接触，其中，所述抗体通过本领域技术人员已知的免疫方法获得，其中，所述免疫方法使用氨基酸序列包含前胃泌素的全部或部分氨基酸序列的肽作为免疫原。所述抗体可以是多克隆的或单克隆的。当使用多于一种抗体时(例如，2个)，本发明的方法可以使用相同类型的抗体(例如两种单克隆抗体)或属于不同类型的抗体(例如一种单克隆的和一种多克隆的)进行。
在另一个具体的实施方案中，所述生物样品与一个这样的抗体接触。更具体地，所述免疫原包含选自以下的肽：
·肽，其氨基酸序列包含全长前胃泌素并且特别是SEQ ID N°1的全长人前胃泌素的氨基酸序列或由其组成。
·肽，其氨基酸序列对应于前胃泌素并且特别是SEQ ID N°1的全长人前胃泌素的氨基酸序列的一部分。
·肽，其氨基酸序列对应于前胃泌素的N末端部分的一部分或对应于前胃泌素的N末端部分的全氨基酸序列，并且特别是包含氨基酸序列SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID N°2)或由其组成的肽，和
·肽，其氨基酸序列对应于前胃泌素的C末端部分的一部分或对应于前胃泌素的C末端部分的全部氨基酸序列，并且特别是包含氨基酸序列QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID N°3)或由其组成的肽，
·肽，其氨基酸序列对应于前胃泌素的C末端部分的氨基酸序列的一部分，并且特别是包含对应于前胃泌素的第71-80位氨基酸的氨基酸序列FGRRSAEDEN(SEQ ID N°40)的肽。
技术人员会容易地认识到，这样的免疫可用来生成多克隆或单克隆抗体，如所希望的。用于获得抗体的这些类型中的每种的方法是本领域中公知的。
通过使用包含对应于人前胃泌素的氨基酸序列1-14(N末端)的氨基酸序列“SWKPRSQQPDAPLG”的免疫原生成的单克隆抗体的实例包括但不限于命名为以下的单克隆抗体：mAb3、mAb4、mAb16，和mAb19与mAb20，如下表1至表4所述。已经记载了其他单克隆抗体，但是不清楚这些抗体实际上是否结合前胃泌素(WO 2006/032980)。表位作图的实验结果显示mAb3、mAb4、mAb16，和mAb19与mAb20确实特异性结合所述hPG N末端氨基酸序列内的表位。本领域中已经记载了特异性识别由SEQ ID NO.2表示的前胃泌素的N末端内的表位的多克隆抗体(参见例如WO 2011/083088)。
表1
| 杂交瘤保藏 | mAb | 氨基酸序列 | SEQ ID N° | |
| 6B5B11C10 | mAb3 | VH CDR 1 | GYIFTSYW | SEQ ID N°4 |
| VH CDR 2 | FYPGNSDS | SEQ ID N°5 | ||
| VH CDR 3 | TRRDSPQY | SEQ ID N°6 | ||
| VL CDR 1 | QSIVHSNGNTY | SEQ ID N°7 | ||
| VL CDR 2 | KVS | SEQ ID N°8 | ||
| VL CDR 3 | FQGSHVPFT | SEQ ID N°9 |
表2
| 杂交瘤保藏 | mAb | 氨基酸序列 | SEQ ID N° | |
| 20D2C3G2 | mAb4 | VH CDR 1 | GYTFSSW | SEQ ID N°10 |
| VH CDR 2 | FLPGSGST | SEQ ID N°11 | ||
| VH CDR 3 | ATDGNYDWFAY | SEQ ID N°12 | ||
| VL CDR 1 | QSLVHSSGVTY | SEQ ID N°13 | ||
| VL CDR 2 | KVS | SEQ ID N°14 | ||
| VL CDR 3 | SQSTHVPPT | SEQ ID N°15 |
表3
表4
通过使用包含对应于人前胃泌素的氨基酸序列55-80的氨基酸序列“QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN”(前胃泌素的C末端部分)的免疫原生成的单克隆抗体的实例包括但不限于命名为以下的抗体：下表5和6中的mAb8和mAb13。表位作图的实验结果显示mAb13的确特异性结合所述hPG C末端氨基酸序列中的表位。
表5
表6
| 杂交瘤保藏 | mAb | 氨基酸序列 | SEQ ID N° | |
| 2C6C3C7 | mAb13 | VH CDR 1 | GFIFSSYG | SEQ ID N°34 |
| VH CDR 2 | INTFGDRT | SEQ ID N°35 | ||
| VH CDR 3 | ARGTGTY | SEQ ID N°36 | ||
| VL CDR 1 | QSLLDSDGKTY | SEQ ID N°37 | ||
| VL CDR 2 | LVS | SEQ ID N°38 | ||
| VL CDR 3 | WQGTHFPQT | SEQ ID N°39 |
其他实例包括通过使用包含SEQ ID N°40的氨基酸序列的免疫原生成的抗hPG单克隆和/或多克隆抗体。
在一个更具体的实施方案中，在根据本发明的方法中，所述生物样品与至少一个抗hPG抗体或其抗原结合片段，优选地与一个抗hPG抗体或其抗原结合片段接触，其中所述抗hPG抗体在N末端抗hPG抗体和C末端抗hPG抗体中选择。
术语“N末端抗hPG抗体”和“C末端抗hPG抗体”分别指与包含位于hPG的N末端部分的氨基酸的表位，或与包含位于hPG的C末端部分的氨基酸的表位结合的抗体。优选地，术语“N末端抗hPG抗体”指与位于其序列由SEQ ID NO.2表示的前胃泌素的结构域中的表位结合的抗体。在另一个优选的实施方案中，术语“C末端抗hPG抗体”指与位于其序列由SEQ IDNO.3表示的前胃泌素的结构域中的表位结合的抗体。
术语“表位”是抗体结合的抗原区域。表位可能被定义为结构的或功能的。功能表位通常是结构表位的亚组，并且具有直接有助于相互作用的亲和力的这些氨基酸。表位还可能是构象的。在某些实施方案中，表位可以包括决定簇，即分子(诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基)的化学活性表面分组，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。可以通过由本领域技术人员已知的表位作图技术进行由抗体结合的表位的确定。表位可以包含连续(sequentially)位于蛋白质的氨基酸序列中的不同氨基酸。表位还可以包含未连续(sequentially)位于蛋白质的氨基酸序列中的氨基酸。
在本发明的方法的一个具体的实施方案中，所述抗体为选自下组的单克隆抗体：
·单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°4、5和6最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°7、8和9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°7、8和9最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链以下序列中的分别至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°10、11和12的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°10、11和12最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°13、14和15的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°13、14和15最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°16、17和18最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°19、20和21最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链以下序列中的包含至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°22、23和24的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°22、23和24最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°25、26和27的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°25、26和27最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°28、29和30的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°28、29和30最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°31、32和33的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°31、32和33最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°34、35和36的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°34、35和36最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个，优选至少两个，优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°37、38和39的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°37、38和39最佳对齐后具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，和
·单克隆抗体，其由2016年12月27日保藏在CNCM(Institut Pasteur,25-28ruedu Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France，保藏号I-5158)的杂交瘤产生。
如本文所使用的两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的“百分比同一性”或“％同一性”指最佳对齐后获得的待比较的两个序列之间的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比，该百分比完全是统计的，并且两个序列之间的差异是沿着它们的长度随机分配的。两个核酸或氨基酸序列的比较传统上通过在将它们对齐之后比较序列来进行，所述比较能够通过区段(segment)进行或通过使用“对齐窗口”进行。除了通过手工比较之外，还可以通过本领域技术人员已知的方法进行序列的最佳对齐以用于比较。
对于展示出与参考氨基酸序列至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的氨基酸序列，优选的实例包括含有参考序列，某些修饰，特别是至少一个氨基酸的缺失、添加或置换，截短或延伸的那些。在置换一个或多个连续或非连续的氨基酸的情况下，这样的置换是优选的：其中置换的氨基酸被“等效(equivalent)”氨基酸代替。这里，措辞“等效氨基酸”意指可以置换为一个结构性氨基酸而不修改相应抗体的生物活性的任何氨基酸以及下面记载的那些具体实例的任何氨基酸。
等效氨基酸可由它们与它们取代的氨基酸的结构相似性(homology)或由可能生成的多种抗体之间的生物活性的比较测试确定。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法中使用的抗体是人源化抗体。
如本文所使用的“人源化抗体”指含有源自非人源的抗体的CDR区的抗体，抗体分子的其他部分源自一种或几种人抗体。另外，如果需要保持结合亲和力，一些骨架区段残基(称为框架FR)可通过使用本领域技术人员公知的技术(Jones et al.,Nature,321:522-525,1986)来修饰。人源化的目的是减小用于将异种抗体(诸如鼠抗体)的免疫原性用于引入到人中，同时保持抗体的整个抗原结合亲和力和特异性。
可使用多种技术对抗体进行人源化，所述技术包括CDR-移植(EP 0 239 400；WO91/09967；美国专利号5,530,101；和5,585,089)，veneering or resurfacing(EP 0 592106；EP 0 519 596；Padlan E.A.,1991,Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka G.M.et al.,1994,Protein Engineering 7(6):805-814；Roguska M.A.etal.,1994,Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.,91:969-973)，和链调换(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)。人抗体可通过本领域中已知的多种方法包括噬菌体展示方法制成。还参见美国专利号4,444,887、4,716,111、5,545,806和5,814,318；和国际专利申请公开号WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741。
在一个更具体的实施方案中，本发明的方法中使用的抗体是选自下组的人源化抗体：
·人源化抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°4、5和6最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°7、8和9CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°7、8和9最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·人源化抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°10、11和12的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°10、11和12最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链分别以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：SEQID N°13、14和15的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°13、14和15最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·人源化抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°16、17和18最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°19、20和21最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·人源化抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°22、23和24的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°22、23和24最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°25、26和27的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°25、26和27最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
·人源化抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°28、29和30的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°28、29和30最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°31、32和33的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°31、32和33最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，和
·人源化抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°34、35和36的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，或在分别与序列SEQ ID N°34、35和36最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°37、38和39的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，或在分别与序列SEQ ID N°37、38和39最佳对齐后，具有至少80％，优选85％、90％、95％和98％同一性的序列，
其中，所述抗体还包含源自人抗体的轻链和重链的恒定区。
在第一个实施方案中，根据本发明的方法包括使生物样品与至少一种结合hPG的表位的抗hPG抗体，优选一种结合hPG的表位的抗hPG抗体接触，其中所述表位位于hPG的C末端部分。或者，根据本发明的方法包括使生物样品与至少一种结合hPG的表位的抗hPG抗体，优选一种结合hPG的表位的抗hPG抗体接触，其中所述表位位于hPG的N末端部分。
在一个更具体的实施方案中，根据本发明的方法包括使生物样品与至少一种结合hPG的表位的抗hPG抗体，优选一种结合hPG的表位的抗hPG抗体接触，其中所述表位包括对应于前胃泌素的N末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列，所述对应于前胃泌素的N末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列从对应于hPG的第10至14位氨基酸、hPG的第9至14位氨基酸、hPG的第4至10位氨基酸、hPG的第2至10位氨基酸和hPG的第2至14位氨基酸的氨基酸序列中选择，其中所述hPG的氨基酸序列为SEQ ID N°1。
在一个更具体的实施方案中，根据本发明的方法包括使生物样品与至少一种结合hPG的表位的抗hPG抗体，优选一种结合hPG的表位的抗hPG抗体接触，其中所述表位包括对应于前胃泌素的C末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列，所述对应于前胃泌素的C末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列从对应于hPG的第71至74位氨基酸、hPG的第69至73位氨基酸、hPG的第71至80位氨基酸、hPG的第76至80位氨基酸和hPG的第67至74位氨基酸的氨基酸序列中选择，其中所述hPG的氨基酸序列为SEQ ID N°1。
在本发明的方法的一个具体的实施方案中，所述方法包含使来自受试者的生物样品与结合前胃泌素的第一部分的第一剂并且与结合前胃泌素的第二部分的第二剂接触的步骤。在一个更具体的实施方案中，其中所述前胃泌素结合分子为抗体，来自受试者的生物样品与结合前胃泌素的第一表位的抗体并且与结合前胃泌素的第二表位的抗体接触。
根据一个优选的实施方案，所述第一抗体与不溶性或部分可溶性载体结合。通过所述第一抗体结合前胃泌素导致从所述生物样品中捕获前胃泌素。优选地，所述第一抗体为结合hPG的表位的抗体，其中所述表位包括如上所述的对应于前胃泌素的C末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列。更优选地，所述第一抗体是在WO 2011/083088中描述的由杂交瘤2H9F4B7产生的单克隆抗体Mab14。杂交瘤2H9F4B7在布达佩斯条约下于2016年12月27日保藏在CNCM(Institut Pasteur,25-28rue du Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France)，保藏号为I-5158。
根据另一个优选的实施方案，所述第二抗体用可检测的部分标记，如下所述。通过第二抗体结合前胃泌素使得能够检测存在于生物样品中的前胃泌素分子。此外，通过第二抗体结合前胃泌素使得能够对存在于生物样品中的前胃泌素分子进行定量。优选地，所述第二抗体是结合hPG的表位的抗体，其中所述表位包括如上所述的对应于前胃泌素的N末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列。更优选地，所述N末端抗体为如上所述的多克隆抗体。或者，还可以使用结合前胃泌素的N末端内的表位的单克隆抗体，诸如例如上述N末端单克隆抗体，特别是包含重链和轻链的单克隆抗体，所述重链包含氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含氨基酸序列为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在一个特别优选的实施方案中，第一抗体与不溶性或部分可溶性载体结合，并且第二抗体用可检测的部分标记。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法包括确定来自以前从未被诊断患有癌症的人受试者的生物样品中前胃泌素的浓度。
在另一个具体的实施方案中，本发明的方法包括确定来自以前从未被诊断患有癌症的人受试者的生物样品中前胃泌素的浓度，其中，所述生物样品选自血液、血清和血浆。
在一个更具体的实施方案中，本发明的方法包括使来自所述受试者的血浆样品与至少一种抗hPG抗体，特别是与一种抗hPG抗体接触，并确定所述样品中前胃泌素的浓度，其中，所述血浆中前胃泌素的浓度高于10pM指示所述受试者有患癌症的风险。换言之，所述血浆中前胃泌素的浓度高于10pM指示所述受试者中的不良预后。
还更优选地，本发明的方法包括使来自所述受试者的血浆样品与至少一种抗hPG抗体，特别是与一种抗hPG抗体接触，并且确定所述样品中前胃泌素的浓度，其中，所述血浆样品中的前胃泌素的浓度高于10pM，优选高于20pM，更优选高于30pM，还更优选高于40pM，甚至更优选高于50pM指示所述受试者有患癌症的风险。
在另一方面，本发明涉及治疗从未被诊断为癌症的患者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过任何上文所述的方法评价所述患者患癌症的风险；和
b)如果存在根据a)的风险，则治疗所述癌症。
本发明的方法是特别有利的，因为其允许在非常早期阶段鉴定癌症。本领域中已知，越早鉴定癌症，缓解的机会越高。另外，患者可用不太具有攻击性的抗癌药物治疗，因此，在保持治疗功效的同时减少副作用的机会。
在一个具体的实施方案中，根据本发明的方法包括将从患者获得的生物样品中的前胃泌素的浓度与样品中的前胃泌素的浓度的预定值进行比较，在一个更具体的实施方案中，所述预定值选自：平均值，或平均值，其基于该平均值的样本值，或平均值，其确定无癌症人群中的值，当患者已知无癌症时获得的前胃泌素浓度值。
在又另一方面，本发明还提供了在上述方法中使用的组合物。根据本发明的这方面，所述组合物用于评价以前从未被诊断患有癌症的受试者中癌症发生的风险，其中，所述组合物包含至少一种前胃泌素结合抗体或其抗原结合片段。
在第一个实施方案中，根据本发明的组合物包含识别表位的抗体，所述表位包含对应于前胃泌素的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个更具体的实施方案中，根据本发明的组合物包含识别前胃泌素的表位的抗体，其中所述表位包含对应于前胃泌素的N末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可包含hPG的第10至14位残基、hPG的第9至14位残基、hPG的第4至10位残基、hPG的第2至10位残基或hPG的第2至14位残基，其中所述hPG的氨基酸序列为SEQ ID N°1。
在一个更具体的实施方案中，根据本发明的组合物包含识别前胃泌素的表位的抗体，其中所述表位包含对应于前胃泌素的C末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可包含hPG的第71至74位残基、hPG的第69至73位残基、hPG的第71至80位残基(SEQ ID N°40)、hPG的第76至80位残基或hPG的第67至74位残基，其中所述hPG的氨基酸序列为SEQ ID N°1。
在又另一方面，本发明提供了用于上述方法的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的任何抗体。包含预定量的试剂与用于进行上述方法的说明的组合的包装材料，例如试剂盒，也在本发明的范围内。优选地，所述试剂盒包含至少一种本发明的抗体，更优选两种。
例如，在第一个实施方案中，所述试剂盒包含结合不溶性或部分可溶性载体的第一抗体。优选地，所述第一抗体是结合hPG的表位的抗体，其中所述表位包含对应于前胃泌素的C末端部分内的氨基酸序列的氨基酸序列，如上所述。更优选地，所述第一抗体是在WO2011/083088中描述的由杂交瘤2H9F4B7产生的单克隆抗体Mab14。杂交瘤2H9F4B7在布达佩斯条约下于2016年12月27日保藏在CNCM(Institut Pasteur,25-28rue du Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France),保藏号为I-5158。在另一个实施方案中，提供用可检测的部分标记的如本文详述的多克隆或单克隆抗体，或它们的抗原结合片段或衍生物，使得它们可以被包装并使用(例如在试剂盒中)，以在分泌或结合至前胃泌素的受体前鉴定具有前述抗原的细胞。这样的标签的非限制性实例包括荧光团诸如异硫氰酸荧光素；发色团，放射性核素，生物素或酶。这样标记的抗体或结合片段可用于抗原的组织学定位、ELISA、细胞分选，以及用于检测或定量前胃泌素和例如荷载该抗原的细胞的其他免疫技术。优选地，所述标记的抗体是结合hPG的表位的抗体，其中所述表位包含对应于前胃泌素的N末端部分的氨基酸序列的氨基酸序列，如上所述。更优选地，所述N末端抗体为多克隆抗体，如上所述。或者，还可以使用结合与前胃泌素的N末端内的表位的单克隆抗体，诸如例如上文所述的N末端单克隆抗体，特别是包含重链和轻链的单克隆抗体，所述重链包含氨基酸序列分别为SEQID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述轻链包含氨基酸序列为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
因此在一个最优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含：
-第一抗前胃泌素抗体，其中所述抗体是其中所述第一抗前胃泌素抗体是由杂交瘤产生单克隆抗体，所述杂交瘤于2016年12月27日保藏在CNCM(Institut Pasteur,25-28rue du Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France)，保藏号为I-5158；和
-第二抗前胃泌素抗体，其中所述第二抗前胃泌素抗体是结合前胃泌素的N末端内的表位的多克隆抗体，或包含重链和轻链的单克隆抗体，所述重链包含氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的以下三个CDR，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述轻链分别包含氨基酸序列为SEQ ID N°19、20和21的以下三个CDR，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
本发明包括试剂盒，其中抗体或其抗原结合片段或衍生物被标记。
试剂可以作为包含赋形剂的干燥粉末通常是冻干粉末提供，溶解时会提供具有适当浓度的试剂溶液。
试剂盒含有用于在体外例如在ELISA或蛋白质印迹中检测和定量前胃泌素的抗体。本发明的抗体可在用于在体外例如在ELISA或蛋白质印迹中检测和定量前胃泌素的试剂盒中提供。当抗体用酶标记时，试剂盒会包含酶需要的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其他添加剂，诸如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。这样的试剂盒可包含被划分成容纳一个或多个容器诸如小瓶、小管等的大容器，这样的容器容纳本发明的单独的元素(element)。例如，一个容器可含有结合不溶性或部分可溶性载体的第一抗体。第二个容器可含有冻干形式或在溶液中的可溶性的可检测地标记的第二抗体。所述大容器还可以含有第三个容器，所述第三个容器容纳冻干形式的或在溶液中的可检测地标记的第三抗体。具有该性质的试剂盒可用于本发明的夹心测定。标签或包装的添加可提供组合物的描述以及对于预期的体外或诊断用途的说明。
还提供试剂盒用作阳性对照用于从细胞中纯化或免疫沉淀前胃泌素。对于前胃泌素的分离和纯化，试剂盒可含有与珠粒(例如琼脂糖珠粒)连接的本文所述的抗体，或其抗原结合片段或衍生物。可提供试剂盒，其含有用于在体外或离体例如在ELISA或蛋白质印迹中检测和纯化前胃泌素的抗体。试剂盒包含容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装添加物。容器容纳包含本发明的至少一种抗体或其结合片段或衍生物的组合物。可包括含有例如稀释剂和缓冲液、对照抗体的另外的容器。标签或包装添加物可提供组合物的描述以及对于预期的体外或诊断用途的说明。
本发明还涉及产品/计算机程序，其含有一组执行本发明的方法的指令特征。
本发明还涉及包括运算部件和输入界面的操作系统，其特征在于所述系统包括用于执行如本文所公开的用于确定患癌症的风险的方法的工具。
参考图13，根据本发明的一个具体实施方案的装置(1)包括能够遵循计算机指令并处理数据的运算部件(10)。一个这样的运算部件优选包括可以是现有技术中已知的任何类型的微处理器(110)。运算部件(10)还具有存储部件(100)，所述存储部件能够接收包括一组执行所述方法的指令特征的计算机程序，并且能够储存数据。
装置(1)还包括与运算部件(10)连接的输入界面(12)，其使设备(1)的操作员(O)能够输入待处理的数据。一个这样的输入界面(12)包括能够使去往运算部件(10)的这类数据输入的任何元件，诸如任选地与指向装置元件相关联的键盘元件。
优选地，运算部件还包括输出界面(14)诸如屏幕，其在一方面使用户能够验证输入的数据的完整性，而另一方面使运算部件(10)能够与操作者(O)互动。
装置(1)可整合在单一系统诸如计算机、智能电话或能够执行本发明的方法的现有技术中已知的任何其他系统中。操作者(O)可以是任何技术水平，因此可以具有行医资格也可以不具有行医资格。
根据本发明的一个具体实施方案，尤其可以设想的是，由操作者(O)输入的数据优选以安全的方式经由网络(例如因特网)发送到包含运算部件的远程服务器，所述运算部件能够实施本发明的方法，并因此能够处理由服务器接收的数据。任选地，在所述处理之后，服务器经由相同的网络或另一个网络将分析结果返回给用户。任选地，服务器在记录工具上记录数据和/或分析结果。显然，可以设想保证捐献者和接受者的生理/临床特征的匿名性的工具。
因此，一个这样的装置(1)能够实施本发明的方法，即，它能够实施以下步骤：
-使用输入界面(12)将生理/临床特征输入到运算部件(10)中(步骤22)，所述特征包括样品中前胃泌素的水平(10)(步骤23)，
-任选地通过运算部件(10)经由数据处理来标准化所述前胃泌素水平(步骤24)，和
-分析所述风险评分以确定患癌症的风险(步骤25)。
因此，本发明的方法不但可以由临床或医院人员实施而且还可以由参与临床研究的所有人员(制药业、科学家、医生等)或甚至由普通大众实施。
下面的例子仅仅是本发明范围和本公开内容的示例。本领域技术人员可在不脱离本发明的范围的情况下对以下所列的实施例设计和构建许多修改。
附图说明
图1：结肠直肠癌的受试者工作特征(ROC)曲线(上图)以及ROC曲线下的面积和统计学分析(下图)。
图2：使用N末端多克隆抗体和C末端多克隆抗体的组合的结肠直肠癌患者(n＝148)中和对照患者(n＝103)中前胃泌素的中位值血浆浓度-双尾的曼-惠特尼检验，***p<0.0001。
图3：肝细胞癌的受试者工作特征(ROC)曲线(上图)以及ROC曲线下的面积和统计学分析(下图)。
图4：使用N末端多克隆抗体和C末端多克隆抗体的组合的肝细胞癌患者(n＝47)中和对照患者(n＝103)中前胃泌素的中位值血浆浓度-双尾的曼-惠特尼检验，***p<0.0001
图5：食道癌的受试者工作特征(ROC)曲线(上图)以及ROC曲线下的面积和统计学分析(下图)。
图6：使用N末端多克隆抗体和C末端多克隆抗体的组合的食道癌患者(n＝12)中和对照患者(n＝103)中前胃泌素的中位值血浆浓度-双尾的曼-惠特尼检验，***p<0.0001
图7：胃癌的受试者工作特征(ROC)曲线(上图)以及ROC曲线下的面积和统计学分析(下图)。
图8：使用N-末端多克隆抗体和C-末端多克隆抗体的组合的胃癌患者(n＝15)中和对照患者(n＝103)中前胃泌素的中位值血浆浓度-双尾的曼-惠特尼检验，**p<0.001
图9：胰腺癌的受试者工作特征(ROC)曲线(上图)以及ROC曲线下的面积和统计学分析(下图)。
图10：使用N末端多克隆抗体和C末端多克隆抗体的组合的胰腺癌患者(n＝44)中和对照患者(n＝103)中的前胃泌素的中位值血浆浓度-双尾的曼-惠特尼检验，***p<0.0001
图11：卵巢癌的受试者工作特征(ROC)曲线(上图)以及ROC曲线下面积和统计学分析(下图)。
图12：使用N末端多克隆抗体和C末端多克隆抗体的组合的卵巢癌患者(n＝8)中和对照患者(n＝103)中前胃泌素的中位值血浆浓度。
图13：根据本发明的一个具体实施方案的处理系统的示意图。
图14：表示根据本发明的一个具体实施方案的方法的功能图。
图15：使用多克隆抗体和单克隆抗体的组合的多种癌症类型患者(n＝231)中和对照患者(n＝322)中前胃泌素的中位值血浆浓度。
图16：使用多克隆抗体和单克隆抗体的组合(mAb-pAb)或单克隆抗体的组合(mAb-mAb)的多种癌症类型患者(n＝10)中的前胃泌素的中位值血浆浓度-双尾的曼-惠特尼检验，NS p>0.05。
实施例
实施例1：使用多克隆抗体检测血浆前胃泌素浓度
血浆前胃泌素水平通过使用两个特异性抗前胃泌素抗体由ELISA定量：捕获抗体被包被在平板的孔上，而披露抗体(revelation antibody)用来检测前胃泌素并且介导信号的披露。
在本实施例中，定量基于ELISA方法，其允许通过使用其反应发光的底物来分配值，该值与结合由捕获抗体保持的抗原的抗体的发光量成比例。
材料
试剂和仪器列于表7：
表7
根据标准方案，通过用N末端前胃泌素(SEQ ID N°2)或用对应于hPG的第71至80位氨基酸并具有序列FGRRSAEDEN(SEQ ID N°40)的C末端前胃泌素免疫兔子，来获得多克隆抗体。
本测定中使用的抗前胃泌素的多克隆抗体的结合特征如下：不结合G34-Gly、G34、G17-Gly、G17，结合全长前胃泌素。
通过将一个胶囊的内容物溶解于100ml的MilliQ水中，通过制备50mM pH 9.6的碳酸盐-碳酸氢钠的溶液来包被96孔板。在碳酸盐缓冲液中制备捕获抗体(3μg/ml)的溶液，所述抗体对应于通过使用前胃泌素的C末端FGRRSAEDEN(SEQ ID N°40)获得的多克隆抗体。将100微升的抗体溶液添加至各孔并在4℃孵育16小时(一夜)。然后通过去除抗体溶液并用300μl 1X PBS/0.1％Tween-20洗涤3次，然后每个孔添加200μl的封闭缓冲液(1X PBS/0.1％Tween-20/0.1％BSA)，并在22℃孵育2小时，来封闭平板。然后去除封闭缓冲液，用300μl 1X PBS/0.1％Tween-20洗涤孔3次。
血浆稀释如下进行：使用纯的、稀释1/2、1/5和1/10的血浆。在1X PBS/0.1％Tween20/0.1％BSA中从纯的血浆制备稀释液。
对于对照测试，在已知浓度的前胃泌素的存在下的ELISA，如下制备前胃泌素稀释液：以0.45mg/ml(45microM)的浓度制备储存重组PG(在大肠杆菌中产生并用谷胱甘肽琼脂糖/标签去除(Tev)/IMAC Counter纯化/透析亲和纯化的全长人前胃泌素，来自法国巴黎巴斯德研究所(Institut Pasteur,Paris,France))，一式三份。如下制备前胃泌素浓度的范围：
·溶液A：预稀释1/10，2μl的储存液+18μl的缓冲液
·溶液B：预稀释1/100，10μl的A+90μl的缓冲液
·溶液C：预稀释1/1000，10μl的B+90μl的缓冲液
·溶液D：500pM,5,55μl的C+494.5μl的稀释剂
·溶液E：250pM,250μl的D+250μl的稀释剂
·溶液F：100pM,200μl的E+300μl的稀释剂
·溶液G：50pM,250μl的F+250μl的稀释剂
·溶液H：25pM,200μl的G+200μl的稀释剂
·溶液I：10pM,100μl的H+150μl的稀释剂
重组PG的范围是线性的并且因此根据使用的抗体可以大致上是宽范围的。
对于测试样品的制备，留出约500μl的每个样品并储存直到分析(并且确认，如果需要的话)结果。测定100μl的范围中的每一点和/或血浆(纯的、稀释至1/2、1/5和1/10的)，并在22℃在平板上孵育2小时。
对于测试的披露，将平板用300μl 1X PBS/0.1％Tween-20洗涤3次。通过在1XPBS/0.1％Tween-20/0.1％BSA中稀释来制备0.5μg/ml的与生物素结合的多克隆兔抗前胃泌素抗体的溶液，其中所述抗体已经通过使用前胃泌素的N-末端部分作为免疫原而获得。将100μl的该溶液添加至各孔。孵育在22℃进行1小时。使用链霉亲和素-HRP的披露通过以下步骤进行：去除检测抗体，并且用300μl 1X PBS/0.1％Tween-20洗涤3次，然后制备在1XPBS/0.1％Tween-20/0.1％BSA中稀释的20ng/ml的链霉亲和素-HRP的溶液，其中将100加100μl的该溶液添加至各孔，然后在22℃孵育1小时。
检测由以下步骤组成：去除链霉亲和素-HRP，并且用300μl 1X PBS/0.1％Tween-20洗涤3次，然后每孔添加100μl的化学发光底物溶液。在使用前30分钟，通过混合等体积的两种溶液SuperSignal ELISA Femto试剂盒，20ml+20ml，来制备底物溶液，并在黑暗中保存在室温下。在黑暗中在室温下孵育5分钟后读取发光。
对于每种条件，一式三份进行测试，并且该范围的结果会被作为图表呈现，该图表显示出取决于前胃泌素浓度的发光变化。对于每种血浆稀释液，使用相应范围(稀释到1/10的样品的范围为1/10)的线性回归线的方程，来确定前胃泌素的浓度。
方法和结果
在来自已知后来已经患癌症的受试者的血浆样品中确定前胃泌素水平。使用对C末端具有特异性的多克隆抗体捕获前胃泌素。使用对N末端具有特异性的标记的多克隆抗体来进行检测。
重要地，在样品收集时，这些受试者从未被诊断患有癌症，并且没有显示出与癌症有关的任何症状。由来自一般人群的血浆样品构成对照。
结果在图1-12中显示。前胃泌素的中位值血浆浓度在以后患结肠直肠癌的患者中为17pM(n＝148)，在患肝细胞癌的患者中为100pM(n＝47)，在患食道癌的患者中为42.3pM(n＝12)，在患胃癌的患者中为17.90pM(n＝15)，在患胰腺癌的患者中为16.6pM(n＝44)，并且在患卵巢癌的患者中为8.45(n＝8)。相比之下，前胃泌素的中位值血浆浓度在对照受试者中为0pM(n＝103)。
这些数据证明了会患癌症的患者在他们的血浆中具有可检测水平的前胃泌素，而健康对照个体没有。甚至在可以诊断任何癌症之前，就可以检测到前胃泌素，这使得前胃泌素成为有用的癌症发病的生物标志物。ROC分析证实了前胃泌素用于各种以上所列的癌症的预测性质。
这些数据证明，具有患癌症的风险的患者在他们的血浆中具有比健康对照个体更高的前胃泌素的浓度。
实施例2：使用多克隆抗体和单克隆抗体的组合检测血浆前胃泌素浓度
在本实施例中，血浆前胃泌素水平通过ELISA通过使用预包被在96孔板上的对人前胃泌素(hPG)具有特异性的抗体来定量。将标准物和样品添加至各孔，并且存在的任何hPG与固定的捕获抗体结合。洗涤孔，并添加抗hPG检测抗体辣根过氧化物酶(HRP)缀合物，产生抗体-抗原-抗体“夹心”。在第二次洗涤后，添加TMB底物溶液，其产生与初始样品中存在的hPG的量成正比的蓝色。终止溶液将颜色从蓝色改变至黄色，并且用酶标仪在450nm读取孔。
根据标准方案，通过用N末端前胃泌素(SEQ ID N°2)或用对应于hPG的第71-80位氨基酸并具有序列FGRRSAEDEN(SEQ ID N°40)的C末端前胃泌素免疫兔子，来获得多克隆抗体。
根据标准方案，通过使用产生针对N末端前胃泌素(SEQ ID N°2)或针对对应于hPG的第71-80位氨基酸并具有序列FGRRSAEDEN的C末端前胃泌素(SEQ ID N°40)的抗体的杂交瘤，来获得单克隆抗体。
在本测定中使用的针对前胃泌素的多克隆抗体和单克隆抗体的结合特性如下：不存在结合G34-Gly、G34、G17-Gly、G17，结合全长前胃泌素。
对于对照测试，在已知浓度的前胃泌素的存在下的ELISA，如下制备前胃泌素稀释液：以0.45mg/ml(45microM)的浓度制备储存重组PG(在大肠杆菌中产生并用谷胱甘肽琼脂糖/标签去除(Tev)/IMAC Counter纯化/透析亲和纯化的全长人前胃泌素，来自法国巴黎巴斯德研究所(Institut Pasteur,Paris,France))，一式三份。如下制备前胃泌素浓度的范围：
·溶液A：预稀释1/10，2μl的储存液+18μl的缓冲液
·溶液B：预稀释1/100，10μl的A+90μl的缓冲液
·溶液C：预稀释1/1000，10μl的B+90μl的缓冲液
·溶液D：500pM,5,55μl的C+494.5μl的稀释剂
·溶液E：250pM,250μl的D+250μl的稀释剂
·溶液F：100pM,200μl的E+300μl的稀释剂
·溶液G：50pM,250μl的F+250μl的稀释剂
·溶液H：25pM,200μl的G+200μl的稀释剂
·溶液I：10pM,100μl的H+150μl的稀释剂
重组PG的范围是线性的，并且因此根据使用的抗体可以大致上是宽范围的。
方法和结果
在来自已知后来已经患癌症的受试者的血浆样品中确定前胃泌素水平。使用WO2011/083088中所述的杂交瘤2H9F4B7产生的C末端单克隆抗体mAb14捕获前胃泌素(杂交瘤2H9F4B7在布达佩斯条约下于2016年12月27日保藏在CNCM(Institut Pasteur,25-28ruedu Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France)，保藏号为I-5158)。使用对N末端具有特异性的标记的多克隆抗体来进行检测。
重要地，在样品收集时，这些受试者从未被诊断患有癌症，并且没有显示出与癌症有关的任何症状。由来自一般人群的血浆样品构成对照。
结果在图15中显示。前胃泌素的中位值血浆浓度在取决于癌症的类型的患者中位于2.750pM与21.5pM之间(n＝231)。相比之下，前胃泌素的中位值血浆浓度在对照受试者中为0pM(n＝322)。
这些数据证明了会患癌症的患者在他们的血浆中具有可检测水平的前胃泌素，而健康对照个体没有。甚至在可以诊断任何癌症之前，就可以检测到前胃泌素，这使得前胃泌素成为有用的癌症发病的生物标志物。
这些数据证明了具有患癌症风险的患者在他们的血浆中具有比健康对照个体更高浓度的前胃泌素。
实施例3：使用单克隆抗体的组合检测血浆前胃泌素浓度
在本实施例中，通过ELISA通过使用预包被在96孔板上的对人前胃泌素(hPG)具有特异性的抗体来定量血浆前胃泌素水平。将标准物和样品添加至各孔，并且存在的任何hPG与固定的捕获抗体结合。洗涤孔，并添加抗hPG检测抗体辣根过氧化物酶(HRP)缀合物，产生抗体-抗原-抗体“夹心”。在第二次洗涤后，添加TMB底物溶液，其产生与初始样品中存在的hPG的量成正比的蓝色。终止溶液将颜色从蓝色改变至黄色，并且用酶标仪在450nm读取孔。
根据标准方案，通过用N末端前胃泌素(SEQ ID N°2)或用对应于hPG的第71-80位氨基酸并具有序列FGRRSAEDEN(SEQ ID N°40)的C末端前胃泌素免疫兔子，来获得多克隆抗体。
根据标准方案，通过使用产生针对N末端前胃泌素(SEQ ID N°2)或针对对应于hPG的第71-80位氨基酸并具有序列FGRRSAEDEN的C末端前胃泌素(SEQ ID N°40)的抗体的杂交瘤，来获得单克隆抗体。
在本测定中使用的针对前胃泌素的多克隆抗体和单克隆抗体的结合特性如下：不存在结合G34-Gly、G34、G17-Gly、G17，结合全长前胃泌素。
对于对照测试，在已知浓度的前胃泌素的存在下的ELISA，如下制备前胃泌素稀释液：以0.45mg/ml(45microM)的浓度制备储存重组PG(在大肠杆菌中产生并用谷胱甘肽琼脂糖/标签去除(Tev)/IMAC Counter纯化/透析亲和纯化的全长人前胃泌素，来自法国巴黎巴斯德研究所(Institut Pasteur,Paris,France))，一式三份。如下制备前胃泌素浓度的范围：
·溶液A：预稀释1/10，2μl的储存液+18μl的缓冲液
·溶液B：预稀释1/100，10μl的A+90μl的缓冲液
·溶液C：预稀释1/1000，10μl的B+90μl的缓冲液
·溶液D：500pM,5,55μl的C+494.5μl的稀释剂
·溶液E：250pM,250μl的D+250μl的稀释剂
·溶液F：100pM,200μl的E+300μl的稀释剂
·溶液G：50pM,250μl的F+250μl的稀释剂
·溶液H：25pM,200μl的G+200μl的稀释剂
·溶液I：10pM,100μl的H+150μl的稀释剂
重组PG的范围是线性的，并且因此根据使用的抗体可以大致上是宽范围的。
方法和结果
在来自已知后来已经患癌症的受试者的血浆样品中确定前胃泌素水平。使用WO2011/083088中所述的杂交瘤2H9F4B7产生的C末端单克隆抗体mAb 14捕获前胃泌素(杂交瘤2H9F4B7在布达佩斯条约下于2016年12月27日保藏在CNCM(Institut Pasteur,25-28ruedu Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France)，保藏号为I-5158)。使用对N末端具有特异性的标记的单克隆抗体mAb 16来进行检测。
重要地，在样品收集时，这些受试者从未被诊断患有癌症，并且没有显示出与癌症有关的任何症状。由来自一般人群的血浆样品构成对照。
结果在图16中显示。使用mAb-pAb和mAb-mAb的前胃泌素的中位值血浆浓度的中位值(分别为8.2pM与6.6pM)和平均值(18.99pM与16.79pM)分别类似(n＝10)。
这些数据证明了mAb-pAb和mAb-mAb ELISA夹心法测试检测患者的血浆中的前胃泌素。重要地，可以鉴定两个测试之间没有显著差异。特别是，mAb-pAb和mAb-mAb夹心法的灵敏性高度相似。因此，甚至在可以诊断任何癌症之前，mAb-mAb ELISA夹心法就可以可靠地用于检测患者的血浆中的前胃泌素，这使得前胃泌素成为有用的癌症发病的生物标志物。
这些数据证明了具有患癌症风险的患者在他们的血浆中具有比健康对照个体更高浓度的前胃泌素。综上所述，本发明包括但不限于以下各项：
1.一种用于评价以前没有被诊断患有癌症的受试者中癌症发生的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的样品中的前胃泌素的水平；
b)基于步骤a)的水平，确定所述受试者会患癌症的风险。
2.项1的方法，其中，所述步骤a)的确定包括使所述样品与至少一种前胃泌素结合分子接触，并测量所述前胃泌素结合分子与前胃泌素的结合。
3.项2的方法，其中，所述与前胃泌素结合的剂为抗前胃泌素抗体，或其抗原结合片段。
4.项3的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
5.项3或4中任一项的方法，其中所述抗体选自N-末端抗前胃泌素抗体和C-末端抗前胃泌素抗体。
6.项3至5的方法，其中所述抗体为选自下组的单克隆抗体：
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°7、8和9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°10、11和12的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ IDN°13、14和15的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ IDN°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°22、23和24的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ IDN°25、26和27的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°28、29和30的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ IDN°31、32和33的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°34、35和36的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ IDN°37、38和39的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和
-单克隆抗体，其由2016年12月27日保藏在CNCM，Institut Pasteur,25-28rue duDocteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France，保藏号为I-5158的杂交瘤产生。
7.项1至6中任一项的方法，其中所述步骤a)的确定包括：
(i)使所述样品与结合前胃泌素的第一部分的第一前胃泌素结合分子接触，和
(ii)使所述样品与结合前胃泌素的第二部分的第二前胃泌素结合分子接触。
8.项7的方法，其中所述第一前胃泌素结合分子结合前胃泌素的C-末端内的表位。
9.项7或8中任一项的方法，其中所述前胃泌素结合分子是由2016年12月27日保藏在CNCM，Institut Pasteur,25-28rue du Docteur Roux,75724Paris CEDEX 15,France，保藏号为I-5158的杂交瘤产生的单克隆抗体。
10.项7至9中任一项的方法，其中所述第二前胃泌素结合分子结合前胃泌素的N-末端内的表位。
11.项7至10中任一项的方法，其中所述第二前胃泌素结合分子是结合前胃泌素的N-末端内的表位的多克隆抗体，或包含重链和轻链的单克隆抗体，所述重链包含以下三个CDR：氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下三个CDR：氨基酸序列分别为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
12.项1至11中任一项的方法，其中在步骤a)中使用ELISA确定所述前胃泌素的水平。
13.项1至12中任一项的方法，其中生物样品选自血液、血清和血浆。
14.一种试剂盒，所述试剂盒包含如项2至6中任一项所述的至少一种抗前胃泌素抗体，用于评价以前没有被诊断患有癌症的受试者中患癌症的风险。
15.项14的试剂盒，其包含：
-第一抗前胃泌素抗体，其中，所述抗体是其中所述第一抗前胃泌素抗体是由2016年12月27日保藏在CNCM，Institut Pasteur,25-28rue du Docteur Roux,75724ParisCEDEX 15,France，保藏号为I-5158的杂交瘤产生的单克隆抗体；和
-第二抗前胃泌素抗体，其中，所述第二抗前胃泌素抗体是结合前胃泌素的N-末端的多克隆抗体或包含重链和轻链的单克隆抗体，所述重链包含以下三个CDR：氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下三个CDR：氨基酸序列分别为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
16.一种产品/计算机程序，其含有一组执行项1至14中任一项的方法的指令特征。
17.一种处理系统，其包括运算部件和输入界面，所述系统包括用于执行项1至14中任一项的方法的工具。
序列表
<110> SYNCERUS有限责任公司
<120> 用于评估癌症发生的风险的组合物和方法
<130> D35884
<140> PCT EP2017/050034
<141> 2017-01-02
<150> EP15307190.7
<151> 2015-12-31
<150> EP16305133.7
<151> 2016-02-05
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 80
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(80)
<223> 人前胃泌素
<400> 1
Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ala Asn Arg Asp Leu Glu Leu Pro Trp Leu Glu Gln Gln Gly Pro Ala
20 25 30
Ser His His Arg Arg Gln Leu Gly Pro Gln Gly Pro Pro His Leu Val
35 40 45
Ala Asp Pro Ser Lys Lys Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu
50 55 60
Ala Tyr Gly Trp Met Asp Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn
65 70 75 80
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第1-14位氨基酸, 人前胃泌素的N-末端
<400> 2
Ser Trp Lys Pro Arg Ser Gln Gln Pro Asp Ala Pro Leu Gly
1 5 10
<210> 3
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 第55-80位氨基酸, 人前胃泌素的C-末端
<400> 3
Gln Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Tyr Gly Trp Met Asp
1 5 10 15
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20 25
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<213> 人工的
<220>
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1 5
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<213> 人工的
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Thr Arg Arg Asp Ser Pro Gln Tyr
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<213> 人工的
<220>
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<213> 人工的
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<220>
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<213> 人工的
<220>
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Phe Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 20D2C3G2 CDR-H3
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Ala Thr Asp Gly Asn Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr
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<211> 11
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<213> 人工的
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<223> 20D2C3G2 CDR-L1
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<213> 人工的
<220>
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<213> 人工的
<220>
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<213> 人工的
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Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1E9D9B6 CDR-H3
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Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Tyr
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1E9D9B6 CDR-L1
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Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
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<213> 人工的
<220>
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1E9D9B6 CDR-L3
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<211> 9
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<213> 人工的
<220>
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Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Ala
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<213> 人工的
<220>
<223> 1B3B4F11 CDR-H2
<400> 23
Ile Ser Phe Ser Gly Tyr Thr
1 5
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1B3B4F11 CDR-H3
<400> 24
Ala Arg Glu Val Asn Tyr Gly Asp Ser Tyr His Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1B3B4F11 CDR-L1
<400> 25
Ser Gln His Arg Thr Tyr Thr
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1B3B4F11 CDR-L2
<400> 26
Val Lys Lys Asp Gly Ser His
1 5
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1B3B4F11 CDR-L3
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Gly Val Gly Asp Ala Ile Lys Gly Gln Ser Val Phe Val
1 5 10
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1C10D3B9 CDR-H1
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr Ala
1 5
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 1C10D3B9 CDR-H2
<400> 29
Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr
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<220>
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Lys Ser Leu Arg His Thr Lys Gly Ile Thr Phe
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Gln Met Ser
1
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Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr Gly
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<220>
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<220>
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Ala Arg Gly Thr Gly Thr Tyr
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<220>
<223> 前胃泌素的第71-80位氨基酸
<400> 40
Phe Gly Arg Arg Ser Ala Glu Asp Glu Asn
1 5 10
Claims (10)
1.一种用于评价以前没有被诊断患有癌症的受试者中癌症发生的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的样品中的前胃泌素的水平；
b)基于步骤a)的水平，确定所述受试者会患癌症的风险。
2.权利要求1的方法，其中，所述步骤a)的确定包括使所述样品与至少一种前胃泌素结合分子接触，并测量所述前胃泌素结合分子与前胃泌素的结合。
3.权利要求2的方法，其中，所述与前胃泌素结合的剂为抗前胃泌素抗体，或其抗原结合片段。
4.权利要求3的方法，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
5.权利要求3或4中任一项的方法，其中所述抗体选自N-末端抗前胃泌素抗体和C-末端抗前胃泌素抗体。
6.权利要求3至5的方法，其中所述抗体为选自下组的单克隆抗体：
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°4、5和6的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°7、8和9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°10、11和12的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°13、14和15的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°16、17和18的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°19、20和21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°22、23和24的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°25、26和27的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°28、29和30的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°31、32和33的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，
-单克隆抗体，其包含重链和轻链，所述重链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°34、35和36的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，所述轻链包含以下序列中的至少一个、优选至少两个、优选三个：氨基酸序列分别为SEQ ID N°37、38和39的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，和
-单克隆抗体，其由2016年12月27日保藏在CNCM，Institut Pasteur,25-28 rue duDocteur Roux,75724 Paris CEDEX 15,France，保藏号为I-5158的杂交瘤产生。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述步骤a)的确定包括：
(i)使所述样品与结合前胃泌素的第一部分的第一前胃泌素结合分子接触，和
(ii)使所述样品与结合前胃泌素的第二部分的第二前胃泌素结合分子接触。
8.权利要求7的方法，其中所述第一前胃泌素结合分子结合前胃泌素的C-末端内的表位。
9.权利要求7或8中任一项的方法，其中所述前胃泌素结合分子是由2016年12月27日保藏在CNCM，Institut Pasteur,25-28 rue du Docteur Roux,75724 Paris CEDEX 15,France，保藏号为I-5158的杂交瘤产生的单克隆抗体。
10.权利要求7至9中任一项的方法，其中所述第二前胃泌素结合分子结合前胃泌素的N-末端内的表位。
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