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CN114699537A - 一种改善缺氧增敏pd-1抗体疗效的ros响应抗癌药物 - Google Patents

一种改善缺氧增敏pd-1抗体疗效的ros响应抗癌药物 Download PDF

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CN114699537A CN202210222591.1A CN202210222591A CN114699537A CN 114699537 A CN114699537 A CN 114699537A CN 202210222591 A CN202210222591 A CN 202210222591A CN 114699537 A CN114699537 A CN 114699537A
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Abstract

本发明属于生物医药技术和纳米医学技术领域，公开了一种改善缺氧增敏PD‑1抗体疗效的ROS响应抗癌药物。本发明利用肿瘤组织含有高水平活性氧产物(Reactive oxygen species,ROS)这一特征，以一种ROS敏感性蛋白交联物(ROS‑linker)为桥梁，以鼠血清白蛋白(Murineserumalbumin,MSA)为药物包裹载体，将PD‑1抗体(anti‑PD1,aPD1)、氧合血红蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)交联，同时包裹疏水性药物阿托伐醌(Atovaquone,ATO)，获得功能化NP‑aPD‑1/HbO2/ATO纳米靶向抗癌药物。本发明在癌症治疗研究，药物运输领域具有较好的应用前景和转化价值，也为抗肿瘤新药研发、老药新用提供了实例和良好思路。

Description

一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物
技术领域
本发明属于生物医药技术和纳米医学技术领域，具体涉及一种通过改善微环境缺氧提高PD-1抗体疗效的纳米药物及其构建技术。
背景介绍
基于免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors,ICIs)的肿瘤免疫疗法，尤其针对程序性死亡受体1/程序性死亡配体1(Programmed cell death protein 1/Programmed cell death ligand 1,PD-1/PD-L1)的单克隆抗体，在临床应用中已经彻底改变了抗肿瘤治疗的范式，广泛应用于黑色素瘤、肺癌等实体瘤临床治疗。然而，PD-1/PD-L1抗体治疗可能引起免疫风暴等严重副作用，且仍有相当一部分患者对治疗无反应，是限制免疫治疗进一步发展的巨大阻力。肿瘤微环境(Tumor microenvironment,TME)的氧合状态在抗肿瘤免疫反应中起着重要作用。在缺氧应激条件下，肿瘤细胞通过释放各种细胞因子诱导免疫重塑，抑制杀伤性T细胞功能，激活免疫抑制细胞等参与肿瘤免疫耐受。而肿瘤细胞及肿瘤基质细胞在缺氧条件下释放诸多免疫抑制性因子阻碍杀伤性T细胞等免疫活性细胞的肿瘤浸润，导致患者对PD-1/PD-L1抗体等免疫治疗反应欠佳。因此，寻找改善肿瘤微环境缺氧的方法，实现肿瘤缺氧部位局部氧合水平的提高，能够有效改善肿瘤免疫微环境，提高免疫治疗效果。
肿瘤微环境缺氧是实体肿瘤的固有特性，主要是由于肿瘤细胞增长及代谢速度远快于新生血管生成速度，而且肿瘤新生血管畸形、渗漏，缺乏有效循环，加重缺氧。近年来，已探索研发多种氧发生器(MnO2,CaO2等)和氧载体(全氟化碳，血红蛋白“Hb”等)，以克服肿瘤的缺氧，但是都存在血液循环时间短，潜在副作用大，稳定性差等缺点。氧合血红蛋白(HbO2)是天然的氧载体，高效载氧并结构稳定，可用以实现外源性氧的补充。抗疟疾药物阿托伐醌(ATO)能够抑制线粒体复合酶Ⅲ的活性，还能够通过阻断线粒体功能而抑制肿瘤细胞增殖，从而显著降低细胞氧耗，改善缺氧。然而，ATO水溶性差，生物利用度低，临床使用时往往需大剂量用药，易导致严重的全身副反应。实现HbO2和ATO的肿瘤靶向递送，将从外源补充和降低内需两方面改善肿瘤组织氧缺乏，纠正肿瘤免疫微环境，并可有效降低ATO的用药量，预防副反应，具有重大的现实意义。
活性氧产物(Reactive oxygen species,ROS)是人体产生的一类氧衍生化学物质，包括过氧化氢(H2O2)，单线态氧(1O2)，超氧化物(O2 -)和羟基自由基(-OH)。肿瘤细胞常处于氧化应激状态，释放大量ROS，肿瘤微环境中的ROS浓度大致在μmoL-mmoL之间，过多的ROS亦参与促进肿瘤耐药及进展。ROS响应策略是使纳米给药系统与肿瘤细胞特有的高水平ROS反应，ROS响应性基团可以作为连接子，连接纳米载体的不同组分，当纳米载体随血液循环来到肿瘤局部，遇到高水平ROS则发生断裂，释放药物，实现活性药物的肿瘤靶向，确保癌细胞有效摄取抗癌药物。一方面实现药物的肿瘤靶向释放，另一方面可降低微环境中ROS水平，阻断依赖ROS的肿瘤进展机制，避免免疫细胞及促免疫因子的氧化损伤，达到更好的治疗效果。
在本专利中，利用生物相容性较高的鼠血清白蛋白(Murineserumalbumin,MSA)作为纳米靶向抗癌药物载体，具有良好的稳定性，避免因人体内环境的变化或免疫反应而降解。利用ROS-linker将aPD-1与HbO2共价连接，利用蛋白质多肽的极性及疏水性，在胶束自组装过程中加入并包载ATO，显著提高了纳米材料靶向性以及疏水性小分子药物的生物利用度。利用HbO2实现肿瘤缺氧部位局部递氧，同时ATO进一步降低肿瘤细胞氧耗，最终有效改善肿瘤微环境缺氧。从提高肿瘤微环境氧的递送以及降低肿瘤和基质细胞耗氧量两方面入手，提高肿瘤微环境氧合水平。肿瘤微环境缺氧的改善，将保证肿瘤浸润淋巴细胞的代谢和活性需求，降低肿瘤的免疫抑制作用。除此之外，白蛋白常作为靶向给药载体以提高药物在体内的靶向性，与Hb共同为内源性物质，不会产生毒性或免疫反应；ATO是FDA批准的经典的抗寄生虫药物，已在临床上使用近20年；ROS-linker在体内断裂后分解成微量小分子化合物并迅速降解。因此，其安全性能够得到有效保证。
发明内容
本发明提供一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，本发明能够有效改善肿瘤微环境缺氧，增加免疫细胞的肿瘤浸润、提高免疫细胞活力，从而增强免疫治疗药物PD-1抗体(anti-PD1,aPD1)对实体肿瘤的治疗效果；同时该药物具有良好的肿瘤靶向释放能力，有效减低aPD1用药量，预防免疫风暴等aPD1的全身性副作用；并且构建的纳米结构良好解决了难溶性药物ATO的包载和靶向递送，提高其生物利用度，从而减低用药量，降低生物毒性。
本发明一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，其特征在于，以一种ROS敏感性蛋白交联物(ROS-linker)为桥梁，以鼠血清白蛋白(Murineserumalbumin,MSA)为药物包裹载体，将PD-1抗体(anti-PD1,aPD1)、氧合血红蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)交联形成纳米胶束，同时包裹疏水性药物阿托伐醌(Atovaquone,ATO)，获得功能化NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米靶向抗癌药物。
本发明利用肿瘤组织含有高水平ROS这一特征，借助ROS响应性蛋白交联剂将aPD-1与氧合血红蛋白(HbO2)连接形成纳米胶束，并包载线粒体呼吸链抑制剂ATO，合成纳米药物NP-aPD-1/HbO2/ATO。通过向肿瘤部位靶向递送aPD1激活免疫，治疗肿瘤，同时降低aPD1的全身性副反应，并通过氧递送及抑制肿瘤细胞自身氧耗改善肿瘤微环境缺氧，增强免疫治疗疗效。
实验结果证明：纳米靶向抗癌药物NP-aPD-1/HbO2/ATO，结构稳定，具有良好的肿瘤靶向递送能力，可包载难溶性药物，显著改善小鼠结肠癌细胞(MC38)的肿瘤微环境缺氧，增强免疫治疗疗效，且对各组织器官无明显毒副作用。
为实现上述目的，一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，包括以下制备步骤：
步骤(1)ROS-linker的合成：将5.1mg N-羟基琥珀酰亚胺、5.0mg 2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸、15.6μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入到184.4μLDMSO中，室温反应6h，即为ROS-linker；
步骤(2)NP-aPD-1/HbO2/ATO的合成：预先用230μL 100mM维生素C处理7.5mg Hb4h,再将15mg BSA及2.3mg aPD-1溶解在PBS中，混匀之后加入50μL(6.67g/L)DMSO溶解的ATO和20μLROS-linker，补充PBS至6844μL，4℃反应过夜；
步骤(3)NP-aPD-1/HbO2/ATO的纯化：步骤(2)中的复合体系转入MWCO 10kDa的透析袋中，透析在2L pH＝7.4PBS溶液中进行12h去除未包裹的药物及蛋白，随后进行低温冻干；冻干后产物根据使用浓度进行溶解，并通入适量氧气使Hb富氧，得到NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米靶向抗癌药物。
本发明具有如下优势：
1)ROS-linker可特异性在肿瘤微环境中断裂，实现了aPD-1、ATO及Hb在肿瘤局部富集及特异性释放的目标，以提高各有效成分的靶向利用，降低副反应。
2)HbO2作为氧载体向肿瘤部位递送氧，同时通过ATO抑制线粒体呼吸链从而降低肿瘤组织氧耗，有效改善肿瘤组织缺氧。
3)本发明所用的aPD-1和ATO均已经过FDA批准应用，而Hb和白蛋白均为机体内源性蛋白质，药物生物安全性得到良好保障，具备一定的转化价值。
4)本发明可包载难溶性药物，提高了生物利用率，降低了药物的治疗浓度的同时实现治疗效率的提升。
附图说明
图1a是NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物的设计理念。
图1b是NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物电镜下结构。
图1c是NP-aPD-1/HbO2/ATO及IgG标准品Western blot检测结果。
图1d是根据Western blot结果绘制的IgG含量标准曲线。
图1e是根据494nm波长吸光度绘制的ATO含量标准曲线。
图2a是H2O2处理前后NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物电镜下形态。
图2b是NP-aPD-1/HbO2/ATO在ROS处理不同时间药物成分的释放。
图2c是NP-aPD-1/HbO2/ATO抑制结肠癌细胞生长的浓度依赖关系。
图2d是NP-aPD-1/HbO2/ATO对肿瘤细胞线粒体复合体III的作用。
图2e是NP-aPD-1/HbO2/ATO在体外释放氧的能力。
图3a是NP-aPD-1/HbO2/ATO在荷瘤小鼠各组织器官的荧光分布图像。
图3b是NP-aPD-1/HbO2/ATO在荷瘤小鼠各组织器官分布的荧光定量。
图4a是NP-aPD-1/HbO2/ATO及各对照药剂处理下小鼠结肠癌移植瘤的生长曲线。
图4b是NP-aPD-1/HbO2/ATO及各对照药剂处理后小鼠结肠癌移植瘤的图像。
图4c是NP-aPD-1/HbO2/ATO及各对照药剂处理后小鼠结肠癌移植瘤的重量。
图5a是NP-aPD-1/HbO2/ATO及各对照药剂处理后小鼠各主要脏器的H&E染色图像。
图5b是NP-aPD-1/HbO2/ATO及各对照药剂处理后小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和血清肌酐(SCr)水平。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、技术特征、发明目的与技术效果易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明内容。
实施例1：NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物的合成及各组分包封率
将5.1mg N-羟基琥珀酰亚胺、5.0mg 2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸、15.6μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二胺加入到184.4μL DMSO中，室温反应6h，得到ROS-linker；预先用230μL 100mM维生素C处理7.5mg Hb 4h,再与15mg BSA及2.3mg aPD-1共同溶解在6844μL PBS中，加入50μL(6.67g/L)DMSO溶解的ATO和20μLROS-linker，4℃反应过夜；之后进行透析与低温冻干，冻干后产物根据使用浓度进行溶解，并通入适量氧气。
图1a是NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物的设计理念。NP-aPD-1/HbO2/ATO整体合成的流程及后续作用机制的示意图如图1a所示。MSA、Hb、aPD-1等成分经ROS-linker交联，在此过程中加入ATO，在蛋白胶束形成过程中包裹ATO，形成纳米球状颗粒，经纯化步骤获得的药物适当通氧，对其中Hb进行氧合，则生成NP-aPD-1/HbO2/ATO。药物在血液循环中，因纳米颗粒的EPR效应，可富集于肿瘤组织，遇肿瘤微环境高水平ROS刺激，ROS-linker断裂，药物有效成分，包括HbO2、ATO、aPD-1等得以释放，HbO2向肿瘤局部靶向递送氧气，ATO被肿瘤细胞及基质细胞摄取，抑制细胞线粒体呼吸连复合体III的活性，降低肿瘤细胞及基质细胞的氧耗，肿瘤微环境缺氧得到有效缓解，为杀伤性T细胞浸润提供较好微环境，药物在肿瘤细胞间隙释放的aPD-1则可封闭T细胞表面PD-1分子，阻断来自肿瘤细胞或基质细胞的细胞耗竭信号，杀伤性T细胞得以发挥其肿瘤杀伤效应。
采用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)检测NP-aPD-1/HbO2/ATO的结构与尺寸，结果如图1b所示，纳米颗粒呈现均匀球状，形状均一，经测量粒径约为218.18±15.75nm。
为检测aPD-1包封率，以质量梯度的变性鼠免疫球蛋白IgG作为标准品进行western blot分析，如图1c。获取梯度变性IgG及0.345μg变性的NP-aPD-1/HbO2/ATO的抗球蛋白抗体免疫印迹图像。使用Image-J2016图像分析软件进行灰度分析，IgG条带灰度值拟合标准曲线，如图1d，图中显示标准曲线的拟合度R2及抗体含量的计算公式。以同次曝光的NP-aPD-1/HbO2/ATO条带计算aPD-1蛋白含量，得到抗体包封率为78.83±6.79％。
ATO特异性吸收494nm波长，因此可利用该波长下吸光度计算ATO含量。利用紫外分光法测梯度浓度的ATO溶液吸光度，得到拟合曲线如图1e所示，裂解纳米颗粒释放ATO并检测494nm吸光度，计算得到ATO载药率为61.68±6.82％(经同样方法制备的不含ATO的NP-aPD-1/HbO2颗粒矫正)。
实施例2：NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物各个组分的生化效应
为观察NP-aPD-1/HbO2/ATO中ROS-linker是否能够响应ROS而断裂释放药物，使用含有1mM H2O2的PBS处理纳米药物24h，未处理及处理后样品分别使用TEM观察，NP-aPD-1/HbO2/ATO经H2O2处理后，电镜下可见其丧失球形结构，分解成为若干不规则形态碎片，如图2a。考虑到肿瘤组织中的H2O2的产生是一个持续和积累的过程，我们维持1mM H2O2浓度处理合成药物不同时间，产物进行蛋白凝胶电泳及银染，观察药物个组分的释放。结果如图2b，NP-aPD-1/HbO2/ATO在ROS作用下蛋白组分的释放具有明显的时间依赖性，处理时间越长，颗粒的解聚及蛋白组分的释放越完全，而在PBS溶液中相同时间内仅释放出少量HAS和血红蛋白二聚体。表明药物中ROS-linker具有良好的ROS响应性能，提示药物能够在肿瘤微环境中完成解聚和有效成分的释放。
合成药物中ATO能够通过抑制线粒体呼吸链而抑制肿瘤细胞增殖。为检测合成药物对体外培养细胞增殖的影响，我们向对数生长期的结肠癌细胞MC38培养基中加入梯度浓度的NP-aPD-1/HbO2/ATO，并加入1mM H2O2孵育细胞24h，通过甲醛固定细胞、结晶紫染色等步骤检测细胞数量，使用Image-J 2016软件进行细胞计数。结果如图2c所示，随着药物浓度的增高，细胞数量显著下降，呈现出浓度依赖性，计算得出体外培养的MC38细胞对NP-aPD-1/HbO2/ATO的IC50约25μM。为检测NP-aPD-1/HbO2/ATO对肿瘤细胞线粒体活性的影响，使用线粒体活性试剂盒检测，细胞分别别经PBS、0.1mM抗霉素A(antimycin A,Ant A)溶液、0.78μΜNP-aPD-1/HbO2及0.78μΜNP-aPD-1/HbO2/ATO处理。其中抗霉素A是经典的线粒体呼吸链复合体Ⅲ阻断剂，用作阳性对照。如图2d所示，与PBS和NP-aPD-1/HbO2处理相比，NP-aPD-1/HbO2/ATO组线粒体活性显著下降，与阳性对照ATO组水平接近。以上数据表明，合成药物处理体外培养的结肠癌细胞，能够有效释放ATO，从而降低肿瘤细胞线粒体活性，抑制肿瘤细胞增殖。
为保证血红蛋白的氧气携带和运输功能，使用还原剂维生素C预处理Hb得到亚铁血红蛋白，用作药物制备。为检测NP-aPD-1/HbO2/ATO向环境中释放氧的能力，将NP-aPD-1/HbO2/ATO悬液与等量NP-aPD-1/ATO溶液进行相同的富氧处理，遂将其加入15mL脱氧PBS(溶解O2<1mg/L)中，以模拟两种溶液在缺氧环境下的氧气释放。利用溶解氧检测仪器记录脱氧PBS在不同时间点的溶解氧含量变化，绘制溶解氧曲线。结果如图2e所示，NP-aPD-1/HbO2/ATO释放氧气的速度与总量均明显高于NP-aPD-1/ATO组，说明蛋白杂交并未破坏Hb的载氧能力，NP-aPD-1/HbO2/ATO具备良好的氧气递送能力。
实施例3：NP-aPD-1/HbO2/ATO的肿瘤靶向富集
为检测NP-aPD-1/HbO2/ATO在小鼠体内脏器及皮下移植瘤的分布，使用Cy5.5荧光集团修饰MSA并用于合成Cy5.5-labeled-NP-aPD-1/HbO2/ATO，分别将其与等量的Cy5.5-MSA通过尾静脉注射给皮下移植有结肠癌肿瘤的C57BL/6小鼠，6h后，解剖获取各脏器及移植瘤，利用体内成像(IVIS)频谱系统观察荧光分布情况和强度，对比不同处理小鼠脏器荧光强度的差异。如图3a所示，经6h代谢，Cy5.5-MSA在肝脏、肺脏、肾脏等组织仅有少量分布，肿瘤组织几乎无分布。而Cy5.5-labeled-NP-aPD-1/HbO2/ATO主要富集于肿瘤，在肺脏及肝脏有少量分布。对图像进行平均荧光强度定量分析，结果显示，单位面积内Cy5.5-MSA在肿瘤及各组织脏器分布水平低下，未见组织脏器的特异性富集，而Cy5.5-labeled-NP-aPD-1/HbO2/ATO特异性富集于肿瘤组织，其肿瘤组织荧光强度约为心脏、脾脏、大脑等脏器的10倍，约为肝脏的5倍，其次肾脏相交其它脏器分布较多，推测与药物代谢途径有关，如图3b。该结果提示NP-aPD-1/HbO2/ATO具有优秀的肿瘤靶向分布特征。
实施例4：NP-aPD-1/HbO2/ATO对肿瘤生长的抑制
为检测NP-aPD-1/HbO2/ATO治疗肿瘤的效果，在C57BL/6小鼠左侧腹股沟注射MC38结肠癌细胞并形成皮下移植瘤。荷瘤小鼠随机分为7组(n＝5)，分别给予一下处理：①PBS；②ATO溶液；③NP-IgG/HbO2/ATO悬液；④aPD-1溶液；⑤aPD-1+HbO2+ATO混合溶液；⑥NP-aPD-1/HbO2悬液；⑦NP-aPD-1/HbO2/ATO悬液。所有药剂均间隔3天尾静脉注射，共计3次，③④⑤⑥⑦组以2mg/kg aPD-1或IgG计算单次给药量，②⑤组按⑦组ATO含量计算ATO给药量。持续监测肿瘤体积，绘制移植瘤生长曲线，如图4a，饲养结束时处死小鼠，剥离移植瘤拍照，称重，如图4b，图4c。结果表明，在所有处理组中，NP-aPD-1/HbO2/ATO处理的小鼠的肿瘤生长速度最慢，体积最小。aPD-1溶液治疗组在前10天能够有效抑制肿瘤生长，但在治疗15天后，肿瘤生长速率加快、实验结束时肿瘤体积小于PBS处理组，但显著大于NP-aPD-1/HbO2/ATO组。ATO溶液治疗组与PBS处理组无显著差异，但具有靶向能力的NP-IgG/HbO2/ATO治疗组肿瘤体积显著小于PBS组；具有靶向能力的NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米药物与aPD-1+HbO2+ATO混合溶液组比较，肿瘤生长显著减缓，体积缩小，显示了NP-aPD-1/HbO2/ATO的肿瘤靶向富集、靶向释放为aPD-1及ATO治疗带来的优势。
实施例5：NP-aPD-1/HbO2/ATO的安全性评估
为观察NP-aPD-1/HbO2/ATO治疗对组织脏器的损伤风险，保留以上七组处理小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器，进行石蜡包埋切片，H&E染色。结果如图5a所示。各组药物处理并未引起小鼠功能器官明显损伤，染色组织亦未见明显炎症反应。此外，对以上七组处理小鼠的血清标本检测谷丙转氨酶(ALT)和血清肌酐(SCr)水平，分别用于判断肝脏功能和肾脏功能，结果如图5b，aPD-1溶液治疗使血清ALT显著升高，提示aPD-1对肝脏功能可能具有潜在损伤风险，而其它处理组，尤其NP-aPD-1/HbO2/ATO处理组小鼠肝功能未见异常。ATO溶液和NP-aPD-1/HbO2/ATO治疗使SCr水平略有升高，但统计学均无差异，提示各组处理对小鼠肾功能无显著损伤。以上结果提示NP-aPD-1/HbO2/ATO对各主要脏器均无损伤，具有良好的生物安全性。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不是对本发明专利范围的限制。凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改与改进等，都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，其特征在于，以一种ROS敏感性蛋白交联物(ROS-linker)为桥梁，以鼠血清白蛋白(Murineserumalbumin,MSA)为药物包裹载体，将PD-1抗体(anti-PD1,aPD1)、氧合血红蛋白(oxyhemoglobin,HbO2)交联形成纳米胶束，同时包裹疏水性药物阿托伐醌(Atovaquone,ATO)，获得功能化NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米靶向抗癌药物。
2.根据权利要求1所述的一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，其特征在于，所述的NP-aPD-1/HbO2/ATO的制备方法如下：
步骤(1)ROS-linker的合成：将5.1mg N-羟基琥珀酰亚胺、5.0mg2,2'-[丙烷-2,2-二基双(硫代)]二乙酸、15.6μL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺加入到184.4μL二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中，室温反应6h，即为ROS-linker；
步骤(2)纳米靶向抗癌药物合成：预先用230μL 100mM维生素C处理7.5mg Hb 4h,再将15mg MSA及2.3mg aPD-1溶解在PBS中，混匀之后加入50μL(6.67g/L)DMSO溶解的ATO和20μLROS-linker，补充PBS至6844μL，4℃反应过夜；
步骤(3)纳米靶向药物递送的纯化：步骤(2)中的复合体系转入MWCO 10kDa的透析袋中，透析在2L pH＝7.4PBS溶液中进行12h，以去除未包裹的药物及蛋白，随后进行低温冻干，冻干后产物根据使用浓度进行溶解，并通入适量氧气，得到NP-aPD-1/HbO2/ATO纳米靶向抗癌药物。
3.根据权利要求1或2所述的一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，其特征在于，所述的NP-aPD-1/HbO2/ATO粒径为218.18±15.75nm。
4.根据权利要求1或2所述的一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，其特征在于，所述的NP-aPD-1/HbO2/ATO其中抗体包封率为78.83±6.79％。
5.根据权利要求1或2所述的一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物，其特征在于，所述的NP-aPD-1/HbO2/ATO其中ATO载药率为61.68±6.82％。
6.权利要求2制备的一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物在实体肿瘤靶向递送系统中的应用。
7.权利要求2制备的一种改善缺氧增敏PD-1抗体疗效的ROS响应抗癌药物在治疗实体肿瘤疾病药物中的应用。
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