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CN114681621B - 肽寡核苷酸缀合物 - Google Patents

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CN114681621B CN202210279461.1A CN202210279461A CN114681621B CN 114681621 B CN114681621 B CN 114681621B CN 202210279461 A CN202210279461 A CN 202210279461A CN 114681621 B CN114681621 B CN 114681621B
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Abstract

本发明涉及肽寡核苷酸缀合物。本文提供寡核苷酸、肽和肽‑寡核苷酸缀合物。本文还提供在有需要的受试者中治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，其包括向所述受试者施用本文所述的寡核苷酸、肽和肽‑寡核苷酸缀合物。

Description

肽寡核苷酸缀合物
本申请是申请日为2016年5月19日的中国专利申请201680041867.9“肽寡核苷酸缀合物”的分案申请。
相关申请
本申请要求2015年5月19日提交的美国临时专利申请号62/163,960和2016年5月17日提交的美国临时专利申请号62/337,536的优先权。这些申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请连同序列表一起以计算机可读格式提交。序列表提供为在2016年5月13日创建的名称为581432_SPT-001-2_sequence_listing_ST25.txt的文件，所述文件的大小为4,227字节。计算机可读格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
背景技术
反义技术提供了用于调节一种或多种特定基因产物(包括另选的剪接产物)的表达的手段，并且在许多治疗、诊断和研究应用中是特别有用的。反义技术背后的原理是与靶核酸杂交的反义化合物例如寡核苷酸通过多种反义机制中的任一种调节基因表达活动诸如转录、剪接或翻译。反义化合物的序列特异性使其具有作为用于靶标验证和基因功能化的工具以及用以选择性调节涉及疾病的基因的表达的治疗剂的吸引力。
虽然在反义技术领域已经取得了显著进展，但在本领域仍然需要寡核苷酸和具有改进的反义或反基因性能的肽-寡核苷酸缀合物。这种改进的反义或反基因性能至少包括例如：较低的毒性、较强的对DNA和RNA的亲和力而不损害序列选择性、改善的药代动力学和组织分布、改善的细胞递送以及可靠且可控的体内分布。
发明内容
本文提供肽、寡核苷酸和肽-寡核苷酸缀合物。本文还提供在有需要的受试者中治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本文所述的肽-寡核苷酸缀合物。
因此，在一方面，本文提供式I的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐，
在一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ia的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ib的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在还另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ic的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在又另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Id的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在还另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ie的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本文提供式IV的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在另一方面，本文提供式IV的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐。
在还另一方面，本文提供在有需要的受试者中治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，其包括向受试者施用本公开的肽-寡核苷酸缀合物。
附图说明
图1示出基于流式细胞术实验所选择的寡核苷酸、肽和肽-寡核苷酸缀合物穿透到HeLa细胞中的程度。
图2A是示出施用PPMO 5之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图2B是示出施用PPMO 6之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图2C是示出施用PPMO 8之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图2D是示出施用PPMO 10之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图3A是示出施用PPMO 5之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图3B是示出施用PPMO 7之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图3C是示出施用PPMO 9之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图3D是示出施用PPMO 11之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的蛋白质印迹。
图4A示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图4B示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 6之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图4C示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化。
图4D示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 6之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化；使用野生型和mdx小鼠作为对照。
图5A示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 8之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图5B示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 10之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图5C示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 8之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化；使用野生型和mdx小鼠作为对照。
图5D示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 10之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化；使用野生型和mdx小鼠作为对照。
图6A示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图6B示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 7之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图6C示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化。
图6D示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 7之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化；使用野生型和mdx小鼠作为对照。
图7A示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 9之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图7B示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 11之后小鼠股四头肌组织中肌营养不良蛋白水平的量化。
图7C示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 9之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化；使用野生型和mdx小鼠作为对照。
图7D示出对施用PPMO 5(相同测定重复两次)或PPMO 11之后小鼠股四头肌组织中外显子23跳跃(％)的量化；使用野生型和mdx小鼠作为对照。
详述
本文提供肽、寡核苷酸和肽-寡核苷酸缀合物。本文还提供在有需要的受试者中治疗疾病的方法，其包括向受试者施用本文所述的肽-寡核苷酸缀合物。本文所述的寡核苷酸以及由此的肽-寡核苷酸缀合物相对于天然或未修饰的寡核苷酸显示出对DNA和RNA更强的亲和力，而不损害序列选择性。在一些实施方案中，本公开的寡核苷酸最小化或阻止RNA酶H的切割。在一些实施方案中，本公开的反义寡核苷酸不激活RNA酶H。
本文所述的肽赋予其对应的肽-寡核苷酸缀合物较低的毒性、增强寡核苷酸的活性、改善药代动力学和组织分布、改善细胞递送，并赋予可靠且可控的体内分布。
定义
下面列出的是用于描述本公开的各种术语的定义。这些定义适用于整个说明书和权利要求书中使用的术语，除非在具体情况下另有限定，无论是单独的还是作为更大组的一部分。
术语“约”应被本领域的普通技术人员了解并应在使用它的上下文中在一定程度上变化。当涉及可测量的值，诸如量、持续时间等时，本文所用的术语“约”意指涵盖偏离指定值±20％或±10％，包括±5％、±1％和±0.1％的变化，因为此类变化合适于进行所公开的方法。
术语“烷基”是指饱和的直链或支链烃部分，在某些实施方案中，所述直链或支链烃部分分别含有1至6个或1至8个碳原子。C1-6-烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、正己基部分；并且C1-8-烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、正己基、庚基和辛基部分。
烷基取代基中的碳原子数可以用前缀“Cx-y”表示，其中x是取代基中碳原子的最小数，并且y是最大数。同样，Cx链是指含有x个碳原子的烷基链。
除非另外指明，否则术语“杂烷基”自身或与另一术语组合意指被所述数量的碳原子与一个或两个选自由O、N和S组成的组的杂原子组成的稳定直链或支链烷基，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化并且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子可置放在杂烷基的任何位置处，包括杂烷基的剩余部分与它连接片段之间，以及连接到杂烷基中的最远端碳原子。实例包括：-O-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-S-CH2-CH3和-CH2-CH2-S(＝O)-CH3。多至两个杂原子可以是连续的，例如像-CH2-NH-OCH3或-CH2-CH2-S-S-CH3。
除非另外指明，否则术语“芳基”单独或与其他术语组合使用意指含有一个或多个环(通常1个、2个或3个环)的碳环芳香族体系，其中所述环可以侧基方式连接在一起(诸如联苯基)或可以为稠合的(诸如萘)。芳基的实例包括苯基、蒽基和萘基。在各种实施方案中，芳基的实例可包括苯基(例如C6-芳基)和联苯基(例如C12-芳基)。在一些实施方案中，芳基具有6至16个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有6至12个碳原子(例如C6-12-芳基)。在一些实施方案中，芳基具有6个碳原子(例如C6-芳基)。
本文所用的术语“杂芳基”或“杂芳香族”指具有芳香族特征的杂环。杂芳基取代基可以通过碳原子数定义，例如，C1-9-杂芳基指示包含在杂芳基中的碳原子的数目，而不包括杂原子的数目。例如，C1-9-杂芳基将包括另外的1至4个杂原子。多环状杂芳基可包括一个或多个部分饱和的环。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如2-和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如3-和5-吡唑基)、异噻唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，3，4-噻二唑基和1，3，4-噁二唑基。
多环状杂环和杂芳基的非限制性实例包括吲哚基(包括例如3-、4-、5-、6-和7-吲哚基)、二氢吲哚基喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(包括例如1-和5-异喹啉基)、1，2，3，4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹喔啉基(包括例如2-和5-喹喔啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1，8-萘啶基、1，4-苯并二噁烷基、香豆素、二氢香豆素、1，5-萘啶基、苯并呋喃基(包括例如3-、4-、5-、6-和7-苯并呋喃基)、2，3-二氢苯并呋喃基、1，2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(包括例如3-、4-、5-、6-，和7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡嗪烷基(pyrrolizidinyl)和喹嗪烷基(quinolizidinyl)。
术语“保护基”或“化学保护基”是指阻断化合物的一些或全部反应性部分并防止此类部分参与化学反应直到保护基被去除的化学部分，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版John Wiley&Sons(1999)中列出且描述的那些部分。在采用不同的保护基的情况下，可能有利的是每个(不同的)保护基可以通过不同的方式去除。在完全不同的反应条件下裂解的保护基实现了此类保护基的区别性去除。例如，保护基可以通过酸、碱和氢解去除。诸如三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、缩醛和叔丁基二甲基甲硅烷基的基团是酸不稳定性的，并且可用于在用Cbz基(其可通过氢解去除)和Fmoc基(其是碱不稳定性的)保护的氨基存在下保护羧基和羟基反应性部分。在用酸不稳定基团(诸如氨基甲酸叔丁酯)或用酸和碱稳定但可水解去除的氨基甲酸酯阻断的胺的存在下，羧酸部分可用碱不稳定性基团，诸如但不限于甲基或乙基阻断，并且羟基反应性部分可用碱不稳定性基团诸如乙酰基阻断。
羧酸和羟基反应性部分也可用可水解去除的保护基诸如苄基阻断，同时胺基可用碱不稳定性基团诸如Fmoc阻断。用于合成式(I)化合物的特别可用的胺保护基是三氟乙酰胺。羧酸反应性部分可用可氧化去除的保护基诸如2，4-二甲氧基苄基阻断，而共存的氨基可用氟化物不稳定的甲硅烷基氨基甲酸酯阻断。
烯丙基阻断基在酸和碱保护基存在下可用，因为前者稳定并随后可通过金属或π酸催化剂去除。例如，烯丙基阻断的羧酸可用钯(0)催化反应在酸不稳定的氨基甲酸叔丁酯或碱不稳定的乙酸酯胺保护基存在下去保护。保护基的又另一形式是可连接化合物或中间体的树脂。只要将残基连接到树脂，官能团就被阻断并且不反应。一旦从树脂释放，官能团就能反应。
术语“核碱基”、“碱基配对部分”、“核碱基配对部分”或“碱基”是指核苷、核苷酸和/或吗啉代亚基的杂环部分。核碱基可以是天然存在的，或者可以是修饰的或这些天然存在的核碱基的类似物，例如核碱基的一个或多个氮原子在每次出现时可以独立地被碳置换。示例性类似物包括次黄嘌呤(核苷肌苷的碱基组分)；2，6-二氨基嘌呤；5-甲基胞嘧啶；C5-丙炔基修饰的嘧啶；10-(9-(氨基乙氧基)吩噁嗪基)(G-钳)等。
碱基对部分的另外实例包括但不限于它们的相应氨基由酰基保护基保护的尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和次黄嘌呤；2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物(诸如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)和其他修饰的核苷碱基，诸如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两个是天然降解产物)。还涵盖了公开于Chiu和Rana，RNA，2003，9，1034-1048；Limbach等Nucleic Acid Research，1994，22，2183-2196以及Revankar和Rao，Comprehensive Natural Products Chemistry，第7卷，313中的修饰的核苷碱基，所述文献的内容以引用的方式并入本文。
碱基对部分的另外实例包括但不限于尺寸扩大的核苷碱基，其中添加了一个或多个苯环。可设想Glen Research目录(www.glenresearch.com)；Krueger AT等，Acc.Chem.Res.，2007，40，141-150；Kool，ET，Acc.Chem.Res.，2002，35，936-943；BennerS.A.等，Nat.Rev.Genet.，2005，6，553-543；Romesberg，F.E.等，Curr.Opin.Chem.Biol.，2003，7，723-733；Hirao，I.，Curr.Opin.Chem.Biol.，2006，10，622-627中所述的核酸碱基置换可用于合成本文所述的寡聚体。尺寸扩大的核苷碱基的实例在下文示出：
术语“寡核苷酸”或“寡聚体”是指包含多个连接的核苷、核苷酸或核苷和核苷酸两者的组合的化合物。在本文提供的具体实施方案中，寡核苷酸是吗啉代寡核苷酸。
短语“吗啉代寡核苷酸”或“PMO”是指具有通过氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯键连接在一起的吗啉代亚基的修饰寡核苷酸，所述键将一个亚基的吗啉氮连接至相邻亚基的5′-环外碳。每个吗啉代亚基包含通过核碱基特异性氢键有效结合靶中核碱基的核碱基配对部分。
术语“反义寡聚体”、“反义化合物”和“反义寡核苷酸”可互换使用，并且是指各自带有碱基配对部分的亚基序列，其通过亚基间键合连接，所述亚基间键合允许碱基配对部分通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与核酸(通常为RNA)中的靶序列杂交，以在靶序列中形成核酸：寡聚体异源双链体。寡聚体可与靶序列具有精确(完美)或接近(足够)序列互补性；靠近寡聚体末端的序列变化通常优于内部中的变化。
这样的反义寡聚体可被设计为阻断或抑制mRNA的翻译或抑制/改变天然的或异常的前体mRNA剪接加工，并且可以说被“导向”或“靶向”与其杂交的靶序列。靶序列通常是包括mRNA的AUG起始密码子、翻译抑制寡聚体或加工前mRNA的剪接位点、剪接抑制寡聚体(SSO)的区。剪接位点的靶序列可以包括在加工前mRNA中正常剪接受体接合点下游的具有其5′端1至约25个碱基对的RNA序列。在各种实施方案中，靶序列可以是加工前mRNA的包含剪接位点或完全包含在外显子编码序列内或跨越剪接受体或供体位点的任何区。寡聚体当以上述方式靶向靶核酸时更一般地被认为是“靶向”生物相关靶，诸如蛋白质、病毒或细菌。
当每个分子中足够数量的对应位置被可彼此氢键合的核苷酸占据时，反义寡核苷酸和靶RNA彼此互补，使得寡核苷酸和靶标之间发生稳定且特异性的结合。因此，“可特异性杂交”和“互补”是用来表示足够程度的互补性或精确配对以使得在寡核苷酸与靶标之间发生稳定且特异性的结合的术语。在本领域中应理解，寡核苷酸的序列不需要与它的可特异性杂交的靶序列的序列100％互补。在寡核苷酸与靶分子的结合干扰靶RNA的正常功能时，寡核苷酸可为特异性杂交的，并且存在足够程度的互补性以避免反义寡核苷酸与非靶序列在需要特异性结合的条件下(即，在体内测定或治疗情况下的生理条件下和在体外测定情况下的其中进行所述体外测定的条件下)的非特异性结合。
寡核苷酸还可包含核苷碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。含有修饰或取代的碱基的寡核苷酸包括这样的寡核苷酸，其中最常见于核酸中的一个或多个嘌呤或嘧啶碱基被替换为不常见或非天然的碱基。在一些实施方案中，核苷碱基在嘌呤碱基的N9原子处或在嘧啶碱基的N1原子处共价连接至核苷酸或核苷的吗啉环。
嘌呤碱基包含与咪唑环稠合的嘧啶环，如通过以下通式所述的：
腺嘌呤和鸟嘌呤是最常见于核酸中的两种嘌呤核碱基。这些可以用其他天然存在的嘌呤，包括但不限于N6-甲基腺嘌呤、N2-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤和7-甲基鸟嘌呤取代。
嘧啶碱基包含如通过以下通式所述的六元嘧啶环：
胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶是最常见于核酸中的嘧啶碱基。这些可被其他天然存在的嘧啶，包括但不限于5-甲基胞嘧啶，5-羟甲基胞嘧啶、假尿嘧啶和4-硫尿嘧啶取代。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸含有代替尿嘧啶的胸腺嘧啶碱基。
其他修饰或取代的碱基包括但不限于2，6-二氨基嘌呤、乳清酸、2-胍丁胺基胞苷(agmatidine)、赖西丁(lysidine)、2-硫代嘧啶(例如，2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶)、G-钳及其衍生物、5-取代的嘧啶(例如，5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、Super T)、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、Super G、Super A和N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤(cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤(cPent-AP)和N2-丙基-2-氨基嘌呤(Pr-AP)、假尿嘧啶或其衍生物；和简并或通用碱基，如2，6-二氟甲苯，或缺少碱基，如脱碱基位点(例如，1-脱氧核糖、1，2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-O-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环氧被氮置换(氮杂核糖))。假尿嘧啶为具有C-糖苷而不是如在尿苷中的规则N-糖苷的天然存在的异构化型式的尿嘧啶。
某些修饰或取代的核苷碱基可对增加本公开的反义寡核苷酸的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。在各种实施方案中，核碱基可包含5-甲基胞嘧啶取代物，已经显示其使核酸双链体稳定性增加0.6℃-1.2℃。
在一些实施方案中，修饰或取代的核碱基可用于有利于反义寡核苷酸的纯化。例如，在某些实施方案中，反义寡核苷酸可含有三个或更多个(例如，3、4、5、6或更多个)连续的鸟嘌呤碱基。在某些反义寡核苷酸中，一连串的三个或更多个连续鸟嘌呤碱基可引起寡核苷酸的聚集，使纯化变复杂。在此类反义寡核苷酸中，连续鸟嘌呤中的一个或多个可被次黄嘌呤取代。次黄嘌呤取代一连串的三个或更多个连续鸟嘌呤碱基中的一个或多个鸟嘌呤可降低反义寡核苷酸的聚集，由此有利于纯化。
本文提供的寡核苷酸被合成并且不包括生物来源的反义组合物。本公开的分子还可与其他分子、分子结构或化合物混合物(例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂)混合、囊封、缀合或以其他方式缔合，以有助于摄取、分布或吸收或其组合。
术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的寡核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“T-G-A(5′-3′)”与序列“T-C-A(5′-3′)”互补。互补性可为“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对原则匹配。或者，在核酸之间可能存在“完全”、“总体”或“完美(100％)”互补性。在核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交的效率和强度具有明显影响。尽管常常期望完美互补性，但是一些实施方案可包括相对于靶RNA的一处或多处、但优选6、5、4、3、2或1处错配。这种杂交可在反义寡聚体与靶序列具有“接近”或“基本上”互补性以及具有精确互补性的情况下发生。在一些实施方案中，寡聚体可以约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％互补性与靶序列杂交。包括在寡聚体内的任何位置处的变化。在某些实施方案中，在寡聚体末端附近的序列的变化通常优于在内部的变化，并且，如果存在，其通常在5’末端、3′末端或两末端的约6、5、4、3、2或1个核苷酸内。
术语“肽”是指包含多个连接的氨基酸的化合物。可以认为本文提供的肽是细胞穿透肽。
术语“细胞穿透肽”和“CPP”可互换使用并且是指阳离子细胞穿透肽，也称作转运肽、载体肽或肽转导结构域。本文提供的肽具有在给定细胞培养群体的100％细胞内诱发细胞穿透的能力并允许在全身性施用时在体内多个组织内大分子易位。在各种实施方案中，本公开的CPP实施方案可包括如下文进一步描述的富精氨酸肽。
术语“治疗”是指一种或多种用于改善疾病的特定程序的应用。在某些实施方案中，具体程序是施用一种或多种药剂。个体(例如，哺乳动物，诸如人类)或细胞的“治疗”为在改变个体或细胞的天然进程的尝试中使用的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用药物组合物，并且可预防地或在病理学事件开始或与病原剂接触之后进行。治疗包括对疾病或病状的症状或病变的任何期望的效果，并且可包括例如对正治疗的疾病或病状的一种或多种可测量标记的最低程度的改变或改进。还包括“预防性”治疗，其可涉及到降低正治疗的疾病或病状的进展速度、延迟所述疾病或病状的发作或降低其发作的严重性。“有效量”或“治疗有效量”是指作为单一剂量或作为一系列剂量的一部分施用到哺乳动物受试者的诸如反义寡聚体的治疗化合物的量，其有效产生所期望的治疗效果。
术语“改善”是指减轻病状或疾病的至少一个指标的严重性。在某些实施方案中，改善包括延缓或减缓病状或疾病的一个或多个指标的进展。指标的严重性可通过本领域的技术人员已知的主观或客观度量来确定。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的寡核苷酸的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式而对母体寡核苷酸进行修饰。合适盐的清单见于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985，第1418页及Journal of Pharmaceutical Science，66，2(1977)中，其各自以全文引用的方式并入本文中。
肽-寡核苷酸缀合物
本文提供了与一个或多个部分(诸如细胞穿透肽)化学连接的寡核苷酸，所述一个或多个部分增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。寡核苷酸可以另外与一个或多个杂烷基部分(例如聚乙二醇)化学连接，所述杂烷基部分进一步增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。在一个示例性实施方案中，富含精氨酸的多肽在其N末端或C末端残基处共价偶联至反义化合物的任一端或两端。
因此，在一方面，本文提供式I的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
A′选自-NHCH2C(O)NH2、-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
其中
R5是-C(O)(O-烷基)x-OH，其中x是3-10并且每个烷基在每次出现时独立地是C2-6-烷基，或R5选自-C(O)C1-6烷基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、-(C1-6-烷基)R6、-(C1-6杂烷基)-R6、芳基-R6、杂芳基-R6、-C(O)O-(C1-6烷基)-R6、-C(O)O-芳基-R6、-C(O)O-杂芳基-R6和
其中R6选自OH、SH和NH2，或者R6是O、S或NH，其共价连接至固体支持体；
每个R1独立地选自OH和-NR3R4，其中每个R3和R4在每次出现时独立地是-C1-6烷基；
每个R2独立地选自H、核碱基和用化学保护基官能化的核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤和脱氮-嘌呤的C3-6杂环；
z是8或-40；并且
E′选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
其中
Q是-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，
R7是-(CH2)2OC(O)N(R8)2，其中R8是-(CH2)6NHC(＝NH)NH2，并且
R11选自OH和-NR3R4，
其中L通过酰胺键共价连接至J的羧基末端，并且L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-和
t是4-9；
每个J在每次出现时独立地选自以下结构的氨基酸：
其中：
r和q各自独立地是0、1、2、3或4，并且
每个R9在每次出现时独立地选自H、氨基酸侧链和用化学保护基官能化的氨基酸侧链，
其中R9的两个或更多个氮基酸侧链基团在每次出现时独立地包含硫，其中硫原子中的两个与它们所连接的原子一起形成结构
其中d是0或1；并且M选自：
其中每个R10在每次出现时独立地是H或卤素；并且
G共价连接至J的氨基末端，并且G选自H、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且
其中以下条件中的至少一个为真：
1)A′是2)E′是或3)E′是
在一个实施方案中，E′选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基和
在另一个实施方案中，仅一个A′是E′是或E′是
在还另一个实施方案中，A′是
或E′是
在又另一个实施方案中，A′选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
在另一个实施方案中，E′选自H、-C(O)CH3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基、硬脂酰基和
在还另一个实施方案中，A′选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、并且
E′是
在又另一个实施方案中，A′是
在另一个实施方案中，E′选自H、-C(O)CH3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基和硬脂酰基。
在又另一个实施方案中，E′选自H和-C(O)CH3。
在还另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ia的肽-寡核苷酸缀合物：
在式I和Ia的实施方案中，R5是-C(O)(O-烷基)xOH，其中每个烷基对于每次出现独立地是C2-6-烷基。
在式I和Ia的另一个实施方案中，R5是-C(O)(O-CH2CH2)3OH。
在另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ib的肽-寡核苷酸缀合物：
在式I和Ib的一个实施方案中，E′选自H、C1-6烷基、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
在式I和Ib的另一个实施方案中，E′选自H和-C(O)CH3。
在式I、Ia和Ib的一个实施方案中，每个R10独立地是选自氟、氯、溴和碘的卤素。
在式I，Ia和Ib的另一个实施方案中，每个R10是氟。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，M是
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，两个氨基酸侧链基团在每次出现时独立地是半胱氨酸或高半胱氨酸氨基酸侧链基团。
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，每个J在每次出现时独立地选自α-氨基酸、β2-氨基酸和β3-氨基酸。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，r和q各自是0。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，J独立地选自半胱氨酸和精氨酸。
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，两个J基团是半胱氨酸。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，z是8-25。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，z是15-25。
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，z是10-20。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，每个R1独立地是NR3R4，其中每个R3和R4在每次出现时独立地是C1-3-烷基。
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，每个R1是N(CH3)2。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，每个R2是核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤和脱氮-嘌呤的C4-6-杂环。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，每个R2是核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自嘧啶、嘌呤和脱氮-嘌呤的C4-6-杂环。
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，每个R2是核碱基，所述核碱基在每次出现时独立地选自腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，每个R2是核碱基，所述核碱基在每次出现时独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-和
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，L选自甘氨酸和
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，L是甘氨酸。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，G选自H、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
在式I、Ia和Ib的还另一个实施方案中，G是H或-C(O)CH3。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，G是-C(O)CH3。
在式I、Ia和Ib的另一个实施方案中，d是1。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，d是0。
在式I、Ia和Ib的又另一个实施方案中，
选自：
在还另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ic的肽-寡核苷酸缀合物：
在又另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Id的肽-寡核苷酸缀合物：
在另一个实施方案中，式I的肽-寡核苷酸缀合物是式Ie的肽-寡核苷酸缀合物：
在另一方面，本文提供式IV的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
A′选自-NHCH2C(O)NH2、-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
其中
R5是-C(O)(O-烷基)x-OH，其中x是3-10并且每个烷基在每次出现时独立地是C2-6-烷基，或R5选自-C(O)C1-6烷基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、-(C1-6-烷基)R6、-(C1-6杂烷基)-R6、芳基-R6、杂芳基-R6、-C(O)O-(C1-6烷基)-R6、-C(O)O-芳基-R6、-C(O)O-杂芳基-R6和
其中R6选自OH、SH和NH2，或者R6是O、S或NH，其共价连接至固体支持体；
每个R1独立地选自OH和-NR3R4，其中每个R3和R4在每次出现时独立地是-C1-6烷基；
每个R2独立地选自H、核碱基和用化学保护基官能化的核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤和脱氮-嘌呤的C3-6杂环；
z是8或-40；并且
E′选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
其中
Q是-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，
R7是-(CH2)2OC(O)N(R8)2，其中R8是-(CH2)6NHC(＝NH)NH2，并且R11选自OH和-NR3R4，
其中L通过酰胺键共价连接至J的羧基末端，并且L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-和
t是4-9；
每个J在每次出现时独立地选自以下结构的氨基酸：
其中：
r和q各自独立地是0、1、2、3或4，并且
每个R9在每次出现时独立地选自H、氨基酸侧链和用化学保护基官能化的氨基酸侧链，
其中R9的两个或更多个氨基酸侧链基团在每次出现时独立地包含硫，其中硫原子中的两个与它们所连接的原子一起形成结构并且
G共价连接至J的氨基末端，并且G选自H、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且
其中以下条件中的至少一个为真：
1)A′是2)E′是或3)E′是
在式IV的一个实施方案中，d是1。
在式IV的另一个实施方案中，E′选自H、-C(O)CH3和
在式IV的还另一个实施方案中，A′选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
并且
E′是
在式IV的又另一个实施方案中，A′是
在式IV的另一个实施方案中，E′选自H和-C(O)CH3。
在式IV的还另一实施方案中，M是
在式IV的还另一个实施方案中，每个J在每次出现时独立地选自α-氨基酸、β2-氨基酸和β3-氨基酸。
在式IV的又另一个实施方案中，r和q各自是0。
在式IV的另一个实施方案中，J独立地选自半胱氨酸和精氨酸。
在式IV的另一个实施方案中，z是15-25。
在式IV的又另一个实施方案中，z是10-20。
在式IV的还另一个实施方案中，每个R1是N(CH3)2。
在式IV的又另一个实施方案中，每个R2是核碱基，所述核碱基在每次出现时独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤。
在式IV的又另一个实施方案中，L是甘氨酸。
在式IV的另一个实施方案中，G选自H、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
在式IV的又另一个实施方案中，G是-C(O)CH3。
在又另一个实施方案中，寡核苷酸包含与RNA靶标具有序列互补性的靶向序列。在具体实施方案中，RNA靶标是细胞RNA靶标。在另一个具体实施方案中，靶向序列具有足够的序列互补性以结合RNA靶标。在又另一个具体实施方案中，靶向序列与RNA靶标具有完美的序列互补性。
本公开的代表性
部分尤其包括以下式的部分：
本公开的代表性肽-寡核苷酸缀合物尤其包括以下结构的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中
G选自H和-C(O)CH3；并且
E′选自H和-C(O)CH3。
在本公开的肽-寡核苷酸缀合物的一个实施方案中，G是H。
在本公开的肽-寡核苷酸缀合物的另一个实施方案中，G是-C(O)CH3。
在本公开的肽-寡核苷酸缀合物的还另一个实施方案中，E′是H。
在本公开的肽-寡核苷酸缀合物的又另一个实施方案中，E′是-C(O)CH3。
在本公开的肽-寡核苷酸缀合物的还另一个实施方案中，E′和G是-C(O)CH3。
在本公开的肽-寡核苷酸缀合物的又另一个实施方案中，G是-C(O)CH3并且E′是H。
在一些实施方案中，本文所述的肽-寡核苷酸缀合物未溶剂化。在其他实施方案中，一种或多种肽-寡核苷酸缀合物呈溶剂化形式。如本领域所知，溶剂化物可以是任何药学上可接受的溶剂，诸如水、乙醇等。
尽管以中性形式绘示了式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie和IV的肽-寡核苷酸缀合物，但是在一些实施方案中，这些肽-寡核苷酸缀合物以药学上可接受的盐形式使用。
寡核苷酸
基于吗啉代的亚基的重要特性包括：1)能够以寡聚体形式由稳定的不带电或带正电的主链键连接的能力；2)支持核苷酸碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-甲基-胞嘧啶和次黄嘌呤)使得所形成的聚合物可与包括靶RNA的互补碱基靶核酸杂交的能力，相对短的寡核苷酸(例如，10-15个碱基)的TM值高于约45℃；3)寡核苷酸主动地或被动地转运到哺乳动物细胞中的能力；和4)寡核苷酸和寡核苷酸：RNA异源双链体分别耐受RNA酶和RNA酶H降解的能力。
寡聚体与靶序列之间形成的双链体的稳定性随结合TM和双链体对细胞酶裂解的易受性而变化。寡聚体相对于互补序列RNA的TM可以通过常规方法测量，所述方法诸如由Hames等，Nucleic Acid Hybridization，IRL Press，1985，第107-108页所述的那些或如Miyada C.G.和Wallace R.B.，1987，Oligomer Hybridization Techniques，MethodsEnzymol.第154卷第94-107页中所述的那些。在某些实施方案中，反义寡聚体相对于互补序列RNA可具有大于体温，并且在一些实施方案中大于约45℃或50℃的结合TM。还包括了在60℃-80℃或更大范围内的TM。根据熟知原理，寡聚体相对于基于互补性的RNA杂交体的TM可以通过增加双链体中C∶G配对碱基的比例或增加异源双链体的长度(碱基对)或通过两者来增加。同时，为了优化细胞摄取，限制寡聚体的大小可能是有利的。为此，本公开的化合物包括在25个碱基或更少的长度下具有高TM(45-50℃或更高)的化合物。
寡核苷酸的长度可为变化的，只要其能够选择性地结合在前体mRNA分子内的预定位置。此类序列的长度可根据本文所述的选择程序确定。通常，寡核苷酸的长度为约8个核苷酸至约50个核苷酸。例如，寡核苷酸的长度(z)可以是8-38、8-25、15-25、17-21或约18。然而，应了解在本文所述的方法中可使用在该范围内的任何核苷酸长度。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸含有碱基修饰或取代。例如，可以选择某些核碱基来增加本文所述的反义寡核苷酸的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。已显示5-甲基胞嘧啶取代物使核酸双链体稳定性增加0.6℃-1.2℃，并且可掺入到本文所述的反义寡核苷酸中。在一个实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘧啶碱基包括5-取代的嘧啶碱基，其中嘧啶碱基选自由胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶组成的组。在一个实施方案中，5-取代的嘧啶碱是5-甲基胞嘧啶。在另一个实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘌呤碱基包括N-2、N-6取代的嘌呤碱基。在一个实施方案中，N-2、N-6取代的嘌呤碱基是2，6-二氨基嘌呤。
基于吗啉代的寡聚体(包括反义寡聚体)详述于例如美国专利号5,698,685；5217866；5142047；5,034,506；5166315；5185444；5,521,063；5,506,337和未决的美国专利申请号12/271,036；12/271040；和PCT公布号WO/2009/064471和WO/2012/043730和Summerton等1997，Antisense and Nucleic Acid Drug Development，7,187-195，其通过引用整体并入本文。
因此，在一方面，本文提供式II的寡核苷酸：
或其药学上可接受的盐，
其中
A选自由以下各项组成的组：OH、-NHCH2C(O)NH2、-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2和
R5是-C(O)(O-烷基)x-OH，其中x是3-10并且每个烷基在每次出现时独立地是C2-6-烷基，或R5选自由以下各项组成的组：-C(O)C1-6烷基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、-C1-6-烷基-R6、-C1-6杂烷基-R6、-芳基-R6、-杂芳基-R6、-C(O)O-C1-6烷基-R6、-C(O)O-芳基-R6和-C(O)O-杂芳基-R6；
R6选自由OH、SH和NH2组成的组，或者R6是O、S或NH，其共价连接至固体支持体；
每个R1独立地是OH或-NR3R4；
每个R3和R4在每次出现时独立地是-C1-6-烷基；
每个R2独立地选自由H、核碱基和用化学保护基官能化的核碱基组成的组，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自由吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤和脱氮-嘌呤组成的组的C3-6-杂环；
z是8-40；
E选自由以下各项组成的组：H、-C1-6-烷基、-C(O)C1-6-烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
Q是-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-；
R7是-(CH2)2OC(O)N(R8)2；
R8是-(CH2)6NHC(＝NH)NH2；
R12是-C(O)NHC1-6-烷基或-C(O)OC1-6-烷基；并且
R13选自由三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基和三甲氧基三苯甲基组成的组。
在式II的一个实施方案中，A是
E选自由以下各项组成的组：H、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基；
R5是-C(O)(O-烷基)xOH，其中每个烷基在每次出现时独立地是-C2-6-烷基、三苯甲基和4-甲氧基三苯甲基；并且
每个R2独立地是核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自由吡啶、嘧啶、嘌呤和脱氮-嘌呤组成的组的C4-6-杂环。
在式II的另一个实施方案中，R5是-C(O)(O-CH2CH2)3OH；并且
每个R2独立地是核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含嘧啶或嘌呤。
在还另一个实施方案中，式II的寡核苷酸是式IIa的寡核苷酸：
在式II和IIa的一个实施方案中，R2是在每次出现时独立地是腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤；并且
每个R1是-N(CH3)2。
表1中提供了如本文所述的核苷酸的各种实施方案。
表1：核苷酸部分的各种实施方案。
在一些实施方案中，本文所述的寡核苷酸未溶剂化。在其他实施方案中，一种或多种寡核苷酸呈溶剂化形式。如本领域所知，溶剂化物可以是任何药学上可接受的溶剂，诸如水、乙醇等。
尽管以中性形式绘示了式II和IIa的寡核苷酸，但是在一些实施方案中，这些寡核苷酸以药学上可接受的盐形式使用。
肽
本文提供的寡核苷酸包括与CPP缀合的寡核苷酸部分。在一些实施方案中，CPP可以是有效增强化合物向细胞中的转运的富精氨酸肽转运部分。在一些实施方案中，转运部分连接至寡聚体的末端。肽具有在给定细胞培养群体的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括之间的所有整数)细胞内诱发细胞穿透的能力并允许在全身性施用时在体内多个组织内大分子易位。在一个实施方案中，细胞穿透肽可为富精氨酸肽转运蛋自。在各种实施方案中，本公开的肽-寡核苷酸缀合物可利用甘氨酸作为CPP与反义寡核苷酸之间的接头。
已经显示，相对于在不存在连接的转运部分下对寡聚体的摄取，如上所述的转运部分大大增强连接的寡聚体的细胞进入。相对于未缀合的化合物，摄取可增强至少十倍，并且在一些实施方案中增强二十倍。
富精氨酸肽转运蛋白(即，细胞穿透肽)的使用特别可用于实施本公开。已经显示某些肽转运蛋白在递送反义化合物到包括肌细胞的原代细胞方面非常有效。此外，与其他已知肽转运蛋白(诸如Penetratin和Tat肽)相比较，在与反义PMO缀合时，本文所述的肽转运蛋白展示出改变若干种基因转录物的剪接的能力增强。
因此，在一方面，本文提供式III的肽：
G-(J)t-L
(III)
或其药学上可接受的盐，
其中
G选自由以下各项组成的组：H、C(O)C1-6-烷基、苯甲酰基和硬脂酰基；
每个J在每次出现时独立地选自以下结构的氨基酸：
每个R9在每次出现时独立地选自由H、氨基酸侧链和用化学保护基官能化的氨基酸侧链组成的组；
其中R9的两个或更多个氨基酸侧链基团在每次出现时独立地包括硫醇或用化学保护基官能化的硫醇；
r和q独立地是0、1、2、3或4；
L选自由-NH(CH2)1-6C(O)OH、-NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)OH和组成的组，所述各项中的每一个可共价连接至固体支持体；并且
t是4-9。
在一个实施方案中，两个氨基酸侧链基团(其中两个氨基酸侧链基团中的每一个独立地包含硫)与它们所连接的原子一起形成结构
M选自由以下组成的组：
并且
d是0或1。
在另一实施方案中，M是
在又另一个实施方案中，两个氨基酸侧链基团在每次出现时独立地是半胱氨酸或高半胱氨酸氨基酸侧链基团。
在还另一个实施方案中，每个J在每次出现时独立地选自α-氨基酸、β2-氨基酸和β3-氨基酸。
在另一个实施方案中，r和q各自是0。
在另一个实施方案中，J独立地选自半胱氨酸和精氨酸。
在又另一个实施方案中，两个J基团是半胱氨酸。
在还另一个实施方案中，L选自-NH(CH2)1-6C(O)OH和
在另一个实施方案中，L是
在又另一个实施方案中，L是NHCH2C(O)OH。
在又另一个实施方案中，G选自由以下各项组成的组：H、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
在还另一个实施方案中，G是-C(O)CH3或硬脂酰基。
在另一个实施方案中，G是-C(O)CH3。
在又另一个实施方案中，G共价连接至J的氨基末端。在另一个实施方案中，L通过酰胺键共价连接至J的羧基末端。
在另一个实施方案中，d是0。
在又另一个实施方案中，d是1。
表2中提供了如本文所述的代表性肽。
表2：示例性肽
在一些实施方案中，本文所述的肽未溶剂化。在其他实施方案中，一种或多种肽呈溶剂化形式。如本领域所知，溶剂化物可以是任何药学上可接受的溶剂，诸如水、乙醇等。
尽管以中性形式绘示了式III的肽，但是在一些实施方案中，这些寡核苷酸以药学上可接受的盐形式使用。
一般合成流程
流程Ia：肽的装订(Stapling)
流程Ib：将肽缀合至PMO的3’端
流程Ic：将肽缀合至PMO的5’端
流程IIa：将二硫化物肽缀合至PMO的3’端
流程IIa的方法适用于在类似条件下将肽缀合至PMO的5’端(参见流程Ic)。
流程IIb：肽-PMO缀合物的装订
流程IIb的方法适用于在类似条件下将肽缀合至PMO的5’端。
流程IIIa：使用肽和PMO的一步法缀合和装订
流程IIIb：使用肽和PMO的一步法缀合和装订
方法
本文提供在有需要的受试者中治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，其包括向受试者施用式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie或V的肽-寡核苷酸缀合物。
因此，在一方面，本文提供在有需要的受试者中治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，其包括向受试者施用本公开的肽-寡核苷酸缀合物。
在一个实施方案中，肌肉疾病是杜兴肌营养不良。
在另一个实施方案中，病毒感染是由选自由以下各项组成的组的病毒引起的：马尔堡病毒、埃博拉病毒、流感病毒和登革病毒。
在另一个实施方案中，细菌感染由结核分枝杆菌引起。
本文考虑的受试者通常是人类。然而，受试者可以是需要治疗的任何哺乳动物。因此，本文所述的方法可以应用于人类和兽医应用。
施用/剂量
治疗组合物的配制和其后续施用(给药)在本领域的技术人员的技能范围内。剂量取决于所欲治疗的疾病病况的严重性和反应性，其中治疗过程持续若干天至若干个月，或者直至实现疾病病况的足够减少。最佳给药时程可从患者体内药物积累的测量值计算出来。
本领域的普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可根据个别寡聚体的相对效力而改变，并且通常可基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50进行估算。一般来说，剂量是0.01μg至100g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或者甚至每2至20年给予一次。本领域的普通技术人员可以根据所测得的药物在体液或组织中的滞留时间和浓度容易地估算出给药的重复率。成功治疗后，可能需要对患者进行维持疗法以防止疾病病况复发，其中寡聚体以维持剂量施用，所述维持剂量在0.01μg至100g/kg体重的范围内，每天一次或多次至每20年一次。
在一些实施方案中，寡核苷酸(式II或IIa的寡核苷酸)单独施用。
在一些实施方案中，寡核苷酸以治疗有效量或剂量施用。“治疗有效量”是式II或IIa的寡核苷酸当单独施用于患者时有效治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的量。对于特定受试者，在给定情况下被证明为“治疗有效量”的量可能并不是对针对所考虑的疾病或病状进行类似治疗的100％受试者有效，但是此类剂量仍被本领域技术人员认为是“治疗上有效量”。对应于治疗有效量的寡核苷酸的量强烈取决于疾病类型、疾病阶段、被治疗的患者年龄以及其他事实。
在不同的实施方案中，根据式II或IIa的寡核苷酸和使用的有效量，寡核苷酸可以调节涉及肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的基因的表达。
尽管式II或IIa的寡核苷酸的量应使得有效治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染，但是所述量优选对患者不是过度有毒的(即，所述量优选在如由医学指南确定的毒性限值内)。在一些实施方案中，为了防止肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的过度毒性或提供对其更有效的治疗，或两者，提供了对总施用剂量的限制。通常，本文考虑的量是按天计的；然而，本文也考虑半日和两日或者三日的周期。
不同的剂量方案可以用于治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，每日剂量(诸如上述示例性剂量中的任何一种)每天施用一次、两次、三次或四次，持续三、四、五、六、七、八、九或十天。根据所治疗的疾病的阶段和严重性，可以伴随高剂量采用较短的治疗时间(例如至多五天)或可以伴随低剂量采用较长的治疗时间(例如，十天或更多天、或数周、或一个月或更长)。在一些实施方案中，每隔一天施用一次或两次日剂量。
式II和IIa的寡核苷酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物形式可以纯的形式或以适当的药物组合物通过本领域已知的任何可接受的施用模式或药剂来施用。寡核苷酸可以通过例如口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内或皮下)、局部、透皮、阴道内、膀胱内、脑池内或直肠施用。剂型可以是例如固体、半固体，冻干粉或液体剂型，例如像片剂、丸剂、软弹性或硬明胶胶囊、粉剂、溶液剂、混悬剂、栓剂、气雾剂等，例如呈适于简单施用精确剂量的单位剂量的形式。一种具体施用途径是口服，具体地可根据待治疗的疾病的严重性程度调节合宜日剂量方案的口服。
辅剂和佐剂可包括例如防腐剂、湿润剂、混悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、乳化剂和分散剂。对微生物作用的防止通常通过各种抗菌剂和抗真菌剂来提供，所述抗菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚和山梨酸等。还可以包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，使可注射药物形式的吸收延长。辅剂还可包括润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂和抗氧化剂，例如像柠檬酸、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
固体剂型可制备有包衣和外壳，诸如肠溶衣和本领域中已知的其他包衣和外壳。它们可以含有安慰剂(pacifying agent)并且可以是在肠道某个部分以延迟的方式释放一种或多种活性寡核苷酸的那些组合物。可使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。活性寡核苷酸也可呈微囊形式，适当时，具有一种或多种以上提及的赋形剂。
用于口服的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。此类剂型是例如通过将本文所述的HDAC抑制剂或视黄酸、或其药学上可接受的盐和任选的药物佐剂溶解、分散(等等)于以下中由此形成溶液或混悬液来制备：载体，例如像水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等；增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油，具体是棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等。
一般来说，根据预定施用方式，药学上可接受的组合物将含有约1重量％至约99重量％的本文所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，和99重量％至1重量％的药学上可接受的赋形剂。在一个实例中，组成为约5重量％与约75重量％之间的如本文所述的寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其余为合适药用赋形剂。
对本领域技术人员来说，制备此类剂型的实际方法是已知的，或将是显而易见的。参考例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1990)。
试剂盒
在其他实施方案中，提供试剂盒。根据本公开的试剂盒包括包含本公开的寡核苷酸、肽、肽-寡核苷酸缀合物或组合物的包装件。在一些实施方案中，试剂盒包括根据式I、Ia、Ib、Ic、Id、Ie或V的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，试剂盒包括根据式II或IIa的寡核苷酸或其药学上可接受的盐。在其他实施方案中，试剂盒包括根据式III的肽或其药学上可接受的盐。
短语“包装件”意指含有本文所呈现的寡核苷酸或组合物的任何器皿。在一些实施方案中，包装件可以是盒子或包装纸。用于包装药学产品的包装材料是本领域技术人员所熟知的。药物包装材料的实例包括但不限于瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适用于选定制剂和施用和治疗的预定方式的任何包装材料。
试剂盒还可以包含不在包装件内而是附接在包装件外部的物品，例如移液器。
试剂盒可以进一步包括用于向患者施用本公开的寡核苷酸或组合物的说明书。试剂盒还可以包括由管理机构(例如美国食品和药品管理局)已批准的本文寡核苷酸的用途的说明书。试剂盒也可以包含寡核苷酸的标签或产品插页。包装件或任何产品插页或两者它们本身可通过管理局的批准。试剂盒可以包括在包装件中的固相或液相(诸如所提供的缓冲液)中的寡核苷酸。试剂盒还可以包括用于制备用于实施所述方法的溶液的缓冲液，以及用于将液体从一个容器转移到另一个容器的移液器。
具体实施方式
本发明还涉及以下实施方案：
1.一种式I的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
A′选自-NHCH2C(O)NH2、-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
其中
R5是-C(O)(O-烷基)x-OH，其中x是3-10并且每个烷基在每次出现时独立地是C2-6-烷基，或R5选自-C(O)C1-6烷基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、-(C1-6-烷基)R6、-(C1-6杂烷基)-R6、芳基-R6、杂芳基-R6、-C(O)O-(C1-6烷基)-R6、-C(O)O-芳基-R6、-C(O)O-杂芳基-R6和
其中R6选自OH、SH和NH2，或者R6是O、S或NH，其共价连接至固体支持体；
每个R1独立地选自OH和-NR3R4，其中每个R3和R4在每次出现时独立地是-C1-6烷基；
每个R2独立地选自H、核碱基和用化学保护基官能化的核碱基，其中所述核碱基在每次出现时独立地包含选自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤和脱氮-嘌呤的C3-6杂环；
z是8或-40；并且
E′选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
其中
Q是-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，
R7是-(CH2)2OC(O)N(R8)2，其中R8是-(CH2)6NHC(＝NH)NH2，并且
R11选自OH和-NR3R4，
其中L通过酰胺键共价连接至J的羧基末端，并且L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-和
t是4-9；
每个J在每次出现时独立地选自以下结构的氨基酸：
其中：
r和q各自独立地是0、1、2、3或4，并且
每个R9在每次出现时独立地选自H、氨基酸侧链和用化学保护基官能化的氨基酸侧链，
其中R9的两个或更多个氨基酸侧链基团在每次出现时独立地包含硫，其中所述硫原子中的两个与它们所连接的原子一起形成结构
其中d是0或1；并且M选自：
其中每个R10在每次出现时独立地是H或卤素；并且
G共价连接至J的氨基末端，并且G选自H、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且
其中以下条件中的至少一个为真：
1)A′是2)E′是或3)E′是
2.如实施方案1所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中E′选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基和
3.如实施方案1所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中A′是
或E′是
4.如实施方案1中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
A′选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
5.如实施方案1-4中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中E′选自H、-C(O)CH3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基、硬脂酰基和
6.如实施方案1-5中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中A′选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、 并且
E′是
7.如实施方案1所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中A′是并且
E′选自H、-C(O)CH3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基和硬脂酰基。
8.如实施方案1所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述式I的肽-寡核苷酸缀合物是选自以下各项的肽-寡核苷酸缀合物：
9.如实施方案1或8所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述肽-寡核苷酸缀合物具有所述式(Ia)并且R5是C(O)(O-CH2CH2)3OH。
10.如实施方案1或8所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述肽-寡核苷酸缀合物具有所述式(Ib)并且E′选自H、C1-6-烷基、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
11.如实施方案1-10中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中每个R10是氟。
12.如实施方案1-11中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
M是
13.如实施方案1-12中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
J独立地选自半胱氨酸和精氨酸。
14.如实施方案1-13中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
两个J基团是半胱氨酸。
15.如实施方案1-14中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
z是8-25。
16.如实施方案1-15中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中每个R1是N(CH3)2。
17.如实施方案1-16中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
每个R2是核碱基，所述核碱基在每次出现时独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤。
18.如实施方案1-17中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-和
19.如实施方案1-18中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
L选自甘氨酸和
20.如实施方案1-19中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
L是甘氨酸。
21.如实施方案1-20中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
G选自H、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
22.如实施方案1-21中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
G是H和-C(O)CH3。
23.如实施方案1-22中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中
G是-C(O)CH3。
24.如实施方案1-23所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中d是1。
25.如实施方案1-23中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中d是0。
26.如实施方案1-24中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中选自：
27.如实施方案1-24和26中任一项所述的肽-寡核苷酸缀合物或其药学上可接受的盐，其中所述肽-寡核苷酸缀合物选自：
其中
G选自H和-C(O)CH3；并且
E′选自H和-C(O)CH3。
28.如实施方案27所述的肽-寡核苷酸缀合物，其中G是H。
29.如实施方案27所述的肽-寡核苷酸缀合物，其中G是-C(O)CH3。
30.如实施方案27所述的肽-寡核苷酸缀合物，其中E′是H。
31.如实施方案27所述的肽-寡核苷酸缀合物，其中E′是-C(O)CH3。
32.如实施方案27所述的肽-寡核苷酸缀合物，其中E′和G是-C(O)CH3。
33.如实施方案27所述的肽-寡核苷酸缀合物，其中G是-C(O)CH3并且E′是H。
实施例
下文阐述的实施例是用于说明的目的以及描述本公开的某些具体实施方案。然而，权利要求的范围并不以任何方式受到本文阐述的实施例的限制。对于本领域技术人员而言，对所公开的实施方案的各种改变和修改将是显而易见的，并且可以在不背离本公开的精神和所附权利要求的范围的情况下做出此类改变和修改，包括但不限于与本公开的化学结构、取代基、衍生物、制剂或方法有关的那些。本文流程中的结构中变量的定义与本文呈现的式中对应位置的变量相称。
实施例1：A用于使用六氟苯进行肽装订的方案
向玻璃小瓶中的环状二硫化物肽Ac-CRRRCRRRG-OH(74.8mg，38.5μmol)(SEQ IDNO：3)中加入TRIS碱(8mL，50mM，于DMF中)和六氟苯(111μL，962μmol)的溶液。向该溶液中加入TCEP的H2O溶液(136μL，0.71M，pH＝8)以还原二硫键并引发反应。将反应混合物在室温下搅拌7小时，并通过LC-MS监测。将所得混合物用40mL 0.1％TFA水溶液稀释、离心、过滤，并通过HPLC进行纯化。将含有肽产物的级分(通过LC-MS进行分析)合并，并冻干，得到所需的全氟芳基肽(19.9mg，8.9μmol，23％收率)。
实施例2：A用于使用十氟联苯进行肽装订的方案
在玻璃小瓶中，将环状二硫化物肽Ac-CRRRCRRRG-OH(74.5mg，38.4μmol)(SEQ IDNO：3)和十氟联苯(25.6mg，76.7μmol)溶解在TRIS碱的DMF溶液(8mL，50mM)中。向该溶液中加入TCEP的H2O溶液(135μL，0.71M，pH～8)以还原二硫键并引发反应。将反应混合物在室温下搅拌7小时，并通过LC-MS监测。将所得混合物用TFA水溶液(40mL 0.1％)稀释、离心、过滤，并通过HPLC进行纯化。将含有肽产物的级分通过LC-MS进行分析、合并，并冻干，得到最终的全氟芳基肽(20mg，8.9μmol，23％收率)。
实施例3：用于肽缀合的方案
向在塑性微量离心管中的PMO(核碱基序列(R2)是：GCT ATT ACC TTA ACC CAG(SEQ ID NO：9)；10.7mg，1.72μmol)和十氟联苯肽Ac-CRRRCRRRG-OH(5.9mg，2.64umol)的混合物中加入DMSO(0.4mL)、于DMSO中的HATU(6.6μL，2.64μmol，0.4M)和DIPEA(2.3μL，13.2μmol)。将管中的内容物混合并在室温下静置2小时。用水(8mL)稀释所得混合物，并且依序进行弱阳离子交换(CM Sepharose)和固相萃取(Amberchrom CG 300M)。将所得产物通过LC-MS和MALDI-TOF MS进行分析，并冻干，得到PMO-肽缀合物(9.8mg，1.26μmol，73％收率)。
实施例4：用于将PMO与环状二硫化物肽一步法缀合接着进行肽装订的方案
向PMO(85mg，0.01mmol，1当量；核碱基序列(R2)：GCTATT ACC TTA ACC CAG(SEQID NO：9))、肽(Ac-Cys-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Cys-Gly-OH或Ac-Cys-Arg-Arg-Arg-Cys-Arg-Arg-Arg-Gly-OH，37mg，各自具有二硫键，2当量)和于DMSO(2mL)中的HATU(8mg，2当量)的溶液中加入二异丙基乙胺(9μL，5当量)。将反应物在室温下搅拌5小时。在加入50mM二硫苏糖醇(DTT)的DMSO溶液(1mL，5当量)、50mM TRIS的DMSO溶液(1mL，5当量)，接着加入六氟苯(60μL，25当量)之后，将反应溶液再搅拌5小时。所需产物通过以下方式获得：进行弱阳离子交换色谱分析(CM-Sepharose)，然后进行固相萃取(Amberchrome CG300M)以脱盐，并且最后冷冻干燥。MALDI/TOF质谱(m/z)：计算值：9975；实测值：9976(M+H)。
实施例5：HeLa细胞测定
图1中的图表(也见表3)在y轴上示出通过Accuri C6流式细胞仪从每个单独细胞读取并通过处理软件求和的e-GFP蛋白绿色荧光发射的“平均荧光强度”。绿色荧光信号条的高度指示基于HeLa-654细胞核中发生的外显子跳跃水平的不同强度，无论细胞是用测试化合物处理还是未处理。条的信号强度或大小也对应于细胞摄取(即，递送到细胞中)的有效性。x轴示出用多种不同的治疗方案测试的测试化合物。各种治疗方案包括随时间的推移对HeLa-654细胞进行的连续处理或脉冲追踪处理，其中将测试化合物与细胞一起温育，然后一段时间(3小时)之后从细胞洗掉，并加入新鲜的不含测试化合物的培养基。
结果：示出了未缀合PMO和未处理细胞的基线活性。本公开的肽/PMO(PPMO)缀合物全部均显示出比以下各项更高的细胞摄取：1)未缀合的PMO，和2)未处理的细胞(其显示出绿色荧光背景信号)。本发明的肽/PMO缀合物与背景或未缀合的PMO之间的这种荧光强度差异表明装订肽/PMO缀合物的显著药理学活性。
在每种情况下，PMO具有以下结构：
其中核碱基序列(包括每次出现独立地选自选自A、G、C或T的核碱基的R2)是：GCTATT ACC TTA ACC CAG(SEQ ID NO：9)。
表3：肽-寡核苷酸缀合物的细胞递送(图1)
平均FL1-H
未处理 36,594.96
PMO 43,039.34
(i，i+4)六-PPMO 3 123,401.08
(i，i+4)十-PPMO 1 87,951.78
(i，i+7)十-PPMO 4 137,184.08
PPMO 3是指以下结构：
其中核碱基序列(包括每次出现独立地选自选自A、G、C或T的核碱基的R2)是：GCTATT ACC TTA ACC CAG(SEQ ID NO：9)。
PPMO 4是指以下结构：
其中核碱基序列(包括每次出现独立地选自选自A、G、C或T的核碱基的R2)是：GCTATT ACC TTA ACC CAG(SEQ ID NO：9)。
实施例6：体内蛋白质和外显子跳跃
如下所述治疗14组，每组5只小鼠(共70只小鼠；65只mdx，5只wt(野生型))，然后分析肌营养不良蛋白和外显子跳跃。
通过尾静脉注射向小鼠给予200μL快速浓注的化合物，然后在注射后8天使其安乐死。收集股四头肌、隔膜、心脏和脑组织(单个结构)，对其进行裂解，并且使用传统蛋白质印迹分析肌营养不良蛋白，并使用RT-PCR和Caliper分析外显子跳跃(参见图2-7)。
测试本公开的化合物的实施方案在体内实现mRNA和蛋白质重塑的能力。在这种情况下，这些测试化合物在mdx小鼠中显示出活性，分别引起外显子23跳跃和肌营养不良蛋白表达的显着增加，如分别通过RT-PCR和蛋白质印迹所示。当在向mdx小鼠给予盐水的阴性对照实验的背景下测量时，该活性尤其明显，所述条件产生基本上为零的外显子23跳跃和肌营养不良蛋白(图4D、5C、5D、6D、7C和7D)。当与两种阳性对照相比时，给予已知活性化合物Ac-R6-Gly-M23D(+7-18)(PPMO 5)的野生型小鼠和mdx小鼠时，测试化合物明显是活性的。在某些情况下，活性比对照更大；例如，PPMO 11(表4)在比阳性对照化合物更低的剂量下在外显子跳跃和肌养蛋白表达方面产生更大的应答(图7B和7D)。因此，测试化合物在七天的体内筛选测定中满足引发正性药理学应答的条件。
在这些研究中使用的本公开的化合物(PPMO)的实施方案具有根据式V的结构：
其中
核碱基序列(包括每次出现独立地选自选自A、G、C或T的核碱基的R2)是：5’-GGCCAA ACC TCG GCT TAC CTG AAA T-3’(SEQ ID NO：14)；并且
R14如表4中所定义的。
表4的化合物根据上述实施例1-4制备。
表4
肌营养不良蛋白蛋白质印迹方安：
1.从-80℃取出组织并手动切碎成小块，根据组织类型加入400-800μL的RIPA裂解缓冲液。
a.TA：400μL，QC：800μL，心脏：400μL
b.裂解缓冲液：RIPA缓冲液(Pierce，目录号89901)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche，目录号04693124001)
2.将约十个2.0mm氧化锆珠(Biospec，目录号11079124zx)加入到管，并且如下使用MagNA Lyser(Roche)裂解组织：
a.5,000rpm，30-40s，在冰上冷却2min。重复这些循环，直到组织完全裂解。
作为氧化锆珠的替代物，使用金属珠(3-5个珠)，3000rpm，20s/个循环(在循环之间在冰上冷却3-5分钟或直到感觉冷)。
3.裂解后，将样品以12，000rpm离心10min，并且将上清液转移到新鲜管，并进行BCA测定以定量蛋白质水平。
4.凝胶电泳：
a.加载标记(Invitrogen，目录号P/NLC5699)，且每泳道加载100μg蛋白质，并且将样品在3-8％Tris乙酸盐凝胶(midi凝胶，Biorad，目录号345-0130)上以50v运行5min；以150v运行1小时，然后以200v运行1.5小时(在凝胶的底部处有71kD标记)。
5.转移：
在4℃、恒定100mA(～25v)，0.45μmPVDF膜(Biorad，目录号1620261)下过夜湿转移(16-18小时)。
6.将膜在TBST中洗涤5min，并在室温(RT)下在于TBST中的10％牛奶(Biorad，目录号170-6404)中封闭1-2小时。
7.用TBST冲洗PVDF膜2-3次，然后在4℃下与于PBS中的5％BSA中的一抗一起孵育过夜。
a.Dys2(Novocastra，Leica Biosystem，目录号NCL-DYS2)1∶30
b.Dys1(Novocastra，Leica Biosystem，目录号NCL-DYS1)1∶1000
c.Mandys8(Sigma，目录号D8168)1∶3000。
8.用TBST洗涤膜(每次10min，3次)，加入HRP缀合的山羊抗小鼠(BioRad，目录号1706516，1∶10000)二抗，在RT下孵育1小时，然后用TBST洗涤(每次10min，3次)。
9.加入Clarity Western ECL底物(Biorad)并在RT下孵育5min，然后用Chemidoc触摸式成像系统可视化。
10.将膜用0.2N NaOH剥离7min，然后在TBST中平衡至少10min。在RT下用于TBST中的10％牛奶封闭印迹1小时。
11.加入α-辅肌动蛋白2抗体(Abcam，兔，目录号ab68168，1∶15000)并在RT下孵育1小时。
12.用TBST洗涤(每次10min，3次)，然后与HRP缀合的山羊抗兔(BioRad，目录号1706515，1∶10000)二抗一起在RT下孵育1小时。
13.用TBST充分洗涤膜，然后如上所述成像。
用于小鼠组织的RNA提取方法：
1.将整个组织块(半股四头肌、半心脏，整个TA...)与MagNA Lyser和金属珠以3000rpm，20/个循环匀化，直到组织裂解良好(在循环之间将样品在冰上冷却3-5分钟或直到感觉冷)。将50-100μL完整裂解物转移到新的96孔板中并与相同体积的RA4缓冲液(来自GE RNAspin试剂盒)混合，然后将裂解物混合物加载到96孔RNAspin板中以进行剩余的纯化步骤。根据试剂盒方案，未用的裂解物(在RA1缓冲液中)在-80℃下保存一年。
2.将样品以5200g离心2min。向RNA结合板的每个孔中加入500μL RA3，并将板以5200g离心2min。丢弃流出液。
3.通过向RNA结合板的每个孔中加入500μL RA2来洗涤膜，并将所述膜以5200g离心2min。
4.向每个孔中加入800μL RA3，并以5200g离心2min。
5.向每个孔中加入500μL RA4，并以5200g离心10min。
6.通过将50μL无RNA酶的水移取到每孔的底部，确保膜完全润湿来将样品洗脱到PCR板(具有圆锥形孔)中。将样品在RT下孵育2min，并以5200g离心3min。如果有任何液体存在于孔中，则将样品在RT下再孵育2分钟，并再次以5200g离心3min。
7.然后在Nanodrop 2000分光光度计上测量RNA浓度。
RT-PCR方案：
用于RT-PCR的引物如下：肌营养不良蛋白外正向：5’-CAATGTTTCTGGATGCAGACTTTGTGG-3’(SEQ ID NO：10)；肌营养不良蛋白外反向：5’-GTTCAGCTTCACTCTTTATCTTCTGCC-3’(SEQ ID NO：11)；肌营养不良蛋白内正向：5’-CACATCTTTGATGGTGTGAGG-3’(SEQ ID NO：12)；肌营养不良蛋白内反向：5’-CAACTTCAGCCATCCATTTCTG-3’(SEQ ID NO：13)。
制备25μL反应物(表5)以用于RT-PCR和初级扩增。根据表6进行RT-PCR程序。
表5：RT-PCR反应混合物
2x反应混合液 12.5μL
Dys内正向引物(10μM) 0.75μL
Dys内反向引物(10μM) 0.75μL
Superscript III Platinum Taq混合液 1uL
模板RNA(RNA样品) 3μL
水。总体积至25μL 7μL
表6：RT-PCR和初级扩增程序
Caliper方案：
RT-PCR完成后，加入25μL PCR缓冲液，并且将总计50μL的反应混合物转移至Caliper板中。基于制造商推荐的方案进行Caliper LabChip生物分析。来自全长肌营养不良蛋白转录物的PCR产物是445bp，并且从外显子23跳跃的mRNA是232bp。
以引用的方式并入
贯穿本申请中所引用的所有文献(包括参考文献、发布的专利、公布的专利申请以及共同未决的专利申请)的内容特此以引用的方式明确整体并入。除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义是一致的。
等同性
本领域的技术人员应认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本公开的特定实施方案的许多相等物。此类等效方案意图包含于下列权利要求中。
序列表
<110> 萨勒普塔医疗公司
<120> 肽寡核苷酸缀合物
<130> 581438: SPT-001PC
<150> 62/163,960
<151> 2015-05-19
<150> 62/337,536
<151> 2016-05-17
<160> 15
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 1
Cys Arg Arg Arg Cys Arg Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 2
Cys Arg Arg Arg Cys Arg Arg Gly
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 3
Cys Arg Arg Arg Cys Arg Arg Arg Gly
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 4
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gly
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 5
Cys Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gly
1 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 6
Cys Arg Arg Arg Arg Cys Gly
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 7
Cys Arg Arg Arg Cys Gly
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽； 对于半胱氨酸修饰参见说明书
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 8
Cys Arg Arg Cys Gly
1 5
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二氨基磷酸酯连接的吗啉代寡聚体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 二氨基磷酸酯连接的吗啉代残基
<400> 9
gctattacct taacccag 18
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌营养不良蛋白外正向引物
<400> 10
caatgtttct ggatgcagac tttgtgg 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌营养不良蛋白外反向引物
<400> 11
gttcagcttc actctttatc ttctgcc 27
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌营养不良蛋白内正向引物
<400> 12
cacatctttg atggtgtgag g 21
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 肌营养不良蛋白内反向引物
<400> 13
caacttcagc catccatttc tg 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 二氨基磷酸酯连接的吗啉代寡聚体
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> 二氨基磷酸酯连接的吗啉代残基
<400> 14
ggccaaacct cggcttacct gaaat 25
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 15
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly
1 5

Claims (35)

1.一种式I的肽-寡核苷酸缀合物：
或其药学上可接受的盐在制备用于治疗杜氏肌营养不良的药物中的用途，
其中：
A’选自-NHCH2C(O)NH2、-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
其中
R5是-C(O)(O-烷基)x-OH，其中x是3-10并且每个烷基在每次出现时独立地是C2-6-烷基，或R5选自-C(O)C1-6烷基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、-(C1-6-烷基)R6、-(C1-6杂烷基)-R6、芳基-R6、杂芳基-R6、-C(O)O-(C1-6烷基)-R6、-C(O)O-芳基-R6、-C(O)O-杂芳基-R6和
其中R6选自OH、SH和NH2，或者R6是O、S或NH，其共价连接至固体支持体；
每个R1独立地选自OH和-NR3R4，其中每个R3和R4在每次出现时独立地是-C1-6烷基；
每个R2独立地是H或核碱基，其中所述核碱基在每次出现时独立地包含选自吡啶、嘧啶、三嗪、嘌呤和脱氮-嘌呤的C3-6杂环；
z是8-40；并且
E’选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
其中
Q是-C(O)(CH2)6C(O)-或-C(O)(CH2)2S2(CH2)2C(O)-，
R7是-(CH2)2OC(O)N(R8)2，其中R8是-(CH2)6NHC(＝NH)NH2，并且
R11选自OH和-NR3R4，
其中L通过酰胺键共价连接至J的羧基末端，并且L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)1-6C(O)NH(CH2)1-6C(O)-和t是4-9；
每个J在每次出现时独立地选自以下结构的氨基酸：
其中：
r和q各自独立地是0、1、2、3或4，并且
每个R9在每次出现时独立地是H或氨基酸侧链，
其中R9的两个或更多个氨基酸侧链基团在每次出现时独立地包含硫，其中所述硫原子中的两个与它们所连接的原子一起形成结构
其中d是0或1；并且M选自：
其中每个R10在每次出现时独立地是H或卤素；并且
G共价连接至J的氨基末端，并且G选自H、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基和硬脂酰基，并且
其中以下条件中的至少一个为真：
1)A’是2)E’是或3)E’是
2.如权利要求1所述的用途，其中E’选自H、-C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基和
3.如权利要求1所述的用途，其中A’是
或E’是
4.如权利要求1所述的用途，其中
A’选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、
5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中E’选自H、-C(O)CH3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基、硬脂酰基和
6.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中A’选自-N(C1-6-烷基)CH2C(O)NH2、并且
E’是
7.如权利要求1所述的用途，其中A’是并且
E’选自H、-C(O)CH3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基和硬脂酰基。
8.如权利要求1所述的用途，其中所述式I的肽-寡核苷酸缀合物是选自以下各项的肽-寡核苷酸缀合物：
9.如权利要求1或8所述的用途，其中所述肽-寡核苷酸缀合物具有所述式(Ia)并且R5是-C(O)(O-CH2CH2)3OH。
10.如权利要求1或8所述的用途，其中所述肽-寡核苷酸缀合物具有所述式(Ib)并且E’选自H、C1-6-烷基、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
11.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中每个R10是氟。
12.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
M是
13.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
J独立地选自半胱氨酸和精氨酸。
14.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
两个J基团是半胱氨酸。
15.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
z是8-25。
16.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中每个R1是N(CH3)2。
17.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
每个R2是核碱基，所述核碱基在每次出现时独立地选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶和次黄嘌呤。
18.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
L选自-NH(CH2)1-6C(O)-、-NH(CH2)5C(O)NH(CH2)2C(O)-和
19.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
L选自甘氨酸和
20.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
L是甘氨酸。
21.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
G选自H、-C(O)CH3、苯甲酰基和硬脂酰基。
22.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中
G是H和-C(O)CH3。
23.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中G是-C(O)CH3。
24.如权利要求1-4和7-8所述的用途，其中d是1。
25.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中d是0。
26.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中选自：
27.如权利要求1-4和7-8中任一项所述的用途，其中所述肽-寡核苷酸缀合物选自：
其中
G选自H和-C(O)CH3；并且
E’选自H和-C(O)CH3。
28.如权利要求27所述的用途，其中G是H。
29.如权利要求27所述的用途，其中G是-C(O)CH3。
30.如权利要求27所述的用途，其中E’是H。
31.如权利要求27所述的用途，其中E’是-C(O)CH3。
32.如权利要求27所述的用途，其中E’和G是-C(O)CH3。
33.如权利要求27所述的用途，其中G是-C(O)CH3并且E’是H。
34.如权利要求1所述的用途，其中R2是用化学保护基官能化的核碱基。
35.如权利要求1所述的用途，其中R9是用化学保护基官能化的氨基酸侧链。
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