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CN114672073A - 一种益生活性复合多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种益生活性复合多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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CN114672073A
CN114672073A CN202210391930.9A CN202210391930A CN114672073A CN 114672073 A CN114672073 A CN 114672073A CN 202210391930 A CN202210391930 A CN 202210391930A CN 114672073 A CN114672073 A CN 114672073A
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South China University of Technology SCUT
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Abstract

本发明公开了一种益生活性复合多糖及其制备方法与应用。本发明的复合多糖为枸杞多糖和海带多糖的组合物。枸杞多糖和海带多糖分别经破碎、去杂、果胶酶和纤维素酶酶解、中温酸性pH提取、离心、浓缩、醇沉、复溶、透析、浓缩、冻干工艺制备而成，再按一定的质量比组合制成复合多糖。该复合多糖显著促进4类肠道有益菌(拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌)的增殖，可应用于食品及保健品中。

Description

一种益生活性复合多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于枸杞、海带精深加工技术领域，具体涉及一种益生活性复合多糖及其制备方法与应用。
背景技术
肠道微生物群由种类繁多、数量庞大的微生物组成，人类与肠道微生物群形成复杂的互作、动态平衡的共生关系。通常地，人体肠道内的微生物群紊乱与多种疾病有关，包括肥胖、糖尿病、自身免疫调节、心血管疾病和炎症性肠病等。益生菌是指对人体健康有益的一类微生物。传统的益生菌为双歧杆菌属(Bifidobacterium)和乳酸杆菌属(Lactobacillus)，能调节肠道微生物群落的多样性和结构，也可以通过降低肠道屏障通透性、调节肠道黏膜免疫反应、维持葡萄糖稳态以及减少脂肪堆积和炎症等途径发挥改善消化类疾病和代谢类疾病的作用。此外，还有一些与宿主具有共生关系的细菌也具有改善特定疾病的作用，被称为新一代益生菌，例如拟杆菌(Bacteroides)和产丁酸菌。拟杆菌具有酵解多糖的能力，酵解产物短链脂肪酸能在多个方面发挥作用，有利于人体健康。产丁酸菌不是进化上的特定分支，而是一个功能类群，在维持肠粘膜屏障功能、提高免疫和促进营养素的消化吸收等方面发挥作用。常见的产丁酸菌有普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)和罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)。肠道微生物群的组成受饮食、疾病状态、药物和遗传等多种因素影响，制定合理的饮食策略能针对性地改善肠道微生物多样性，尤其是益生元的摄入与补充可以调节肠道微生物群的组成，改善宿主健康情况。
益生元是不被宿主消化吸收但可以选择性地刺激宿主体肠道微生物生长，并对宿主自身健康有利的一类物质，其分解的主要产物为短链脂肪酸。常见的益生元种类主要为菊粉和低聚糖，现代研究发现多糖作为新型益生元拥有巨大潜力。然而，不同结构的多糖只能对特定的肠道微生物发挥促增殖作用，导致单一多糖对肠道微生物的作用不具有广谱性，复合多糖将成为今后产品开发的主要方向。
枸杞多糖是我国传统药食同源中药材枸杞的主要活性成分，是一种富含鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)结构的果胶多糖，RG-I结构主要由重复二糖单元[→4)-α-D-半乳糖醛酸-(1→2)-α-L-鼠李糖-(1→]构成，侧链连接有阿拉伯糖、半乳糖等中性糖。据报道枸杞多糖能够提高有益菌如双歧杆菌、乳杆菌和拟杆菌的相对丰度，进一步促进乙酸、丙酸和正丁酸等短链脂肪酸的产生。但枸杞原料的成本较高，且枸杞多糖的得率偏低，在工业生产中存在经济效益低的问题。海带别名昆布，是一种多年生大型食用藻类，在我国沿海地区养殖面积广、产量高、价格低廉，可大规模利用。海带多糖是海带的主要功效成分，含有丰富的硫酸基和岩藻糖，据报道海带多糖可以刺激粪杆菌属(Faecalbacterium)和罗氏菌(Roseburia)等产丁酸菌的生长。但海带存在腥味强烈，风味不佳的问题，这对海带的精深加工产品的开发有一定的制约性。因此，将陆源益生元枸杞多糖和海洋益生元海带多糖这两种结构不同的多糖组合在一起，既能降低生产成本、掩盖不良风味，也能达到功能互补、协同增效的目标。
关于枸杞多糖和海带多糖的制备方法已有广泛研究，主要有热水提取法、酸提取法、碱提取法和酶提取法，并辅以超声波提取和微波提取，伴有脱脂、脱色和脱蛋白等工艺处理。一种提取低分子量海带岩藻多糖的方法公开了将海带粉末用无水乙醇浸泡脱脂、加入活性多肽、蒸汽爆破处理破碎细胞壁，再采用热水提取、CaCl2除杂、乙醇和丙酮沉淀多糖、分离纯化的方法得到海带岩藻多糖，该多糖分子量小、易吸收。一种海带多糖的提取方法公开了将原料粉碎后超高压(350MPa)处理、超声波处理、Sevag法除蛋白、冷冻干燥制得海带多糖。一种采用气流差法提取枸杞中枸杞多糖的方法公开了将枸杞干燥、粉碎后，在超高压提取器加压、加热使细胞破碎，经80％乙醇提取、用膜分离系统和树脂柱分离系统纯化、浓缩冻干等工艺获得枸杞多糖。一种枸杞多糖、制备方法及其应用公开了将枸杞烘干、粉碎，用丙酮浸泡脱脂、乙醇浸泡脱游离糖，再加入NaOH溶液提取、醇沉、透析和干燥后获得一种富含RG-I结构的枸杞多糖，具有抗癌潜力。但这些方法也存在着一些不足之处：(1)通过蒸汽爆破、超高压处理等物理手段虽然可以快速破坏细胞壁结构，但需要多种配套设备，对机械设备要求较高；(2)使用热水或碱提取的多糖含有较多的蛋白质，需要进一步脱蛋白，工艺比较繁琐，再者高温和碱性pH条件会加速美拉德反应，或许对产品色泽、气味产生不良影响；(3)提纯过程多使用有机试剂进行除杂，如丙酮脱脂、Sevag试剂脱蛋白，难以适用于食品加工企业。而综合各因素考虑，本技术利用酶法破壁、中温提取的工艺条件较为温和；采用果胶酶和纤维素酶酶解方式破坏细胞壁结构，促使多糖成分的溶出；酸性条件提取能降低蛋白质的溶出率，无需进一步除蛋白。简而言之，选择酶法破壁、中温酸性pH提取是一种反应条件温和、有机溶剂添加量少，又能获得高活性多糖的制备方法。
目前国内文献大多以促进传统益生菌生长为指标评价多糖的体外益生活性，鲜少有对新一代益生菌如产丁酸菌和拟杆菌促增殖效果的研究。例如，一种具有调节肠道菌群作用的复合果粉及制备方法公开了将龙眼干、枸杞干和红枣干按比例复配、乙醇浸泡、干燥、高温增香后冷冻超微粉碎制成一种流动性好、稳定性强的复合果粉，对复合益生菌株(发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜热链球杆菌)有促增殖作用。同样地，一种改善人体肠道菌群的枸杞片剂及其制备方法公开了由枸杞干果、大麦苗粉、燕麦粉、异麦芽低聚糖、海藻多糖、双歧杆菌、乳酸菌和增稠剂等原料组成，能促进双歧杆菌的生长繁殖，改善胃肠功能。所以，将传统益生菌(双歧杆菌和乳杆菌)和新一代益生菌(拟杆菌和产丁酸菌)组合在一起，作为益生活性的多元评价指标，能更科学地评价不同类型多糖的功效。不仅如此，目前对单一的枸杞多糖或海带多糖的益生活性研究较少，且尚未有关于枸杞多糖和海带多糖组合物作为益生元改善肠道微生物的报道。因此，制备获得一种含量高、活性好的复合多糖益生元，靶向作用于多种肠道益生菌，具有广阔的市场前景和良好的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种益生活性复合多糖及其制备方法与应用。该复合多糖为枸杞多糖和海带多糖的组合物，能显著促进4类肠道有益菌(拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌)的增殖，可应用于食品及保健品中。
本发明技术创新与特色之处在于通过果胶酶和纤维素酶酶解、中温酸性pH提取的方式制备枸杞多糖和海带多糖，再将两者按一定质量比复配，得到一种促进肠道有益菌(拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌)增殖的复合多糖。
本发明的具体技术方案如下：
本发明提供一种益生活性复合多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)枸杞多糖提取：枸杞匀浆去杂，酶解，调节pH，中温提取，离心分离，减压浓缩，醇沉，复溶后透析，浓缩冻干，得到枸杞多糖粉末；
(2)海带多糖提取：海带干粉制备，去杂，酶解，调节pH，中温提取，离心分离，第一次减压浓缩，醇沉，复溶后透析，浓缩冻干，得到海带多糖粉末；
(3)复合多糖制备：分别称取枸杞多糖粉末和海带多糖粉末，混合均匀后，得复合多糖。
进一步地，所述枸杞多糖提取的具体条件如下：
(1)枸杞匀浆去杂：称取干枸杞，按料液比1:6～1:10g/mL加入体积百分比浓度70～90％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨2～4次，在搅拌速率120～180r/min、温度80～90℃的条件下回流提取1～2h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取1～3次，回收残渣的干燥温度为50～60℃，干燥时间10～12h，得残渣1；
(2)酶解：残渣1按料液比1:20～1:40g/mL加入水，同时加入残渣1质量0.6％～1％的纤维素酶和残渣1质量0.1％～0.3％的果胶酶酶解，调节pH至4～5，在搅拌速率120～180r/min、温度45～55℃条件下酶解2～4h，然后在搅拌速率200～400r/min、温度90～100℃条件下灭酶10～20min，冷却，得混悬液1；
(3)调节pH：调节混悬液1的pH为1.5～2.5，得混悬液2；
(4)中温提取：混悬液2升温至45～55℃，在搅拌速率200～400r/min条件下恒温提取1.5～2.5h，得提取液1；
(5)离心分离：提取液1在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取上清液1；
(6)减压浓缩：上清液1于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，得提取液2；
(7)醇沉：在提取液2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为70％～90％(v/v)，在温度4～8℃条件下醇沉6～10h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取沉淀1；
(8)复溶后透析：在沉淀1中加入15～25倍沉淀1质量的水，在搅拌速率200～400r/min、温度45～55℃条件下溶解1～2h，放入6000～10000Da的透析袋中在温度4～8℃条件下透析48～72h，得提取液3；
(9)浓缩冻干：提取液3于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，冷冻干燥，得枸杞多糖粉末。
进一步地，所述海带多糖提取的具体条件如下：
(1)海带干粉制备：将干海带清洗2～4次，于50～60℃烘干10～12h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:6～1:10g/mL加入体积百分比浓度70％～90％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率120～180r/min、温度80～90℃的条件下回流提取1～2h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取1～3次，回收残渣的干燥温度为50～60℃，干燥时间10～12h，得残渣2；
(3)酶解：取残渣2，按料液比1:20～1:40g/mL加入水，同时加入残渣质量0.6％～1％纤维素酶和0.1％～0.3％果胶酶酶解，调节pH至4～5，在搅拌速率120～180r/min、温度45～55℃条件下酶解2～4h，然后在搅拌速率200～400r/min、温度90～100℃条件下灭酶10～20min，冷却，得混悬液3；
(4)调节pH：调节混悬液3的pH为1.5～2.5，得混悬液4；
(5)中温提取：混悬液4升温至45～55℃，在搅拌速率200～400r/min条件下恒温提取1.5～2.5h，得提取液4；
(6)离心分离：提取液4在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取上清液2；
(7)减压浓缩：上清液2于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，得提取液5；
(8)醇沉：往提取液5中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为70％～90％(v/v)，在温度4～8℃条件下醇沉6～10h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取沉淀2；
(9)复溶后透析：在沉淀2中加入15～25倍沉淀2质量的去离子水，在搅拌速率200～400r/min、温度45～55℃条件下溶解1～2h，放入6000～10000Da的透析袋中在温度4～8℃条件下透析48～72h，得提取液6；
(10)浓缩冻干：提取液6于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，冷冻干燥，得海带多糖粉末。
进一步地，所述复合多糖是按枸杞多糖与海带多糖质量之比7:3～9:1混合均匀后制得。
进一步地，所述混合的方式为枸杞多糖粉末和海带多糖粉末通过搅拌混合均匀。
本发明提供所述一种益生活性复合多糖的制备方法制备得到的复合多糖。
本发明提供的复合多糖，促进肠道有益菌拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌的增殖。
本发明提供的复合多糖，制备工艺条件温和、节能环保，得到的多糖含量高、益生活性好。
本发明还提供所述复合多糖应用于食品及保健品。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
本发明使用的原料枸杞和海带均为药食同源物质，利用果胶酶和纤维素酶酶解的方式破坏细胞壁结构，促使多糖成分的溶出；酸性条件提取降低了蛋白质的溶出率，无需进一步脱蛋白。此外，中温酸性pH提取的方法适度抑制了美拉德反应，多糖褐变程度不高，色泽好。本发明采用酶法破壁、中温酸性pH提取多糖的方法反应条件温和，对生产设备、设施要求不高，不涉及有毒有害有机溶剂的使用，对环境友好，符合食品加工规范。
枸杞多糖是富含RG-I结构域的果胶多糖，海带多糖是一种主要含有硫酸基和岩藻糖的复杂多糖，两种多糖结构不同，作用靶点不同，二者复配后协同增效，能较大程度地促进多种肠道有益菌(拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌)的增殖。同时，该复合多糖解决了单独使用海带多糖风味不佳和单独使用枸杞多糖成本较高的问题，提高经济效益，增加市场需求，且复合多糖分子量低、水溶性好，能应用于包括清爽型饮品、口服液等多种剂型食品或保健品。
附图说明
图1为5mg/mL单一多糖对复合菌株的促增殖作用。
图2为5mg/mL复合多糖对复合菌株的促增殖作用。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面将结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例和对比例制备的复合多糖通过如下方法进行测定。
1、主要化学成分含量测定
(1)总糖含量测定
采用苯酚-硫酸法(参考GB/T 15672-2009)测定样品中总糖含量。取0.10mg/mL的样品溶液2mL，加入1mL 6％(w/w)苯酚后，混匀，立即加入5mL 18.4mol/L浓硫酸，充分混匀，25℃下静置反应40min后，于490nm处测吸光度。
枸杞多糖：准确配制浓度为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL的葡萄糖标准溶液，根据上述步骤测定其在490nm处的吸光度，得到标准曲线。根据标准曲线计算出样品中总糖含量。
海带多糖：准确配制浓度为0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL的岩藻糖标准溶液，根据上述步骤测定其在490nm处的吸光度，得到标准曲线。根据标准曲线计算出样品中总糖含量。
(2)蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝法(参考SN/T 3926-2014)测定样品中蛋白含量。取0.5mL 5mg/mL样品溶液置于比色管中，加入0.5mL蒸馏水，5mL 0.1mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液(称取约100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95％(v/v)的乙醇水溶液后，再加入100mL 85％(w/v)的磷酸水溶液，用水稀释至1L，滤纸过滤)，振荡摇匀，静置2min，于595nm处测定吸光度。
精确称取牛血清蛋白50mg，加水溶解并定容至500mL，配制成0.1mg/mL的蛋白质标准溶液，分别吸取蛋白质标准溶液0、0.03mL、0.06mL、0.12mL、0.24mL、0.48mL、0.72mL、0.84mL、0.96mL于10mL的比色管中，加水补至1mL，再分别加入5mL 0.1mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡摇匀，静置2min，于595nm处测定吸光度，得到标准曲线。根据标准曲线计算出样品中蛋白含量。
(3)硫酸基含量测定
用1mol/L HCl溶液(盐酸)配制硫酸根浓度为0.5mg/mL的K2SO4标准溶液后，分别取K2SO4标准溶液0、40μL、80μL、100μL、120μL、160μL、200μL，用1mol/LHCl溶液(盐酸)补至200μL，依次加入3.8mL 0.06g/mL三氯乙酸水溶液，1mL 0.005g/mLBaCl2-明胶溶液，混匀，20min后，用1mol/LHCl溶液(盐酸)做空白，测得360nm处吸光度A；用1mL 0.005g/mL明胶水溶液代替0.005g/mL BaCl2-明胶溶液，测得吸光度B。以硫酸根浓度为横坐标，吸光度差值A-B为纵坐标绘制标准曲线。
准确称取2mg样品于安瓿瓶中，加入1mL 1mol/LHCl溶液，封口密闭，于105℃水解6h，取400μL水解液，依次加入3.6mL 0.06g/mL三氯乙酸水溶液，1mL 0.005g/mLBaCl2-明胶溶液，混匀，20min后，用1mol/LHCl溶液(盐酸)做空白，测得360nm处吸光度A；用1mL0.005g/mL明胶水溶液代替0.005g/mL BaCl2-明胶溶液，测得吸光度B。根据标准曲线计算样品的硫酸基含量。
2、分子量的测定
采用分子排阻凝胶色谱联合多角度激光光散射仪和示差检测器(SEC-MALLS-RI)测定多糖分子量。准确配制5mg/mL样品溶液，充分溶解，过0.22μm微孔滤膜，待进样分析。
HPLC分析条件为：Ultrahydrogel保护柱(40×6mm)，Ultrahydrogel 2000SEC色谱柱(7.8×300mm)和Ultrahydrogel 1000SEC色谱柱(7.8×300mm)串联使用，进样体积100μL，柱温35℃，流动相流速0.6mL/min，流动相为0.1mol/L硝酸钠(含0.05％(w/w)叠氮化钠)溶液，检测器采用MALLS串联RI，折光指数增量dn/dc为0.135mL/g，利用BSA校正RI与MALLS之间的延迟体积。
3、单糖组成的测定
(1)标准品的制备：等体积吸取葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、岩藻糖8种单糖标准品(10mg/mL，溶剂为超纯水)20μL于具塞试管中，混匀，为混合标准品。吸取50μL混合标准品于具塞试管中，加入50μL 0.6mol/L的NaOH水溶液，100μL 0.5mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，于70℃衍生化反应100min，冷却。加入100μL 0.3mol/L HCl溶液，补水至终体积为2mL，加入2mL氯仿，混匀，2000rpm离心5min，弃去氯仿相，反复萃取6次，取水相过0.22μm微孔滤膜，待HPLC进样分析。
(2)样品的制备：取1mL 10mg/mL样品溶液于安瓿瓶中，加入1mL4mol/L三氟乙酸水溶液，封口，110℃水解8h；取出冷却，加入400μL甲醇使之溶解，旋干，再加入400μL甲醇使之溶解，旋干，重复该操作步骤6次。加入100μL 0.6mol/LNaOH水溶液使残留物彻底溶解，再加入PMP进行衍生化，待HPLC进样分析。
(3)HPLC分析：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相为0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.7)-乙腈(85:15，v:v)，流动相流速1mL/min，柱温30℃，检测波长250nm。
4、促增殖活性的测定
(1)细菌的活化：配制拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌每个菌株相应的活化培养基，除氧后置于高压锅121℃灭菌15min，烘干，加入1mL菌液(OD600为0.6)，厌氧培养12～24h。将培养基取出，于4500g离心5min，弃去上清液，加入2mL生理盐水(0.9g/mL的NaCl水溶液)重悬，并将菌液稀释到同等浓度(OD600为0.25)。
(2)OD600的测定：配制YCFA培养基备用，取5mg/mL样品溶液过滤除菌，在无菌酶标板上加入100μL样品溶液、90μLYCFA培养基和10μL复合菌液(拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌，体积比例为50:40:9:1)，对照组加入100μL无菌蒸馏水(阴性对照)和100μL葡萄糖溶液(5mg/mL，溶剂为无菌蒸馏水)(阳性对照)，放入厌氧培养箱中培养24h，于600nm处测吸光值，得到OD600。
实施例1
一种益生活性复合多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
用于复配的枸杞多糖提取条件如下：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:6g/mL加入70％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨2次，在搅拌速率120r/min、温度80℃的条件下回流提取1h，在离心力为6000g，离心时间为15min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取1次，回收残渣的干燥温度为50℃，干燥时间10h，得残渣A1；
(2)酶解：18g残渣A1按料液比1:20g/mL加入去离子水，同时加入残渣A1质量0.6％的纤维素酶和残渣A1质量0.1％的果胶酶酶解，调节pH至4，在搅拌速率120r/min、温度45℃条件下酶解2h，然后在搅拌速率200r/min、温度90℃条件下灭酶10min，冷却至室温，得混悬液A1；
(3)调节pH：调节混悬液A1的pH为1.5，得混悬液A2；
(4)中温提取：混悬液A2升温至45℃，在搅拌速率200r/min条件下恒温提取1.5h，得提取液A1；
(5)离心分离：提取液A1在离心力为6000g，离心时间为15min条件下离心，取上清液A1；
(6)减压浓缩：390mL上清液A1于50℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％，得提取液A2；
(7)醇沉：在提取液A2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为70％(v/v)，在温度4℃条件下醇沉6h，在离心力为6000g，离心时间为15min条件下离心，取沉淀A1；
(8)复溶后透析：在沉淀A1中加入15倍沉淀A1质量的去离子水，在搅拌速率200r/min、温度45℃条件下溶解1h，放入6000Da的透析袋中在温度4℃条件下透析48h，得提取液A3；
(9)浓缩冻干：320mL提取液A3于50℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-A粉末。
用于复配的海带多糖提取条件如下：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗2次，于50℃烘干10h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:6g/mL加入70％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率120r/min、温度80℃的条件下回流提取1h，在离心力为6000g，离心时间为15min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取1次，回收残渣的干燥温度为50℃，干燥时间10h，得残渣A2；
(3)酶解：45g残渣A2，按料液比1:20g/mL加入去离子水，同时加入残渣A2质量0.6％的纤维素酶和残渣A2质量0.1％的果胶酶酶解，调节pH至4，在搅拌速率120r/min、温度45℃条件下酶解2h，然后在搅拌速率200r/min、温度90℃条件下灭酶10min，冷却至室温，得混悬液A3；
(4)调节pH：调节混悬液A3的pH为1.5，得混悬液A4；
(5)中温提取：混悬液A4升温至45℃，在搅拌速率200r/min条件下恒温提取1.5h，得提取液A4；
(6)离心分离：提取液A4在离心力为6000g，离心时间为15min条件下离心，取上清液A2；
(7)减压浓缩：500mL上清液A2于50℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％，得提取液A5；
(8)醇沉：往提取液A5中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为70％(v/v)，在温度4℃条件下醇沉6h，在离心力为6000g，离心时间为15min条件下离心，取沉淀A2；
(9)复溶后透析：在沉淀A2中加入15倍沉淀A2质量的去离子水，在搅拌速率200r/min、温度45℃条件下溶解1h，放入6000Da的透析袋中在温度4℃条件下透析48h，得提取液A6；
(10)浓缩冻干：460mL提取液A6于50℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％，冷冻干燥，得海带多糖LP-A粉末。
分别称取3.5g枸杞多糖LB-A粉末和1.5g海带多糖LP-A粉末，按质量之比7:3通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L1。
实施例2
一种益生活性复合多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
用于复配的枸杞多糖提取条件如下：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨3次，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B1；
(2)酶解：18g残渣B1按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B1质量0.8％的纤维素酶和残渣B1质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B1；
(3)调节pH：调节混悬液B1的pH为2，得混悬液B2；
(4)中温提取：混悬液B2升温至50℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液B1；
(5)离心分离：提取液B1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液B1；
(6)减压浓缩：400mL上清液B1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液B2；
(7)醇沉：在提取液B2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀B1；
(8)复溶后透析：在沉淀B1中加入20倍沉淀B1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液B3；
(9)浓缩冻干：325mL提取液B3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-B粉末。
用于复配的海带多糖提取条件如下：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗3次，于55℃烘干11h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B2；
(3)酶解：45g残渣B2，按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B2质量0.8％的纤维素酶和残渣B2质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B3；
(4)调节pH：调节混悬液B3的pH为2，得混悬液B4；
(5)中温提取：混悬液B4升温至50℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液B4；
(6)离心分离：提取液B4在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液B2；
(7)减压浓缩：500mL上清液B2于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液B5；
(8)醇沉：往提取液B5中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀B2；
(9)复溶后透析：在沉淀B2中加入20倍沉淀B2质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液B6；
(10)浓缩冻干：460mL提取液B6于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得海带多糖LP-B粉末。
分别称取4g枸杞多糖LB-B粉末和1g海带多糖LP-B粉末，按质量之比8:2通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L2。
实施例3
一种益生活性复合多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
用于复配的枸杞多糖提取条件如下：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:10g/mL加入90％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨4次，在搅拌速率180r/min、温度90℃的条件下回流提取2h，在离心力为8000g，离心时间为25min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取3次，回收残渣的干燥温度为60℃，干燥时间12h，得残渣C1；
(2)酶解：18g残渣C1按料液比1:40g/mL加入去离子水，同时加入残渣C1质量1％的纤维素酶和残渣C1质量0.3％的果胶酶酶解，调节pH至5，在搅拌速率180r/min、温度55℃条件下酶解4h，然后在搅拌速率400r/min、温度100℃条件下灭酶20min，冷却至室温，得混悬液C1；
(3)调节pH：调节混悬液C1的pH为2.5，得混悬液C2；
(4)中温提取：混悬液C2升温至55℃，在搅拌速率400r/min条件下恒温提取2.5h，得提取液C1；
(5)离心分离：提取液C1在离心力为8000g，离心时间为25min条件下离心，取上清液C1；
(6)减压浓缩：405mL上清液C1于60℃减压浓缩，浓缩至原体积的30％，得提取液C2；
(7)醇沉：在提取液C2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为90％v/v，在温度8℃条件下醇沉10h，在离心力为8000g，离心时间为25min条件下离心，取沉淀C1；
(8)复溶后透析：在沉淀C1中加入25倍沉淀C1质量的去离子水，在搅拌速率400r/min、温度55℃条件下溶解2h，放入10000Da的透析袋中在温度8℃条件下透析72h，得提取液C3；
(9)浓缩冻干：325mL提取液C3于60℃减压浓缩，浓缩至原体积的30％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-C粉末。
用于复配的海带多糖提取条件如下：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗4次，于60℃烘干12h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:10g/mL加入90％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率180r/min、温度90℃的条件下回流提取2h，在离心力为8000g，离心时间为25min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取3次，回收残渣的干燥温度为60℃，干燥时间12h，得残渣C2；
(3)酶解：45g残渣C2，按料液比1:40g/mL加入去离子水，同时加入残渣C2质量1％的纤维素酶和残渣C2质量0.3％的果胶酶酶解，调节pH至5，在搅拌速率180r/min、温度55℃条件下酶解4h，然后在搅拌速率400r/min、温度100℃条件下灭酶20min，冷却至室温，得混悬液C3；
(4)调节pH：调节混悬液C3的pH为2.5，得混悬液C4；
(5)中温提取：混悬液C4升温至55℃，在搅拌速率400r/min条件下恒温提取2.5h，得提取液C4；
(6)离心分离：提取液C4在离心力为8000g，离心时间为25min条件下离心，取上清液C2；
(7)减压浓缩：510mL上清液C2于60℃减压浓缩，浓缩至原体积的30％，得提取液C5；
(8)醇沉：往提取液C5中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为90％(v/v)，在温度8℃条件下醇沉10h，在离心力为8000g，离心时间为25min条件下离心，取沉淀C2；
(9)复溶后透析：在沉淀C2中加入25倍沉淀C2质量的去离子水，在搅拌速率400r/min、温度55℃条件下溶解2h，放入10000Da的透析袋中在温度8℃条件下透析72h，得提取液C6；
(10)浓缩冻干：465mL提取液C6于60℃减压浓缩，浓缩至原体积的30％，冷冻干燥，得海带多糖LP-C粉末。
分别称取4.5g枸杞多糖LB-C粉末和0.5g海带多糖LP-C粉末，按质量之比9:1通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L3。
对比例1
一种枸杞多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨3次，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B1；
(2)酶解：18g残渣B1按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B1质量0.8％纤维素酶和残渣B1质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B1；
(3)调节pH：调节混悬液B1的pH为2，得混悬液B2；
(4)中温提取：混悬液B2升温至50℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液B1；
(5)离心分离：提取液B1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液B1；
(6)减压浓缩：400mL上清液B1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液B2；
(7)醇沉：在提取液B2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀B1；
(8)复溶后透析：在沉淀B1中加入20倍沉淀B1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液B3；
(9)浓缩冻干：325mL提取液B3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-B粉末。
对比例2
一种枸杞多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨3次，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B1；
(2)酶解：18g残渣D1按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B1质量0.8％的纤维素酶和残渣B1质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B1；
(3)调节pH：调节混悬液D1的pH为2，得混悬液B2；
(4)高温提取：混悬液D2升温至100℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液D1；
(5)离心分离：提取液D1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液D1；
(6)减压浓缩：390mL上清液D1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液D2；
(7)醇沉：在提取液D2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀D1；
(8)复溶后透析：在沉淀D1中加入20倍沉淀D1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液D3；
(9)浓缩冻干：310mL提取液D3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-D粉末。
对比例3
一种枸杞多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨3次，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B1；
(2)酶解：18g残渣E1按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B1质量0.8％的纤维素酶和残渣B1质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B1；
(3)中温提取：混悬液E1升温至50℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液E1；
(4)离心分离：提取液E1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液E1；
(5)减压浓缩：400mL上清液E1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液E2；
(6)醇沉：在提取液E2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀E1；
(7)复溶后透析：在沉淀E1中加入20倍沉淀E1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液E3；
(8)浓缩冻干：320mL提取液E3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-E粉末。
对比例4
一种枸杞多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)枸杞匀浆去杂：称取60g干枸杞，按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，过胶体磨3次，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B1；
(2)酶解：18g残渣F1按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B1质量0.8％的纤维素酶和残渣B1质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B1；
(3)高温提取：混悬液F1升温至100℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液F1；
(4)离心分离：提取液F1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液F1；
(5)减压浓缩：350mL上清液F1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液F2；
(6)醇沉：在提取液F2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀F1；
(7)复溶后透析：在沉淀F1中加入20倍沉淀F1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液F3；
(8)浓缩冻干：290mL提取液F3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得枸杞多糖LB-F粉末。
对比例5
一种海带多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗3次，于55℃烘干11h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B2；
(3)酶解：45g残渣B2，按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B2质量0.8％的纤维素酶和残渣B2质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B3；
(4)调节pH：调节混悬液B3的pH为2，得混悬液B4；
(5)中温提取：混悬液B4升温至50℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液B4；
(6)离心分离：提取液B4在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液B2；
(7)减压浓缩：500mL上清液B2于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液B5；
(8)醇沉：往提取液B5中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀B2；
(9)复溶后透析：在沉淀B2中加入20倍沉淀B2质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液B6；
(10)浓缩冻干：460mL提取液B6于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得海带多糖LP-B粉末。
对比例6
一种海带多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗3次，于55℃烘干11h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B2；
(3)酶解：45g残渣G1，按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B2质量0.8％的纤维素酶和残渣B2质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B3；
(4)调节pH：调节混悬液G1的pH为2，得混悬液B4；
(5)高温提取：混悬液G2升温至100℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液G1；
(6)离心分离：提取液G1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液G1；
(7)减压浓缩：370mL上清液G1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液G2；
(8)醇沉：往提取液G2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀G1；
(9)复溶后透析：在沉淀G1中加入20倍沉淀G1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液G3；
(10)浓缩冻干：300mL提取液G3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得海带多糖LP-G粉末。
对比例7
一种海带多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗3次，于55℃烘干11h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B2；
(3)酶解：45g残渣H1，按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B2质量0.8％的纤维素酶和残渣B2质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B3；
(4)中温提取：混悬液H1升温至50℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液H1；
(5)离心分离：提取液H1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液H1；
(6)减压浓缩：510mL上清液H1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液H2；
(7)醇沉：往提取液H2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀H1；
(8)复溶后透析：在沉淀H1中加入20倍沉淀H1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液H3；
(9)浓缩冻干：470mL提取液H3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得海带多糖LP-H粉末。
对比例8
一种海带多糖的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)海带干粉制备：将60g干海带清洗3次，于55℃烘干11h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:8g/mL加入80％(v/v)乙醇水溶液，在搅拌速率150r/min、温度85℃的条件下回流提取1.5h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取2次，回收残渣的干燥温度为55℃，干燥时间11h，得残渣B2；
(3)酶解：45g残渣I1，按料液比1:30g/mL加入去离子水，同时加入残渣B2质量0.8％的纤维素酶和残渣B2质量0.2％的果胶酶酶解，调节pH至4.5，在搅拌速率150r/min、温度50℃条件下酶解3h，然后在搅拌速率300r/min、温度95℃条件下灭酶15min，冷却至室温，得混悬液B3；
(4)高温提取：混悬液I1升温至100℃，在搅拌速率300r/min条件下恒温提取2h，得提取液I1；
(5)离心分离：提取液I1在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取上清液I1；
(6)减压浓缩：550mL上清液I1于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，得提取液I2；
(7)醇沉：往提取液I2中加入乙醇水溶液，使乙醇水溶液体积百分比浓度为80％(v/v)，在温度6℃条件下醇沉8h，在离心力为7000g，离心时间为20min条件下离心，取沉淀I1；
(8)复溶后透析：在沉淀I1中加入20倍沉淀I1质量的去离子水，在搅拌速率300r/min、温度50℃条件下溶解1.5h，放入8000Da的透析袋中在温度6℃条件下透析60h，得提取液I3；
(9)浓缩冻干：490mL提取液I3于55℃减压浓缩，浓缩至原体积的25％，冷冻干燥，得海带多糖LP-I粉末。
对比例9
分别称取3g枸杞多糖LB-B粉末和2g海带多糖LP-B粉末，按质量之比6:4通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L4。
对比例10
分别称取2g枸杞多糖LB-B粉末和3g海带多糖LP-B粉末，按质量之比4:6通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L5。
对比例11
分别称取4g枸杞多糖LB-B粉末和1g海带多糖LP-G粉末，按质量之比8:2通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L6。
对比例12
分别称取3g枸杞多糖LB-B粉末和2g海带多糖LP-G粉末，按质量之比6:4通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L7。
对比例13
分别称取2g枸杞多糖LB-B粉末和3g海带多糖LP-G粉末，按质量之比4:6通过搅拌混合均匀后，得复合多糖L8。
单一枸杞多糖基本化学成分、分子量和单糖组成的分析
枸杞多糖基本化学成分、分子量和单糖组成如表1-3所示。
对比枸杞多糖LB-B、LB-D、LB-E、LB-F(对比例1-4)，发现各组样品多糖含量相近，无明显差异，但高温酸性pH提取的LB-D蛋白含量偏高。
相对分子质量是影响多糖生物活性的一个重要因素，合适的相对分子质量才能发挥多糖的最佳活性。枸杞多糖的分子量集中在5.97×103g/mol～1.44×104g/mol，说明制备得到的枸杞多糖分子量小，分散性好。高温提取的LB-D和LB-F分子量低于中温提取的LB-B和LB-E。
不同提取方式制备得到的枸杞多糖均由半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖组成，其中鼠李糖/半乳糖醛酸的比值可以反映出RG-I结构域的占比，该比值在0.57～0.83之间，说明枸杞多糖是典型的RG-I型果胶多糖结构。其中LB-B、LB-E和LB-F单糖组成相似，以阿拉伯糖、半乳糖醛酸为主，而LB-D的半乳糖醛酸、鼠李糖和半乳糖含量较高，阿拉伯糖含量较低，这说明高温酸性pH提取条件对枸杞多糖的单糖组成影响较大。
以上结果表明，不同提取方式制备得到的枸杞多糖在化学成分和结构上存在一定差异。
表1枸杞多糖的基本化学成分
Figure BDA0003597283500000201
表1中不同字母表示组间存在显著性差异(p＜0.05)表2枸杞多糖的分子量
Figure BDA0003597283500000202
表3枸杞多糖的单糖组成
Figure BDA0003597283500000211
单一海带多糖基本化学成分、分子量和单糖组成的分析
海带多糖基本化学成分、分子量和单糖组成如表4-6所示。
对比海带多糖LP-B、LP-G、LP-H、LP-I(对比例5-8)，发现LP-G多糖含量最高，LP-H、LP-I次之，LP-B多糖含量最低；LP-H、LP-I的硫酸基含量较高，LP-B次之，LP-G的硫酸基含量最低，这说明高温酸性pH提取方式会使硫酸基团脱落；四种海带多糖的蛋白含量都较低，其中LP-I蛋白含量最低。不同提取温度和pH条件对海带多糖的化学成分影响较大，具有显著性差异。
海带多糖的分子量在104g/mol～105g/mol之间，分子量小，分散性好，其中高温提取的LP-G和LP-I分子量低于中温提取的LP-B和LP-H。不同提取方式制备得到的海带多糖均由岩藻糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖醛酸组成，其中LP-B、LP-H和LP-I单糖组成相似，以岩藻糖为主，而LP-G的甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖含量较高，岩藻糖含量较低，结构存在差异，这说明高温酸性pH提取条件对海带多糖的单糖组成影响较大。
表4海带多糖的基本化学成分
Figure BDA0003597283500000212
表4中不同字母表示组间存在显著性差异(p＜0.05)表5海带多糖的分子量
Figure BDA0003597283500000213
Figure BDA0003597283500000221
表6海带多糖的单糖组成
Figure BDA0003597283500000222
单一多糖对四类肠道微生物的促增殖作用
单一多糖(5mg/mL，溶剂为无菌蒸馏水)对混合菌株的促增殖作用如图1(不同字母表示组间存在显著性差异(p＜0.05))所示。
复合多糖是由单独提取的枸杞多糖粉末和海带多糖粉末混合制得，比较单独的枸杞多糖和海带多糖益生活性为复配的条件提供一定的参考。在5mg/mL浓度下，与阴性对照组(无菌蒸馏水)相比，单一的枸杞多糖LB-B、LB-D、LB-E、LB-F(对比例1-4)和单一的海带多糖LP-B、LP-G、LP-H、LP-I(对比例5-8)都能促进肠道有益菌的生长，且枸杞多糖表现出比海带多糖更强的促增殖作用，因此选择以枸杞多糖为主的复配方式进行后续研究。其中，中温酸性pH提取的枸杞多糖LB-B比LB-D、LB-E和LB-F的促增殖作用更强，突出了中温酸性pH提取的优势。
海带多糖价格低廉，来源广泛，可大规模利用，将海带多糖和枸杞多糖复配可以降低制备多糖的成本。四种海带多糖中，LP-G的促增殖活性最强，LP-B次之，LP-H和LP-I活性最弱。LP-B和LP-G在主要化学成分和单糖组成上存在明显差异，LP-B的多糖含量低，硫酸基含量高，单糖组成以岩藻糖为主；LP-G的多糖含量高，硫酸基含量低，单糖组成以甘露糖为主。多糖的生理活性受制备方法、分子量、单糖组成、硫酸基含量等多种因素影响。现代研究表明，多糖的益生活性与其单糖组成密切相关，大部分具有调节肠道微生物作用的多糖主要含有甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖，少数含有半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、岩藻糖和木糖。因此，选择促增殖活性较好的LP-B和LP-G与LB-B复配，进一步研究如何科学地将不同类型的多糖组合在一起，彼此互补，力求对肠道微生物促增殖功效最大化。
复合多糖对四类肠道微生物的促增殖作用
复合多糖(5mg/mL，溶剂为无菌蒸馏水)对混合菌株的促增殖作用如图2(不同字母表示组间存在显著性差异(p＜0.05))所示。
复合多糖是由LB-B与LP-B、LP-G按照不同比例组合制成。对比复合多糖L1、L2、L3(实施例1-3)和L4、L5、L6、L7、L8(对比例9-13)，发现L1-3对复合菌株的促增殖作用最强，接近于阳性对照葡萄糖溶液(5mg/mL，溶剂为无菌蒸馏水)组的作用效果。具体地说，比较LB-B分别和LP-B、LP-G复配的效果，发现以8:2质量比组合的L2组(LB-B与LP-B复配)对复合菌株的促增殖作用强于L6组(LB-B与LP-G复配)，而以6:4质量比组合的L4组(LB-B与LP-B复配)和L7组(LB-B与LP-G复配)、以4:6质量比组合的L5组(LB-B与LP-B复配)和L8组(LB-B与LP-G复配)在活性方面没有明显差异，且复合多糖L4、L5、L7和L8对混合菌株的促增殖作用明显不如单一的枸杞多糖LB-B，这说明两种多糖复配的比例对复合多糖的活性影响较大。同样地，L1、L2、L3、L4和L5之间的对比也说明了枸杞多糖和海带多糖复配的比例会影响到该复合多糖的活性，复合多糖中枸杞多糖比例越高，促增殖作用越强，但枸杞多糖和海带多糖以7:3～9:1的质量比组合后能协同增效，促增殖作用优于单一的枸杞多糖或海带多糖。
综上所述，本发明技术的实施例：中温酸性pH提取的枸杞多糖(LB-B)和中温酸性pH提取的海带多糖(LP-B)按7:3～9:1的质量比复配后得到的复合多糖(L1-3)活性最好。将成本低、风味较差的海带多糖和成本高、风味较好的枸杞多糖复配，能降低多糖制备成本、掩蔽海带多糖的腥味，提高经济效益，扩大市场需求，而且二者复配后具有协同增效的作用，对肠道有益菌的促增殖作用与葡萄糖的作用效果相媲美。这说明本发明技术能通过一个较优的制备方法得到一种风味协调、功能互补的高益生活性复合多糖。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，首先分别提取枸杞多糖和海带多糖，再进行复配，得到一种能同时促进4类肠道有益菌增殖的复合多糖，具体包括以下步骤：
(1)枸杞多糖提取：枸杞匀浆去杂，酶解，调节pH，提取，离心分离，减压浓缩，醇沉，复溶后透析，浓缩冻干，得到枸杞多糖粉末；
(2)海带多糖提取：海带干粉制备，去杂，酶解，调节pH，提取，离心分离，减压浓缩，醇沉，复溶后透析，浓缩冻干，得到海带多糖粉末；
(3)复合多糖制备：分别称取枸杞多糖粉末和海带多糖粉末，混合均匀后，得复合多糖。
2.根据权利要求1所述的一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述枸杞多糖提取的具体条件如下：
(1)枸杞匀浆去杂：称取干枸杞，按料液比1:6～1:10g/mL加入体积百分比浓度70％～90％乙醇溶液，过胶体磨2～4次，在搅拌速率120～180r/min、温度80～90℃的条件下回流提取1～2h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取1～3次，回收残渣的干燥温度为50～60℃，干燥时间10～12h，得残渣1；
(2)酶解：残渣1按料液比1:20～1:40g/mL加入水，同时加入残渣1质量0.6％～1％的纤维素酶和残渣1质量0.1％～0.3％的果胶酶酶解，调节pH至4～5，在搅拌速率120～180r/min、温度45～55℃条件下酶解2～4h，然后在搅拌速率200～400r/min、温度90～100℃条件下灭酶10～20min，冷却，得混悬液1；
(3)调节pH：调节混悬液1的pH为1.5～2.5，得混悬液2；
(4)提取：混悬液2升温，在搅拌速率200～400r/min条件下恒温提取1.5～2.5h，得提取液1；
(5)离心分离：提取液1在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取上清液1；
(6)减压浓缩：上清液1于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，得提取液2；
(7)醇沉：在提取液2中加入乙醇溶液，使乙醇溶液体积百分比浓度为70％～90％，在温度4～8℃条件下醇沉6～10h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取沉淀1；
(8)复溶后透析：在沉淀1中加入15～25倍沉淀1质量的水，在搅拌速率200～400r/min、温度45～55℃条件下溶解1～2h，放入6000～10000Da的透析袋中在温度4～8℃条件下透析48～72h，得提取液3；
(9)浓缩冻干：提取液3于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，冷冻干燥，得枸杞多糖粉末。
3.根据权利要求1所述的一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述海带多糖提取的具体条件如下：
(1)海带干粉制备：将干海带清洗2～4次，于50～60℃烘干10～12h，粉碎；
(2)去杂：按料液比1:6～1:10g/mL加入体积百分比浓度70％～90％乙醇溶液，在搅拌速率120～180r/min、温度80～90℃的条件下回流提取1～2h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，弃去上清液，回收残渣，按上述步骤重复提取1～3次，回收残渣的干燥温度为50～60℃，干燥时间10～12h，得残渣2；
(3)酶解：取残渣2，按料液比1:20～1:40g/mL加入水，同时加入残渣2质量0.6％～1％的纤维素酶和残渣2质量0.1％～0.3％的果胶酶酶解，调节pH至4～5，在搅拌速率120～180r/min、温度45～55℃条件下酶解2～4h，然后在搅拌速率200～400r/min、温度90～100℃条件下灭酶10～20min，冷却，得混悬液3；
(4)调节pH：调节混悬液3的pH为1.5～2.5，得混悬液4；
(5)提取：混悬液4升温，在搅拌速率200～400r/min条件下恒温提取1.5～2.5h，得提取液4；
(6)离心分离：提取液4在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取上清液2；
(7)减压浓缩：上清液2于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，得提取液5；
(8)醇沉：往提取液5中加入乙醇溶液，使乙醇溶液体积百分比浓度为70％～90％，在温度4～8℃条件下醇沉6～10h，在离心力为6000～8000g，离心时间为15～25min条件下离心，取沉淀2；
(9)复溶后透析：在沉淀2中加入15～25倍沉淀2质量的水，在搅拌速率200～400r/min、温度45～55℃条件下溶解1～2h，放入6000～10000Da的透析袋中在温度4～8℃条件下透析48～72h，得提取液6；
(10)浓缩冻干：提取液6于50～60℃减压浓缩，浓缩至原体积的20％～30％，冷冻干燥，得海带多糖粉末。
4.根据权利要求1所述的一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述复合多糖是按枸杞多糖与海带多糖质量之比7:3～9:1混合均匀后制得。
5.根据权利要求2所述的一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述升温为升温至45～55℃。
6.根据权利要求3所述的一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述升温为升温至45～55℃。
7.根据权利要求4所述的一种益生活性复合多糖的制备方法，其特征在于，所述混合的方式为枸杞多糖粉末和海带多糖粉末通过搅拌混合均匀。
8.权利要求1所述一种益生活性复合多糖的制备方法制备得到的复合多糖。
9.根据权利要求8所述一种益生活性复合多糖的制备方法制备得到的复合多糖，其特征在于，所述复合多糖促进肠道有益菌拟杆菌、产丁酸菌、双歧杆菌和乳杆菌的增殖。
10.权利要求9所述复合多糖应用于食品及保健品。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106540104A (zh) * 2015-09-18 2017-03-29 陈志俊 一种防治糖尿病的复合多糖及其制备方法
CN110302210A (zh) * 2019-06-15 2019-10-08 西北工业大学 一种多糖组合物在调节失重环境下肠道菌群失调中的应用
CN112694539A (zh) * 2020-12-14 2021-04-23 华南理工大学 一种高良姜多糖及其制备方法与作为乳化剂制备慢消化乳液的应用

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