CN114657138A

CN114657138A - 一种表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物

Info

Publication number: CN114657138A
Application number: CN202011528929.3A
Authority: CN
Inventors: 王淋立; 陈月花; 杨建国; 莫健
Original assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Current assignee: Future Intelligent Regenerative Medicine Research Institute Guangzhou Co ltd
Priority date: 2020-12-22
Filing date: 2020-12-22
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明公开了一种表达靶向B7‑H4的shRNA和/或shRNA‑miR的多能干细胞或其衍生物，该多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7‑H4的shRNA和/或shRNA‑miR的表达序列。本发明提供的多能干细胞或其衍生物表达靶向B7‑H4的shRNA和/或shRNA‑miR被外泌体包裹后，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7‑H4，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

Description

一种表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物。

背景技术

B7-H4(B7H4,又称B7s1和B7x)是B7家族中的一员。B7-H4蛋白由信号肽区、一对V、C免疫球蛋白外段、跨膜区和胞浆区组成，属于I型跨膜糖蛋白，通过GPI铆定于细胞膜。而H4通过GPI交联有利于接近主要组织相容性复合体(MHC)分子并且这样的空间结构有利于负性共刺激作用的介导。B7H4表达在专职抗原呈递细胞(APC)，并广泛分布在非淋巴组织上。它能通过抑制T细胞的增殖、细胞因子的产生和细胞周期的进程来负性调控T细胞的免疫应答。近年来研究发现，B7-H4在多种肿瘤细胞中，如肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、肾癌、黑色素瘤等细胞表面呈高表达，B7-H4的表达与肿瘤的分裂、分期和预后密切相关。而且在肿瘤的血管内皮细胞和肿瘤浸润性巨噬细胞和树突状细胞表面也高表达。采用免疫组织化学技术检测了肺癌、结直肠癌，乳腺癌、胃癌等患者肿瘤组织中B7-H4的表达，发现上述肿瘤组织高表达B7-H4。B7-H4也可以可溶性形式(soluble B7-H4，sB7-H4)存在于人的血液和其他体液中，目前已经发现多种肿瘤患者外周血中sB7-H4水平升高。在一些动物模型中发现B7-H4在肿瘤细胞上高表达，能够抑制细胞凋亡和刺激肿瘤生长。B7-H4有广泛而多样的糖基化，这是肿瘤细胞逃避免疫监视的屏障。在肿瘤的进展中，B7-H4扮演了转化癌症前期细胞并使之逃避免疫监视的角色，比如在卵巢癌的免疫缺陷小鼠模型中，高表达B7-H4能刺激肿瘤的形成，主要通过刺激细胞增殖，增加细胞粘附，转移和侵袭来实现，这说明了B7-H4也许独立于免疫之外的直接刺激肿瘤形成的因素。正常上皮细胞过表达B7-H4会导致其恶性转变，主要是抑制了细胞的凋亡。在体外实验中，用siRNA干扰B7-H4基因的肿瘤细胞株会加速凋亡。因此，B7-H4已成为治疗肿瘤的新靶点，B7-H4阻断物(抗B7-H4抗体)可作为肿瘤治疗药物。然而，抗B7-H4抗体的作用时间短，需要长期进行注射，对于病人来说需要花费高昂的费用。

外泌体，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。外泌体介导的细胞间通讯主要通过以下三种方式：一是外泌体膜蛋白可以与靶细胞膜蛋白结合，进而激活靶细胞细胞内的信号通路。二是在细胞外基质中，外泌体膜蛋白可以被蛋白酶剪切，剪切的碎片可以作为配体与细胞膜上的受体结合，从而激活细胞内的信号通路。有报道称一些外泌体膜上蛋白在其来源细胞膜上未能检测出。三是外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，非选择性的释放其所含的蛋白质、mRNA以及microRNA。目前已经尝试用外泌体携带siRNA、化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。

干细胞是一类具备自我更新能力及向特定功能体细胞分化能力的“种子”细胞，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，在免疫应答、衰老、肿瘤发生等重大生物学活动中发挥着核心且不可替代的作用。依据干细胞特性的程度差异，主要将干细胞分为：全能干细胞(Totipotent stem cells)、多能干细胞(Pluripotent stem cells，PSCs)和成体干细胞(adult stem cell)。其中，多能干细胞PSCs具备几近无限的自我更新能力，以及在正常发育条件下向胚内所有胚层的器官、组织、细胞发育分化的潜能，典型的PSCs主要包括胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EGCs)、胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells，ECCs)，以及诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)等，这类细胞由于其强大的功能，并且可以一定程度地通过伦理限制，因此具有十分深远和广泛的应用前景。

因此，开发一种可以在人体中表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR及分泌该靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的外泌体的多能干细胞或其衍生物具有重要意义。

但是，无论是自体iPSCs细胞库，还是免疫配型PSCs细胞库的构思或建立都需要花费极大的财力、物力和人力。同种异基因供受体的器官、组织或细胞移植的分子免疫学基础主要是基于经典的主要组织相容性复合体MHC-I和MHC-II(人又作HLA-I、HLA-II)的配型。截至2019年6月，已鉴定和命名的HLA系统等位基因已超过20000个，仅经典的HLA-A、B、C的等位基因数分别都超过5000个，这些经典的HLA-I/II型等位基因各种可能的随机组合将是天文数字，并且随着新的等位基因的发现组合数随之增加，给器官、组织、细胞移植前的组织配型及供体选择带来极大的障碍，也给构建覆盖人群免疫配型PSCs细胞库带来巨大的困难。

于是，构建同种异体免疫兼容的通用型PSCs迫在眉睫。近年已有许多报道通过敲除B2M、CIITA等基因，实现HLA-I和HLA-II细胞表面或本身基因的缺失表达，进而使细胞具备免疫耐受或逃逸T/B细胞特异性免疫应答，产生免疫兼容的通用型PSCs，为更广泛的通用型PSCs源细胞、组织、器官应用奠定了重要的基础。也有报道细胞过表达CTLA4-Ig、PD-L1从而抑制同种异的免疫排斥。最近又有报道，在敲除B2M、CIITA的同时，敲入CD47，从而使细胞获得了逃逸除特异性免疫应答外，还具备免疫耐受或逃逸NK等细胞的固有免疫应答，从而使细胞具备了更加全面更强的免疫兼容特性。然而，这些方案要么免疫兼容不彻底，仍有通过其他途径发生同种异体的免疫排斥；要么彻底消除同种异体免疫排斥应答，但使供体源移植物的细胞本身同时丧失了抗原提呈的能力，这给受体带来了极大的致瘤性和病毒感染等疾病的风险。

为此，也有报道，不直接敲除B2M，而敲除HLA-A、HLA-B或一并敲除CIITA的同时，保留HLA-C，并构建12个覆盖人群超过90％的HLA-C免疫配型抗原，以此达到移植物的细胞仍具备一定程度的抗原提呈功能，并且同时能够通过HLA-C抑制NK细胞的固有免疫应答。但这类细胞，一来，HLA-I类抗原提呈的抗原类型缩小了三分之二以上，能够提呈的抗原完整性极大地不可逆的缩小，对于各种肿瘤、病毒以及其他疾病抗原的提呈具有极大的偏向性，仍然保留了相当程度的致瘤和病毒感染等疾病的风险，在CIITA同时敲除的情况下其致病风险更高；二来，12种高频率免疫配型的HLA-C抗原种族差异很大，通过我们核实计算部分地区仅能占到70％的比例，而中国、印度等人口大国目前尚未有权威的大样本量的HLA数据展示，这样制备出来的通用型PSCs使用仍受到巨大的配型空缺考验；第三，这种方法会经历数次反复的基因编辑工作，按每次基因编辑至少两轮单细胞分离培养计，整个过程至少需要六轮以上的单细胞分离培养，这些流程不可避免且极大概率地因多次基因编辑脱靶或染色质不稳定或因大量单细胞传代增殖造成细胞各种不可预测的突变，进而诱发致癌、代谢疾病等各种问题。由此可见，这类免疫兼容方案亦为“过渡时期”的权宜之计，仍有许多问题没有更好的解决。

此外，还有人设计通过诱导自杀基因在供体组织、细胞致病后诱导杀死，这样做的后果将产生严重的组织坏死、细胞因子风暴等不可预知的疾病风险问题，并且这类设计的细胞杀死后将不复存在合适的供体细胞、组织和器官又是一大难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多能干细胞或其衍生物；

本发明的另一目的在于提供一种外泌体；

本发明的再一目的在于提供所述多能干细胞或其衍生物和/或所述外泌体在制备B7-H4高表达肿瘤治疗药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列。

本发明研究发现，在多能干细胞或其衍生物中导入靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR表达序列后，多能干细胞或其衍生物中分泌的外泌体中包含高丰度的靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR以及加工成熟的siRNA，外泌体携带这些效应RNA分子与靶细胞结合，然后将其释放，从而阻断B7-H4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，其能够有效清除肿瘤细胞。

所述靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的序列如SEQ ID NO.101～SEQ IDNO.103所示。

本发明的第二个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列，所述多能干细胞或其衍生物基因组的B2M基因和/或CIITA基因被敲除。

当B2M和CIITA基因被敲除后，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此，其肿瘤治疗效果最佳。

本发明的第三个方面，提供一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有第一核酸分子；

且，所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3’UTR区域导入有第二核酸分子；

所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA。

本技术方案中，所述第一核酸分子编码的小核酸分子能够与免疫应答相关基因3’UTR区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达，进而使得此类细胞具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。而且，该RNA干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物，因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与免疫应答相关基因的3’UTR处导入的第二核酸分子所介导的免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。

进一步地，所述小核酸分子包括短干扰核酸、短干扰RNA、双链RNA，优选为miRNA、shRNA、shRNA-miR中的至少一种。

进一步地，上述多能干细胞或其衍生物来源于人类；上述小核酸分子的序列为不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列。

上述小核酸分子优选来源于秀丽隐杆线虫。例如：

5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG-3’(SEQ ID NO.1)；

5’-TCACAACCTCCTAGAAAGAGTAGA-3’(SEQ ID NO.100)。

进一步地，上述第二核酸分子包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。

进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达系统，用于调控第一核酸分子的表达。

本技术方案中，诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，从而控制小核酸分子的表达量。

当诱导型基因表达系统开启时，正常表达的小核酸分子和免疫应答相关基因3’UTR区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达。因此，此类细胞或衍生物被移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。

当移植物发生病变后，可以通过添加外源诱导物来关闭诱导型基因表达系统，进而关闭小核酸分子的表达，中止小分子核酸对免疫应答相关基因mRNA的干扰作用，恢复免疫应答相关基因的正常表达，进而恢复移植物细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的移植物，从而提高了这类多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

而且，该RNA干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物，因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与免疫应答相关基因的3’UTR处导入的第二核酸分子所介导的免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。

本发明的第四个方面，提供：

一种多能干细胞或其衍生物，所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入至少一种免疫兼容分子的表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

本技术方案中，免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，将其移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR，这些抑制因子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7-H4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达系统，用于调控免疫兼容分子的表达。

本技术方案中，诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，进一步控制免疫兼容分子表达序列的表达量，从而实现多能干细胞或其衍生物免疫兼容的可逆性调控。当免疫兼容分子正常表达时，多能干细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达被抑制或过表达，从而使得进行同种异体细胞治疗时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高供体细胞与受体之间的免疫兼容能力。而当供体细胞发生病变时，可通过外源诱导物诱导关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆地使供体细胞表面重新表达HLAⅠ类分子，恢复供体细胞的抗原提呈能力，进而受体免疫系统通过识别不匹配的HLAⅠ类分子或通过交叉HLAⅠ类分子抗原提呈(经典非兼容HLA之间的抗原提呈/识别)突变的分子，使受体能够清除病变的细胞，从而提高了这类通用型多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

关于本发明的第三个和第四个方面，进一步地，所述与免疫应答相关的基因包括：

(1)主要组织相容性复合体基因，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(2)主要组织相容性复合体相关基因，包括B2M和CIITA中的至少一种。

关于本发明的第四个方面，进一步地，所述免疫兼容分子包括以下的至少一种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47和HLA-G中的至少一种；

(2)HLA-C类分子，包括人群中比例合计超过90％的HLA-C复等位基因，或者超过90％的HLA-C复等位基因与B2M构成的融合蛋白基因；

(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，上述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，上述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。

更进一步地，所述靶向B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.10中的一种；

靶向CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13中的一种；

靶向HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16中的一种；

靶向HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.19中的一种；

靶向HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.22中的一种；

靶向HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.23～SEQ IDNO.25中的一种；

靶向HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.26～SEQ IDNO.28中的一种；

靶向HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.29～SEQ IDNO.30中的一种；

靶向HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.31～SEQ IDNO.33中的一种；

靶向HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.34～SEQ IDNO.36中的一种；

靶向HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.37～SEQ IDNO.39中的一种；

靶向HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.40～SEQ IDNO.42中的一种；

靶向HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.43～SEQ IDNO.45中的一种；

靶向HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.46～SEQ IDNO.48中的一种。

关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子，其中：shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；上述抗干扰素效应分子为靶向PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。

更进一步地，上述靶向PKR的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.51中的一种；

靶向2-5As的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.60中的一种；

靶向IRF-3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO63中的一种；

靶向IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.66中的一种。

关于本发明的第三个和第四个方面，所述诱导型基因表达系统包括Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

当采用的诱导型基因表达系统为Tet-Off系统时，可通过添加外源诱导物四环素(Doxycycline，Dox)来控制细胞或其衍生物中小核酸分子的表达。当所述的多能干细胞或其衍生物被移植到供体中后，甚至可以通过调整Dox的添加量，来逐步降低小核酸分子的表达量，使得细胞能够逐步地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。通常情况下，Dox的添加量为0-100uM。

二聚体诱导表达系统具体指：运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白FKBP12(FKBP与FK506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为FRAP(FRBP-雷帕霉素相关蛋白，即mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶点))有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将DNA结合区域融合到一个或多个FKBP结构域，将转录抑制域融合到FRAP的93位氨基酸部位，称为FRB，这样足以结合FKBP-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与DNA结合区域相结合的位点的基因进行转录。

关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，上述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因，所述外泌体加工合成基因包括STEAP3、Syndevan-4、L-天冬氨酸氧化酶片段(SEQ ID NO.69)、CD63-L7Ae(SEQ ID NO.70)和Cx43 S368A中的至少一种。

在干细胞或其衍生物的基因组中导入外泌体加工合成基因可以提高外泌体的分泌效率，及其对shRNA、shRNA-miR和加工成熟的siRNA的包裹效率。

关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述靶向B7-H4、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：

(1)shRNA表达框架：自5’到3’依次包括shRNA序列、茎环序列、shRNA序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上PolyT作为RNA聚合酶III的转录终止子；

(2)shRNA-miR表达框架：使用shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。

关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列、第一核酸分子、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法，所述基因编辑的方法优选为基因敲入。

关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列、第一核酸分子、外泌体加工合成基因、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统的导入位点为基因组安全位点，优选为AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

关于本发明的第一个至第四个方面，更进一步地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；

所述多能干细胞衍生物包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；

所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

本发明的第五个方面，提供一种外泌体，由所述多能干细胞或其衍生物分泌得到。

本发明的第六个方面，提供所述所述多能干细胞或其衍生物和/或所述外泌体在制备B7-H4高表达肿瘤治疗药物中的应用。

本发明的有益效果是：

1.本发明第一个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，可应用于自体细胞诱导的iPSCs或者MSCs低免疫源性细胞。其通过在自体细胞诱导的iPSCs基因组中导入靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列后，iPSCs能够大量表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR，并被细胞分泌的外泌体包裹。外泌体携带这些抑制因子与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7-H4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

2.本发明第二个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，还可以应用于同种异体细胞治疗。由于本发明中的多能干细胞或其衍生物中的B2M、CIITA基因被敲除，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，当其被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR，这些抑制因子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7-H4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

3.本发明第三个方面所提供的多能干细胞或其衍生物具有免疫兼容的特性，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答反应。而且，该多能干细胞或其衍生物的RNA干扰程序只作用于此类被改造过的多能干细胞或其衍生物。因此，当此类细胞或衍生物被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体细胞的基因组产生干扰。

更进一步地，所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有诱导型基因表达系统，用于调控第一核酸分子的表达，从而实现此类多能干细胞或其衍生物的免疫兼容可逆。

4.本发明第四个方面所提供的多能干细胞或其衍生物，其基因组中导入了免疫兼容分子表达序列，因而此类多能干细胞或其衍生物的免疫源性低，当其被移植到受体中时，由第一核酸分子编码的小核酸分子与第二核酸分子的转录产物所介导的针对免疫应答相关基因的RNA干扰，只作用于供体细胞，而不会对受体的细胞的基因组产生干扰。提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。移植物可以在受体内源源不断地表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR，这些抑制因子被外泌体包裹后，外泌体携带其与靶细胞结合，进而将其释放，从而阻断B7-H4通路，解除免疫抑制，激活免疫系统，并恢复T细胞活性，使其能够有效清除肿瘤细胞。

更进一步地，本发明第四个方面所提供的多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入了诱导型基因表达系统，诱导型基因表达系统可以调控免疫兼容分子的表达，而诱导型基因表达系统受外源诱导物的调控，通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间、种类来控制诱导型基因表达系统的开启与关闭，进一步控制免疫兼容分子表达序列的表达量，从而实现多能干细胞或其衍生物免疫兼容的可逆性调控。当诱导型基因表达系统开启时，正常表达的小分子核酸和免疫应答相关基因3’UTR区域导入的第二核酸分子的转录产物特异性结合，从而启动RNA干扰程序，将免疫应答相关基因的mRNA降解或沉默，从而阻断免疫应答相关基因的表达。因此，此类细胞或衍生物被移植到受体中时，可以消除或者降低同种异体免疫排斥应答，提高移植物与受体之间的免疫兼容能力。当移植物发生病变后，可以通过添加外源诱导物来关闭诱导型基因表达系统，从而停止小核酸分子的表达及小分子核酸对免疫应答相关基因mRNA的干扰作用，恢复免疫相关基因的正常表达，进而恢复移植物细胞的抗原提呈能力，使受体能够清除病变的移植物，从而提高了这类多能干细胞或其衍生物的临床安全性，极大地扩展其在临床应用的价值。

5.本发明中的多能干细胞或其衍生物还可以通过调整外源诱导物的添加量、持续作用时间，来逐步降低多能干细胞或其衍生物中小核酸分子的表达量，使得供体细胞能够逐步地表达低浓度的免疫相关基因来刺激供体，从而使得供体对移植的细胞或其衍生物逐步产生耐受，最终达到稳定的耐受。此时，即使移植物细胞表面表达不匹配的HLAⅠ类分子，也能够被受体免疫系统兼容。

附图说明

图1为Cas9(D10A)的质粒图谱。

图2为sgRNA Clone AAVS1-1的质粒图谱。

图3为sgRNA Clone AAVS1-2的质粒图谱。

图4为sgRNA clone B2M-1的质粒图谱。

图5为sgRNA clone B2M-2的质粒图谱。

图6为sgRNA clone B2M-3的质粒图谱。

图7为sgRNA clone B2M-4的质粒图谱。

图8为sgRNA clone CIITA-1的质粒图谱。

图9为sgRNA clone CIITA-2的质粒图谱。

图10为sgRNA clone CIITA-3的质粒图谱。

图11为sgRNA clone CIITA-4的质粒图谱。

图12为AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)的质粒图谱。

图13为AAVS1 KI Vector(shRNA,诱导型)的质粒图谱。

图14为AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,组成型)的质粒图谱。

图15为AAVS1 KI Vector(shRNA-miR,诱导型)的质粒图谱。

图16为B2M KI Vector的质粒图谱。

图17为CIITA KI Vector的质粒图谱。

具体实施方式

以下结合具体的实施例及附图对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

1实验材料与方法

1.1靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR

靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如表1所示。

表1 靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列

下面表8-表9的实验方案中，各实验组别敲入的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR均为采用表1中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.2多能干细胞或其衍生物

多能干细胞可选自胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)以及其他形式的多能干细胞，例如hPSCs-MSCs、NSCs、EBs细胞。其中：

ESCs：可选用HN4细胞，购自上海中科院。

iPSCs：使用我们所建立的第三代高效安全的episomal-iPSCs诱导系统(6F/BM1-4C)，pE3.1-OG--KS和pE3.1-L-Myc--hmiR302 cluster经电转进入体细胞中，RM1培养2天，含2uM Parnate的BioCISO-BM1培养2天，含2uM Parnate、0.25mM sodium butyrate、3uMCHIR99021和0.5uM PD03254901的BioCISO-BM1培养2天，在用干细胞培养基BioCISO培养到17天左右即可挑取iPSCs克隆，所挑取的iPSCs克隆经纯化、消化、传代以获得稳定的iPSCs。具体构建方法参见：Stem Cell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

hPSCs-MSCs：将iPSCs使用干细胞培养基(BioCISO，含10uM TGFβ抑制剂SB431542)培养25天，期间80-90汇合度进行消化传代(2mg/mL Dispase消化)，1:3传代到Matrigel包被的培养板中，接着ESC-MSC培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR、NEAA、双抗、谷氨酰胺、β-巯基乙醇、10ng/mL bFGF和SB-431542)进行培养，每天换液，80-90汇合度进行传代(1:3传代)，连续培养20天即可。具体构建方法参见：Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112(2):530-535。

NSCs：将iPSCs使用诱导培养基(knockout DMEM培养基，含10％KSR，含TGF-β抑制剂，BMP4抑制剂)培养14天，挑取玫瑰花环状的神经细胞到低粘附培养板中进行培养，培养基使用比例为1:1的DMEM/F12(含1％N2，Invitrogen)和Neurobasal培养基(含2％B27，Invitrogen)，还含有20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，进行培养，消化使用Accutase进行消化传代即可。具体构建方法参见：FASEB J.2014；28(11):4642-4656。

EBs细胞：将汇合度达到95％的iPSCs使用BioC-PDE1消化6min后使用机械刮传法将细胞刮成块状，沉降降细胞团块，沉降的细胞团块转移到低粘附培养板中使用BioCISO-EB1培养7天，隔天换液。7天后转移到Matrigel包被的培养板中继续使用BioCISO进行贴壁培养，7天后即可获得具有内、中、外三胚层结构的拟胚体(EBs)。具体构建方法参见：StemCell Res Ther.2017Nov 2；8(1):245。

所述多能干细胞衍生物还包括多能干细胞所分化的成体干细胞、各胚层细胞或组织、器官；所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

1.3小核酸分子及对应的第一核酸分子、第二核酸分子

小核酸分子的序列为来源于不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列，优选来源于秀丽隐杆线虫。

本实施例所采用的小核酸分子的序列为

5’-TTGTACTACACAAAAGTACTG-3’(SEQ ID NO.1)；

根据上述小核酸分子设计第一核酸分子和第二核酸分子，分别如下：

第一核酸分子(即小核酸分子的shRNA表达框架或shRNA-miR表达框架)：

(1)小核酸分子的shRNA表达框架的序列组成为：

5’-CCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.2)N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ ID NO.3)N₂₂...N₄₂TTTTTT-3’。

其中，

a)N₁...N₂₁为上述小核酸分子序列，N₂₂...N₄₂为上述小核酸分子序列的反向互补序列；

b)如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；

c)带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d)N表示A或T或G或C碱基。

(2)小核酸分子的shRNA-miR表达框架：将小核酸分子序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。具体序列如下：

5’-GAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO.4)M₁N₁...N₂₁TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.5)N₂₂...N₄₂M₂TGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAAT(SEQ ID NO.6)-3’。

其中，

a)N₁...N₂₁为小核酸分子序列，N₂₂...N₄₂为小核酸分子序列的反向互补序列；

b)如果质粒需要表达多个基因的shRNA-miR，则每个基因分对应一个shRNA-miR表达框架，然后无缝连接起来；

c)带不同抗性基因的组成型shRNA-miR质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d)N表示A或T或G或C碱基，M碱基表示A或C碱基；

e)若N1为G碱基，则M₁为A碱基；否则M₁为C碱基；

f)M₁碱基与M₂碱基互补。

第二核酸分子：包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。小核酸分子序列的反向互补序列可通过随机的Linker序列连接。

作为本发明的一个实施例，所述第二核酸分子由开头10nt的随机序列、及8个重复的小核酸分子序列的反向互补序列通过随机的linker序列(CGTA)连接而成：

atTCTAGATACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTACAGTACTTTTGTGTAGTACAACGTA(SEQ IDNO.7)。

1.4基因组安全位点

本发明技术方案中，基因敲入的基因组安全位点可选自AAVS1安全位点、eGSH安全位点，或者其它安全位点：

(1)AAVS1安全位点

AAVS1位点(别名“PPP1R2C位点”)位于人类基因组第19号染色体上，是一个经过验证、能够确保转入DNA片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录，且该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。

(2)eGSH安全位点

eGSH安全位点位于人类基因组第1号染色体上，是一个经过论文验证、能够确保转入DNA片段预期功能的另一个“安全港”位点。

(3)其它安全位点

H11安全位点(也叫Hipp11)，位于人的22号染色体，是Eif4enif1与Drg1这两个基因之间的一个位点，由Simon Hippenmeyer于2010年发现并命名，由于H11位点位于两个基因之间，故外源基因插入后影响內源基因表达的风险很小。H11位点被验证是一个基因间的安全的转录激活区域，是AAVS1、eGSH位点之外的一个新的“安全港”位点。

1.5诱导型基因表达系统

诱导型基因表达系统选自：tet-Off系统或者二聚体关闭表达系统：

(1)tet-Off系统

在没有四环素存在时，tTA蛋白持续作用在tet启动子上，使基因持续表达。在需要转基因保持在一个持续表达状态下，该系统是非常有用。加入四环素时，四环素可使tTA蛋白的结构变化，使其不能与启动子结合，从而使其驱动的基因表达水平下降。为了使该系统保持“关闭”状态，必须连续添加四环素。

本发明将tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。

(2)二聚体关闭表达系统

二聚体介导的基因表达调控系统：化学调控靶基因转录的方法有很多种，最常见的是利用影响转录因子活性的别构调节物进行调控。其中的一个方法是运用二聚化的诱导剂或者二聚体在无活性的融合蛋白上重组有活性的转录因子。最常用的体系是将天然产物雷帕霉素(rapamydn)或者无生物活性的类似物作为二聚化的药物。雷帕霉素(或类似物)同胞质蛋白FKBP12(FKBP与FK506结合的蛋白)和一种大的丝-苏氨酸蛋白激酶，称为FRAP【FRBP-雷帕霉素相关蛋白，即mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶点)】有高度亲和性，又与这两种蛋白质相结合的功能，因此作为异源性二聚体将这两种蛋白质聚到一起。为调控靶基因转录，将DNA结合区域融合到一个或多个FKBP结构域，将转录抑制域融合到FRAP的93位氨基酸部位，称为FRB，这样足以结合FKBP-雷帕霉素复合物。只有在雷帕霉素存在的情况下，这两种融合蛋白才能发生二聚化。因而抑制具有与DNA结合区域相结合的位点的基因进行转录。

1.6免疫兼容分子

所述免疫兼容分子可以调控多能干细胞或其衍生物中同种异体免疫排斥相关基因的表达。具体免疫兼容分子的种类及序列如表2所示。

表2 免疫兼容分子

以上shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子的靶序列如表3所示。

表3 shRNA或shRNA-miR的序列

下面表8-表9的实验方案中，各实验组别的敲入的shRNA或shRNA-miR类免疫兼容分子均为采用表3中的靶序列1构建得到的shRNA或shRNA-miR。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的shRNA或shRNA-miR免疫兼容分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.7shRNA/miRNA加工复合体基因和抗干扰素效应分子

在细胞核内的初级miRNA(pri-miRNA)经过复合物Drosha-DGCR8进行微处理，将pri-miRNA裂解成前体miRNA(pre-miRNA)，这时会形成发夹结构。接着，经Exportin-5-Ran-GTP复合物将pre-miRNA转运出核。在胞浆中与双链RNA结合蛋白TRBP(TARBP2)结合的RNaseDicer酶将pre-miRNA分解成成熟的长度，miRNA在这时还处于双链状态。最后被转运进AGO2，形成RISC(RNA诱导沉默复合体)。最终miRNA双链的一条链保留在RISC复合物中，另外一条则排出被迅速降解掉。而DGCR8作为Drosha的主要结合蛋白，可以通过其C末端的两个双链RNA结合区域与pri-miRNA结合，招募并指导Drosha在pri-miRNA的正确位置剪切，生产pre-miRNA，pre-miRNA进一步被Dicer和TRBP/PACT加工剪切，形成成熟的miRNA。DGCR8的缺失或异常表达会影响Drosha的剪切活性，进而影响miRNA的活性，导致疾病的发生。TRBP能够招募Dicer复合体miRNA形成RISC Ago2。

本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点敲入可诱导关闭表达的针对HLA I类分子和HLA II类分子等的shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的shRNA和/或miRNA加工机器包括Drosha(Accession number:NM_001100412)、Ago1(Accessionnumber:NM_012199)、Ago2(Accession number:NM_001164623)、Dicer1(Accessionnumber:NM_001195573)、Exportin-5(Accession number:NM_020750)、TRBP(Accessionnumber:NM_134323)、PACT(Accession number:NM_003690)和DGCR8(Accession number:NM_022720)，以便细胞不占用其他miRNA的加工，影响细胞功能。

此外，在IFN诱生的过程中，双链RNA所依赖的蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent Protein Kinase,PKR)，它是整个细胞信号转导通路的关键因子，同时还有2’,5’寡腺苷酸合成酶(2,5-Oligoadenylate Synthetase,2-5As)，这两种酶与dsRNA诱生IFN密切相关。PKR能通过磷酸化真核细胞转录因子，从而抑制蛋白质合成，使细胞停滞于G0/G1和G2/M期，并诱导凋亡，而dsRNA可以促进2-5As合成，结果导致RNase即RNaseL的非特异性活化，降解细胞内所有的mRNA，致细胞死亡。I型干扰素的诱导特异性是通过IRF转录因子家族成员实现的，在细胞缺乏IRF-3和IRF-7的表达下，在很多病毒感染情况下I型干扰素是不能被诱导分泌的。缺乏IFN的应答，要使其恢复，需要上述两种蛋白质的共表达才行。

本发明利用基因敲入技术，在基因组安全位点处敲入免疫兼容分子shRNA-miR表达序列时，优选同时敲入可诱导关闭表达的针对抑制PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7基因的shRNA和/或shRNA-miR表达序列，降低dsRNA诱发的干扰素反应，从而避免产生细胞毒性。

shRNA/miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、免疫兼容分子在基因组安全位点的插入位置顺序没有限定，它们之间可以以任何次序排列，而不会相互干扰或者影响基因组其它基因的结构和功能。

具体的抗干扰素效应分子的靶序列如表4所示。

表4 抗干扰素效应分子的靶序列

下面表8-表9的抗干扰素效应分子敲入方案中，各实验组别的抗干扰素效应分子的靶序列均为采用表4中的靶序列1构建得到的抗干扰素效应分子。本领域的技术人员可以理解：以其他靶序列构建得到的抗干扰素效应分子同样可以实现本发明的技术效果，均落入本发明权利要求的保护范围。

1.8免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架

免疫兼容分子、抗干扰素效应分子的shRNA或shRNA-miR的通用框架序列如下所示：

(1)shRNA组成型表达框架为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.67)

N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ ID NO.3)N₂₂...N₄₂TTTTTT；

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA靶序列，N₂₂...N₄₂为对应基因的shRNA靶序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA，则每个基因分对应一个shRNA表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、N表示A、T、G、C碱基；

e、SEQ ID NO.67为U6启动子序列；

f、SEQ ID NO.3为茎环序列。

(2)shRNA诱导型表达框架为：

GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCGAGCTCGGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGCTAGCGCCACC(SEQ ID NO.68)N₁...N₂₁TTCAAGAGA(SEQ ID NO.3)N₂₂...N₄₂TTTTTT；

其中：

d、N表示A、T、G、C碱基；

e、SEQ ID NO.68为H1 TO启动子序列；

f、SEQ ID NO.3为茎环序列。

(3)shRNA-miR组成型或诱导型表达框架为：

以shRNA-miR靶序列替换microRNA-30中的靶序列得到，具体序列如下：

GAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG(SEQ ID NO.4)M₁N₁...N₂₁TAGTGAAGCCACAGATGTA(SEQ ID NO.5)

N₂₂...N₄₂M₂TGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAAT(SEQ ID NO.6)；

其中：

a、N₁...N₂₁为对应基因的shRNA-miR靶序列，N₂₂...N₄₂为对应基因的shRNA-miR靶序列的反向互补序列；

b、如果质粒需要表达多个基因的shRNA-miR，则每个基因分对应一个shRNA-miR表达框架，然后无缝连接起来；

c、带不同抗性基因的组成型shRNA-miR质粒，只有抗性基因不同，其它序列一样；

d、M碱基表示A或C碱基，N表示A、T、G、C碱基；

e、如果N₁为G碱基，则M₁为A碱基；否则M₁为C碱基；

f、M₁碱基与M₂碱基互补。

1.9外泌体加工合成基因

外泌体加工合成基因选自STEAP3(NM_182915)、Syndecan-4(NM_002999)、L-天冬氨酸氧化酶片段(SEQ ID NO.69)、CD63-L7Ae(SEQ ID NO.70)和Cx43 S368A中的至少一种。其中，Cx43 S368A由Cx43(NM_000165)的第368位的S(丝氨酸)突变为A(丙氨酸))所得。

1.10基因编辑系统、基因编辑方法及检验方法

1.10.1基因编辑系统

本发明的基因编辑技术采用CRISPR-Cas9基因编辑系统。使用的Cas 9蛋白为Cas9(D10A)，Cas9(D10A)与sgRNA结合，sgRNA负责特异识别靶序列(基因组DNA)，然后Cas 9(D10A)对该靶序列进行单链切割。基因组DNA发生双链断裂(DNA Double Strand Break,DSB)，必须有两组Cas 9(D10A)/sgRNA分别对基因组DNA的两条链进行切割，且切割的距离不能太远。Cas 9(D10A)/sgRNA方案与Cas 9/sgRNA方案相比，优点是特异性更高，脱靶的概率更低。本基因编辑系统使用的质粒或Donor片段分别为：Cas9(D10A)质粒、sgRNA clone质粒、Donor片段。

(1)Cas9(D10A)质粒：表达Cas 9(D10A)蛋白的质粒，在sgRNA的引导下特异性单链切割基因组DNA。

(2)sgRNA质粒：表达sgRNA的质粒，sgRNA(small guide RNA)是向导RNA(guideRNA，gRNA)，在基因编辑负责引导表达Cas 9(D10A)蛋白的靶向切割。

AAVS1、B2M、CIITA的sgRNA序列如下：

sgRNA-AAVS1-1：5’-TATAAGGTGGTCCCAGCTCGGGG-3’(SEQ ID NO.71)；

sgRNA-AAVS1-2：5’-AGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGG-3’(SEQ ID NO.72)。

sgRNA-B2M-1:5’-CTCCTGTTATATTCTAGAACAGG-3’(SEQ ID NO.73)；

sgRNA-B2M-2:5’-TTTCAGCATCAATGTACCCTGGG-3’(SEQ ID NO.74)；

sgRNA-B2M-3:5’-CGCGAGCACAGCTAAGGCCA-3’(SEQ ID NO.75)；

sgRNA-B2M-4:5’ACTCTCTCTTTCTGGCCTGG 3’(SEQ ID NO.76)。

sgRNA-CIITA-1:5’-GGCACTCAGAAGACACTGATGGG-3’(SEQ ID NO.77)；

sgRNA-CIITA-2:5’-AAGGTGTCTGGTCGGAGAGCAGG-3’(SEQ ID NO.78)；

sgRNA-CIITA-3:5’-ACCCAGCAGGGCGTGGAGCC-3’(SEQ ID NO.79)；

sgRNA-CIITA-4:5’-GTCAGAGCCCCAAGGTAAAA-3’(SEQ ID NO.80)。

(3)Donor片段：两头含有重组臂，分别位于基因组DNA断裂位置的左右两边，中间含有需要插入的基因、片段或者表达元件。在Donor片段存在的情况下，细胞在基因组断裂的位置发生同源重组(Homologous recombination，HR)反应。如果不添加Donor片段，细胞的基因组断裂位置发生非同源末端连接(Non-homologous End Joining-NHEJ)反应。该片段由KI(Knock-in，下同)Vector质粒酶切后回收获取。

AAVS1、B2M、CIITA同源臂如下：

(1)AAVS1同源臂AAVS1-HR-L和AAVS1-HR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82所示；

(2)B2M同源臂B2M-HR-L和B2M-HR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.83和SEQ IDNO.84所示；

(3)CIITA同源臂CIITA-HR-L和CIITA-HR-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.86所示。

1.10.2组成型质粒和诱导型质粒

组成型质粒：从组成型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能不可以进行调控。

诱导型质粒：从诱导型质粒获取的Donor片段，敲入基因组DNA后，该片段的表达功能可以通过添加诱导物的方法来调控，相当于对表达功能添加了一个开启或者关闭的开关。

1.10.3质粒构建方法

(1)Cas9(D10A)质粒：该质粒不再需要构建，直接从Addgene(Plasmid 41816,Addgene)订购。

(2)sgRNA质粒：原始的空白质粒从Addgene(Plasmid 41824,Addgene)订购，然后在网站(URL:https://cctop.cos.uni-heidelberg.de)输入DNA序列设计靶序列，最后把不同的靶序列分别放入空白的sgRNA质粒完成构建。

(3)KI Vector质粒：

a.Amp(R)-pUC origin片段的获取：设计PCR引物，以pUC18质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把该片段扩增出来并回收；

b.AAVS1或者eGSH重组臂的获取：提取人细胞的基因组DNA并设计对应的引物，然后以人的基因组DNA为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，把这类片段AAVS1、B2M、CIITA同源臂(AAVS1-HR-L、AAVS1-HR-R、B2M-HR-L、B2M-HR-R、CIITA-HR-L和CIITA-HR-R)扩增出来并回收；

c.各个质粒元件的获取：设计各元件的PCR扩增引物，然后以含该元件的质粒为模板使用高保真酶(南京诺唯赞生物,P505-d1)通过PCR的方法，分别把各个质粒元件扩增出来并回收；

d.组装成完整质粒：使用多片段重组酶(南京诺唯赞生物，C113-02)把前面步骤获取的片段连接起来，形成一个完整的质粒。

上述方法得到的Cas9(D10A)质粒图谱如图1所示，AAVS1安全位点的sgRNA质粒图谱如图2-3所示，B2M基因的sgRNA质粒图谱如图4-7所示，CIITA基因的sgRNA质粒图谱如图8-11所示，构建的AAVS1KI质粒图谱(组成型和诱导型)如图12-15所示，B2M KI质粒图谱如图16所示，CIITA KI质粒图谱如图17所示。

1.10.4基因编辑过程

一、AAVS1基因敲入的单细胞克隆操作步骤

(1)电转程序：

供体细胞准备：人多能干细胞。

试剂盒：Human Stem Cell

Kit 1。

仪器：电转仪。

培养基：BioCISO。

诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone AAVS1-1、sgRNA clone AAVS1-2、AAVS1 neoVectoⅠ、AAVS1 neo VectorⅡ。

注：eGSH基因敲入使用的诱导质粒：Cas9D10A、sgRNA clone eGSH-1、sgRNA cloneeGSH-2、eGSH-neo/eGSH-puro(donor)这里的donor质粒与AAVS1的比较，只有左右重组臂不一样，其它元件都一样。由于eGSH的基因编辑过程与AAVS1的相同，后面就不再重复列举。

(2)电转后的人多能干细胞进行含G418和puro的双抗生素培养基进行筛选。

(3)进行单细胞克隆筛选及培养，获得单细胞克隆株。

二、AAVS1基因敲入的单细胞克隆株培养试剂

(1)培养基：BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro(应提前置于室温，避光条件放置30～60分钟，直至恢复到室温。注意：不应将BioCISO置于37℃进行预热，避免生物分子活性降低。)。

(2)基质胶：hESC级Matrigel(传代或复苏细胞前，将Matrigel工作液加入细胞培养瓶皿中并摇匀，确保Matrigel完全没过培养瓶皿底部，且在使用前任意一处Matrigel都不能干掉。为保证细胞能够更好的贴壁和存活，Matrigel放入37℃培养箱包被时间：1:100XMatrigel不能低于0.5小时；1:200X Matrigel不能低于2小时。)。

(3)消化液：使用DPBS溶解EDTA至终浓度为0.5mM，pH7.4(注意：EDTA不能使用水稀释，否则细胞会因渗透压降低而死亡。)。

(4)冻存液：60％BioCISO+30％ESCs级FBS+10％DMSO(冻存液最好现配现用。)。

三、常规维持传代培养过程

(1)传代的最佳时刻以及传代比例

a.传代最佳时刻：细胞整体汇合度达80％～90％；

b.传代最佳比例：1:4～1:7传代，次日最佳汇合度应维持在20％～30％。

(2)传代过程

a.事先将包被好的细胞培养瓶皿中的Matrigel吸走弃掉，加入适量培养基(BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro)，并放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

b.待细胞符合传代的要求，吸掉培养基上清，加入适量的0.5mM EDTA消化液到细胞瓶皿中；

c.将细胞放入37℃、5％CO₂培养箱中孵育5～10分钟(消化至镜下观察到大部分细胞收缩变圆但还未漂浮即可，轻柔吹打细胞使其从壁上脱离，将细胞悬液吸到离心管内，200g离心5分钟；

d.离心后，弃上清，用培养基重悬细胞，轻柔反复吹打细胞数次至混匀，然后将细胞转移至事先准备好包被Matrigel的瓶皿中；

e.细胞转移至细胞瓶皿后，前后左右水平摇匀，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

f.次日观察细胞贴壁存活状态，吸掉培养基每天正常按时换液。

四、细胞冻存

(1)按照常规传代的操作步骤，使用0.5mM EDTA消化细胞至大部分细胞收缩变圆但尚未漂浮，轻柔吹打细胞，收集细胞悬液，200g离心5分钟，弃上清，加入适量冻存液重悬细胞，将细胞转移至冻存管(建议六孔板汇合度80％冻存一支，冻存液体积为0.5mL/支)；

(2)将冻存管置于程序降温盒中，立即放入-80℃过夜(需保证冻存管每分钟温度下降1℃)；

(3)次日立即将细胞转移入液氮。

五、细胞复苏

(1)提前准备好Matrigel包被的细胞瓶皿，复苏细胞前，吸掉Matrigel，向细胞瓶皿中加入适量的BioCISO，置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育；

(2)将冻存管从液氮中快速取出，立即放入37℃水浴锅中快速摇晃，使细胞快速融解，仔细观察待冰晶完全消失停止摇晃，将细胞转移至生物安全柜；

(3)提前加入10mL DMEM/F12(1:1)基础培养基至15mL离心管，并平衡至室温，使用巴氏吸管吸取1mL DMEM/F12(1:1)缓慢加入冻存管中，轻柔混匀，将细胞悬液转移到准备好的含有DMEM/F12(1:1)的15mL离心管中，200g离心5分钟；

(4)小心弃掉上清，加入适量BioCISO，轻轻混匀细胞，种到提前准备好的细胞瓶皿中，水平前后左右摇匀后，镜下观察无异常后，摇匀置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(5)次日观察细胞贴壁存活状态，每天正常按时换液。若贴壁良好，则BioCISO更换为BioCISO+300μg/mL G418+0.5μg/mL puro。

1.10.5基因敲入检测方法

1.单细胞克隆AAVS1基因敲入检测

(1)AAVS1基因敲入检测说明

a.试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子；

b.试验方法:首先在Donor质粒抗性基因内部设计一条引物，然后在插入位点的基因组(靠近重组臂)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现)；

c.试验方案引物序列及PCR方案如表5所示。

表5 试验方案引物序列及PCR方案

B2M和CIITA基因3’UTR处第二核酸分子敲入的检测方法与AAVS1的检测原理相同，采用的PCR检测条件如表6、7所示。

表6 试验方案引物序列及PCR方案(B2M位点的敲入检测)

表7 试验方案引物序列及PCR方案(CIITA位点的敲入检测)

1.10.6在基因组安全位点敲入基因方法的检验方法

(1)试验目的：PCR检测经过基因敲入处理的细胞，测试该细胞是否为纯合子。由于两个Donor片段只有抗性基因的序列具有差异性，因此要判断该细胞是否为纯合子(两条染色体分别敲入不同抗性基因的Donor片段)，就需要检测该细胞的基因组是否含有两种抗性基因的Donor片段，只有双敲入的细胞才有可能是正确的纯合子。

(2)试验方法：首先在Donor质粒内部(非重组臂部分)设计一条引物，然后在基因组(非重组臂部分)设计另一条引物。如果Donor片段在基因组能够正确插入，就会有目的条带出现，否则无目的条带出现。

1.11 表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR及外泌体的多能干细胞或其衍生物对B7-H4的阻断效果检测

利用外泌体提取试剂盒(BestBio，lot#BB-3901)提取培养表达被外泌体包裹的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物后的培养上清中的外泌体。培养上清4℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液A，上下颠倒1min，4℃过夜。4℃条件下10000g离心60min，收集外泌体沉淀即可。

再利用流式细胞计量测定法对多能干细胞表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的阻断效果进行测试。在表达B7-H4的CHO细胞的培养基中添加含靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的外泌体，并对表达B7-H4的CHO细胞进行培养72h。消化成单个细胞并用PBS洗涤细胞2次后，将FITC标记的B7-H4抗体融合蛋白加入到试管中，37℃温育30分钟。使用流式细胞仪进行流式细胞计量分析。根据染色的平均荧光强度(MFI)，即可测量出多能干细胞表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR抑制CHO细胞表达B7-H4的效果。

1.12 ⁵¹Cr释放法检测靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR对T细胞杀伤肿瘤的影响

(1)效应细胞的准备：

T细胞分离：使用Ficoll密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradientcentrifugation)分离人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，再使用Dynabeads^TM CD3(Invitrogen^TM，货号：11151D)试剂盒分离出T细胞。将细胞重悬在含10％FBS的RPMI1640培养基中，通过台盼蓝染色计数细胞，并浓缩至1×10⁷细胞/mL。

(2)靶细胞的准备

肿瘤(RCC肾癌)细胞，将其消化重悬，通过台盼蓝染色计数细胞，配成1×10⁷细胞/mL的细胞悬液。

(3)⁵¹Cr释放试验

肿瘤细胞先用表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞的培养基上清培育72h，再与T细胞接触时，T就会攻击肿瘤细胞造成细胞裂解死亡。而未经表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞的培养基上清培育的会发生肿瘤细胞不被T细胞所识别，会发生免疫逃逸。所以通过检测培养基中⁵¹Cr的量，即可反应出T细胞杀伤肿瘤的能力。⁵¹Cr的释放到培养液中的量越少，肿瘤细胞越容易发生免疫逃逸。

定量检测细胞介导的细胞毒作用，以放射性同位素⁵¹Cr标记靶细胞，与效应分子或细胞共孵育，根据靶细胞裂解所释放的⁵¹Cr放射脉冲数(cpm)而判断细胞毒活性。

具体步骤如下：

a.将靶细胞用100μCi(Ci,放射性活度单位)的Na⁵¹CrO₄在37℃标记120min，每15分钟震摇一次，标记后再用清洗液离心清洗5次，最后重悬于培养液中，配成1×10⁶细胞/mL备用。

b.将靶细胞及T细胞加入96孔培养板中，每孔加100μL靶细胞(2.5×10³个)及100μL效应细胞(E/T＝1:2、1:5、1:10，E/T为靶细胞与效应细胞T的比)，同时设立自然释放对照孔(100μL靶细胞+100uL培养基)和最大释放孔(100μl靶细胞+100ul 2％SDS)。放置37℃，5％CO₂培养孵育4h。取出后用移液器吸出各孔上清液后，离心取上清液100μL，用γ计数仪测量cpm值。

c.结果计算：根据公式计算⁵¹Cr自然释放率和T细胞的活性：

注：一般要求⁵¹Cr自然释放率<10％。

1.13小鼠肿瘤治疗方法

在人源化NSG小鼠(The Jackson Laboratory(JAX))中，对其右腋下皮下注射5×10⁶肿瘤细胞(MC结肠癌，NIC肺癌，MM黑色素瘤)细胞，待肿瘤长到60mm³大小时，进行尾静脉注射200uLPBS(含人免疫细胞和1×10⁶的表达被外泌体包裹的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞衍生物)进行肿瘤治疗，其中只注射含人免疫细胞的组作为对照组。20天后处死小鼠，然后比较各组之间肿瘤大小，并进行差异性统计分析。

2.实验方案

将表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR、外泌体加工合成基因、第一核酸分子、第二核酸分子、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子敲入到多能干细胞基因组的实验方案如表8-表9所示，其中，“+”号表示基因或核酸序列的敲入，“-”号表示基因敲除。

表8 组成型表达实验方案

选取的质粒以及具体的敲入位置情况如下：

总体原则：靶向B7-H4的shRNA(或shRNA-miR)放入对应质粒的shRNA(或shRNA-miR)表达框架2内，其余的shRNA(或shRNA-miR)放入对应质粒的shRNA(或shRNA-miR)表达框架1内，基因序列放入MCS内。

B2M-3’UTR-miRNA-locus或CIITA-3’UTR-miRNA-locus即第二核酸分子(SEQ IDNO.7)，分别敲入B2M和CIITA基因的3’UTR区域。

B2M/CIITA-3’UTR-shRNA为小核酸分子的shRNA表达框架，也即第一核酸分子，特异性靶向B2M基因和CIITA基因3’UTR区域第二核酸分子的转录产物，敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR为小核酸分子的shRNA-miR表达框架，也即第一核酸分子，靶向B2M基因和CIITA基因3’UTR区域第二核酸分子的转录产物，敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

CD47表示CD47表达序列，其敲入位点为基因组安全位点AAVS1。

若表达框或者MCS需要插入多个片段，可先使用EMCV IRESwt(SEQ ID NO.99)连接起来，然后插入。

基因敲入的sgRNA质粒为：sgRNA clone B2M-1、sgRNA clone B2M-2,、sgRNAclone CIITA-1和sgRNA clone CIITA-2。

基因敲除使用的sgRNA质粒为：sgRNA clone B2M-3、sgRNA clone B2M-4、sgRNAclone CIITA-3、sgRNA clone CIITA-4。

(1)Aa1分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的shRNA表达框架2放入B7-H4的shRNA靶序列。

(2)Aa2分组

AAVS1 KI Vector(shRNA，组成型)质粒的shRNA表达框架2放入B7-H4的shRNA靶序列，shRNA表达框架1放入其余的shRNA靶序列(包括B2M/CIITA-3’UTR-shRNA的靶序列)，MCS放入基因序列；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus；

(注：基因敲入(KI)使用sgRNA质粒为:sgRNA clone B2M-1,sgRNA clone B2M-2,sgRNA clone CIITA-1,sgRNA clone CIITA-2)。

(3)Aa3分组

AAVS1 KI Vector(shRNA,组成型)质粒的shRNA表达框架2放入B7-H4的shRNA靶序列，shRNA表达框架1放入其余的shRNA靶序列，敲除B2M和CIITA，MCS放入基因序列。

(注：基因敲除(KO)使用sgRNA质粒为:sgRNA clone B2M-3,sgRNA clone B2M-4,sgRNA clone CIITA-3,sgRNA clone CIITA-4)。

(4)Aa4分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，组成型)质粒的shRNA表达框架2放入靶向B7-H4的shRNA序列，shRNA表达框架1放入其余的shRNA靶序列，MCS放入基因序列。

(5)Ab1分组

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，组成型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入B7-H4的shRNA-miR靶序列。

(6)Ab2分组

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，组成型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入B7-H4的shRNA-miR靶序列，shRNA-miR表达框架1放入其余的shRNA-miR靶序列(包括B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR的靶序列)，MCS放入基因序列；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus；

(7)Ab3分组

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，组成型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入B7-H4的shRNA-miR靶序列，shRNA-miR表达框架1放入其余的shRNA-miR靶序列，敲除B2M和CIITA，MCS放入基因序列；

(8)Ab4分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，组成型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入靶向B7-H4的shRNA-miR序列，shRNA-miR表达框架1放入其余的shRNA-miR靶序列，MCS放入基因序列。

其中，在进行免疫兼容改造的时候，可以先在hPSCs上进行进行改造，改造完成后再分化成多能干细胞的衍生物进行运用；也可以在hPSCs分化成多能干细胞的衍生物后再进行免疫兼容改造。

表9 诱导型表达(免疫兼容可逆)实验方案

(1)B1分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，诱导型)质粒的shRNA表达框架2放入B7-H4的shRNA靶序列，shRNA表达框架1放入其余的shRNA靶序列(包括B2M/CIITA-3’UTR-shRNA的靶序列)，MCS放入基因序列；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus；

(注：基因敲入(KI)使用sgRNA质粒为:sgRNA clone B2M-1,sgRNA clone B2M-2,sgRNA clone CIITA-1,sgRNA clone CIITA-2),采用Tet-Off系统诱导系统。

(2)B2分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，诱导型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入B7-H4的shRNA-miR靶序列，shRNA-miR表达框架1放入其余的shRNA-miR靶序列(包括B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR的靶序列)，MCS放入基因序列；

B2M KI Vector放入B2M-3’UTR-miRNA-locus；

CIITA KI Vector放入CIITA-3’UTR-miRNA-locus；

(3)B3分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA，诱导型)质粒的shRNA表达框架2放入靶向B7-H4的shRNA序列，shRNA表达框架1放入其余的shRNA靶序列(包括B2M/CIITA-3’UTR-shRNA的靶序列)，MCS放入基因序列。加入Tet-Off系统诱导系统。

(4)B4分组：

AAVS1 KI Vector(shRNA-miR，诱导型)质粒的shRNA-miR表达框架2放入靶向B7-H4的shRNA-miR序列，shRNA-miR表达框架1放入其余的shRNA-miR靶序列(包括B2M/CIITA-3’UTR-shRNA-miR的靶序列)，MCS放入基因序列。加入Tet-Off系统诱导系统。

本发明中的Tet-Off系统具体为：

Tet-Off系统以及一种或多种免疫兼容分子的序列敲入多能干细胞的基因组安全位点处，通过四环素的添加与否精准开启或关闭免疫兼容分子的表达，从而可逆调控多能干细胞或其衍生物中主要组织相容性复合体相关基因的表达。

3.实验结果

3.1多能干细胞或其衍生物表达的装载靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的外泌体对B7-H4的阻断效果检测

将表8-表9各实验组方案敲入hPSCs-MSCs细胞的基因组安全位点，37℃，0.5％CO₂培养箱培养，收集培养基上清，利用外泌体提取试剂盒(BestBio，lot#BB-3901)提取培养表达被外泌体包裹的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞及其衍生物后的培养上清中的外泌体。培养上清4℃条件下3000g离心15min，收集上清后在4℃条件下10000g离心20min，收集上清，按4:1比例加入提取液A，上下颠倒1min，4℃过夜。4℃条件下10000g离心60min，收集外泌体沉淀即可。再利用流式细胞计量测定法对多能干细胞表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的阻断效果进行测试。在表达B7-H4的CHO细胞的培养基中添加含靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的外泌体，并对表达B7-H4的CHO细胞进行培养72h。消化成单个细胞并用PBS洗涤细胞2次后，将FITC标记的B7-H4抗体融合蛋白加入到试管中，37℃温育30分钟。使用流式细胞仪进行流式细胞计量分析。根据染色的平均荧光强度(MFI)，即可测量出多能干细胞表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR抑制CHO细胞表达B7-H4的效果。各实验组的检测结果如表10所示。N(对照)组是指没有添加含靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的外泌体进行培养的表达B7-H4的CHO细胞。

表10 各实验组表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR对B7-H4表达的抑制效果

从上表可以看出，本发明的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR能有效抑制靶细胞的B7-H4表达，从而达到阻断B7-H4效果。而且其抑制程度在各组中表达相对恒定，所以多能干细胞衍生物所表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR不受细胞分化形态及其他外源基因(免疫兼容改造)所影响。

3.2表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果

将表8-表9各实验组方案敲入MSCs细胞的基因组安全位点，得到表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的细胞。使用⁵¹Cr测试试验检验其抗肿瘤效果。各实验组的检测结果如表11所示。

表11 各实验组表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR对T细胞杀伤肿瘤细胞的影响

组别	<sup>51</sup>Cr释放率平均值(％)	偏差(±)	独立样本T检验(*p<0.01)
				N(对照)	34.537	1.107	-
Aa1	55.654	1.511	*
				Aa2	54.302	2.295	*
Aa3	55.295	0.301	*
				Aa4	54.478	2.648	*
Ab1	57.930	1.103	*
				Ab2	53.787	3.321	*
Ab3	53.753	2.698	*
				Ab4	53.445	3.065	*
B1	53.837	2.730	*
				B2	56.400	3.309	*
B3	54.827	1.704	*
				B4	54.673	3.208	*

注：N(对照)组是指未用表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞的培养基上清处理细胞。独立样本T检验(*p<0.01)。

通过以上实验，可以证明本发明制备的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR起到抗肿瘤作用。

3.3靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR在多种肿瘤治疗中进行应用

我们选择B2M和CIITA基因敲除方案组(Aa3、Ab3)的细胞(MSCs)中进行测试。

在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，我们对其进行注射各组实验细胞，观察其对MC结肠癌，NIC肺癌，MM黑色素瘤的治疗的效果。为避免免疫兼容问题，我们所使用的免疫细胞与hPSCs及hPSCs源衍生物均来源于同一人的。各实验组结果如表12所示。

表12 各实验组表达的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物的抗肿瘤效果

注：N(对照)组是指未注射实验细胞的NSG小鼠肿瘤模型。独立样本T检验(*p<0.01)。

通过以上实验，可以证明本发明制备的多能干细胞或其衍生物所表达的被外泌体包裹的靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR能够起到抗肿瘤作用。

3.4免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试

通过上述实施例，表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的hPSCs源衍生物能有效阻断B7-H4而起到抗肿瘤作用。我们还必须考虑hPSCs源衍生物的免疫兼容问题。因此我们选取一个合适的组合对免疫兼容进行测试。

我们利用MSCs的低免疫源性的特点，在人源化NSG小鼠肿瘤模型中，对其进行注射能够表达靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR的hPSCs源免疫兼容MSCs，观察其肿瘤(MC结肠癌)治疗的效果。注:所使用的免疫细胞与hPSCs源MSCs来源于为非同一人。

对照组是指未注射MSCs细胞的NSG小鼠肿瘤模型。

加Dox组别的处理是：在小鼠饮食中添加0.5mg/mL的Dox，进行饲养小鼠，从注射表达靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR细胞开始，一直使用，直到试验结束。结果如表13所示。

表13 免疫兼容分子诱导型表达组的可逆性表达测试结果

以上实验表明：仅表达靶向B7-H4的shRNA的MSCs(组2)，其具有低免疫源性，可以在异体内存在一定时间，所以其能够发挥一定的肿瘤治疗效果，而进行免疫兼容改造的(组3-7，包括组成型和可逆诱导型免疫兼容)，其免疫兼容效果更佳，比没有经免疫兼容改造的MSCs在体内存在时间更长(或能做到长期共存)，其发挥肿瘤治疗效果更佳，而组4为B2M和CIITA基因敲除组，其完全消除HLA-I和HLA-II类分子产生的影响，因此其肿瘤治疗效果最佳。但由于其组成型免疫兼容改造(基因敲入/敲除)，无法在移植物产生变异或不需要时进行清除，从而有组6-9方案设定。组8和9中在进行注射表达靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR的细胞进入小鼠的同时，对小鼠使用Dox诱导剂(一直使用)，注射表达靶向B7-H4的shRNA/shRNA-miR的细胞的小鼠的免疫兼容效果将被消除，其在体内存在时间与未经免疫兼容改造的MSCs相当，其肿瘤治疗效果也与未经免疫兼容改造的MSCs相当。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 未来智人再生医学研究院（广州）有限公司

王淋立

<120> 一种表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物

<130>

<160> 103

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 1

ttgtactaca caaaagtact g 21

<210> 2

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccactcccta tcagtgatag agaaaagtga aagtcgagtt taccactccc tatcagtgat 60

agagaaaagt gaaagtcgag tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaagtcg 120

agtttaccac tccctatcag tgatagagaa aagtgaaagt cgagctcggt acccgggtcg 180

aggtaggcgt gtacggtggg aggcctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 240

cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccggg accgatccag 300

cctgctagcg ccacc 315

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttcaagaga 9

<210> 4

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaggcttcag tactttacag aatcgttgcc tgcacatctt ggaaacactt gctgggatta 60

cttcttcagg ttaacccaac agaaggctaa agaaggtata ttgctgttga cagtgagcg 119

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagtgaagcc acagatgta 19

<210> 6

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcctactgc ctcggacttc aaggggctac tttaggagca attatcttgt ttactaaaac 60

tgaatacctt gctatctctt tgatacattt ttacaaagct gaattaaaat ggtataaat 119

<210> 7

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

attctagata cagtactttt gtgtagtaca acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta 60

cagtactttt gtgtagtaca acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta cagtactttt 120

gtgtagtaca acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta cagtactttt gtgtagtaca 180

acgtacagta cttttgtgta gtacaacgta 210

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 8

gggagcagag aattctctta t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 9

ggagcagaga attctcttat c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 10

gagcagagaa ttctcttatc c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 11

gctacctgga gcttcttaac a 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 12

ggagcttctt aacagcgatg c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 13

gggtctccag tatattcatc t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 14

gctcccactc catgaggtat t 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 15

ggtatttctt cacatccgtg t 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 16

aggagacacg gaatgtgaag g 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 17

gctcccactc catgaggtat t 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 18

ggtatttcta cacctccgtg t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 19

ggaccggaac acacagatct a 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 20

ttcttacttc cctaatgaag t 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 21

aagttaagaa cctgaatata a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 22

aacctgaata taaatttgtg t 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 23

gggtctggtg ggcatcatta t 21

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 24

ggtctggtgg gcatcattat t 21

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 25

gcatcattat tgggaccatc t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 26

gatgaccaca ttcaaggaag a 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 27

gaccacattc aaggaagaac t 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 28

gctttcctgc ttggcagtta t 21

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 29

gcgtaagtct gagtgtcatt t 21

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 30

gacaatttaa ggaagaatct t 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 31

ggccatagtt ctccctgatt g 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 32

gccatagttc tccctgattg a 21

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 33

gcagatgacc acattcaagg a 21

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 34

gcagcaggat aagtatgagt g 21

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 35

gcaggataag tatgagtgtc a 21

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 36

ggttcctgca cagagacatc t 21

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 37

ggatgtggaa cccacagata c 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 38

gatgtggaac ccacagatac a 21

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 39

gtggaaccca cagatacaga g 21

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 40

gggtagcaac tgtcaccttg a 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 41

ggatttcgtg ttccagttta a 21

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 42

gcatgtgcta cttcaccaac g 21

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 43

gctcacagtc atcaattata g 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 44

gccctgaaga cagaatgttc c 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 45

gcggaccatg tgtcaactta t 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 46

gcctgatagg acccatattc c 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 47

gcatccaata gacgtcattt g 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 48

gcgtcactgg cacagatata a 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 49

ggatggattt gattatgatc c 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 50

ggaccttgga acaatggatt g 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 51

gctaattctt gctgaacttc t 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 52

gcagttctgt tgccactctc t 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 53

gggagagttc atccaggaaa t 21

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 54

ggagagttca tccaggaaat t 21

<210> 55

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 55

gggttggttt atccaggaat a 21

<210> 56

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 56

ggatcagaag agaagccaac g 21

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 57

ggttcaccat ccaggtgttc a 21

<210> 58

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 58

ggaggaactt tgtgaacatt c 21

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 59

gctgtaagaa ggatgctttc a 21

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 60

gctgcaggca ggattgtttc a 21

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 61

gcctcgagtt tgagagcta 19

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 62

agacattctg gatgagtta 19

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> human

<400> 63

gggtctgtta cccaaagaa 19

<210> 64

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 64

ggacactggt tcaacacctg t 21

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 65

ggttcaacac ctgtgacttc a 21

<210> 66

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 66

acctgtgact tcatgtgtgc g 21

<210> 67

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 67

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgctagcgcc acc 253

<210> 68

<211> 686

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 68

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

ctttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca 300

gtgatagaga aaagtgaaag tcgagtttac cactccctat cagtgataga gaaaagtgaa 360

agtcgagttt accactccct atcagtgata gagaaaagtg aaagtcgagt ttaccactcc 420

ctatcagtga tagagaaaag tgaaagtcga gtttaccact ccctatcagt gatagagaaa 480

agtgaaagtc gagtttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaag tcgagctcgg 540

tacccgggtc gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg 600

aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg 660

gaccgatcca gcctgctagc gccacc 686

<210> 69

<211> 1607

<212> DNA

<213> human

<400> 69

atgaatactc tccctgaaca ttcatgtgac gtgttgatta tcggtagcgg cgcagccgga 60

ctttcactgg cgctacgcct ggctgaccag catcaggtca tcgttctaag taaggccggt 120

aacgaggttc aacattttat gcccagggcg gtattgccgc cgtgtttgat aaactgacag 180

cattgactcg catgtggaag acacattgat tgccggggct ggtatttgcg atcgccatgc 240

agttgaattt gtcgccagca atgcacgatc ctgtgtgcaa tggctaatcg accagggggt 300

gttgtttgat acccacattc aaccgaatgg cgaagaaagt taccatctga cccgtgaagg 360

tggacatagt caccgtcgta ttcttcatgc cgccgacgcc accggtagag aagtagaaac 420

cacgctggtg agcaaggcgc tgaaccatcc gaatattcgc gtgctggagc gcagcaacgc 480

ggttgatctg attgtttctg acaaaattgg cctgccgggc acgcgacggg ttgttggcgc 540

gtgggtatgg aaccgtaata aagaaacggt ggaaacctgc cacgcaaaag cggtggtgct 600

ggcaaccggc ggtgcgtcga aggtttatca gtacaccacc aatccggata tttcttctgg 660

cgatggcatt gctatggcgt ggcgcgcagg ctgccggttg ccaatctcga tttaatcagt 720

tccaccctac cgcgctatat cacccacagg cacgcaattt cctgttaaca gaagcactgc 780

gcggcgaggc gcttatctca agcgcccgga tggtacgcgt ttatccgatt ttgatgagcg 840

cggcgaactg ccccgcgcga tattgtcgcc cgcgccattg accatgaaat gaaacgcctc 900

ggcgcagatt gtatgttcct tgatatcagc cataagcccg ccgattttat tcgccagcat 960

ttcccgatga tttatgaaaa gctgctcggg ctgggattga tctcacacaa gaaccggtac 1020

cgattgtgcc tgctgcacat tatacctgcg gtggtgtaat ggttgatgat catgggcgta 1080

cggacgtcga gggcttgtat gccattggcg aggtgagtta taccggctta cacggcgcta 1140

accgcatggc ctcgaattca ttgctggagt gtctggtcta tggctggtcg gcggcggaag 1200

atatcaccag acgtatgcct tatgcccacg acatcagtac gttaccgccg tgggatgaaa 1260

gccgcgttga gaaccctgac gaacggtagt aattcagcat aactggcacg agctacgtct 1320

gtttatgtgg gattacgttg gcattgtgcg cacaacgaag cgcctggaac gcgccctgcg 1380

gcggataacc atgctccaac aagaaataga cgaatattac gcccatttcc gcgtctcaaa 1440

taatttgctg gagctgcgta atctggtaca ggttgccgag ttgattgttc gctgtgcaat 1500

gatgcgtaaa gagagtcggg gttgcatttc acgctggatt atccggaact gctcacccat 1560

tccggtccgt cgatccttcc cccggcaatc attacataaa cagataa 1607

<210> 70

<211> 411

<212> DNA

<213> human

<400> 70

ggaagtggtg ccggcaccgg cggcatgtac gtgcgcttcg aggtgcccga ggacatgcag 60

aacgaggccc tgagcctgct ggaaaaagtg cgcgagagcg gcaaagtgaa gaagggcacc 120

aacgaaacca ccaaggccgt ggaacggggc ctggccaagc tggtgtatat cgccgaggac 180

gtggaccccc ccgagattgt ggcccatctg cccctgctgt gcgaagagaa gaacgtgccc 240

tacatctacg tgaagtccaa gaacgacctg ggcagagccg tgggcatcga ggtgccatgt 300

gcctctgccg ccatcatcaa cgagggcgag ctgcggaaag aactgggcag cctggtggaa 360

aagatcaagg gcctgcagaa gggttccggt ggatccggtt ccggacgggc t 411

<210> 71

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 71

tataaggtgg tcccagctcg ggg 23

<210> 72

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 72

agggccggtt aatgtggctc tgg 23

<210> 73

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 73

ctcctgttat attctagaac agg 23

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 74

tttcagcatc aatgtaccct ggg 23

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 75

cgcgagcaca gctaaggcca 20

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 76

actctctctt tctggcctgg 20

<210> 77

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 77

ggcactcaga agacactgat ggg 23

<210> 78

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 78

aaggtgtctg gtcggagagc agg 23

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 79

acccagcagg gcgtggagcc 20

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 80

gtcagagccc caaggtaaaa 20

<210> 81

<211> 804

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 81

tgctttctct gacctgcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt 60

ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt 120

cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc 180

cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg 240

tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct 300

gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct 360

tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc 420

gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc 480

ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt 540

catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc 600

ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc 660

ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct 720

gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct 780

gtcccctcca ccccacagtg gggc 804

<210> 82

<211> 837

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 82

actagggaca ggattggtga cagaaaagcc ccatccttag gcctcctcct tcctagtctc 60

ctgatattgg gtctaacccc cacctcctgt taggcagatt ccttatctgg tgacacaccc 120

ccatttcctg gagccatctc tctccttgcc agaacctcta aggtttgctt acgatggagc 180

cagagaggat cctgggaggg agagcttggc agggggtggg agggaagggg gggatgcgtg 240

acctgcccgg ttctcagtgg ccaccctgcg ctaccctctc ccagaacctg agctgctctg 300

acgcggccgt ctggtgcgtt tcactgatcc tggtgctgca gcttccttac acttcccaag 360

aggagaagca gtttggaaaa acaaaatcag aataagttgg tcctgagttc taactttggc 420

tcttcacctt tctagtcccc aatttatatt gttcctccgt gcgtcagttt tacctgtgag 480

ataaggccag tagccagccc cgtcctggca gggctgtggt gaggaggggg gtgtccgtgt 540

ggaaaactcc ctttgtgaga atggtgcgtc ctaggtgttc accaggtcgt ggccgcctct 600

actccctttc tctttctcca tccttctttc cttaaagagt ccccagtgct atctgggaca 660

tattcctccg cccagagcag ggtcccgctt ccctaaggcc ctgctctggg cttctgggtt 720

tgagtccttg gcaagcccag gagaggcgct caggcttccc tgtccccctt cctcgtccac 780

catctcatgc ccctggctct cctgcccctt ccctacaggg gttcctggct ctgctct 837

<210> 83

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 83

cctggacttc tccagtactt tctggctgga ttggtatctg aggctagtag gaagggcttg 60

ttcctgctgg gtagctctaa acaatgtatt catgggtagg aacagcagcc tattctgcca 120

gccttatttc taaccatttt agacatttgt tagtacatgg tattttaaaa gtaaaactta 180

atgtcttcct tttttttctc cactgtcttt ttcatagatc gagacatgta agcagcatca 240

tggaggtaag tttttgacct tgagaaaatg tttttgtttc actgtcctga ggactattta 300

tagacagctc taacatgata accctcacta tgtggagaac attgacagag taacatttta 360

gcagggaaag aagaatccta cagggtcatg ttcccttctc ctgtggagtg gcatgaagaa 420

ggtgtatggc cccaggtatg gccatattac tgaccctcta cagagagggc aaaggaactg 480

ccagtatggt attgcaggat aaaggcaggt ggttacccac attacctgca aggctttgat 540

ctttcttctg ccatttccac attggacatc tctgctgagg agagaaaatg aaccactctt 600

ttcctttgta taatgttgtt ttattcttca gacagaagag aggagttata cagctctgca 660

gacatcccat tcctgtatgg ggactgtgtt tgcctcttag aggttcccag gccactagag 720

gagataaagg gaaacagatt gttataactt gatataatga tactataata gatgtaacta 780

caaggagctc cagaagcaag agagagggag gaacttggac ttctctgcat ctttagttgg 840

agtccaaagg cttttcaatg aaattctact gcccagggta cattgatgct gaaaccccat 900

<210> 84

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 84

tcaaatctcc tgttatattc tagaacaggg aattgatttg ggagagcatc aggaaggtgg 60

atgatctgcc cagtcacact gttagtaaat tgtagagcca ggacctgaac tctaatatag 120

tcatgtgtta cttaatgacg gggacatgtt ctgagaaatg cttacacaaa cctaggtgtt 180

gtagcctact acacgcatag gctacatggt atagcctatt gctcctagac tacaaacctg 240

tacagcctgt tactgtactg aatactgtgg gcagttgtaa cacaatggta agtatttgtg 300

tatctaaaca tagaagttgc agtaaaaata tgctatttta atcttatgag accactgtca 360

tatatacagt ccatcattga ccaaaacatc atatcagcat tttttcttct aagattttgg 420

gagcaccaaa gggatacact aacaggatat actctttata atgggtttgg agaactgtct 480

gcagctactt cttttaaaaa ggtgatctac acagtagaaa ttagacaagt ttggtaatga 540

gatctgcaat ccaaataaaa taaattcatt gctaaccttt ttcttttctt ttcaggtttg 600

aagatgccgc atttggattg gatgaattcc aaattctgct tgcttgcttt ttaatattga 660

tatgcttata cacttacact ttatgcacaa aatgtagggt tataataatg ttaacatgga 720

catgatcttc tttataattc tactttgagt gctgtctcca tgtttgatgt atctgagcag 780

gttgctccac aggtagctct aggagggctg gcaacttaga ggtggggagc agagaattct 840

cttatccaac atcaacatct tggtcagatt tgaactcttc aatctcttgc actcaaagct 900

<210> 85

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 85

cttgacaagt ctcctgctcc tcactatgaa gatcactgtc ccccagccct gtgctccccg 60

cactgtgctg cacgtccacc tccattccac tgcccctccc atccccccat cttgatagca 120

cccttcccag gtgtcaagct gcccctccta gagtgtcctg cctaaacccc ctctcctggc 180

tcctcccgct acagcatgtt ctctgaggac actaaccacg ctggaccttg aactgggtac 240

ttgtggacac agctcttctc caggctgtat cccatgagcc tcagcatcct ggcacccggc 300

ccctgctggt tcagggttgg cccctgcccg gctgcggaat gaaccacatc ttgctctgct 360

gacagacaca ggcccggctc caggctcctt tagcgcccag ttgggtggat gcctggtggc 420

agctgcggtc cacccaggag ccccgaggcc ttctctgaag gacattgcgg acagccacgg 480

ccaggccaga gggagtgaca gaggcagccc cattctgcct gcccaggccc ctgccaccct 540

ggggagaaag tacttctttt tttttatttt tagacagagt ctcactgttg cccaggctgg 600

cgtgcagtgg tgcgatctgg gttcactgca acctccgcct cttgggttca agcgattctt 660

ctgcttcagc ctcccgagta gctgggacta caggcaccca ccatcatgtc tggctaattt 720

ttcattttta gtagagacag ggttttgcca tgttggccag gctggtctca aactcttgac 780

ctcaggtgat ccacccacct cagcctccca aagtgctggg attacaagcg tgagccactg 840

caccgggcca cagagaaagt acttctccac cctgctctcc gaccagacac cttgacaggg 900

<210> 86

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 86

cacaccgggc actcagaaga cactgatggg caacccccag cctgctaatt ccccagattg 60

caacaggctg ggcttcagtg gcagctgctt ttgtctatgg gactcaatgc actgacattg 120

ttggccaaag ccaaagctag gcctggccag atgcaccagc ccttagcagg gaaacagcta 180

atgggacact aatggggcgg tgagagggga acagactgga agcacagctt catttcctgt 240

gtcttttttc actacattat aaatgtctct ttaatgtcac aggcaggtcc agggtttgag 300

ttcataccct gttaccattt tggggtaccc actgctctgg ttatctaata tgtaacaagc 360

caccccaaat catagtggct taaaacaaca ctcacattta ttctgctcac atatctgtca 420

tttgagcagg gctcagcggg gacagctcct tctgtcctac tctgtgtcag gtggggcagc 480

ttgagggttg ggctggtgtc acctgaagac tcattcttct gtacgtctga caggcaatgc 540

tggctgttgg ctgggggcct cagtgccact acggaatagt tggctaggac ccctccatgt 600

gggctagttg ggcttcctca tagtatggtg gctgggttgg agggtgtccc aaaaagaaag 660

gaggggatag agagagacca cttttcataa cctagcctta gaagtcacac agtattactt 720

ctgctacata tatatgtttt aagaggcagg gtctcactct gtcgcccagt ctggaatgca 780

gtggtatgat cacggctcac tgcagcctca acctcctggg ctaagtgatc ctcccacctc 840

agcctcccga atagctggga ctacaggtgt gagtcaccaa gcccagttaa tctttagttt 900

<210> 87

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 87

ccatagctca gtctggtcta tc 22

<210> 88

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 88

ctcttcgtcc agatcatcct ga 22

<210> 89

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 89

ccatagctca gtctggtcta tc 22

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 90

cacaccttgc cgatgtcgag 20

<210> 91

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 91

gcactgaacg aacatctcaa gaag 24

<210> 92

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 92

ctcttcgtcc agatcatcct ga 22

<210> 93

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 93

gcactgaacg aacatctcaa gaag 24

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 94

cacaccttgc cgatgtcgag 20

<210> 95

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 95

tgctccgggt ttgtctcaga tg 22

<210> 96

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 96

ctcttcgtcc agatcatcct ga 22

<210> 97

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 97

tgctccgggt ttgtctcaga tg 22

<210> 98

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 98

cacaccttgc cgatgtcgag 20

<210> 99

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 99

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540

ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cacaaccatg 590

<210> 100

<211> 24

<212> DNA

<213> Caenorhabditis elegans

<400> 100

tcacaacctc ctagaaagag taga 24

<210> 101

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 101

ggtaatctgt ggcgtaacaa g 21

<210> 102

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 102

gcacaaggat ttaatccaga t 21

<210> 103

<211> 21

<212> DNA

<213> human

<400> 103

acctgggatc atttatcatt c 21

Claims

1.一种多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组导入有靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列。

2.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列如SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.103所示。

3.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的B2M和/或CIITA基因被敲除。

4.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入有第一核酸分子；

且所述多能干细胞或其衍生物中的免疫应答相关基因的3’UTR区域导入有第二核酸分子；所述第一核酸分子编码介导RNA干扰的小核酸分子，所述小核酸分子特异性靶向第二核酸分子的转录产物，且所述小核酸分子不靶向所述多能干细胞或其衍生物的任何其他的mRNA或lncRNA。

5.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述小核酸分子包括短干扰核酸、短干扰RNA、双链RNA，优选为miRNA、shRNA、shRNA-miR中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述多能干细胞或其衍生物来源于人类；所述小核酸分子的序列为不靶向人类任何mRNA或lncRNA的非人类物种的随机序列。

7.根据权利要求4所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于，所述第二核酸分子包括至少3个重复的小核酸分子序列的反向互补序列，优选为6～10个重复的小核酸分子序列的反向互补序列。

8.根据权利要求1所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入一种或多种免疫兼容分子表达序列，所述免疫兼容分子用于调控多能干细胞细胞或其衍生物中与免疫应答相关的基因的表达。

9.根据权利要求4或8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述与免疫应答相关的基因包括：

10.根据权利要求8所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述免疫兼容分子包括以下的任一种或多种：

(1)免疫耐受相关基因，包括CD47或HLA-G；

(3)靶向主要组织相容性复合体基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1和HLA-DPB1中的至少一种；

(4)靶向主要组织相容性复合体相关基因的shRNA和/或shRNA-miR，所述主要组织相容性复合体相关基因包括B2M和CIITA中的至少一种。

11.根据权利要求10所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述靶向B2M的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.10中的一种；

所述靶向CIITA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.13中的一种；

所述靶向HLA-A的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.16中的一种；

所述靶向HLA-B的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.19中的一种；

所述靶向HLA-C的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.22中的一种；

所述靶向HLA-DRA的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.23～SEQ IDNO.25中的一种；

所述靶向HLA-DRB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.26～SEQ IDNO.28中的一种；

所述靶向HLA-DRB3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.29～SEQ IDNO.30中的一种；

所述靶向HLA-DRB4的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.31～SEQ IDNO.33中的一种；

所述靶向HLA-DRB5的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.34～SEQ IDNO.36中的一种；

所述靶向HLA-DQA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.37～SEQ IDNO.39中的一种；

所述靶向HLA-DQB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.40～SEQ IDNO.42中的一种；

靶向HLA-DPA1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.43～SEQ ID NO.45中的一种；

靶向HLA-DPB1的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.48中的一种。

12.根据权利要求1～11任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子。

13.根据权利要求12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因包括Drosha、Ago1、Ago2、Dicer1、Exportin-5、TRBP(TARBP2)、PACT(PRKRA)、DGCR8中的至少一种；

所述抗干扰素效应分子为PKR、2-5As、IRF-3和IRF-7中的至少一种的shRNA和/或shRNA-miR。

14.根据权利要求13所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述靶向PKR的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.51中的一种；

所述靶向2-5As的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.60中的一种；

所述靶向IRF-3的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO63中的一种；

所述靶向IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的靶序列选自SEQ ID NO.64～SEQ ID NO.66中的一种。

15.根据权利要求2、11或14所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向B7-H4、主要组织相容性复合体基因、主要组织相容性复合体相关基因、PKR、2-5As、IRF-3或IRF-7的shRNA和/或shRNA-miR的表达框架如下所示：

(1)shRNA表达框架：由5’到3’依次包括权利要求2、11或14所述的shRNA靶序列、茎环序列、权利要求2、7或10所述的shRNA靶序列的反向互补序列、Poly T；两个反向互补靶序列由中间一茎环序列分隔组成发夹结构，最后连上Poly T作为RNA聚合酶III的转录终止子；

(2)shRNA-miR表达框架：使用权利要求2、11或14所述的shRNA-miR靶序列替换microRNA-30或者microRNA-155中的靶序列得到。

16.根据权利要求15所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述shRNA表达框架中的茎环序列长度为3～9个碱基；所述Poly T长度为5～6个碱基。

17.根据权利要求4、8或12所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组中还导入诱导型基因表达系统，用于调控第一核酸分子和/或免疫兼容分子和/或shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因和/或抗干扰素效应分子的表达；优选的，所述诱导型基因表达系统为Tet-Off系统、二聚体诱导表达系统中的至少一种。

18.根据权利要求1～17中任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述多能干细胞或其衍生物的基因组还导入外泌体加工合成基因；

优选的，所述外泌体加工合成基因包括STEAP3、Syndevan-4、L-天冬氨酸氧化酶片段(SEQ ID NO.69)、CD63-L7Ae(SEQ ID NO.70)和Cx43 S368A中的至少一种。

19.根据权利要求18所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列、第一核酸分子、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入采用病毒载体干扰、非病毒载体转染或基因编辑的方法。

20.根据权利要求18所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：所述靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的表达序列、第一核酸分子、免疫兼容分子的表达序列、shRNA和/或miRNA加工复合体相关基因、抗干扰素效应分子、诱导型基因表达系统、外泌体加工合成基因的导入位点为多能干细胞或其衍生物的基因组安全位点；

优选的，所述基因组安全位点包括AAVS1安全位点、eGSH安全位点、H11安全位点中的一种或多种。

21.根据权利要求1～20中任一项所述的多能干细胞或其衍生物，其特征在于：

所述多能干细胞包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎癌细胞、或者诱导多能干细胞；

所述成体干细胞包括间充质干细胞或者神经干细胞。

22.一种外泌体，由权利要求1～21中任一项所述多能干细胞或其衍生物分泌得到。

23.权利要求1～21中任一项所述多能干细胞或其衍生物和/或权利要求22所述外泌体在制备肿瘤治疗药物中的应用。