CN114657082B

CN114657082B - 一种乳酸乳球菌及其应用

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Publication number: CN114657082B
Application number: CN202110419707.6A
Authority: CN
Inventors: 杨求华; 林琪; 周宸; 吴建绍; 肖益群; 杨福元; 王丽莉
Original assignee: Fujian Fisheries Research Institute
Current assignee: Fujian Fisheries Research Institute
Priority date: 2021-04-19
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: CN114657082A

Abstract

本发明公开了一种乳酸乳球菌，其保藏编号为CGMCC No.20329，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年7月9日。本发明还提供一种保藏编号为CGMCC No.20329的乳酸乳球菌在制备微生物制剂中的应用。该菌株分离筛选自仿刺参肠道，能促进仿刺参健康生长，改善肠道菌群，可以有效的抵御病原菌塔式弧菌的感染，增强机体免疫机能。该乳酸乳球菌为内源性肠道益生菌，不仅适用于海洋环境生长繁殖，而且对养殖动物和人类不存在危险，在应用方面具有高效性和安全性。本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329具有生产成本低，工艺简单，具有良好的商业前景。

Description

一种乳酸乳球菌及其应用

技术领域

本发明涉及水产微生物应用技术领域，尤其涉及一种乳酸乳球菌及其应用。

背景技术

随着我国水产养殖行业的兴起及其集约化养殖过程中水质环境和气候条件等因素的变化，养殖过程中出现了以细菌性疾病为主的多种病害，这些细菌性疾病通常通过抗生素和化学药物进行预防和治疗，其带来的负面影响引起众多学者的关注。

养殖业中持续使用抗生素，在防治疾病的同时，也破坏水体环境，而且扰乱了宿主体内肠道菌群结构，使细菌产生耐药性，这些耐药性的病原菌可能会通过食物链传递给人类，导致人体内正常菌群的耐药性变化。有研究报道称环境中的抗生素除了会造成化学污染外，还可能会诱导环境中抗性微生物和抗性基因的产生，并加剧抗生素抗性传播的风险。某些抗性微生物可能会直接或者间接参与到食物链等途径进入人体，导致人体对抗生素耐药性增加，从而给人类公共健康带来某种程度的危胁，严重危害人类健康。

随着绿色环保食品的可持续发展，众多学者致力于抗生素和化学药物替代品的研究，益生菌(乳酸菌)成为其中的研究热点。乳酸菌是人与动物胃肠道的常见菌和共生菌，很久以来，乳酸菌作为重要的益生菌己广泛地用于食品、饮料和微生态制剂等行业中，被公认为是安全级微生物。是近年发展起来的新型绿色添加剂，具有改善养殖动物消化道有益菌群，抑制或杀死有害菌，提高动物健康水平，促进动物生长发育及提高饲料利用率等功效。乳酸菌还具有：无副作用、无污染和无残留，可净化水体环境，改善饲料口味，提高机体免疫力，防控病原微生物，促进养殖生物生长能力等作用，从而达到预防水产养殖相关疾病的效果，在水产养殖中备受重视。因此，乳酸菌的应用研究成为水产健康养殖的重点。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种乳酸乳球菌及其应用，其作为添加剂有效改善肠道菌群，防控病原微生物，促进养殖生物生长能力，增强宿主免疫功能。

有鉴于此，本发明提供了一种乳酸乳球菌，其保藏编号为CGMCC No.20329。

优选的，菌株分离自仿刺参肠道。

相应的，本发明还提供一种保藏编号为CGMCC No.20329的乳酸乳球菌在制备微生物制剂中的应用。

优选的，所述微生物制剂用于抑制病原微生物，促进养殖生物生长能力，增强宿主免疫功能。

优选的，所述微生物制剂为液体或粉剂益生菌。

优选的，包括：将乳酸乳球菌CGMCC No.20329接种在MRS固体培养基上，取单菌落接种于MRS液体培养基中，在30℃、摇床转速150-200rpm条件下培养30-50h得到种子液；将所述种子液按照 5％转接于新鲜的MRS液体培养基，在30℃、摇床转速为150-200rpm 条件下培养40-60h，得到发酵液；将所述发酵液5000g离心分离 30min，用PBS裂解液洗涤2次，弃上清留沉淀，用PBS裂解液重悬得到乳酸乳球菌CGMCC No.20329的益生菌。

优选的，得到种子液的步骤中，培养时间为36h。

优选的，得到种子液的步骤中，摇床转速为180rpm。

优选的，得到发酵液的步骤中，培养时间为48h。

优选的，得到发酵液的步骤中，摇床转速为180rpm。

本发明提供了一种乳酸乳球菌，其保藏编号为CGMCC No.20329，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期 2020年7月9日。本发明还提供一种保藏编号为CGMCC No.20329 的乳酸乳球菌在制备微生物制剂中的应用。该菌株分离筛选自仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道，能促进仿刺参健康生长，改善肠道菌群，可以有效的抵御病原菌塔式弧菌的感染，增强机体免疫机能。该乳酸乳球菌为内源性肠道益生菌，不仅适用于海洋环境生长繁殖，而且对养殖动物和人类不存在危险，在应用方面具有高效性和安全性。本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329具有生产成本低，工艺简单，具有良好的商业前景。

生物保藏说明

乳酸乳球菌，分类命名：Lactococcus lactis。2020年7月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏编号为CGMCC No.20329。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329的生长曲线图；

图2为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同温度条件下的生长曲线图；

图3为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同 pH条件下的生长图；

图4为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同葡萄糖浓度条件下的生长图；

图5为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同氮源浓度条件下的生长图；

图6为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同装液量下的生长图；

图7为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在控制 pH和不控制pH条件下的生长图；

图8为本发明实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329应用于仿刺参养殖下累计成活率图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种乳酸乳球菌，其保藏编号为CGMCC No.20329。本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年7月9日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

相应的，本发明还提供一种保藏编号为CGMCC No.20329的乳酸乳球菌在制备微生物制剂中的应用。所述微生物制剂用于抑制病原微生物，促进养殖生物生长能力，增强宿主免疫功能。作为优选方案，所述微生物制剂为液体或粉剂益生菌，即将所述乳酸乳球菌制成菌液或菌粉。

作为优选方案，乳酸乳球菌CGMCC No.20329的益生菌按照如下方法制备，包括：将乳酸乳球菌CGMCC No.20329接种在MRS固体培养基上，取单菌落接种于MRS液体培养基中，在30℃、摇床转速 150-200rpm条件下培养30-50h得到种子液；将所述种子液按照5％转接于新鲜的MRS液体培养基，在30℃、摇床转速为150-200rpm条件下培养40-60h，得到发酵液；将所述发酵液5000g离心分离30min，用PBS裂解液洗涤2次，弃上清留沉淀，用PBS裂解液重悬得到乳酸乳球菌CGMCC No.20329的益生菌。

作为优选方案，得到种子液的步骤中，培养时间优选为36h，摇床转速优选为180rpm。得到发酵液的步骤中，培养时间优选为48h，摇床转速优选为180rpm。

本发明优选采用如下方法对菌体浓度检测：采用酶标仪法，用吸光度(OD600)来表示菌体的浓度。以培养基为本底对照，测定菌株生长一定时间后的OD600值，减去本底的OD600值为所测菌体的值。用涂布平板计数法测定菌体的数量，根据OD600值与菌液中菌体的数量，确定所需的菌液浓度，制成液态益生菌。

本发明的乳酸乳球菌来源于仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道的内源性乳酸乳球菌CGMCC No.20329，该菌株不仅有抑制病原菌的效果，还能增强养殖生物非特异性免疫水平和抵御病原菌感染的能力。

本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329菌种信息如下：

1.来源。该菌株分离自仿刺参肠道能促进仿刺参健康生长，改善肠道菌群，可以有效的抵御塔式弧菌的感染，增强机体免疫机能。

2.形态学特征。革兰氏阳性细菌，兼性厌氧，不产荚膜和芽孢，在MRS固体培养基上，30℃培养48h的菌落形态直径大小为1-2 mm，圆形，凸起，乳白色，表面光滑，边缘整齐。

3.生理生化特征。D-苦杏仁甙反应阳性，磷脂酰肌醇磷脂酶C反应阴性，D-木糖反应阳性，精氨酸双水解酶1反应阳性，β-半乳糖苷酶反应阴性，α-葡糖苷酶反应阳性，环糊精反应阳性，L-天冬氨酸芳胺酶反应阳性，环糊精反应阳性，L-天冬氨酸芳胺酶反应阴性，β-半乳糖吡喃糖苷酶反应阴性，α-甘露糖苷酶反应阴性，磷酸酶反应阴性，亮氨酸芳胺酶反应阳性，L-脯氨酸芳胺酶反应阴性，β-葡萄糖醛酸酶反应阴性，α-半乳糖苷酶反应阴性，L-吡咯烷酮芳胺酶反应阴性，β-葡萄糖醛酸酶反应阴性，丙氨酸芳胺酶反应阳性,酪氨酸芳胺酶反应阴性,D-山梨醇反应阳性,UREASE反应阴性，多粘菌素B耐药反应阳性,D-半乳糖反应阳性,D-核糖反应阳性,L-乳酸盐碱化反应阴性，乳糖反应阴性，N-乙酰-D-氨基葡萄糖反应阳性，D-麦芽糖反应阳性，杆菌肽耐药反应阳性，新生霉素耐药反应阳性，在6.5％NaCl中生长反应阳性，D-甘露醇反应阴性，D-甘露糖反应阳性，甲基-B-D-吡喃葡萄糖苷反应阳性，支链淀粉反应阴性，D-棉子糖反应阴性，O/129耐药(comp.vibrio.)反应阴性，水杨素反应阳性，蔗糖反应阳性，D-海藻糖反应阳性，精氨酸双水解酶2反应阳性，奥普托欣耐药反应阳性。

所述乳酸乳球菌的16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329具有如下特点：

1.本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329制成的益生菌饲料，能促进仿刺参健康生长，改善肠道菌群，有效的抵御病原菌塔式弧菌的感染，增强机体免疫机能。

2.本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329具有生产成本低，工艺简单，具有良好的商业前景。

3.本发明的乳酸乳球菌CGMCC No.20329来源于海洋仿刺参肠道，为内源性肠道益生菌，不仅适用于海洋环境生长繁殖，而且对养殖动物和人类不存在危险，在应用方面具有高效性和安全性。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

本发明实施例采用的原料均为市购。

本发明实施例采用的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)CGMCC No.20329保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020年7月9日，保藏号为CGMCCNo.20329，该菌株分离筛选自仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道。

实施例1

乳酸乳球菌CGMCC No.20329的益生菌制备：

乳酸乳球菌菌种保存于-80℃，将乳酸乳球菌CGMCC No.20329 接种在MRS固体培养基上，取一单菌落接种于MRS液体培养基中，在30℃摇床转速180rpm条件下培养36h得到种子液；

将所述种子液按照5％转接于新鲜的MRS液体培养基，在30℃摇床转速180rpm条件下培养48h，得到发酵液，将所述发酵液5000g 离心分离30min，用PBS裂解液洗涤2次，弃上清留沉淀，用PBS裂解液重悬得到乳酸乳球菌CGMCC No.20329的益生菌。

菌体浓度检测：

采用酶标仪法，用吸光度(OD600)来表示菌体的浓度。以培养基为本底对照，测定菌株生长一定时间后的OD600值，减去本底的 OD600值为菌体的数量。

用涂布平板计数法测定菌体的数量，根据OD 600与菌液中菌体的数量。

所述PBS裂解液按照如下方法制备：

将磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g，氯化钾(KCl)0.2g，十二水合磷酸氢二钠(Na₂HPO₄〃12H₂O)3.63g和氯化钠(NaCl)8.0g混合，利用双蒸水定容至1000mL，调节pH值为7.4，灭菌4℃保存备用。

MRS固体培养基与MRS液体培养基购自北京陆桥技术服务股份有限公司，MRS液体培养基为MRS肉汤，按照说明书上的用法进行配制。

图1为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329的生长曲线图。培养基为MRS肉汤，培养温度为37℃。图2为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同温度条件下的生长曲线图，培养基为MRS肉汤。图3为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329 在不同pH条件下的生长图，培养基为MRS肉汤，培养温度为30℃。图4为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同葡萄糖浓度条件下的生长图，培养基为MRS肉汤，培养温度为30℃，pH值为6.5。图5为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在不同氮源浓度条件下的生长图，培养基为MRS肉汤，培养温度为30℃。图6为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCCNo.20329在不同装液量下的生长图，培养基为MRS肉汤，培养温度为30℃。图7为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329在控制pH和不控制pH条件下的生长图，培养基为MRS肉汤，培养温度为30℃，控制pH组的pH 值为6.5。

实施例2

乳酸乳球菌CGMCC No.20329益生菌饲料的应用：

步骤1)益生菌饲料制备：

将菌液调制所需的浓度与仿刺参饲料混匀，菌落(mL)与饲料(g) 的比例为1：2，制成柔软的面团状，CGMCC No.20329含量达到1*10⁸ CFU/g。

步骤2)仿刺参养殖：

将240头健康仿刺参饥饿处理2d后用基础饲料驯养7d，随机分成2组：实验组(CGMCC No.20329组)和对照组(CK组)，每组100只。仿刺参养于1.2×0.5×0.8m的水槽中24h曝气，采用定量投喂，每日投喂2次：上午9:00，下午5:00，日投喂量约为体重的3％，流水养殖，投喂期间不流水，投喂前用虹吸管清除剩余饲料和排泄物，实验组投喂CGMCCNo.20329菌饲料，对照组投喂基础饲料。每天观察仿刺参摄食和状态情况，试验周期8周。

步骤3)仿刺参肠道免疫指标：

试验仿刺参养殖到第6周，每组每缸取3只肠道混样无菌研磨，检测肠道一氧化氮合成酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、蛋白含量。结果如表1显示，一氧化氮合成酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、蛋白含量明显高于对照组，说明CGMCC No.20329能提高仿刺参肠道的非特异性免疫因子。

表1菌株CGMCC No.20329对仿刺参肠道免疫酶活的影响

步骤3)相对增重率检测：

每周每组进行称重，称量8周，都为未攻毒的仿刺参。计算相对增重率(Weightgain ratio,WGR,％)＝100×(终末体重-初始体重)/初始体重，从表2可知，实验组仿刺参的体重增重明显优于对照组，计算各组相对增重率，CGMCC No.20329组为：122.12％，CK组为109.41％。说明乳酸乳球菌CGMCC No.20329对仿刺参的生长有促进作用。

表2为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329应用于仿刺参养殖下的体重图。CGMCC No.20329为投喂乳酸乳球菌，CK为对照组投喂基础饲料。

表2菌株CGMCC No.20329对仿刺参生长的影响

步骤4)高通量测序分析肠道菌群组成：

每周每组随机挑选9只仿刺参，无菌取3只仿刺参肠道混样，每个处理3个生物学重复，第7周第8周为每组攻毒后的肠道，高通量测序肠道微生物多样性，在门水平上：CGMCCNo.20329组和CK组主要为厚壁菌门(Firmicutes)，变形菌门(Proteobacteria)；在门水平上： 1-8周内乳球菌属(Lactococcus)在CGMCC No.20329组的相对丰度从0.00％到76.23％不等，在CK组的相对丰度从0.00％到7.33％不等。说明仿刺参在投喂乳酸乳球菌后，其在肠道的量明显增加，改善了肠道菌群组成。本实施例的菌群结构分析如表3～表6所示。

表3门水平上实验投喂CGMCC No.20329组肠道菌群结构组成

表4门水平上对照投喂CK组肠道菌群结构组成

表5属水平上实验投喂CGMCC No.20329组肠道菌群结构组成

表6属水平上对照投喂CK组肠道菌群结构组成

步骤5)仿刺参的抗病力：

取塔式弧菌用PBS悬浮至浓度为1*10⁸CFU/mL，即为攻毒菌液，取步骤2)的各组实验仿刺参，每组随机挑选30只，随机分为三个生物学重复，采用体腔注射法每只注射剂量为100uL，14d后统计各组仿刺参的累计成活率，CGMCC No.20329组为73.33％，CK组为33.33％。因此，乳酸乳球菌CGMCC No.20329能够提高仿刺参抵抗塔式弧菌的感染。图8为本实施例提供的乳酸乳球菌CGMCC No.20329应用于仿刺参养殖下累计成活率图，CGMCCNo.20329为投喂乳酸乳球菌，CK为对照组投喂基础饲料。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 申请人福建省水产研究所

<120> 一种乳酸乳球菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1000

<212> DNA

<213> Lactococcus lactis CGMCC No.20329

<400> 1

cccctgggtt ctaactttac gagcgccctc cttgcggtta ggcaacctac ttcgggtact 60

cccaactccc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120

gtgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc 180

cgaactgaga atggttttaa gagattagct aaacatcact gtctcgcgac tcgttgtacc 240

atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300

caccttcctc cggtttatca ccggcagtct cgttagagtg cccaacttaa tgatggcaac 360

taacaatagg ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420

gacaaccatg caccacctgt atcccgtgtc ccgaaggaac ttcctatctc taggaatagc 480

acgagtatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 540

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca 600

ggcggagtgc ttattgcgtt agctgcgata cagagaactt atagctccct acatctagca 660

ctcatcgttt acggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg 720

agcctcagtg tcagttacag gccagagagc cgctttcgcc accggtgttc ctccatatat 780

ctacgcattt caccgctaca catggaattc cactctcctc tcctgcactc aagtctacca 840

gtttccaatg catacaatgg ttgagccact gccttttaca ccagacttaa taaaccacct 900

gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgctcggg acctacgtat taccgcggct 960

gctggcacgt agttagccgt ccctttctgg gtagttaccg 1000

Claims

1.一株乳酸乳球菌，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.20329。

2.一株保藏编号为CGMCC No.20329的乳酸乳球菌在制备微生物制剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂用于抑制病原微生物，促进养殖生物生长能力，增强宿主免疫功能。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述微生物制剂为液体或粉剂益生菌。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

将乳酸乳球菌CGMCC No.20329接种在MRS固体培养基上，取单菌落接种于MRS液体培养基中，在30℃、摇床转速150-200rpm条件下培养30-50h得到种子液；

将所述种子液按照5％转接于MRS液体培养基，在30℃、摇床转速为150-200rpm条件下培养40-60h，得到发酵液；

将所述发酵液5000g离心分离30min，用PBS洗涤，弃上清留沉淀，用PBS重悬得到乳酸乳球菌CGMCC No.20329的益生菌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，得到种子液的步骤中，培养时间为36h。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，得到种子液的步骤中，摇床转速为180rpm。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，得到发酵液的步骤中，培养时间为48h。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，得到发酵液的步骤中，摇床转速为180rpm。