CN114643275B

CN114643275B - 一种细菌原位修复土壤中砷的方法与应用

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Publication number: CN114643275B
Application number: CN202210169420.7A
Authority: CN
Inventors: 王亚楠; 刘粮丰; 王华伟; 孙英杰; 刘梦凡; 王祁; 段钰而; 赵辛龙; 滕家志; 莫泽旭
Original assignee: Qingdao University of Technology
Current assignee: Qingdao University of Technology
Priority date: 2022-02-23
Filing date: 2022-02-23
Publication date: 2024-02-20
Anticipated expiration: 2042-02-23
Also published as: CN114643275A

Abstract

本发明公开了一种细菌原位修复土壤中砷的方法及应用，包括如下步骤：将菌株富集培养后加入到砷污染土壤中，加入碳源、二价锰等组分后，调节土壤含水率在20‑40％，搅拌器搅拌10‑30min，然后置于室温条件下培养2‑3周，让细菌诱导产生的生物锰氧化物材料和土壤中的三价砷或五价砷发生物理‑化学‑生化反应，可以将土壤中不稳定态的砷转化为稳定态的砷，达到土壤砷修复的目的。本发明操作简单、可调整性强，适用于大面积的砷污染土壤修复。

Description

一种细菌原位修复土壤中砷的方法与应用

技术领域

本发明涉及土壤处理技术领域，具体为一种细菌原位修复土壤中砷的方法与应用。

背景技术

砷广泛存在于自然环境中，是一种具有毒性的类金属。自然环境中，砷存在于地壳、火成岩和沉积岩中，主要以黄铁矿、雄黄、雌黄砷等硫化矿物的形式存在。而人为活动，如化学肥料、杀虫剂的使用，以及采矿活动，都会促进砷在地下水和农田中的积累。砷因为其剧毒性，被美国毒物与疾病登记署列为一类危险物质，危险程度高于镉、铅、汞等有毒金属。长期处于高砷的环境，会对人体健康造成严重伤害。人类可通过饮水和食物链接触到砷，砷会在人体的肝和肾器官中大量蓄积。相关的病理学研究发现，如果长期摄入砷含量超标的饮用水或食物会引起砷中毒，严重可引起休克、肾衰竭，甚至出现多器官衰竭而死亡。长期暴露在高砷环境中，可能引起基因突变，大大增加患癌风险。

砷污染土壤治理依靠的现有技术主要有土壤淋洗、固化/稳定化、热处理、植物修复和微生物修复等技术。土壤淋洗通常是向土壤中投加各类淋洗剂(如有机或无机酸、碱、盐和螯合剂)，该方法不仅会破坏土壤原有的微团聚体结构，还会导致营养元素的淋失和沉淀，容易引起地下水污染，只适用于面积小污染重的土壤治理。热处理砷污染土壤时也会破坏土壤结构，同时也面临高处理成本和运行费用的问题。固化/稳定化技术在砷污染土壤工程治理中有较多的应用，如水泥包封固化、螯合剂稳定化、金属氧化物等无机材料吸附固化等，但一般药剂投加量通常在5％以上，一次成本高并容易产生二次污染等。植物修复法具有成本低、不破坏土壤原有结构、对土壤理化性质改变小的优点，但修复效率较低、修复周期长。微生物修复作为新兴的修复技术，具有效果好、经济、不会产生二次污染的优势，已被证明是有效的修复方法，受到了国内外研究者的关注。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌原位修复土壤中砷的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种细菌原位修复土壤中砷的方法，S11：将能诱导产生生物锰氧化物材料的菌液加入到砷污染土壤中，依次加入碳源、二价锰组分后；

S12：调节土壤含水率在20-40％，搅拌器搅拌10-30min，然后置于室温条件下培养2-3周，让生物锰氧化物材料和土壤中的三价砷或五价砷发生物理-化学反应，完成土壤砷修复；

作为优选，所述菌株采用将二价锰转化为四价锰氧化物的菌株。

作为优选，所述菌株具体为别雷斯不动杆菌WHW-2。

作为优选，所述生物锰氧化物材料的制备步骤具体为：将菌株接种于17-25g/L的营养肉汤培养基中进行富集培养。

作为优选，富集培养的条件为：温度在15-30℃，频率为100-180rpm的水平振荡下，好氧富集培养3-5天；富集培养过程中，菌株的转接量按照体积比2％-10％。

将富集培养的菌株加入到50g砷污染土壤中，加入菌液后，依次加入蛋白胨16mg，酵母浸粉4mg，磷酸二氢钾2mg，硫酸镁4mg，硝酸钠4mg，氯化钙2mg，氯化铵2mg，柠檬酸铁铵20mg，硫酸锰4mg，碳酸铵2mg。

作为优选，细菌的投加量按液固比为每克土壤添加0.8-1.5mL。

作为优选，调节土壤含水率在25％，搅拌器搅拌25min，然后置于室温条件下培养3周。

另一方面，本发明还提供上述细菌原位修复土壤中砷的方法在环境修复工程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明不需要将细菌负载到载体上，操作简单，可调整性强，将二价锰通过菌株的作用以锰氧化物的形式与污染土壤紧密接触，有效提升砷修复效果，以生物锰氧化物修复砷污染土壤的方法，在菌株代谢产物的作用下，可以将土壤中可交换态的砷转化为残渣态的砷，从而降低砷在土壤中的迁移性和生物有效性，有效固定土壤中的砷。

2、本发明工艺简单、修复时间短、操作方便、处理成本低、处理范围大、无二次污染等优点；将生物锰氧化物材料随菌液加入到砷污染土壤中，让生物锰氧化物材料和土壤中的三价砷或五价砷发生一系列物理-化学反应，降低土壤中砷的可迁移性，尤其是三价砷，以达到砷修复的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中以OD₆₀₀锰氧化物含量变化；

图2为本发明实施例1中二价锰和四价锰含量变化；

图3为本发明所用菌株的谱系发育树。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未有以生物锰氧化物修复砷污染土壤，这种方法可以在一定程度上降低砷在土壤中的迁移和生物有效性，固定土壤中的砷，且这种效果比较显著。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种细菌培养的方法，包括该菌种的分离纯化过程，具体为：

(1)细菌菌种的分离与驯化：

首先把带有混合微生物群的水样加入到营养肉汤培养基中，培养72h后将营养肉汤培养基中的菌液转接到PYCM培养基(0.8g/L蛋白胨，0.2g/L酵母浸粉，0.1g/L磷酸氢二钾，0.2g/L硫酸镁，0.2g/L硝酸钠，0.1g/L氯化钙，0.1g/L氯化铵，1g/L柠檬酸铁铵，0.2g/L硫酸锰，0.1g/L碳酸铵)中继续驯化。

逐级稀释：吸取PYCM中的菌液按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8的梯度进行稀释。

涂布：先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布器在表面做来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出均匀的单个菌落。

平板划线：配制PYCM固体平板，用接种环挑取单个菌落划线到固体平板上，反复多次划线，得到纯种菌落，最后通过谱系鉴定命名别雷斯不动杆菌WHW-2。

将得到的菌株接种到营养肉汤中富集培养；

将富集培养后的菌株接种到含有二价锰的培养基中培养，一般在培养2-3天后，即可得到细菌诱导产生的锰氧化物材料。

菌株为能够将二价锰转化为锰氧化物的菌株，菌株具体为别雷斯不动杆菌WHW-2。

其中，本发明在土壤体系内引入的是培养5天后的菌液，培养5天后，培养基中的二价锰基本达到稳定水平。

本发明之所以采用菌株培养的生物法来将二价锰转化为锰氧化物材料，而不是简单的通过化学氧化的方式来制备锰氧化物材料，这是因为生物法相对于常规的化学反应过程，具有如下优势：(1)反应条件更温和，环境近似于中性，避免了大量酸、碱性试剂及有毒有害试剂的运用，整个制备过程更加绿色环保；(2)与无机的锰(Ⅳ)氧化物相比，生物锰(Ⅳ)氧化物具有更高的比表面积，对砷的吸附效率更高；

在本发明的一个或多个实施方式中，生物锰氧化物材料的制备方法具体包括下列步骤：

1)将菌株接种于培养基中进行富集培养；

2)制备含有二价锰的培养基；

3)将富集的菌株加入到该培养基中，一定条件下振荡培养，5天后高速离心即得到生物锰氧化物材料。

在本发明的一个或多个实施方式中，菌株为别雷斯不动杆菌WHW-2。

具体的，菌株富集培养基为本领域内能够起到菌株富集作用的培养基，且针对不同类型的菌株，培养基的成分可进行适应性调整；以恶臭假单胞菌为例，作为优选的实施例，培养基组成为：营养肉汤(19g/l)。

进一步的，富集培养的条件为：在15-35℃，水平振荡下(100-180rpm)，好氧富集培养1-5天，在该培养条件下，菌株生长情况良好。

进一步的，富集培养过程中，菌株的转接量为2-10％。

在本发明的一个或多个实施方式中，含有二价锰的培养基为添加有二价锰的任意能够维持菌株正常代谢的培养基，作为优选的实施例，该培养基的制备方法具体为：取蛋白胨0.8g/L、酵母浸粉0.2g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.2g/L、硝酸钠0.2g/L、氯化钙0.1g/L、氯化铵0.1g/L、柠檬酸铁铵1.0g/L、硫酸锰0.2g/L、碳酸铵0.1g/L，制备成培养基，将300mL培养基加入500mL锥形瓶中，调节pH＝7±0.2。

进一步的，为了避免其他菌种影响待接种菌株的活性，也避免其他菌种代谢产生副产物，二价锰培养基配置完成后先进行灭菌处理再进行后续菌株的接种，灭菌处理时间为30-40min，优选为30分钟。振荡培养的条件为：置于振荡培养箱在30-35℃、180r·min^-1条件下振荡培养5天。

由于二价锰、菌株的作用各不相同，且相互影响，因此添加量对于修复砷污染土壤的效果具有重要影响。其中二价锰转化的锰氧化物对砷有氧化能力，三价砷吸附在氧化锰表面，被氧化为五价砷，五价砷在锰氧化物表面发生配位反应，形成As(V)-MnO₂双齿双核桥接复合物。二价锰的添加量过高则会导致整个过程以氧化作用为主，吸附能力降低，砷不能富集在锰氧化物的表面，同样也是不利用含砷土壤的高效修复；因此，作为优选的实施例，二价锰以硫酸锰的形式添加，锰的添加量为65mg/L；

本发明第二方面提供一种细菌原位修复土壤中砷的方法，S11：将能诱导产生生物锰氧化物材料的菌液加入到砷污染土壤中，依次加入碳源、二价锰组分后；

进一步的，菌株采用将二价锰转化为四价锰氧化物的菌株，菌株具体为别雷斯不动杆菌WHW-2。

具体的，生物锰氧化物材料的制备步骤具体为：将菌株接种于17-25g/L的营养肉汤培养基中进行富集培养。

值得说明的是，富集培养的条件为：温度在15-30℃，频率为100-180rpm的水平振荡下，好氧富集培养3-5天；富集培养过程中，菌株的转接量按照体积比2％-10％。

更进一步的，将富集培养的菌株加入到50g砷污染土壤中，加入菌液后，依次加入蛋白胨16mg，酵母浸粉4mg，磷酸二氢钾2mg，硫酸镁4mg，硝酸钠4mg，氯化钙2mg，氯化铵2mg，柠檬酸铁铵20mg，硫酸锰4mg，碳酸铵2mg。

值得注意的是，细菌的投加量按液固比为每克土壤添加0.8-1.5mL。

此外，调节土壤含水率在25％，搅拌器搅拌25min，然后置于室温条件下培养3周。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

细菌菌株的富集培养：

选用的细菌菌株为别雷斯不动杆菌WHW-2。将该细菌按体积比2-10％的转接量接种于富集培养基(19g/l营养肉汤)中，于15-35℃水平震荡下(100-180rpm)，好氧富集培养1-5天；

由图1可知，培养5天后，以OD₆₀₀表征的生物锰氧化物的浓度增加趋势趋于平缓，可用此时的生物锰氧化物对砷污染土壤进行修复。

由附图2可知，培养5天后，培养基中Mn(Ⅱ)的浓度已经低于4mg/L，Mn(Ⅱ)继续转化为锰(Ⅳ)氧化物过程缓慢，可用此时的生物锰氧化物对砷污染土壤进行修复。

实施例2

生物锰氧化物的制备：

1)制备培养基：蛋白胨0.8g/L、酵母浸粉0.2g/L、磷酸氢二钾0.1g/L、硫酸镁0.2g/L、硝酸钠0.2g/L、氯化钙0.1g/L、氯化铵0.1g/L、柠檬酸铁铵1.0g/L、硫酸锰0.2g/L、碳酸铵0.1g/L，制备成培养基，将300mL培养基加入500mL锥形瓶中，调节pH＝7±0.2。配置完成后灭菌30min。

将菌株加入灭菌后的培养基。将其置于振荡培养箱在150r·min^-1(30℃)条件下振荡培养5天。振荡完成后，离心抽滤得到固体粉末，即生物锰氧化物材料。

2)修复过程：将步骤(2)制得的生物锰氧化物材料加入到砷污染土壤中进行修复工作；

将步骤(1)制得的生物锰氧化物材料按投加比1％的比例(0.5g)加入到50克砷污染土壤中，调节土壤含水率在40％，搅拌器搅拌20分钟，然后置于室温条件下(25℃)培养2周，终止实验。

由上表数据可知，本实施例通过水浸提、TCLP浸提后砷含量都有降低，水浸提后由未修复时的0.14mg/L降至0.09mg/L，修复效率为35.71％；TCLP浸提后由未修复的0.18mg/L降至0.08mg/L，修复效率为55.56％。

实施例3

在实施例2的基础上，将砷污染土壤继续调节含水率40％，搅拌器搅拌20分钟，置于室温条件下(25℃)，培养2周后，分析修复效果。

由上表数据可知，本实施例砷含量都有降低，水浸提后由未修复时的0.14mg/L降至0.08mg/L，修复效率为42.86％；TCLP浸提后由未修复的0.18mg/L降至0.07mg/L，修复效率为61.11％。

效果分析：

从上述实施例可以看出：采用本发明所提供的生物锰氧化物材料处理含砷土壤，砷含量都有明显降低，这说明该材料可达到比较优异的修复砷污染土壤的效果。

修复过程：

三价砷的活性、毒性和迁移能力均强于五价砷，且有着更强的附着能力和移动性，因而在砷污染土壤的修复工作中首先考虑三价砷的去除。

锰氧化物常温下稳定，结构疏松，具有表面电荷高、比表面积大，表面羟基基团—OH丰富，具有氧化和吸附的双重作用，可以作为一种较好的砷和重金属复合污染土壤稳定化修复材料。较高价态的锰氧化物对H⁺和多价阳离子的亲和力比对碱金属离子的亲和力大的多。因此，微生物诱导得到的生物锰氧化物的电荷特征和胶体稳定性决定于H⁺离子和多价金属离子的浓度。锰氧化物对三价砷有一定的氧化和吸附能力，砷(Ⅲ)吸附在氧化锰表面，表面的三价砷可被氧化为五价砷，As(V)在锰氧化物表面发生配位反应，形成As(V)-MnO₂双齿双核桥接复合物。与无机的锰氧化物相比，生物锰氧化物具有更高的比表面积，对砷的吸附效率更高。

因此，本发明提供一种以生物锰氧化物修复砷污染土壤的方法，在菌株代谢产物的作用下，可以将土壤中可交换态的砷转化为残渣态的砷，从而降低砷在土壤中的迁移性和生物有效性，有效固定土壤中的砷。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种细菌原位修复土壤中砷的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S11：将能诱导产生生物锰氧化物材料的菌液加入到砷污染土壤中，依次加入碳源、二价锰组分后；

S12：调节土壤含水率在20-40%，搅拌器搅拌10-30min，然后置于室温条件下培养2-3周，让生物锰氧化物材料和土壤中的三价砷或五价砷发生物理-化学反应，完成土壤砷修复；

所述能诱导产生生物锰氧化物材料的菌液的制备步骤具体为：将菌株接种于17-25g/L的营养肉汤培养基中进行富集培养；

富集培养的条件为：温度在15-30℃，100-180rpm的水平振荡下，好氧富集培养3-5天；富集培养过程中，菌株的转接量按照体积比2%-10%；

步骤S11具体为：将富集培养得到的能诱导产生生物锰氧化物材料的菌液加入到50g砷污染土壤中，依次加入蛋白胨16mg，酵母浸粉4mg，磷酸二氢钾2mg，硫酸镁4mg，硝酸钠4mg，氯化钙2mg，氯化铵2mg，柠檬酸铁铵20mg，硫酸锰4mg，碳酸铵2mg；菌液的投加量按液固比为每克土壤添加0.8-1.5mL；

所述菌株采用将二价锰转化为四价锰氧化物的菌株，所述菌株具体为别雷斯不动杆菌WHW-2，所述菌株的分离纯化过程，具体为：

驯化：把带有混合微生物群的水样加入到营养肉汤培养基中，培养72h后将营养肉汤培养基中的菌液转接到PYCM培养基中继续驯化；PYCM培养基的组成为：0.8g/L蛋白胨，0.2g/L酵母浸粉，0.1g/L磷酸氢二钾，0.2g/L硫酸镁，0.2g/L硝酸钠，0.1g/L氯化钙，0.1g/L氯化铵，1g/L柠檬酸铁铵，0.2g/L硫酸锰，0.1g/L碳酸铵；

逐级稀释：吸取PYCM中的菌液按10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8的梯度进行稀释；

涂布：先倒好平板让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布器在表面做来回左右的涂布，让菌液均匀分布，长出均匀的单个菌落；

平板划线：配制PYCM固体平板，用接种环挑取单个菌落划线到固体平板上，反复多次划线，得到纯种菌落，通过谱系鉴定命名别雷斯不动杆菌WHW-2。

2.根据权利要求1所述的细菌原位修复土壤中砷的方法，其特征在于：调节土壤含水率在25%，搅拌器搅拌25min，然后置于室温条件下培养3周。

3.权利要求1-2任一项所述细菌原位修复土壤中砷的方法在环境修复工程中的应用。