CN114558171B - 一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，属于口腔内科及骨科技术领域，包括以下步骤：S1.取5‑50％的聚丙烯酸(Polyacrylicacid，PAA)水溶液(MW＝100000‑250000)以去离子水稀释，充分搅拌，制备为A液；S2.将羧甲基壳聚糖(Carboxymethylchitosan，CMC)(MW＝20000‑300000)溶解于NaH2PO4溶液中制备0.1‑30％的CMC/NaH2PO4溶液，并取处理牙本质基质于其中分散，充分搅拌，制备为B液；S3.将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌12‑48h后，加入NaOH调整PH为7.0‑7.5；S4.待PH值稳定，继续搅拌过，并同时向步骤S3中的混合液滴加CaCl2溶液，可见凝胶逐渐缠绕于搅拌子，将凝胶收集后得到凝胶材料。
Description
技术领域
本发明属于口腔内科及骨科技术领域，具体涉及一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法。
背景技术
颌面部的硬组织，包括颌骨、颅骨和牙齿，由于缺乏肌肉和韧带，经常会因创伤、肿瘤、感染等受损，发生诸如上下颌骨部分缺损、下颌骨骨折、龋病、牙外伤等情况(MorotomiT,Washio A,Kitamura C.Current and future options for dental pulp therapy[J].Jpn Dent Sci Rev,2019,55(1):5-11.Liu J,Zhang SS,Zheng SG,et al.Oral HealthStatus and Oral Health Care Model in China[J].Chin J Dent Res,2016,19(4):207-215.)。由于颌面部硬组织在气道支撑、咀嚼、吞咽、呼吸等生理过程中、在社会人际交往中及美学等方面具有重要意义，因此，通过组织工程等医学技术手段实现对颌面部硬组织损伤的组织形态学和功能学的恢复是颌面部硬组织修复的重要研究方向。目前，骨缺损的修复过程需要成骨材料填充缺损，免疫细胞介导的替代性吸收和诱导干细胞分化，并通过成骨-破骨细胞过程实现交替吸收和再生(Roohani I,Yeo GC,Mithieux SM,et al.Emergingconcepts in bone repair and the premise of soft material s[J].CURRENT OPINIONIN BIOTECHNOLOGY,2021,74:220-229.Shao R,Dong Y,Zhang S,et al.State of the artof bone biomaterials and their interactions with stem cells:Current state andfuture directions[J].Biotechnology Journal,2022:e2100074.)。牙体硬组织的长期稳定则需要在损伤后保存或恢复牙髓组织的血液循环和生理活性，诱导功能干细胞的归巢和分化，不断形成修复性牙本质，最终保持或重建牙髓牙本质复合体的功能(Sabeti M,HuangY,Chung YJ,et al.Prognosis of Vital Pulp Therapy on Permanent Dentition:ASystematic Review and Meta-analysis of Randomized Controlled Trials[J].JEndod,2021,47(11):1683-1695.)。
目前除了作为骨修复金标准的自体骨移植外，用于硬组织修复和再生的生物材料主要分为三类，即生物骨及骨类似物、生物陶瓷基材料和合成或天然的高分子聚合物的材料，以及双重或多重复合生物骨修复材料(A KJLB,B SP,BJFK.Biomaterial developmentsfor bone tissue engineering[J].BIOMATERIALS,2000,21(23):2347-2359.)。如在活髓保存治疗中常用的硅酸钙基复合盖髓材料，以硅酸钙为功能成分，固化过程中释放出如OH-、Ca2+和Si4+，促进牙髓暴露区的硬组织修复和再矿化(Goldberg Michel,Njeh Akram,Uzunoglu Emel,Yumoto Hiromichi.Is Pulp Inflammation a Prerequisite for PulpHealing and Regeneration.Mediators Inflamm.2015.2015.)。同样，磷酸钙骨水泥、生物骨粉、羟基磷灰石、珊瑚、β-磷酸三钙(β-TCP)等也常作为复合材料的主要功能成分用于修复骨缺损(Xu HH,Wang P,Wang L,et al.Calcium phosphate cements for boneengineering and their biological properties[J].Bone Research,2017,5:17056.)。但基于钙盐矿物的骨修复材料生物活性不足，难以模拟骨或牙本质修复的生理微环境，传统的动物源性骨粉材料具有较高的生物活性和骨诱导性，但其免疫原性和潜在风险不容小觑(Ho-Shui-Ling A,Bolander J,Rustom LE,et al.Bone regeneration strategies:Engineered scaffolds,bioactive molecules and stem cells current stage andfuture perspectives[J].BIOMATERIALS,2018,180:143-162)。而牙本质基质作为一种易于自行获得的生物矿物材料，可能成为一种更有效的异种骨粉替代物，应用于临床硬组织缺损修复。
牙本质70％为羟基磷灰石，而胶原为主的有机质约占20％，其余是水和非胶原蛋白(noncollagen proteins，NCPs)，如牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein，DPP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1，DMP-1)、和骨桥蛋白(osteopontin，OPN)等，这些有机成分可在深龋进展中释放，参与诱导修复性牙本质形成。基于此，本项目组前期利用牙本质基质为原料制备了一种含有大量与牙本质发生、形成和矿化相关的细胞外基质成分的脱细胞、脱矿处理的牙本质基质材料(treated dentin matrix，TDM)(Yang B,Chen G,LiJ,et al.Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets incombination with a dentin matrix-based scaffold.Biomaterials.2012.33(8):2449-2461.)。在此基础上，项目组优化设计了具有诱导生物矿化的牙本质基质材料TDMP，通过小型猪的临床前动物实验，证明TDM成分较氢氧化钙和MTA具有更合适的成牙诱导能力，可以更好地促进牙髓牙本质复合体的再生(Chen J,Cui C,Qiao X,et al.Treated dentinmatrix paste as a novel pulp capping agent for dentin regeneration.J TissueEng Regen Med.2017.11(12):3428-3436；Wen B,Huang Y,Qiu T,et al.ReparativeDentin Formation by Dentin Matrix Proteins and Small Extracellular Vesicles.JEndod.2021.47(2):253-262.)。
然而，在临床工作中，组织缺损的环境和结构复杂，材料需要与缺损周缘充分接触，稳定的充填于缺损区，减少多余的流动和膨胀，且易于操作成型和进行填充。而由于牙本质基质的高度矿化结构，在碾磨成粉末后，以水赋形的水-粉剂型缺乏可塑性，且操作性能欠佳，不利于封闭充填，因此有必要对其塑形性和可操作性进一步提升，进一步促进牙本质基质材料的发展和临床转化。
生物矿化(biomineralization)是生物体在体内合成具有特定功能和结构的生物矿物如骨、牙釉质、牙本质等的过程，其中非胶原蛋白(noncollagen proteins，NCPs)和蛋白多糖(如酸性糖胺聚糖)作为胶连分子和无定形磷酸钙前驱体(amorphous calciumphosphate,ACP)的稳定剂，促进胶原矿化，并将矿化的纳米纤维结合在一起。通过模拟生物矿化过程，可构建出具有与骨或牙齿更接近结构和特殊力学功能的复合材料(Rauner N,Meuris M,Zoric M,Tiller JC.Enzymatic mineralization generates ultrastiff andtough hydrogels with tunable mechanics.Nature.2017.543(7645):407-410；Yao S,Jin B,Liu Z,et al.Biomineralization:From Material Tactics to BiologicalStrategy.Adv Mater.2017.29(14).)。因此，利用NCPs模拟物聚丙烯酸(Polyacrylicacid，PAA)和蛋白多糖类似物羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)，具有构建矿物凝胶载体的可能。聚丙烯酸具有丰富的羧基,且富含氢键和离子键，可作为功能性聚阴离子电解质来模拟NCPs(Sun S,Mao LB,Lei Z,Yu SH,
H.Hydrogels fromAmorphous Calcium Carbonate and Polyacrylic Acid:Bio-Inspired Materials for"Mineral Plastics".Angew Chem Int Ed Engl.2016.55(39):11765-11769.)。羧甲基壳聚糖由壳聚糖(Chitosan)经羧化改善可溶性获得，是由甲壳动物外壳中提取的一种天然阳离子多糖聚合物，化学结构和生物学行为类似于骨和牙齿的细胞外基质成分糖胺聚糖，同样具有丰富的羧基和羟基，具有灵活的反应条件和改性策略(Tang G,Tan Z,Zeng W,etal.Recent Advances of Chitosan-Based Injectable Hydrogels for Bone and DentalTissue Regeneration.Front Bioeng Biotechnol.2020.8:587658)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，解决现有技术中的牙本质基质粉末难以成形的技术问题。
本发明公开了一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1.取5-50％的聚丙烯酸(Polyacrylic acid，PAA)水溶液(MW＝100000-250000)稀释至非粘稠状态，充分搅拌，得到A液；
S2.将羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)(MW＝20000-300000)溶解于饱和NaH2PO4溶液中制备0.1-30％的CMC/NaH2PO4溶液，并取处理牙本质基质(treateddentin matrix，TDM)于其中分散，充分搅拌，得到B液；
S3.将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌12-48h后，加入0.1-3mol/L NaOH溶液调整PH为7.0-7.5
S4.待PH值稳定，继续搅拌，并同时向步骤S3中的混合液滴加CaCl2溶液，可见凝胶逐渐缠绕于搅拌子，将凝胶收集后得到凝胶材料。
进一步的，所述A液通过5-50％的聚丙烯酸和去离子水以体积比1：2-1：20进行稀释。
进一步的，所述步骤S3将B液逐滴滴加到A液的过程中需不断搅拌，搅拌转数不低于400rpm，搅拌时间为12-48h。
进一步的，步骤S4中所述CaCl2溶液浓度为0.1-10mol/L。
进一步的，步骤S4中待无新凝胶产生后，继续搅拌2h后停止，将获得的凝胶材料剥离，并用进行清洗。
进一步的，所述步骤S4之后还包括步骤S5将凝胶材料分装于后-80℃冷冻，并于真空冷冻干燥机中冻干后，经环氧乙烷灭菌，无菌条件下以冷冻研磨仪研磨成粉保存。
进一步的，所述处理牙本质基质使用离体牙制得。
进一步的，获得离体牙后，对离体牙进行预处理，仅保留牙本质成分。
进一步的，所述离体牙来源为猪、犬、牛、猴、人等，但不限于此物种。
进一步的，所述离体牙获得后后立即将其置于无菌生理盐水中，密封冷藏保存于4℃不超过3天，或-20℃保存不超过1月。
进一步的，所述预处理步骤具体为：对离体牙用无菌生理盐水冲洗，去除牙冠及部分根尖组织，拔出牙髓，去除牙周膜及牙骨质层以及扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分。
进一步的，预处理后的牙本质，分别经17％的EDTA(Ethylene DiamineTetraacetic Acid，EDTA)溶液、10％的EDTA溶液和5％的EDTA溶液脱矿。
进一步的，每次脱矿后需清洗后再进行下一步骤。
进一步的，所述清洗为使用离子水超声震荡。
进一步的，所述EDTA溶液pH为7.0-7.5，并且经过0.22μm滤器过滤灭菌。
进一步的，将脱矿后的牙本质冷冻，冷冻之后进行冻干。
进一步的，所述冷冻为-80℃冷冻2-3小时。
进一步的，所述冻干为在真空冷冻干燥机中冻干12h。
进一步的，所述冻干后的处理牙本质基质经过灭菌和研磨后，密封包装，置于-20℃保存备用。
进一步的，所述研磨为以30Hz条件研磨30min。
一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶，包括聚丙烯酸PAA，羧甲基壳聚糖CMC，处理牙本质基质TDM以及无定形磷酸钙ACP，其中，所述聚丙烯酸PAA质量百分含量10％-60％，所述羧甲基壳聚糖CMC质量百分含量5％-20％，所述处理牙本质基质TDM质量百分含量40％-60％，所述无定形磷酸钙ACP质量百分含量10％-30％。
本发明的有益效果为：
1.本发明获得的处理牙本质基质凝胶材料冻干粉在-20℃低温保存以保存蛋白活性，使用时与无菌生理盐水按2:1的水粉体积比调拌恢复凝胶态，此时可进行牙髓缺损区或者不规则骨组织缺损区域的充填等操作；
2.本发明所构建的处理牙本质基质凝胶具有良好的成形性和临床操作性能，可有效携带牙本质基质的生物活性成分，并充填于复杂的髓腔环境以及不规则的骨缺损环境中。本专利的凝胶材料制备方案反应条件温和，操作简便，可短时间内大量制备，主要应用于口腔内科领域的直接盖髓术和牙髓切断术等乳牙和年轻恒牙的活髓保存治疗中，根尖周炎及根尖囊肿的根尖诱导成形术相关治疗以及颌面部骨及四肢骨等不规则骨缺损的相关治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明处理牙本质基质凝胶PAA-CMC-TDM制备模式图；
图2为本发明组分调整后PAA-CMC-TDM形态展示；
图3为本发明组分调整后PAA-CMC-TDM制备展示；
图4为本发明PAA-CMC-TDM水凝胶与TDM的可操作性比较；
图5为本发明PAA-CMC-TDM水凝胶与TDM团块超声震荡下稳定性比较；
图6为本发明PAA-CMC-TDM水凝胶与TDM用于牙髓保存盖髓术的手术示意图；
图7为本发明PAA-CMC-TDM、TDM和iROOT BP应用于牙髓缺损8周后的影像学及组织学结果；
图8为本发明PAA-CMC-TDM、TDM应用于大鼠股骨缺损6周后的影像学及组织学结果；
图9为本发明PAA-CMC-TDM、TDM应用于大鼠颅骨缺损6周后的影像学及组织学结果；
图10为本发明PAA-CMC-TDM凝胶结构示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。
实施例1
本发明的实施方式提供了一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，本实施方式作为本发明的一较佳实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝20000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备1％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(转数500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl23ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min,即可获得乳白色凝胶,如图1所示。
步骤11：将清洗后的凝胶进行分装，分装后-80℃冷冻6小时，并于真空冷冻干燥机中冻干12h后，经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装保存于-20℃。
使用时，将冻干凝胶粉与无菌生理盐水按2:1的水粉体积比调拌60s左右，以促进材料恢复凝胶态。用于活髓保存时，将凝胶直接充填覆盖于牙髓断面即可完成盖髓充填操作。之后，于充填材料上进一步充填玻璃离子水门汀和光固化树脂材料,如图6所示。
实施例2
本实施方式作为本发明的一较佳实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备1％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末250mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 3ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min，即可获得乳白色凝胶，如图2.B-b所示。
实施例3
本实施方式作为本发明的一较佳实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备1％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 3ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min，即可获得乳白色凝胶，如图2.B-c所示。TDM含量的增大可提高材料的稳定性，同时会在其他条件不变的情况下，增大凝胶的体积，TDM的添加量以1ml35％的PAA为基础，可添加50mg-500mg的TDM。
实施例4
本实施方式作为本发明的一较佳实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.3g CMC(MW＝100000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备3％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末250mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 3ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min，即可获得凝胶，如图2.C-b所示。
实施例5
本实施方式作为本发明的一较佳实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.5g CMC(MW＝100000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备5％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末250mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 3ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min，即可获得乳黄色凝胶，如图2.C-c所示。随着CMC的含量增大，凝胶的硬度增大，且形态更稳定。
实施例6
本实施方式作为本发明的一较佳实施例，调整了加入氯化钙的量，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml去离子水中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 1ml。随着CaCl2的加入，见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min，即可获得乳白色凝胶，如图3.D-b所示。足量的氯化钙可保证凝胶的形成完全，在控制PAA和CMC的量一定的情况下，氯化钙的加入过量对其形成的凝胶影响不大。
实验例1
步骤1：将获得的离体牙充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分，在经EDTA脱矿后，将处理牙本质基质冻干，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，制备为TDM粉末。
步骤2：将TDM粉末与去离子水调拌作为对照组1。
步骤3：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液作为对照组2。
步骤4：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml去离子水中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液，作为对照组3。
步骤5：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 1ml。随着CaCl2的加入，见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料PAA-CMC-TDM，作为实验组。
步骤6：将实验组PAA-CMC-TDM粉末与对照组TDM粉末材料均加去离子水，调拌成可充填状态后，静置5-10min，加力制备成多种形状，观察两组材料在成形性方面的差异以单纯的TDM粉末+去离子水作为对照组1，实验组内容完全按照实施例1制备获得PAA-CMC-TDM，将实验组和对照组分别置于去离子水中，分别超声震荡5min，10min，30min，观察材料的形态。
结果：如图5所示，在超声震荡后，可以发现，成团的对照组TDM材料快速在水中崩解，而成形的PAA-CMC-TDM则仅有少量的崩解，保持材料的形态稳定。
实验例2
步骤1：将获得的离体牙充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。在经EDTA脱矿后，将处理牙本质基质冻干，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，制备为TDM粉末。
步骤2：将TDM粉末与去离子水调拌作为对照组1。
步骤3：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液作为对照组2。
步骤4：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml去离子水中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液，作为对照组3。
步骤5：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入NaOH调整PH为7.0。待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 1ml。随着CaCl2的加入，见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料PAA-CMC-TDM，作为实验组。
步骤5：将实验组PAA-CMC-TDM粉末与对照组TDM粉末材料均加去离子水，调拌成可充填状态后，静置5-10min，加力制备成多种形状，观察各组材料在成形性方面的差异。
结果：如图4所示，在对照组TDM和实验组PAA-CMC-TDM在相同条件下制备成形后，可发现，在静置5-1min后，TDM材料成形性不足，勉强成形后表面可见多处皲裂，PAA-CMC-TDM则可顺利成形，且形态较完整，单独的A液和B液为液态，无法成形。
实验例3：
步骤1：将获得的离体牙充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。在经EDTA脱矿后，将处理牙本质基质冻干，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，制备为TDM粉末。
步骤2：将TDM粉末与去离子水调拌作为实验组1。
步骤3：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤4：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml去离子水中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤5：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/lNaOH调整PH为7.0。待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 1ml。随着CaCl2的加入，见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料PAA-CMC-TDM，作为实验组2。
步骤6：以商品化的i ROOT BP盖髓剂作为对照组，以单纯的TDM粉末+去离子水作为实验组1，实验组2为PAA-CMC-TDM。在6月龄比格犬的前牙及前磨牙上制备牙髓缺损模型，将对照1、对照2和实验组材料分别盖于牙髓断面上。
结果：如图7所示，8W后，收集样本，通过Micro-CT和组织学HE染色结果可以发现，三组均可形成可观察的牙本质桥影像学图像，其中，PAA-CMC-TDM组形成的修复性牙本质层清晰，厚度均一，与目前临床中较好的i ROOT BP盖髓剂相比无明显差别，且在牙髓腔内无其余钙化点。
实验例4：
步骤1：将获得的离体牙充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。在经EDTA脱矿后，将处理牙本质基质冻干，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，制备为TDM粉末。
步骤2：将TDM粉末与去离子水调拌作为TDM实验组。
步骤3：取实施例2中获得的凝胶材料PAA-CMC-TDM，作为PAA-CMC-TDM实验组。
步骤4：选用雌性SD大鼠(286～330g)，用高速牙科手机和小型球钻(直径1mm)制备股骨缺损(直径3mm，深度3mm)，按实验设计填充PAA-CMC-TDM或TDM材料。将大鼠右股骨制作成与对照组相同的缺损区，作为空白对照。
结果：如图8所示，6W后，收集样本，通过Micro-CT和组织学HE染色结果可以发现，与空白对照组相比，PAA-CMC-TDM和TDM组有效促进了骨小梁的形成和缺损区骨组织的修复再生，PAA-CMC-TDM组有效稳定了TDM颗粒，保证其处于缺损区，并实现良好的骨再生。
实验例5：
步骤1：将获得的离体牙充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。在经EDTA脱矿后，将处理牙本质基质冻干，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，制备为TDM粉末。
步骤2：将TDM粉末与去离子水调拌作为TDM实验组。
步骤3：取实施例2中获得的凝胶材料PAA-CMC-TDM，作为PAA-CMC-TDM实验组。
步骤4：选用雌性SD大鼠(286～330g)16只，注射麻醉后，在其头顶部剃毛、备皮、消毒，于正中作1.5cm-2cm的切口，钝性分离皮下组织，暴露颅骨，用慢速牙科手机和5mm环钻于颅骨矢状缝两侧的颅骨顶部制备左右两个缺损(直径5mm)。按实验设计填于左侧缺损填充充PAA-CMC-TDM或TDM材料。将右侧缺损作为空白对照组。
结果：如图9所示，6W后，收集样本，通过Micro-CT和组织学HE染色结果可以发现，与空白对照组相比，PAA-CMC-TDM组有效促进了骨小梁的形成和缺损区骨组织的修复再生。与单纯的TDM组相比，PAA-CMC-TDM赋形剂有效稳定了TDM颗粒，保证其处于缺损区，并实现良好的骨再生。
对比例1
本实施方式作为本发明的一非优化实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将制备好的处理牙本质基质粉末250mg分散于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/lNaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl23ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min，可获得半透明白色凝胶，其较添加CMC的凝胶比，稳定性降低，易受重力影响而坍塌，如图2.C-a所示。
对比例2
本实施方式作为本发明的一非优化实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝20000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备1％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末250mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为5.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 2-3ml。随着CaCl2的加入，可见凝胶逐渐缠绕于聚四氟乙烯搅拌子上，待无新凝胶产生后，停止添加CaCl2，继续搅拌2h后停止。将反应后的液体去除，只保留获得的凝胶材料，并将获得的凝胶在去离子水中搅拌清洗3次，每次30min,可获得乳白色的凝胶材料，如图3.C-a所示。但凝胶的PH过低，为酸性，无法用于人体缺损牙本质的填充。
对比例3
本实施方式作为本发明的一非优化方案实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝20000)溶解于10ml去离子水溶液中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末250mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为8.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 2-3ml。随着CaCl2的加入，可见体系中形成大量无具体形态的絮状物，无法形成稳定的凝胶，如图3.C-c所示。
对比例:4
本实施方式作为本发明的一例未优化的实施例，包括以下步骤：
步骤1，人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2，将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3，更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4，将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA脱矿30min；10％的EDTA脱矿20min；5％的EDTA脱矿10min(EDTA溶液pH为7.0-7.5，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5，将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6，将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7，取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8，将0.1g CMC(MW＝300000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备1％的CMC/NaH2PO4溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末250mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9，在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10，待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 2-3ml。随着CaCl2的加入，可见大量絮状沉淀形成，材料无法形成可操作的凝胶。
如图2.A所示，当选用的CMC的分子量为30万时，按此方案无法形成可操作性可成形的凝胶，而只是单纯的无序的絮状沉淀，如图3.A-c所示。
对比例5
本实施方式作为本发明的一未优化实施例，包括以下步骤：
步骤1，取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤2，将0.1g CMC(MW＝20000)溶解于10ml 0.1mol/l的NaH2PO4溶液中制备1％的CMC/NaH2PO4溶液，充分搅拌，制备为B液。
步骤3，在剧烈搅拌下(转数不低于400rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为8。
步骤4，待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 2-3ml。随着CaCl2的加入，可见逐渐形成聚合的凝胶，将其剥离，即可获得半透明的凝胶。
如图2.B-a所示，在不加TDM时，也可形成半透明的凝胶材料，凝胶强度低，易因自身重力而塌陷，且缺乏生物活性。
对比例6
本实施方式作为本发明的未优化的实施例，包括以下步骤：
步骤1：人源性处理牙本质基质主要由在口腔临床获得因正畸等原因拔除的患者离体牙制备所得。在牙拔出后，即刻置于无菌生理盐水中保存。
步骤2：将获得的离体牙用无菌生理盐水反复冲洗3次后，在洁净环境下，用牙科手机和裂钻去除牙冠及部分根尖组织，用拔髓针、根管锉尽可能拔出牙髓，并初步预备根管。
步骤3：更换相应大小的金刚砂车针，去除牙体组织外周的牙周膜及牙骨质层，并进一步预备并扩大根管，充分去除牙髓组织和修复性牙本质成分，仅保留原发性牙本质成分。
步骤4：将制备好的处理牙本质基质以材料体积10倍的去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。之后，分别经17％的EDTA溶液脱矿30min；10％的EDTA溶液脱矿20min；5％的EDTA溶液脱矿10min(EDTA溶液pH为7.2，经0.22μm滤器过滤灭菌)，每步更换脱钙液前，将处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，每次10min。
步骤5：将脱矿后的处理牙本质基质以去离子水超声震荡清洗3次，然后在无菌条件下分成碎块后装进冻存管，-80℃冷冻3小时，于真空冷冻干燥机中冻干12h。
步骤6：将冻干后的处理牙本质基质经环氧乙烷灭菌，在超净台内将冻干处理牙本质基质装入冷冻研磨罐中，用冷冻研磨机以30Hz条件研磨30min，分装入EP管内，密封包装，置于-20℃保存备用。
步骤7：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤8：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml去离子水中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤9：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤10：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 3ml。随着CaCl2的加入，可见溶液中出现大量絮状沉淀，如图3.B-a所示，PAA和CMC及TDM未聚合在一起形成凝胶结构。
对比例7
本实施方式作为本发明的未优化的实施例，包括以下步骤：
步骤1：取35％的聚丙烯酸水溶液(MW＝250000)0.5ml，以去离子水稀释至10ml，充分搅拌，制备为A液。
步骤2：将0.1g CMC(MW＝100000)溶解于10ml去离子水中制备1％的CMC溶液，并取制备好的处理牙本质基质粉末500mg于其中分散，充分搅拌，制备为B液。
步骤3：在剧烈搅拌下(500rpm)，将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌24h后，加入1mol/l NaOH调整PH为7.0。
步骤4：待PH值稳定，在搅拌过程中向所获得的混合液滴加1mol/l的CaCl2 0.1ml。随着CaCl2的加入，可见溶液透明度降低，但未见明显的沉淀或凝胶形成,如图3.D-a所示。
与传统氢氧化钙盖髓剂相比，处理牙本质基质源性材料的盖髓剂由于是生物来源的生物活性制剂，不会有由强碱性带来的可能的不良反应，且形成的修复性牙本质层与生理修复类似。而通过本发明制备的PAA-CMC-TDM材料，在保留处理牙本质基质生物活性的基础上，具有良好的成形性和临床操作性能，可有效携带TDM的生物活性成分，并充填于复杂的髓腔环境中。其制备方案具有反应条件温和，操作简便，可短时间内大量制备等优势。
本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.取5-50%的聚丙烯酸水溶液，稀释至非粘稠状态，充分搅拌，得到A液;
S2.将羧甲基壳聚糖溶解于饱和NaH2PO4溶液中制备CMC/NaH2PO4溶液，并取处理牙本质基质于其中分散，充分搅拌，得到B液;
S3.将B液逐滴滴加到A液中，充分搅拌，加入NaOH溶液调整PH为7.0-7.5
S4.待PH值稳定，继续搅拌，并同时向步骤S3中的混合液滴加CaCl2溶液，可见凝胶逐渐缠绕于搅拌子，将凝胶收集后得到凝胶材料；
S5.将凝胶材料分装于后-80℃冷冻，并于真空冷冻干燥机中冻干后，经环氧乙烷灭菌，无菌条件下以冷冻研磨仪研磨成粉保存。
2.根据权利要求1所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述聚丙烯酸水溶液MW=100000-250000。
3.根据权利要求1所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述A液通过5-50%的聚丙烯酸和去离子水以体积比1：2-1：20进行稀释。
4.根据权利要求1所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖MW=20000-300000。
5.根据权利要求1所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3将B液逐滴滴加到A液的过程中需不断搅拌，搅拌转数不低于400rpm，搅拌时间为12-48h。
6.根据权利要求1所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述CaCl2溶液浓度为0.1-10mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的制备方法，其特征在于，所述处理牙本质基质使用离体牙制得。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶制备方法制得的凝胶，其特征在于，包括聚丙烯酸PAA，羧甲基壳聚糖CMC，处理牙本质基质TDM以及无定形磷酸钙ACP，其中，所述聚丙烯酸PAA质量百分含量10%-60%，所述羧甲基壳聚糖CMC质量百分含量5%-20%，所述处理牙本质基质TDM质量百分含量40%-60%，所述无定形磷酸钙ACP质量百分含量10%-30%。
9.根据权利要求8所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的使用方法，其特征在于，将所述凝胶材料制备成冻干粉并低温保存，使用时与无菌生理盐水调拌恢复凝胶态再进行填充。
10.根据权利要求8所述的一种牙/骨硬组织修复再生的矿物基质凝胶的应用，其特征在于，用于牙或骨硬组织修复再生。
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| 牙本质基质在组织再生中的应用;朱甜等;《华西口腔医学杂志》;20190228;第37卷(第1期);第92页第1段至第95页第1段 * |
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