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CN114555111A - 包含干扰素-β或其变体的免疫细胞因子用于治疗人表皮生长因子受体2阳性癌症的用途 - Google Patents

包含干扰素-β或其变体的免疫细胞因子用于治疗人表皮生长因子受体2阳性癌症的用途 Download PDF

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CN114555111A CN202080071160.9A CN202080071160A CN114555111A CN 114555111 A CN114555111 A CN 114555111A CN 202080071160 A CN202080071160 A CN 202080071160A CN 114555111 A CN114555111 A CN 114555111A
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Abstract

本发明涉及一种重组蛋白的用途，其中干扰素‑β蛋白和与HER2抗原结合的抗体融合，用于治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症患者。所述重组蛋白通过患者中的癌症特异性抗癌免疫反应可表现出优于常规抗体治疗剂的功效，从而用于更多患者，并因此可有效用作治疗癌症的新型药物。

Description

包含干扰素-β或其变体的免疫细胞因子用于治疗人表皮生长 因子受体2阳性癌症的用途
发明领域
本申请要求2019年8月19日提交的韩国专利申请号No.10-2019-0101351的优先权，并在本文中引用了其整个说明书作为本申请说明书的一部分。
本发明涉及一种干扰素-β和人表皮生长因子受体2(HER2)相互连接的重组蛋白用于治疗癌症的用途，以及更具体地涉及一种干扰素或干扰素-β的变体与抗HER2抗体相互连接的重组蛋白用于治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的用途。
发明背景
干扰素(IFN)是在免疫中发挥重要作用的主要细胞因子之一，且已知它具有很强的抗癌作用。这些干扰素分为I型干扰素(IFN-α和IFN-β)、II型干扰素(IFN-γ)和III型干扰素(IFN-λ)。
I型干扰素表现出抗病毒和抗增殖作用，且在癌症免疫监视、识别肿瘤特异性抗原和消除肿瘤细胞的功能上也发挥着重要作用。在I型干扰素中，IFN-β对细胞生长的抑制作用比IFN-α更强。特别是与抗癌剂一起使用时，IFN-β的抗增殖活性和协同作用的作用范围非常好。然而，已知干扰素治疗具有高细胞毒性，使接受治疗的人中例如发烧(80％)、肌痛(73％)、头痛(50％)、疲劳(50％)、不适(50％)等症状。
曲妥珠单抗是靶向人表皮生长因子受体2(HER2)的抗体癌症治疗药物，且正用于治疗HER2阳性癌症患者。然而，因为单独使用曲妥珠单抗不足以引发治疗效果，所以将其与正帕妥珠单抗(另一种靶向HER2的抗体治疗药物)和化疗药物联合施用。此外，在HER2阳性癌症患者中，它仅用于某些HER2表达水平高的患者群体，并仍然存在局限性，诸如施用抗体治疗后出现的例如癌症复发或对HER2治疗产生耐药性等。
具体地，最近用于治疗HER2阳性癌症的治疗剂(诸如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)仅处方于具有恶性HER2阳性肿瘤细胞的患者以获得临床反应，所述恶性HER2阳性肿瘤细胞的细胞表面具有超过1,000,000个HER2受体。恶性HER2阳性肿瘤细胞的细胞表面具有超过1,000,000个HER2受体的此类患者通常被归类为HER2 IHC 3+。可选地，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗可处方于HER2表达水平为IHC 2+并在荧光原位杂交(FISH)测定中存在HER2基因扩增的患者，即由本领域技术人员确定为FISH阳性的患者。
基于使用例如Dako Denmark A/S提供的Hercep TestTM和/或HER2 FISH(pharmDxTM)或Monogram Biosciences提供的
Figure BDA0003588892860000011
测定来测量的HER2表达水平，将患者进行分类。具有HER2低表达水平(即HER2表达水平为IHC 1+或IHC 2+以及FISH结果为阴性)肿瘤细胞的患者，通常对曲妥珠单抗和帕妥珠单抗治疗未显示出足够的临床反应。因此，由于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗仅处方于特定范围的患者，所以它们作为癌症治疗的应用受到了限制。
另一方面，I型干扰素的信号传导是通过干扰素受体的活性逐步激活许多酶，在这种情况下转录因子(诸如STAT1和STAT2)也参与其中。这种信号传导激活了免疫系统，这对于许多抗癌药物发挥其抗癌作用至关重要，例如化疗药物(诸如蒽环类药物)、靶向生长因子受体(诸如人表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)等)的抗体治疗药物、以及佐剂和溶瘤病毒疗法治疗药物。特别地，pSTAT3是曲妥珠单抗治疗耐药机制涉及的信号传导分子之一，以两个相同分子聚合的形式(pSTAT3同源二聚体)存在，并已知被pSTAT1抑制。因此，当激活pSTAT1的I型干扰素与曲妥珠单抗联合使用时，可以预期抗癌功效会增加。
因此，本发明人通过产生重组蛋白开发与现有HER2抗体治疗剂相比治疗功效更强的新型治疗药剂，所述重组蛋白中干扰素-β蛋白和HER2靶向抗体融合在一起。本发明的融合蛋白与目前的HER2抗体治疗药物不同，它对HER2低表达水平的患者显示治疗功效，此外，它可以有效降低癌症复发的概率，表明了开发新型癌症治疗药物的可能性。
发明描述
待解决的问题
本发明的一个方面的目的是提供用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含重组蛋白作为活性组分，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
本发明的另一个方面的目的是提供用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其由重组蛋白组成，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
本发明的另一个方面的目的是提供用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其基本上由重组蛋白组成，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ IDNO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
本发明的另一个方面的目的是提供重组蛋白用于制备用于HER2表达水平为IHC1+或更高的癌症的治疗剂的用途，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
本发明的另一个方面的目的是提供治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物蛋白包含干扰素-β或SEQID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β或其片段的HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
本发明的另一个方面的目的是提供用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
本发明的另一个方面的目的是提供用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其由干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段组成。
本发明的另一个方面的目的是提供用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其基本上由干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段组成。
本发明的另一个方面的目的是提供组合物用于制备用于HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的治疗剂的用途，所述组合物包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段。
本发明的另一个方面的目的是提供治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含干扰素-β或SEQ IDNO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段。
问题的解决方案
根据本发明的一个实施方案，本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC1+或更高的癌症的药物组合物，其包含重组蛋白，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其由重组蛋白组成，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其基本上由重组蛋白组成，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了重组蛋白用于制备用于HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的治疗剂的用途，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β或其片段的HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其由干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其基本上由干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段组成。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了组合物用于制备用于HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的治疗剂的用途，所述组合物包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段。
下面将对本发明进行详细描述。
本发明提供了用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含重组蛋白，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
干扰素-β(IFN-β或IFNβ)是一种具有5个α螺旋的球状蛋白质，大小为22kDa，且据报道由于其多种免疫活性(诸如tt活性、细胞生长抑制活性或抗增殖活性、淋巴细胞细胞毒性增强活性、免疫调节活性、靶细胞分化诱导或抑制活性、巨噬细胞活化活性、细胞因子产量增加活性、细胞毒T细胞增效活性、自然杀伤细胞增加活性等)，它可以有效治疗癌症、自身免疫性疾病、病毒感染、HIV相关疾病、丙型肝炎和类风湿关节炎。然而，干扰素-β是一种具有聚集性的强疏水蛋白，且生物活性和产率低，且半衰期短，这限制干扰素-β的利用。因此，本发明新开发了一种与干扰素-β的变体缀合的重组蛋白，通过在干扰素-β或与野生型干扰素-β融合的重组蛋白的基因中诱导定点诱变，所述干扰素-β的变体与无改变的野生型干扰素-β相比显示在细胞中的表达水平增强。
干扰素-β的变体或干扰素-β的突变体(在说明书中也称为干扰素-β突变蛋白)的特征在于，第27位精氨酸(R)被苏氨酸(T)取代，从而在第80位和第25位氨基酸残基处包含糖基。在这种情况下，干扰素-β变体可以由SEQ ID NO：1的氨基酸序列或编码其的SEQ IDNO：2的核苷酸序列表示。干扰素-β的此类变体可包括野生型干扰素-β的全部或部分氨基酸序列，并具有干扰素-β活性。
抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及其片段。完整的抗体整体呈Y形，且由两条长的重链(H)和两条短的轻链(L)组成。每条重链和轻链通过硫化物键相互连接，并划分为可变区(V)(与抗原反应的区域)和恒定区(C)(表达效应子功能的区域)。在可变区中，有一个互补决定区(CDR)，它决定可变区的结构，从而与抗原形成特异性结合，并控制抗体结合强度。抗体片段表示能够与抗原反应以表现出抗原结合活性的特定位点，例如Fab片段(木瓜蛋白酶消化的片段)、Fab'片段(胃蛋白酶消化的和部分还原的片段)、F(ab')2片段(胃蛋白酶消化的片段)、Facb(纤溶酶消化的片段)、Fd(胃蛋白酶消化的、部分还原的和重聚合的片段)、scFv片段(分子生物学技术处理的片段)等。优选地，抗体是识别肿瘤特异性抗原的抗体或其片段，并可以用作用于癌症的靶向疗法。例如，它可以是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗，其靶向人表皮生长因子受体2(HER2)的抗体治疗剂。在这种情况下，曲妥珠单抗可以由具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的重链和具有如SEQID NO：4所示的氨基酸序列的轻链组成。
重组蛋白可以是由干扰素-β或干扰素-β的变体或突变体和抗体或其片段通过肽接头连接而形成的融合蛋白或复合蛋白。肽接头是指由两个或更多个氨基酸或氨基酸类似物通过肽键相互连接而形成的短片段分子，用于将两个或更多个分开的物质相互连接。在这种情况下，可以利用以甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸等为主要构成氨基酸的接头，诸如甘氨酸-丝氨酸接头、甘氨酸-丝氨酸-丙氨酸接头等。这种接头可以连接到抗体重链的C端或抗体轻链的C端。接头的N端可以连接到抗体轻链的C端和抗体重链的C端。在这种情况下，接头的C端可与干扰素-β变体的N端相连。重组蛋白可以是如SEQ ID NO：5所示的蛋白，其具有其中干扰素-β变体与曲妥珠单抗的重链相连的氨基酸序列。
在各种细胞因子中，干扰素-β对癌细胞生长的抑制效果最强。然而，单独使用干扰素-β的治疗，会作用于癌症患者的全身并引起各种副作用。此外，已知受治疗的患者会出现例如发烧(80％)、肌肉疼痛(73％)、头痛(50％)、疲劳(50％)和不适(50％)的症状。
人表皮生长因子受体2(HER2)是一类在乳腺癌和胃癌中过表达的酪氨酸激酶受体，大小为185kDa，以及它通过激活各种细胞内信号系统发挥着促进细胞生长的作用。因此，已开发了多种HER2靶向抗体治疗剂，其特异性抑制HER2活性并通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)表现出抗癌效果，并且目前正在患者中使用。然而，由于单独的HER2抗体治疗不够有效，将其与帕妥珠单抗(另一种靶向HER2的抗体治疗药物)和化疗药物联合施用。另外，抗体治疗剂仅用于HER2阳性癌症患者中某些HER2高表达水平的患者，并仍然存在其他局限性，例如在施用治疗剂后癌症复发或对当前HER2治疗剂产生耐药性。特别地，pSTAT3是曲妥珠单抗治疗耐药机制涉及的信号传导物质之一，以两个相同物质聚合的形式(pSTAT3同源二聚体)存在，并已知被pSTAT1抑制。因此，当激活pSTAT1的干扰素-β与曲妥珠单抗联合时，可以预期抗癌功效增加。
另一方面，HER2靶向抗体治疗剂(例如曲妥珠单抗)通常处方用于治疗HER2受体过表达的癌细胞。与相同组织类型的非癌细胞相比，具有HER2受体过表达的癌细胞含有明显更高水平的HER2受体蛋白或其基因。这种过表达可能是由基因扩增或由转录或翻译的增加而引起的。HER2受体过表达或扩增可以在诊断或预后分析中通过评估细胞表面上存在的HER2蛋白水平的增加程度来确定(例如，通过免疫组织化学分析；IHC).可选地，或额外地，它可以通过Southern印迹或聚合酶链反应(PCR)技术(例如，定量实时PCR(qRT-PCR)或原位杂交(ISH)，诸如荧光原位杂交(FISH)和发色团原位杂交(CISH))测量细胞中编码HER2的核酸水平来确定。
通常，HER2靶向抗体治疗剂(例如曲妥珠单抗)处方于具有评分为IHC 3+的HER2过表达癌细胞的患者，或HER2表达水平为IHC 2+并通过荧光原位杂交(FISH)分析具有HER2基因扩增由此由本领域技术人员确定为FISH阳性(FISH(+))的患者。
本发明提供的组合物的特征在于，其可以施用于患者群体并在其中发挥治疗效果，所述患者群体通常不能处方常规的HER2靶向抗体治疗或者即使处方也不能预期任何显著疗效。
在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+，或IHC 2+并且FISH阴性的癌症。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的乳腺癌或胃癌。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+，或IHC 2+并且FISH阴性的乳腺癌或胃癌。
通过本领域已知的方法，本发明的药物组合物可根据施用途径以各种方式与药学上可接受的载体一起配制。“药学上可接受的”是指生理上可接受的无毒的组合物，且它不抑制活性成分的作用并且在施用于人时通常不会引起过敏反应，诸如肠胃疾病、头晕或类似反应。载体包括各种溶剂、分散介质、水包油或油包水乳液、水性组合物、脂质体、微珠和微粒体。
施用途径可以是口服或肠胃外施用。肠胃外施用方法包括但不限于静脉施用、肌内施用、动脉施用、髓内施用、鞘内施用、心内施用、透皮施用、皮下施用、腹腔施用、鼻内施用、经肠施用、局部施用、舌下施用或直肠施用。
当本发明的药物组合物口服施用时，本发明的药物组合物可根据本领域已知的方法配制成例如粉剂、颗粒、片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体或凝胶、糖浆、混悬剂、薄片等形态与合适的载体一起用于口服施用。合适的载体的示例可包括糖(诸如乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和麦芽糖醇)、和淀粉(包括玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉和马铃薯淀粉)、和纤维素(包括纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和羟丙基甲基纤维素等)、以及填充剂(诸如明胶、聚乙烯吡咯烷酮等)。此外，如有必要，可添加交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或海藻酸钠作为崩解剂。此外，药物组合物可进一步包含抗聚集剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、乳化剂和防腐剂。
此外，当肠道外施用时，本发明的药物组合物可根据本领域已知的方法以注射剂、经皮施用和鼻吸入剂的形式与合适的肠道外载体一起配制。在注射的情况下，必须对其进行消毒，并防止其受到微生物例如细菌和真菌的污染。对于注射剂，合适的载体的示例包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其混合物和/或含有植物油的溶剂或分散介质。更优选地，合适的载体可选自Hanks溶液、林格溶液、含有三乙醇胺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)或等渗溶液(诸如灭菌注射用水、10％乙醇、40％丙二醇和5％葡萄糖)。为了防止注射剂被微生物污染，它可进一步包括各种抗菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞。此外，在大多数情况下，注射剂可进一步含有等渗剂，诸如糖或氯化钠。在经皮施用的情况下，包括例如软膏、乳膏、洗剂、凝胶、外用溶液、面剂、搽剂和空气卷(air rolls)等形式。如本文所用，“经皮施用”是指通过将药物组合物局部施用至皮肤从而将药物组合物中所含的有效量的活性成分递送至皮肤中。例如，本发明的药物组合物可以制备成可注射制剂，并通过用30号细注射针轻轻刺入皮肤或直接用于皮肤来施用。这些制剂在制药化学中常见的处方指南中有所描述。
在吸入施用的情况下，可使用合适的推进剂(例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷，二氧化碳或其他适用的气体)将根据本发明使用的化合物以气溶胶喷雾的形式方便地从加压包或雾化器递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀门来确定，以提供计量数。例如，吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊和药筒可配制成含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。至于其他药学上可接受的载体，可以参考本领域已知的那些载体。
此外，根据本发明的药物组合物可含有一种或多种缓冲剂(例如，盐水或PBS)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(例如，EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。
此外，可使用本领域已知的方法配制本发明的药物组合物，以向哺乳动物施用后使活性成分快速、持续或延迟释放。
此外，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括提供以下步骤：
a)从患者获得癌组织；
b)对获得的癌组织进行免疫组织化学染色；
c)在步骤b)中选择IHC 1+或更高的HER2阳性癌症患者；和
d)施用重组蛋白，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β或其变体的HER2靶向抗体或其片段。
目前市场上的HER2抗体治疗剂(即曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)正用于治疗患有HER2阳性乳腺癌或胃癌的患者。对HER2患者的癌组织进行免疫组织化学法(IHC)时，它们仅用于具有非常高水平的HER2表达(IHC 3+)或适中水平表达(IHC 2+)以及阳性FISH结果的患者。这是因为这些抗体治疗剂对HER2低表达水平的患者无效。
本发明提供的HER2抗体与干扰素-β或其变体的融合蛋白显示出进一步增强的抗癌活性，因为干扰素-β或其变体增加了癌症治疗效果和免疫激活效果，同时对HER2信号传导和ADCC的抑制(作为现有抗体治疗剂的抗癌功能)基本保持不变。因此，在选择HER2阳性癌症患者向其施用融合蛋白用于治疗癌症的目的时，应根据与目前HER2抗体治疗剂不同的标准。
在选择患者施用HER2靶向抗体和干扰素-β或其变体的融合蛋白时，对来自癌症患者的癌症组织进行IHC，并筛选出表达水平为IHC 1+或更高的。
根据本发明的一个优选方面，其特征可在于，可以在步骤c)选择IHC 1+的患者之后进行步骤d)。
根据本发明的一个优选实施例，其特征可在于，在步骤c)选择IHC 2+的患者，并进一步进行额外的FISH分析。因此，可以对IHC 2+患者中FISH结果为阴性的患者进行步骤d)。
本发明提供了一种重组蛋白的用途，所述重组蛋白包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β或其变体的HER2靶向抗体或其片段。
本发明提供一种治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的包括组合物蛋白的组合物，所述组合物蛋白包含干扰素-β或SEQ IDNO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和直接地或间接地共价连接至干扰素-β或其变体的HER2靶向抗体或其片段作为有效成分。
本发明的“有效量”是指当向个体或对象施用时，具有改善、治疗、检测、诊断、或减轻、或抑制HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症进展的效果的量。“对象”可以是动物，优选地包括哺乳动物，特别是人类，并且可以是动物来源的细胞、组织、器官等。对象可以是需要该效果的患者。
本发明的“治疗”总体上是指缓解HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症相关症状或癌症进展，且它可以包括治愈、基本上预防或改善HER2阳性癌症的状况。此外，它还包括但不限于减轻、治愈或预防由疾病引起的一种或大部分症状。
如本文所用，术语“包含”与“包括”或“特征在于”所用的含义相同，并且在根据本发明的组合物或方法中，不排除未具体提及或描述的任何附加组分或方法步骤。此外，术语“由……组成”是指排除未具体描述的附加元素、步骤或成分。术语“基本上由……组成”是指，在组合物或方法的范围内，除了所描述的物质或步骤之外，它可包括基本上不影响其基本性质的物质或步骤。
本发明提供一种用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
通过同时施用干扰素-β或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段，根据本发明的药物组合物发挥作用，以增强预防和治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的效果。
更具体地，通过向单独每种药物并不能改善的患者群体(即HER2低表达水平的癌症患者群体)共同施用干扰素-β蛋白或SEQ ID NO:1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段，治疗癌症时可以出现显著的协同作用。本发明首次公开了这种联合施用的协同效应。
在本发明中，术语“协同”是指，如文献中所述，当每种组分联合施用时产生的效果大于作为单一组分单独施用时产生的效果的总和(Chou和Talalay,Adv.Enzyme.Regul.,22:27-55,1984)。
在本发明中，术语“联合施用”是指向对象一起施用两种或更多种成分。当单个组分一起施用时，意味着可以同时或以任何顺序或在不同时间依次施用每个组分，以获得所需的治疗效果。
当干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段分别或分开配制，并以分开的组合物的形式联合施用时，可根据已知的方法分别制备制剂。
同时，干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段可以配制成单一组合物的形式，并且可以根据已知的方法制备制剂。
至于根据本发明的包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的其变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段的药物组合物，可以同时、分开或依次施用每种组分。例如，当包括在本发明的药物组合物中的各个组分一起配制成单一组合物时，它们可以同时施用。当其不作为单一组合物制备时，一种组分可以在另一种组分之前或之后施用，和/或与另一种组分同时施用。可由医生或专家确定根据本发明的药物组合物的施用顺序，即是否施用某种、在什么时间点、同时、分别还是依次施用。这种施用顺序可能会因各种因素而改变。
在本发明的一个方面，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+、或IHC 2+并且FISH阴性的癌症。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的乳腺癌或胃癌。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物的特征可在于，其用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+、或IHC 2+并且FISH阴性的乳腺癌或胃癌。
本发明还提供了一种组合物用于制备HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的治疗药剂的用途，所述组合物包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段。
本发明还提供了一种治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含干扰素-β或SEQ ID NO：1的干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)和HER2靶向抗体或其片段。
发明效果
根据本发明的重组蛋白，其中干扰素β或其变体与HER2靶向抗体或其片段相互融合，可用于治疗患有HER2阳性癌症的患者。此外，本发明提供了一种选择HER2阳性癌症患者的方法，所述患者将被施用重组蛋白，使得与常规的HER2抗体治疗剂相比，有更多的患者可以从治疗中受益。
附图简述
图1示出了曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白纯化实验的结果。使用蛋白A珠对亲和层析的第一步骤中分离的蛋白进行SDS-PAGE，以及随后通过离子交换层析分离蛋白。
图2是示出曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白的直接细胞毒性的图表。NCI-N87细胞在96孔板中生长，并接受不同浓度的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白的处理。72小时后，进行WST测定以评估活细胞的百分比。尽管在曲妥珠单抗处理组中未观察到细胞毒性，但证实了细胞毒性作用仅出现在曲妥珠单抗-IFNβ处理组中。
图3是示出曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白的间接免疫激活导致的细胞毒性结果的图表。NCI-N87细胞在96孔板中培养，然后用不同浓度的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白与PBMC一起处理。48小时后，通过WST测定测量活细胞的百分比。
图4a至4c示出了流式细胞技术结果以分析曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白的HER2结合能力。三种不同的细胞系，包括MCF-7(图4a)、MDA-MB-231(图4b)和NCI-N87(图4c)，与曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白发生反应，并通过流式细胞技术测量它们与HER2的结合能力。
图5是用于比较乳腺癌细胞系和胃癌细胞系中HER2表达水平的免疫印迹结果。根据每个细胞系的HER2表达水平，它们被分为HER2低表达、HER2适中表达和HER2高表达。
图6a和图6b示出了曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白在胃癌细胞系中的直接细胞毒性结果。在96孔板中培养不同HER2表达水平的胃癌细胞株，并用不同浓度的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白处理。72小时后，通过WST测定确认活细胞的百分比。
图7a和图7b示出了曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白在乳腺癌细胞系中的直接细胞毒性结果。在96孔板中培养不同HER2表达水平的乳腺癌细胞系，并然后用不同浓度的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白处理。72小时后，通过WST测定确认活细胞的百分比。
图8a和图8b是曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白在胃癌细胞系中间接免疫激活的细胞毒性结果。在96孔板中培养具有不同HER2表达水平的细胞系，并用不同浓度的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白与PBMC一起处理。48小时后，通过WST测定确认活细胞的百分比。
发明详述
下面将参照附图对本发明进行更详细的描述。然而，这些描述仅用于说明性目的，以帮助理解本发明，并且本发明的范围不受这些说明性描述的限制。
1.材料和方法
1-1.设计以制备融合蛋白。
为了建立瞬时表达与突变蛋白融合的抗体的稳定的细胞和细胞系，将pCHO1.0(Life Technologies)用作表达载体。将曲妥珠单抗用作抗体，并且将干扰素-β的变体(其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代)用作突变蛋白(突变蛋白质)。
干扰素-β变体与抗体的重链区融合。将接头克隆到抗体的重链区，并分别在其中克隆干扰素-β变体。此后，将限制性内切酶AvrII切割位点(CCTAGG)和Bstz17I切割位点(GTATAC)(来自Thermo Scientific，USA的酶)插入整个基因的3'-末端和5'-末端，以固定重链的最终基因。此外，将限制性内切酶EcoRV位点(GATATC)和PacI位点(TTAATTAA)插入抗体轻链的3'-末端和5'-末端，以固定轻链的最终基因。将重链和轻链的最终基因插入pCHO1.0载体。
1-2.融合蛋白构建体在哺乳动物细胞中的表达
使用FreeStyleTM MAX试剂(Thermo Scientific)将曲妥珠单抗和与曲妥珠单抗融合的干扰素-β变体(Trastuzumab-IFNβ突变蛋白)的表达载体转化到CHO-S细胞(ThermoScientific)中。添加OptiPROTM SFM(Thermo Scientific)到FreeStyleTM MAX试剂-DNA复合物中，将获得的混合物放入烧瓶中的CHO-S细胞中，并在大气压、8％CO2加湿气氛下孵育。转化后48小时，选出用于表达融合蛋白的稳定的转化株。通过用10-50μg/mL的嘌呤霉素和100-1,000nM的MTX进行二次筛选来分选细胞。在葡萄糖的存在下，将选定的细胞在37℃、8％CO2加湿气氛和130rpm下孵育14天，以表达融合蛋白。
1-3.融合蛋白的纯化
通过亲和层析法和离子交换层析法分离CHO-S细胞中表达的融合蛋白。将CHO-S培养基通过装满蛋白质A Mabselect sure(GE Healthcare)的柱后，依次用洗脱平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液洗脱，以获得纯化的蛋白质。在离子交换层析纯化方法的情况下，将亲和层析纯化获得的融合蛋白通过填充有HiTrap Q(HiTrap Q FF，GE Healthcare)的柱，然后加入洗脱缓冲液以获得纯化的蛋白。
1-4.细胞系和培养条件
人胃癌(NCI-N87)细胞系和人乳腺癌(MCF-7、MDA-MB-231)细胞系购自KoreanCell Line Bank(KCLB)。
在RPMI-1640(HyClone,USA)培养基(含有10％FBS(HyClone)、100单位/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素)中培养NCI-N87细胞，使用DMEM(HyClone,USA)培养基(含有10％FBS(HyClone)、100单位/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素)在37℃、具有湿度的5％CO2的大气压力条件下培养MCF-7和MDA-MB231细胞。
1-5.检测干扰素-β的直接细胞毒性
在96孔板中在每个孔中孵育2.0×104(200μL)NCI-N87细胞，并将其分为对照组和IFNβ处理组、曲妥珠单抗处理组或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白处理组。次日，施用相应浓度的IFNβ(1、5、10ng/ml)、曲妥珠单抗(15、30、60、120ng/ml)或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白(20、40、80、160ng/ml)，并孵育72小时。然后，将10μl的EZ-Cytox(Dae-il Biotech)加入每个孔，并在培养箱中反应3小时。使用SpectraMax iD3多模式酶标仪(Molecular Device)测量450nm处的吸光度，并进行比较。
1-6.检测干扰素-β的间接细胞毒性
在96孔板中在每个孔中孵育2.0×104(200μL)NCI-N87细胞，并将其分为对照组和IFNβ处理组、曲妥珠单抗处理组或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白处理组。次日，将外周血单个核细胞(PBMC)(Zenbio)以20:1的比例加入癌细胞，分别将干扰素β(100ng/ml)、曲妥珠单抗(100，350ng/ml)或曲妥珠单抗-干扰素β突变蛋白(100，350ng/ml)处理至相应浓度，并培养48小时。然后，将10μl的EZ-Cytox(Daeil Biotech)加入每个孔，并在培养箱中进行反应3小时。使用SpectraMax iD3多模式酶标仪(Molecular Device)测量450nm处的吸光度，并进行比较。
1-7.流式细胞技术
为了测量抗体与HER2的结合能力，进行流式细胞技术分析。使用细胞解离缓冲液(无酶，基于PBS)(Gibco)回收NCI-N87细胞、MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞，并于4℃在冷PBS(含2％FBS)中将其细胞活性抑制1小时。然后，将细胞用PBS洗涤三次，并与PBS稀释的1μg曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白于4℃孵育30分钟。随后，将细胞用PBS洗涤三次，并然后与山羊抗人IgG FITC(Jackson)于4℃孵育30分钟。通过流式细胞仪(CytoFLEX FlowCytometer)(Beckman Coulter)测量荧光抗体。
1-8.分析癌细胞中的内源性HER2表达
为了测量乳腺癌细胞系(HCC1954、BT-474、MDA-MB-231、BT-549)和胃癌细胞系(NCI-N87、KATOIII、Hs746T、MKN74、HFE145、SNU1、SNU620)中的HER2表达水平，进行免疫印迹实验。
每种细胞系培养7天，并收集培养基并离心以去除细胞(8000rpm，10分钟)。收集少量去除细胞的培养基，与5×样品缓冲液混合，并于100℃煮沸10分钟以诱导足够的蛋白质变性。随后，将制备的蛋白质样品加载到具有标记物的tricine SDS-PAGE凝胶上，并在130v电压下进行1小时30分钟的电泳。然后，将凝胶分离并放置在3M纸上，在凝胶顶部放置有PVDF膜，以及铺设另一张3M纸，浸入1×转移缓冲液中，并在100v电压下转移蛋白70分钟。加入5％Tris-缓冲盐水-Tween20(TBS-T，0.1％Tween20)并在室温下封闭膜1小时30分钟。将蛋白转移的PVDF膜用TBS-T洗涤两次，并浸入TBS-T中。以1∶1000的比例在TBS-T中稀释来制备抗HER2抗体。然后，将膜浸入抗体稀释溶液中，在室温下反应2小时。完成此过程后，将膜用TBS-T洗涤3次，每次10分钟。加入与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗，并在室温下反应1小时。再洗涤一次，然后用ECL试剂(增强型化学发光试剂，Intron)确认蛋白质条带。使用C-DiGit(LI-COR，USA)测量条带强度。
1-9.检测胃癌细胞系的直接细胞毒性
以与上述1-5相同的方式进行实验。
在96孔板中，以每孔2.0×104个细胞(200μl)的密度培养NCI-N87细胞、SNU1细胞、SNU620细胞、Hs746T细胞和KATOIII细胞，并且在每个细胞系中，分配了以下处理组，诸如IFNβ-R27T处理组、曲妥珠单抗处理组、曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白(trastuzumab-R27T)处理组和T-DM1处理组。次日，分别施用相应浓度的IFNβ(1、5、10ng/ml)、曲妥珠单抗(15、30、60、120ng/ml)或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白(20、40、80、160ng/ml)，并孵育72小时。然后，将10μl的EZ-Cytox(Daeil Biotech)加入每个孔，并在培养箱中进行反应3小时。使用SpectraMax iD3多模式酶标仪(Molecular Device)测量450nm处的吸光度，并进行比较。
1-10.检测乳腺癌细胞系的直接细胞毒性
以与上述1-5相同的方式进行实验。
在96孔板中，以每孔2.0×104(200μl)的密度分别培养BT-474细胞、SKBR3细胞、HCC1954细胞、MDA-MB-453细胞、MDA-MB-231细胞和BT549细胞，并针对每种细胞系，分配了以下处理组，诸如IFNβ处理、曲妥珠单抗处理和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白(曲妥珠单抗-R27T)处理。次日，施用相应浓度的IFNβ(1、5、10ng/ml)、曲妥珠单抗(15、30、60、120ng/ml)或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白(20、40、80、160ng/ml)，并孵育72小时。然后，将10μl的EZ-Cytox(Daeil Biotech)加入每个孔，并在培养箱中进行反应3小时。使用SpectraMax iD3多模式酶标仪(Molecular Device)测量450nm处的吸光度，并进行比较。
1-11.检测胃癌细胞系的非直接细胞毒性
在96孔板中，将各个N87细胞、KATOIII细胞、Hs746T细胞或MKN74细胞分为IFNβ处理组、曲妥珠单抗处理组或曲妥珠单抗IFNβ突变蛋白(曲妥珠单抗-R27T)处理组，并以每孔1.0×104个细胞(200μl)的浓度培养。次日，将外周血单个核细胞(PBMC)(Zenbio)以1:1或1:2的比例加入癌细胞，分别将IFNβ(100ng/ml)、曲妥珠单抗(100、350ng/ml)或曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白(100、350ng/ml)以相应浓度处理，并培养3天。然后，将10μl的EZ-Cytox(Daeil Biotech)加入每个孔，并在培养箱中进行反应3小时。使用SpectraMax iD3多模式酶标仪(Molecular Device)测量450nm处的吸光度，并进行比较。
2.结果
2-1.曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白融合蛋白的表达与纯化
在相同条件下使用表达曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白和曲妥珠单抗的细胞系进行蛋白质表达和纯化实验。对于表达条件，在37℃和5％CO2的条件下培养CHO-S细胞系10天。使用Cedex-bio(Roche)测量存在于细胞培养基中的表达的融合蛋白的浓度，并通过应用AKTA仪器系统和蛋白A珠的亲和层析纯化融合蛋白。之后，使用离子交换层析进行二次纯化。
如图1所示，证实了在与预期大小对应的位置上，观察到通过两步纯化过程产生的曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白的重链和轻链蛋白。
2-2.曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白融合蛋白的抗癌功效
WST试验用于分析融合蛋白的直接细胞毒性作用和通过免疫激活的间接抗癌功效。
参见图2，曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白针对NCI-N87细胞表现出直接细胞毒性，然而，曲妥珠单抗与细胞毒性无关。这表明曲妥珠单抗阻断信号转导不会对细胞造成显著的损害或毒性。
参见图3，曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白通过免疫细胞激活在NCI-N87细胞中显示出细胞毒性，并且与曲妥珠单抗相比对癌细胞显示出甚至更大的细胞毒性。
2-3.通过曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白靶向HER2
为了测量与HER2的结合能力，进行流式细胞技术分析。
参见图4，证实了曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白在HER2高表达水平的细胞系(NCI-N87)中具有相同的HER2结合能力。同样地，观察到曲妥珠单抗和曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白即使在HER2低表达水平的细胞系(MCF-7、MDA-MB-231)中也具有相当的HER2结合能力。这些结果表明，曲妥珠单抗即使与IFNβ突变蛋白融合，它的HER2结合能力也没有变化。
2-4.分析癌细胞系中的内源性HER2表达水平
进行免疫印迹实验，以比较乳腺癌细胞系和胃癌细胞系中HER2表达水平。比较乳腺癌细胞系HCC1954、BT-474、MDA-MB-231、BT-549和胃癌细胞系NCI-N87、KATOIII、Hs746T、MKN74、HFE145、SNU1和SNU620的HER2表达水平，并将其分成三组。
如图5所示，HER2低表达组包括乳腺癌细胞系中的MDA-MB231细胞和BT-549细胞，以及胃癌细胞系中的HS746T细胞和KATOIII细胞。HER2适中表达组包括MDA-MB-453乳腺癌细胞，以及SNU1和SNU620胃癌细胞。乳腺癌细胞系中的BT-474细胞和HCC1954细胞，以及胃癌细胞中的NCI-N87细胞属于HER2高表达组。
2-5.取决于乳腺癌细胞系和胃癌细胞系中的HER2表达水平的直接细胞毒性效果
通过WST测定法，在显示HER2高表达水平的NCI-N87细胞、HER2适中表达水平的SNU1细胞和SNU620细胞以及HER2低表达水平的Hs746T细胞和KATOIII细胞中测量融合蛋白的直接细胞毒性效果。
如图6a和图6b所示，曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白针对具有HER2适中表达水平的细胞和低表达水平的胃癌细胞显示出直接细胞毒性效果，而曲妥珠单抗没有显示出任何细胞毒性效果。
此外，如图7a和图7b所示，曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白针对具有HER2适中表达水平的细胞和低表达水平的乳腺癌细胞显示出直接细胞毒性效果。
2-6.取决于胃癌细胞系中HER2表达水平的间接细胞毒性作用
将HER2高表达的NCI-N87细胞或HER2低表达的Hs746T细胞与PBMC共培养，以比较PBMC介导的细胞毒性作用。测量了通过免疫激活的间接抗癌功效。
如图8a和图8b所示，曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白针对NCI-N87细胞以及具有HER2低表达水平的Hs746T细胞表现出通过免疫细胞激活的细胞毒性功效，证明与曲妥珠单抗相比，它具有更好的癌细胞毒性。
因此，可以理解到，曲妥珠单抗-IFNβ突变蛋白即使在HER2表达水平相对较低时也对HER2阳性癌症发挥治疗作用，相反曲妥珠单抗仅在HER2表达水平非常高时才有效。
序列表
<110> 基因制药株式会社
<120> 包含干扰素-β或其变体的免疫细胞因子用于治疗人表皮生长因子受体2阳性癌症的用途
<130> OP21-0148/PCT/CN
<150> KR 10-2019-0101351
<151> 2019-08-19
<150> PCT/KR 2020/011030
<151> 2020-08-19
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of interferon beta mutein
<400> 1
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 2
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polynucleotide sequence of interferon beta mutein
<400> 2
atgtcctaca acctgctggg cttcctgcag cggtcctcca acttccagtg ccagaaactg 60
ctgtggcagc tgaatggcac cctggaatac tgcctgaagg accggatgaa cttcgacatc 120
cccgaggaaa tcaagcagct gcagcagttc cagaaagagg acgccgctct gaccatctac 180
gagatgctgc agaacatctt cgccatcttc cggcaggact cctcctccac cggctggaac 240
gagacaatcg tggaaaatct gctggccaac gtgtaccacc agatcaacca cctgaaaacc 300
gtgctggaag agaagctgga aaaagaggac ttcacccggg gcaagctgat gtcctccctg 360
cacctgaagc ggtactacgg ccggatcctg cactacctga aggccaaaga atactcccac 420
tgcgcctgga ccatcgtgcg ggtggaaatc ctgcggaact tctactttat caaccggctg 480
accggctacc tgaggaactg a 501
<210> 3
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Trastuzumab heavy chain
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 4
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of Trastuzumab light chain
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 5
<211> 631
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of interferon beta mutein-Trastuzumab heavy
chain
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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340 345 350
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355 360 365
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Leu Glu Tyr Cys
485 490 495
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu
500 505 510
Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu
515 520 525
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595 600 605
Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg
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Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
625 630

Claims (14)

1.一种用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含重组蛋白作为活性组分，所述重组蛋白包含干扰素-β和直接地或间接地共价连接至所述干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述干扰素-β是SEQ ID NO：1的干扰素-β变体，其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗体或其片段为曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述重组蛋白是由所述干扰素-β和所述抗体或其片段通过肽接头连接而成的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症为乳腺癌或胃癌。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述癌症的HER2表达水平为IHC 1+，或者IHC 2+并且FISH为阴性。
7.重组蛋白用于制备用于HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的治疗剂的用途，所述重组蛋白包含干扰素-β和直接地或间接地共价连接至所述干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段。
8.一种治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物蛋白包含干扰素-β和直接地或间接地共价连接至所述干扰素-β的HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
9.一种用于预防或治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的药物组合物，其包含干扰素-β和HER2靶向抗体或其片段作为活性组分。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述干扰素-β是SEQ ID NO：1的干扰素-β变体，其中第27个氨基酸残基被苏氨酸取代。
11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述干扰素-β和所述HER2靶向抗体或其片段配制成单一组合物或分开的组合物。
12.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述干扰素-β和所述HER2靶向抗体或其片段同时施用、分别施用或依次施用。
13.组合物用于制备用于HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的治疗剂的用途，所述组合物包含干扰素-β和HER2靶向抗体或其片段。
14.一种治疗HER2表达水平为IHC 1+或更高的癌症的方法，包括向有此需要的对象施用有效量的组合物，所述组合物包含干扰素-β和HER2靶向抗体或其片段。
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