CN114540343A - 纯化方法 - Google Patents
纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114540343A CN114540343A CN202210134209.1A CN202210134209A CN114540343A CN 114540343 A CN114540343 A CN 114540343A CN 202210134209 A CN202210134209 A CN 202210134209A CN 114540343 A CN114540343 A CN 114540343A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- filter
- porous region
- nucleic acid
- sample
- pore size
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 151
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 255
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 211
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 211
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 163
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 146
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 107
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 62
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 59
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 claims description 45
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 39
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 39
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 26
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 23
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 14
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000002657 fibrous material Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 239000005368 silicate glass Substances 0.000 claims description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 159
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 93
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 77
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 67
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 52
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 40
- 239000000463 material Substances 0.000 description 38
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 33
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 29
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 22
- -1 lithium salt Chemical class 0.000 description 22
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 21
- 239000002585 base Substances 0.000 description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 16
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 13
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 11
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 10
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 9
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 9
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 8
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical group [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 229910003002 lithium salt Inorganic materials 0.000 description 7
- 159000000002 lithium salts Chemical class 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 6
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 3
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002459 porosimetry Methods 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000010754 BS 2869 Class F Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000815 hypotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910001507 metal halide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000005309 metal halides Chemical class 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 150000003385 sodium Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
- B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
- B01D61/147—Microfiltration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D21/00—Separation of suspended solid particles from liquids by sedimentation
- B01D21/26—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force
- B01D21/262—Separation of sediment aided by centrifugal force or centripetal force by using a centrifuge
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D35/00—Filtering devices having features not specifically covered by groups B01D24/00 - B01D33/00, or for applications not specifically covered by groups B01D24/00 - B01D33/00; Auxiliary devices for filtration; Filter housing constructions
- B01D35/02—Filters adapted for location in special places, e.g. pipe-lines, pumps, stop-cocks
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
- B01D69/02—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor characterised by their properties
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
- B01D71/02—Inorganic material
- B01D71/04—Glass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
- B01D2325/02—Details relating to pores or porosity of the membranes
- B01D2325/0283—Pore size
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
- B01D2325/04—Characteristic thickness
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2523/00—Reactions characterised by treatment of reaction samples
- C12Q2523/30—Characterised by physical treatment
- C12Q2523/308—Adsorption or desorption
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Mechanical Treatment Of Semiconductor (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
描述了从样品分离核酸的滤器和从样品分离并纯化核酸的方法。滤器具有第一多孔区域和第二多孔区域。第一多孔区域设置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第一多孔区域具有大于第二多孔区域的标称孔径。
Description
本申请是申请日为2020年2月14日，中国申请号202080014339.0，发明名称为“纯化方法”的分案申请。
发明领域
本发明涉及从样品分离核酸的滤器。本发明还涉及从样品分离核酸的方法、纯化从样品分离的核酸的方法和从样品分离核酸的试剂盒。
背景
分离包含来自生物样品(例如细胞)的DNA的纯的、完好核酸在众多领域至关重要。
例如，来自患者的含细胞临床样品可以经历某种程序(包括细胞裂解步骤)以分离包含DNA的核酸，后者随后经本领域熟知的程序分析。这种分析可以例如旨在鉴定来自特定微生物(例如细菌)的DNA(以确定患者是否已经被该微生物感染)或可以例如旨在确定患者的DNA是否具有一个或多个造成某医学病状的点突变。
已知的DNA分离方法通常至少包括以下步骤：
(a)用缓冲的裂解组合物裂解含细胞的样品；
(b)将(a)的样品与浓盐溶液混合；
(c)来自(b)的样品与醇(例如甲醇、乙醇或异丙醇)混合；
(d)使所得到的混合物与固相支持物(即滤器)接触，以固定来自已裂解材料的DNA；
(e)用含有醇的洗涤液洗涤支持物；并且
(f)洗脱DNA。
这类已知的分离方法经常导致提取相对短的DNA片段，例如小于50,000碱基对(bp)的片段。这些片段随后可以通过短读段测序技术(例如Illumina销售的那些技术)或如Oxford Nanopore Technologies(ONT)提供的长读段测序技术来测序，例如MinION、GridION X5、PromethION上运行的流动小室等或Sequel System上运行的PacificBiosciences(Pacbio)单分子实时(SMRT)。短读段测序技术适于相对短的DNA片段(如100至500bp)的代码测序。这些序列随后用来基于重叠序列片段构建基因组。但是，在许多情况下这种类型的技术不能用来破译重复序列或重组染色体区段的代码。该技术经常还可以用来确定比对的序列是否源自相同的链(染色体)或细胞，或构建的基因组是否另由来自不同链和细胞的小读段构成。
长读段测序技术可以读取数十个或成千上万个碱基长的序列并且可以用来证明序列衍生自同一条链。在一个有临床意义的实例中，长读段测序法用来成功地定位BCR-ABL1融合基因转录物上的突变。这些类型的突变使慢性髓细胞性白血病(CML)患者抵抗酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法，并且因此重要的是表征、筛选和研究那些导致耐药的突变。归因于基因靶上使用约1,600bp的长读段(比短读段技术的100至500bp读段大得多)，已经可能鉴定相同链上存在的突变并且将它们与其他链或其他转录物同工型上存在的随机改变区分。这还提供关于CML突变克隆性分布的信息。这些结果可以训练向患者施用哪种疗法的决策(Cavalier等人,2015)。
许多长读段技术需要平均100千碱基(kb)或较长的长DNA。甚至随后，长读段技术倾向于偏好读取较小的DNA片段(10kb以下)，若这类片段存在于含较长片段的样品中。这可能导致测序错误及序列作图难题。偏好短DNA片段还可能使得瞄准或读取复杂基因组(如人类基因组)的基因更困难。
然而，可能难以获得1)含有适于测序的长DNA片段和2)不含有或具有减少量的较短DNA片段的优质DNA。
影响给定方法提供含具体核酸的给定样品的能力的因素包括固相支持物(即滤器)保留所需核酸的能力，并且还包括一旦捕获，使用者从固相支持物/滤器取下(即通过从滤器/柱洗脱)相关的已捕获核酸的能力。
一些核酸分离方法使用离心力分离核酸和/或移除杂质(离心法)。离心法可能提供更快的纯化时间，原因在于离心力；然而，这类方法一般不用于分离长链核酸。这是因为对于提取产率和纯度适合测序或其他下游分析的核酸所必备的离心力具有使核酸碎裂的倾向性，从而降低链长度。用于分离核酸的其他方法分离利用阴离子交换树脂和重力分离核酸和/或移除杂质。尽管这比离心法更温和，但处理可能花费明显量的时间并且因而不是特别易于掌握的。这阻碍了即时医疗场景下使用这类方法的能力。另外，阴离子交换树脂分离同一混合物内部的短核酸片段和长核酸片段。
避免离心步骤的用于DNA提取的替代性方法包括磁珠或磁性平整表面技术。采用这类技术，使用者必须在吸出液体时极其小心不扰动珠沉淀物。因此，该提取方案对使用者要求高并且不能多路化。另外，磁珠和磁性平整表面技术在DNA提取过程期间不提供大小排阻能力。
因此需要从样品提取核酸的新滤器和方法，它们提供更高产率和/或更高纯度的较长核酸片段和/或提供较长/较短片段比率更高的样品。还需要以更快速和易于掌握的方法改进提供较长的核酸片段。
本发明寻求解决上文提到的一个或多个问题。
发明简述
在其最一般的情况下，本公开内容提出一种从样品分离核酸的新滤器，所述滤器在提供含有更高比率较长/较短核酸片段的产物样品和/或增加的核酸片段平均碱基对长度方面具有特殊实用性。本发明的滤器在从样品分离核酸的方法中具有广泛适用性并且本身可以用于离心纯化或常规重力纯化方法中，但是特别有利地应用于离心纯化方法中。本上下文中的滤器在本领域内并且根据本发明的方法/用途用于捕获/保留来自与滤器接触(通常使其穿过滤器)的流体样品中的所需核酸，同时允许制剂的所不需组分(其可以包含所不需的核酸片段或其他所不需的样品组分，例如其他生物产物)穿过滤器处于滤液中。在这个方面，本发明能够提供较长/较短核酸片段的改进分离。本公开内容还提出用于分离核酸的新方法。这些方法对上文描述的本发明滤器以及本领域使用的常规滤器具有总体适用性。本发明的新方法尤其能够提供纯化核酸(尤其链长度较长的那些纯化核酸)的一个或多个增加的回收产率、增加的较长/较短核酸链比率和已分离核酸的增加的平均碱基对长度。
本公开因此提供本发明的以下方面。在发明部分的发明详细中进一步描述这些方面和这些方面的一般实施方案及具体实施方案。
根据本发明的第一方面，提供一种从样品分离核酸的滤器，滤器至少包括第一多孔区域和第二多孔区域，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中第一多孔区域具有大于第二多孔区域的标称孔径。
根据本发明的第二方面，提供包含根据第一方面的滤器的核酸提取柱。
根据本发明的第三方面，提供一种使用根据本发明第一方面的滤器从样品分离核酸的方法。换句话说，本发明还提供根据本发明第一方面的滤器在从样品分离核酸的方法中的用途。在实施方案中，该方法包括：
(i)使包含核酸的样品与醇和盐接触(任选地通过使样品与含有醇和盐的溶液接触)(即以提供含有核酸、醇和盐的组合物)，盐任选地作为盐溶液以0.05至10M的浓度提供；并且
(ii)使根据本发明第一方面的滤器与步骤(i)的所得组合物接触，以提供具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iii)优选地用包含醇的洗涤液处理具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iv)从滤器洗脱核酸的至少一部分。
根据本发明的第四方面，提供一种从样品分离核酸的方法，所述方法包括：
(i)使包含核酸的样品与醇和盐接触(任选地包含醇和盐的溶液)(即以提供含有核酸、醇和盐的组合物)，盐任选地作为盐溶液以0.05至10M的浓度提供；并且
(ii)使滤器与包含在步骤(i)后获得的核酸的组合物接触，以提供具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iii)优选地，用包含醇的洗涤液处理具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iv)从滤器洗脱核酸的至少一部分，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于70至90℃的温度温育滤器。
根据本发明的第五方面，提供一种纯化从样品分离的核酸的方法，所述方法包括：
(i)使核酸与醇和盐接触(任选地其中醇和盐在溶液中提供)(即以提供含有核酸、醇和盐的组合物)，盐任选地以0.05至10M的浓度提供；
(ii)使滤器与包含在步骤(i)后获得的核酸的组合物接触，以提供具有与其结合的核酸的滤器；
(iii)优选地，用包含醇的洗涤液处理具有与其结合的核酸的滤器(醇溶液任选地进一步含有盐如盐锂，任选地以0.05M-10M的浓度含盐)；并且
(iv)实施从滤器第一次洗脱核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于70至90℃的温度温育滤器，随后对滤器离心；并且
(v)实施从滤器的第二次洗脱核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于不超过90℃(例如从10-90℃)的温度温育滤器，随后对滤器离心。
根据本发明的另一个方面，提供从样品分离核酸的试剂盒，试剂盒包含：
(i)根据第一方面的滤器；
(ii)盐(优选地离液剂，例如胍盐)，
(iii)洗剂，其任选地包含锂盐；
(iv)任选地，洗脱缓冲液；和
任选地裂解剂。
发明详述
根据本发明的第一方面，提供一种从样品分离核酸的滤器，所述滤器至少包括第一多孔区域和第二多孔区域，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中第一多孔区域具有大于第二多孔区域的标称孔径。
发明人已经惊讶地发现，滤器中多孔区域的这种组合导致滤器上较长核酸片段的保留相对于较短片段而言明显改进。本发明的实施方案能够提供已分离总核酸的增加的产率、已分离核酸的增加的平均碱基对长度和/或提供样品中过滤过程后可以从滤器洗脱的较长/较短核酸的增加的比率。
核酸可以是任何形式的核酸(如RNA和/或DNA)和优选地是DNA。在实施方案中，滤器能够相对于长度较短的核酸，例如相对于长度小于10kb的片段，增加10kb或较大(如长度10kb至165.5千碱基(kb))的核酸片段的保留。在实施方案中，本发明的滤器可以能够展示相对于较短片段，例如相对于长度小于40kb的片段，增加40kb或较大(如长度40kb至165.5kb)的核酸片段的保留。
相对于非本发明的滤器，滤器能够增加具有增加的平均碱基对长度的核酸片段的保留。
尽管具有较小标称孔径的多孔区域理解成有益于分离任何长度的核酸片段，但所得的分离的核酸片段具有多种长度，包括较小的片段和较长的片段。分离的核酸中的较小片段可能干扰其中想要较大片段的下游加工，如测序。
由于包含较小孔径的多孔区域有益于保留全部尺寸的片段，本领域普通技术人员将期望，包含了包含较小标称孔径的多孔区域的本发明滤器同等地保留并且因此提供多种长度的分离的核酸片段。因此令人惊讶的是，本发明的滤器提供已分离核酸的增加的平均碱基对长度和/或提供分离的样品中增加的较长/较短核酸比率。
还认定较小的标称孔径对分离较长核酸片段不太有效，可能归因于孔被生物样品中的其他分子(如可能未充分变性的蛋白质、脂质和/或糖)堵塞。这可以导致包含较小标称孔的多孔区域撕裂，这可以导致保留在多孔区域上的核酸片段丢失。这可以另外地或备选地导致多孔区域被其他分子覆盖，其中所述其他分子可能消除较长核酸片段与之结合的多孔区域的表面区域。
因此，特别令人惊讶的是，具有较大标称孔径的第一多孔区域和在第一区域下游具有较小标称孔径的第二多孔区域的组合提供以下至少一者：已分离总核酸的增加的产率、已分离核酸的增加的平均碱基对长度和分离的样品中增加的较长/较短核酸比率。
尽管传统上认为具有较大标称孔径的多孔区域更有益于分离长核酸片段，但发明人已经观察到，与具有较小孔径的多孔区域相比，具有较大孔径的多孔区域倾向于显示更弱的结构完整性并且因而更倾向于破损、泄漏和丢失保留的核酸片段。本领域普通技术人员将因此理解，就用于这类纯化方法中包含多孔区域的核酸滤器而言，相对于核酸分离提供较大孔的益处受结构完整性降低的不利影响，这意味可能影响滤器保留的核酸的总产率和针对较长片段的选择性。
发明人先前已经发现，相对于对比滤器，本发明的滤器提供改进的结构完整性。本发明的滤器与对比滤器相同，例外在于本发明滤器的第二区域相对于第一区域具有较小的孔。这种改进的完整性使本发明的滤器在实践中更易操作及使用。另外，本发明的滤器不太倾向于撕裂。
通过提供与孔径较小的第二(下游)区域的滤器组合的具有孔径较大的第一(上游)区域的滤器，发明人已经惊讶地发现，就提供含有较长链片段的洗脱批次而言，例如依据这类洗脱批次中的产率和/或长/短片段比率，观察到改进的结果。
通过提供具有孔径较大的第一(上游)区域的滤器，所述滤器与相对于第一(上游)区域而言孔径较小的第二(下游)区域组合，进一步与相对于第二(下游)区域而言孔径较大的第三(第一区域和第二区域下游)区域组合，发明人还已经惊讶地发现，就提供含有较长链片段的洗脱批次而言，例如依据这类洗脱批次中的产率和/或长/短片段比率，观察到特别改进的结果。第三(第一区域和第二区域的下游)区域可以具有与第一(上游)区域基本上相等(例如相同)的孔径。
不希望受理论约束，本发明人认为，依据本发明滤器观察到的改进原因在于第二多孔区域向第一区域和/或第三区域提供额外的结构完整性。这确保与完整性无额外改进的对比滤器相比，第一多孔区域和/或第三多孔区域更好地能够保留其结合较长核酸片段的功能能力。
令人惊讶地，本发明人还已经发现，多孔区域的顺序影响分离的核酸片段的产率、比率和平均碱基对长度；第一多孔区域(具有较大标称孔径)布置成使用时由样品在第二多孔区域(具有较小标称孔径)之前接触，这提供已分离总核酸的改进产率。获得的长核酸/短核酸比率以及平均碱基对长度也改进。这是令人惊讶的，因为本领域普通技术人员的倾向性将认为，孔较小的区域可能不利地影响产率和/或滤器对较长核酸的选择性，但发明人已经发现这并非如此。
不希望受理论约束，本发明人认为较短的核酸片段比较长的核酸片段更快地结合于多孔区域。通过首先布置孔径较大的多孔区域(从而这个区域由样品在样品穿过第二区域之前接触)，可以相对于短核酸片段优先地捕获较大的核酸片段，较短的核酸片段反而更可能穿过滤器装置而无结合。
将可以理解，除非另外说明，否则本文所述的特征(包括任何后续权利要求和附图)中任一者可以与处于任何组合的以下方面的任一者组合。
如本领域普通技术人员将理解，标称孔径是本领域的已知术语。标称孔径的值表示多孔区域滤除具有该大小值或较大值的粒子的能力。例如，0.20μm标称孔径用来表示具有该孔径的多孔区域可以阻止0.20μm或较大的粒子穿过多孔区域。一般，标称孔径具有最小百分比，即标称孔径涉及多孔区域滤除最小百分比具有该大小值或较大值的粒子的能力。在实施方案中，标称孔径可以具有至少50，至少60，至少70，至少80或至少90％的最小百分比，即具有特定标称孔径的多孔区域滤除的具备给定大小值或更大值的粒子的百分比。在实施方案中，标称孔径可以具有至少95％的最小百分比。在实施方案中，标称孔径可以具有至少98％的最小百分比(即多孔区域能够分别滤除至少95％或至少98％具有给定粒度的粒子)。
多种方法适于确定多孔区域的标称孔径。在实施方案中，用于确定多孔区域的标称孔径的方法可以包括孔隙率测定法。这种方法基于液体由表面张力和毛细力滞留在多孔区域的孔中。可以使用对抗液体表面张力的相反力迫使液体出孔所要求的最小压力用作孔直径的度量。该方法通常在真空内进行，例如在孔度计中进行，以压缩气体形式施加的力渐增。众多孔度计是市售的并且从而为本领域普通技术人员轻易可及。
通常，使用非润湿性液体如汞作为孔隙率测定法中的液体。
Washburn方程通常用来测定孔隙率测定法中的力平衡。该方程是：
PL＝液体的压力
PG＝气体的压力
σ＝液体的表面张力
θ＝液体的接触角
Dp＝孔直径
汞与大部分固体接触角是大约140°，而汞在20℃真空下的表面张力是480mN/m。基于这些值，方程变成：
其他确定孔径的合适试验包括使用扫描电子显微术视验。因此，在实施方案中，用于确定多孔区域的标称孔径的方法可以包括扫描电子显微术。在这类试验中，在扫描电子显微镜(SEM)下查看多孔区域的至少一部分，以获得该部分的SEM图像。随后可以定量地分析这些图像，例如使用成像软件如ImageJ(NIH,US)来测量孔径。随后可以计算平均或中位孔径。从这个孔径中，本领域普通技术人员随后可以确定什么尺寸的粒子将能够穿过这个孔径，并因此穿过标称孔径。
在实施方案中，粒子挑战法可以用来测定多孔区域的标称孔径。在这种方法中，将大小已知的粒子(经常称作“挑战粒子”)施加至多孔区域。随后在多孔区域上游和下游测量粒度和粒子丰度。取决于粒子的大小和它是否经检测标志(例如荧光标记)标记，测量可以借助于显微术、自动化粒子计数器、浊度分析流式细胞术、亚微米粒子计数器或其他基于光散射的技术。
在实施方案中，第一区域可以前置有又一多孔区域，所述的又一多孔区域可以具有不同或基本上相等的标称孔径，例如与第一多孔区域的标称孔径相同。在其中又一前置性多孔区域具有与第一多孔区域的标称孔径基本上相等(例如相同)的标称孔径的实施方案中，前置性多孔区域可以理解是第一多孔区域，例如第一多孔区域的部分。在一些实施方案中，第一区域未前置有又一多孔区域(即第一多孔区域是使用时接触核酸组合物的滤器第一多孔区域)。
因此，在一些实施方案中，滤器装置包含多个第一多孔区域。将可以理解在这类实施方案中，多个第一多孔区域将按流体流动方向彼此相邻。已经发现这种排列特别有益于分离改进比率的较长/较短核酸片段(参见，例如图1C)。
在实施方案中，又一前置性多孔区域可以具有小于第一多孔区域标称孔径的标称孔径。任选地，又一前置性多孔区域可以具有与第二多孔区域标称孔径基本上相等(例如相同)的标称孔径。
在实施方案中，滤器可以包含又一多孔区域(例如第三多孔区域)，其设置成使用时由样品在第二多孔区域之后(例如在第一多孔区域和第二多孔区域的下游)接触。将可以理解，第三多孔区域可以具有与第二多孔区域基本上相等(例如相同)或不同的标称孔径。
第三多孔区域可以具有与第一多孔区域基本上相等(例如相同)或不同的标称孔径。
在实施方案中，第三多孔区域可以具有大于第二多孔区域的标称孔径，任选地与第一多孔区域标称孔径基本上相等(例如相同)的标称孔径。发明人已经发现，具有基本上相等(例如相同)标称孔径的第三和第一多孔区域的排列特别有益于分离增加比率的较长/较短核酸片段和已分离核酸片段的增加的平均碱基对长度。
在实施方案中，第一多孔区域的标称孔径可以是至少2μm。在实施方案中，第一多孔区域的标称孔径可以不多于3μm。任选地，第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm。发明人已经发现这种标称孔径范围有利于保留较长的核酸片段，例如40kb或较大(如40至165.5kb)的核酸片段。在实施方案中，第一区域的标称孔径可以是2.5至2.8μm，任选地约2.7μm，例如2.7μm。
第二多孔区域的标称孔径可以是至少0.5μm。在实施方案中，第二多孔区域的标称孔径可以不多于1.8μm。任选地，第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm。在实施方案中，第二多孔区域的标称孔径可以是0.5μm至1.3μm。
在实施方案中，第二多孔区域的标称孔径可以是0.6至1μm。第二多孔区域的标称孔径可以是约0.7μm，例如可以是0.7μm。
在一些实施方案中，第一多孔区域的标称孔径是至少2μm(并且任选地不多于3μm)并且第二多孔区域的标称孔径不多于1.8μm，例如任选地是0.5至1.8μm。例如，在一些实施方案中，第一区域的标称孔径是2.5至2.8μm，优选地约2.7μm，并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，任选地0.6至1μm，优选地约0.7μm。
在实施方案中，第三多孔区域的标称孔径可以是至少2μm。在实施方案中，第三多孔区域的标称孔径可以不多于3μm。任选地，第三多孔区域的标称孔径可以是2μm至3μm。发明人已经发现这种标称孔径范围有利于保留较长的核酸片段，例如40kb或较大(如40至165.5kb)的核酸片段。在实施方案中，第三多孔区域的标称孔径可以是2.5至2.8μm，任选地约2.7μm，例如2.7μm。
在一些实施方案中，第一多孔区域的标称孔径是至少2μm(并且任选地不多于3μm)，第二多孔区域的标称孔径不多于1.8μm(例如任选地是0.5至1.8μm)，并且第三多孔区域的标称孔径是至少2μm(并且任选地不多于3μm)。例如，在一些实施方案中，第一区域的标称孔径是2.5至2.8μm(优选地约2.7μm)，第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm(任选地0.6至1μm，优选地约0.7μm)，并且第三多孔区域的标称孔径是2.5至2.8μm(优选地约2.7μm)。
本发明的多种实施方案包括约0.7μm(例如0.7μm)的第二区域标称孔径和约2.7μm(例如2.7μm)的第一区域标称孔径。本发明的多种实施方案包括约0.7μm(例如0.7μm)的第二区域标称孔径和约2.7μm(例如2.7μm)的第一和第三区域标称孔径。
本文所述的滤器可以包含技术人员已知的可用于保留核酸的任何合适材料。已知用于这个目的的合适材料包括硅酸盐。因此，在实施方案中，第一和第二多孔区域至少一者可以包含硅酸盐或二氧化硅基材料(例如由其组成)。在包括第三和/或又一多孔区域的实施方案中，第三和/或又一多孔区域可以包含硅酸盐或二氧化硅基材料(例如由其组成)。在合适的实施方案中，全部相应的多孔区域均可以包含硅酸盐或二氧化硅基材料(例如由其组成)。优选的硅酸盐或二氧化硅基材料包括硅酸盐玻璃，例如硼硅酸盐或石英玻璃，最优选地硼硅酸盐玻璃。
本发明滤器中的孔可以由技术人员已知的众多方法提供。然而，孔通常提供作为已装填纤维材料(例如压制型纤维网片形式)的粒子之间形成的小孔。在实施方案中，滤器可以包含纤维材料(例如由其组成，或由之组成)，如前述段落提到的材料中任一者，例如硅酸盐玻璃纤维，例如硼硅酸盐玻璃纤维或石英玻璃纤维，优选地硼硅酸盐玻璃。从而，第一多孔区域和/或第二多孔区域可以由纤维材料形成，所述纤维材料任选地包含二氧化硅材料或二氧化硅基材料的纤维，如硅酸盐玻璃纤维，例如硼硅酸盐玻璃纤维或石英玻璃纤维(或由其组成)。在实施方案中，第一和第二多孔区域中至少一者可以包含硼硅酸盐玻璃纤维。第一多孔区域和第二多孔区域可以由相同或不同纤维材料，例如硼硅酸盐玻璃纤维或石英玻璃纤维，例如QM-A石英玻璃微纤维形成。在实施方案中，本发明滤器的相应多孔区域每者包含纤维材料(例如由其组成，或由之组成)，如前述段落提到的材料中任一者，例如硅酸盐玻璃纤维，例如硼硅酸盐玻璃纤维或石英玻璃纤维，优选地硼硅酸盐玻璃。
在包含第三和/或又一多孔区域的实施方案中，第三和/或又一多孔区域可以由纤维材料形成，所述纤维材料任选地包含二氧化硅材料或二氧化硅基材料的纤维，如硅酸盐玻璃纤维，例如硼硅酸盐玻璃纤维或石英玻璃纤维(或由其组成)。第三和/或又一多孔区域可以由与第二和/或第一多孔区域相同和或不同的纤维材料形成。
在实施方案中，滤器可以包含石英玻璃纤维，例如QM-A石英玻璃微纤维。
在实施方案中，第一和第二多孔区域每者可以包含多孔材料的膜或薄片。
按名称Whatman Glass Microfibre filters(GF)可获得的类型的滤器适用于本发明中。这类滤器的实例包括A、B、D和F级的GF滤器。A级滤器具有1.6μm的标称孔径。B级滤器具有1.0μm的标称孔径。D级滤器具有2.7μm的标称孔径。F级滤器具有0.7μm的标称孔径。GF滤器由硼硅酸盐玻璃纤维形成。在一些实施方案中，滤器至少包含D级和F级滤器。在一些实施方案中，滤器至少包含布置在两个D级滤器之间的F级滤器。在一些实施方案中，滤器由布置在两个D级滤器之间的F级滤器组成。技术人员将已知其他合适的滤器。
在实施方案中，如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度可以是1000μm至2000μm。在实施方案中，如按样品流动方向测量的滤器装置的最大厚度可以是1500μm至2000μm。在实施方案中，第一多孔区域可以至少是第二多孔区域厚度(相对于流体流动方向)的两倍。第一多孔区域可以具有500至600μm的最大厚度(相对于流体流动方向)。第二多孔区域可以具有250至480μm的最大厚度(相对于流体流动方向)。在实施方案中，第一多孔区域具有500至600μm的最大厚度(相对于流体流动方向)并且第二多孔区域具有250至480μm的最大厚度(相对于流体流动方向)。将可以理解，这类多孔区域一般将具有该区域宽度范围的均匀厚度(相对于流体流动方向)。这具有以下优点：确保穿过滤器的流体全部部分的流路的长度一致。
在实施方案中，第一区域可以前置有又一多孔区域，所述的又一多孔区域可以具有如按样品流动方向测量与第一多孔区域的厚度不同或基本上相等(例如相同)的厚度。在其中又一前置性多孔区域具有与如按样品流动方向测量的第一多孔区域厚度基本上相等(例如相同)的厚度的实施方案中，前置性多孔区域可以理解是第一多孔区域，例如第一多孔区域的部分。在实施方案中，前置性多孔区域和第一多孔区域各自具有500至600μm的最大厚度(相对于流体流动方向)。第二多孔区域可以具有250至480μm的最大厚度(相对于流体流动方向)。
在实施方案中，第三多孔区域可以具有500至600μm的最大厚度(相对于流体流动方向)。
依据厚度，除非另外规定为相反，否则这将理解为指多孔区域按流体流动方向的长度。
将可以理解，滤器一般可以至少包含两个对立面，第一个面布置成使用时由流体样品首先接触，此后，流体样品借助第二个面穿过滤器(其中至少一些样品保留在滤器上)。
第一多孔区域比第二个面更接近于第一个面。在实施方案中，第一个面可以包含第一多孔区域。在实施方案中，第二个面可以包含第二多孔区域。在另一方面，第二区域可以位于滤器的主体内部，从而第二个面可以包含与第二区域相比标称孔隙度不同的又一(例如第三)区域，例如它可以具有与第一多孔区域相同的孔隙度。在这类实施方案中，第二多孔区域位于第一和又一(例如第三)多孔区域之间。
第一多孔区域可以与相同滤器内部的第二区域成一体(例如用其形成)或与之连接。一般且便利地，第一多孔区域可以对应于具有给定(较大)标称孔径的不同滤器(即第一滤器)并且第二多孔区域可以对应于具有第二(较小)标称孔径的第二不同滤器，即其中第一滤器相对于经过装置的液体流动相对于第二滤器为上流，其中所述的第二滤器相对于经过装置的液体流动为下游。不同滤器可以结合在一起，或可以不结合在一起(例如它们可以完全处于可分开的接触中，例如相对于流体流动方向相互堆叠)。可以按相对于流体经滤器流动的堆叠布置，提供不同滤器或多孔区域的组合。对于重力柱，这通常将是竖直堆叠的布置，但对于一些装置，如离心装置，将可以理解，流体经滤器流动可以不是垂直的。在离心装置中流体流动的情况下，这种流动因施加的离心力而无需垂直，并且从而在这类布置中，堆叠在这种情况下无须在关系方面是垂直的，前提是第一滤器或区域相对于经过装置的液体流动相对于第二滤器或区域为上游，其中所述的第二滤器或区域相对于经过装置的液体流动为下游。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm，任选地不多于1500μm。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，第二区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)并且第一区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)，并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm，任选地不多于1500μm。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm，任选地不多于1500μm并且其中滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
滤器可以包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm。
在一些实施方案中，滤器包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)。
在一些实施方案中，滤器包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
滤器可以包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm。
在一些实施方案中，滤器包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm。
滤器可以包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm。
滤器可以包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm。
滤器可以包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含多个(例如2个)第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，并且如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm，滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
多个第一多孔区域可以包含两、三、四、五或六个第一多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)。在一些实施方案中，多个第一多孔区域包含两个第一多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)。
在一些实施方案中，滤器包含两个第一多孔区域和第二多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中每个第一多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)；每个第一多孔区域的厚度是500至600μm，第二多孔区域的厚度是250至480μm，前提是如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm，滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
滤器可以包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)。
滤器可以包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，其中如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm。
滤器可以包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，其中如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm。
滤器可以包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
滤器可以包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，其中如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1000μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
滤器可以包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是2μm至3μm并且第二多孔区域的标称孔径是0.5至1.8μm，如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，其中如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
在一些实施方案中，滤器包含第一多孔区域、第二多孔区域和第三多孔区域(或在具体的实施方案中由其组成)，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，并且第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，其中第一和第三多孔区域的标称孔径是约2.7μm(例如2.7μm)并且第二多孔区域的标称孔径是约0.7μm(例如0.7μm)，第一多孔区域的厚度是500至600μm，第二多孔区域的厚度是250至480μm并且第三多孔区域的厚度是500至600μm，前提是如按样品流过滤器的方向测量的滤器最大厚度是1500μm至2000μm并且滤器包含硅酸盐或二氧化硅基材料，任选地硼硅酸盐玻璃(优选地硼硅酸盐玻璃纤维)。
本发明的滤器特别适合用作核酸提取柱。便利地，如本领域技术人员已知，可以因此在核酸提取柱(例如，如专利申请号WO 2016/147004中所述的离心柱)中提供滤器装置。离心柱中的滤器优选地以至少一个包含硼硅酸盐纤维的薄板或膜的形式提供。
因此，根据本发明的第二方面，提供用于从样品分离核酸的核酸提取柱，所述核酸提取柱包括根据第一方面或本文所述的其任何实施方案的滤器。
一般，核酸提取柱处于适于插入微量离心管(例如Eppendorf管)的管形式。滤器可以形成柱的基部。在使用时，可以将样品添加至色谱柱，从而样品流过滤器和/或被其保留。流过滤器的任何样品随后可以由微量离心管保留。
将可以理解，核酸提取柱的本体(不包括滤器)可以由塑料形成。本领域普通技术人员可以构思其他合适的材料。
根据本发明的第三方面，提供一种使用根据本发明第一方面的滤器从样品分离核酸的方法。换句话说，本发明还提供根据本发明第一方面的滤器在从样品分离核酸的方法中的用途。在实施方案中，该方法包括：
(i)使包含核酸的样品(例如裂解的样品)与醇和盐接触(任选地包含醇和盐的溶液)(即以提供包含核酸、醇和盐的组合物)，盐任选地在溶液中以0.05至10M的浓度提供；并且
(ii)使本文中所述的本发明第一方面的滤器与包含在步骤(i)后获得的核酸的组合物接触，以提供具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iii)优选地，用包含醇和任选地盐的洗涤液处理具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iv)从滤器洗脱核酸的至少一部分。
该方法可以任选地还包括：(v)在步骤(iv)后实施从滤器第二次洗脱核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于不超过90℃的温度温育滤器，任选地随后对滤器离心。
上文方法提供了分离核酸片段的改进方法。具体地说，与不使用本发明滤器的相应方法相比，使用本发明滤器获得的分离的核酸通常更纯和更完好(参见实施例和相应的附图)。另外，总核酸片段的产率，和获得的长/短核酸片段的比率改进(例如图1C)。
在实施方案中，样品可以包含纯化的核酸。在其他实施方案中，样品可以包含或是裂解的生物样品。
在实施方案中，该方法包括步骤：裂解包含核酸的生物样品。可以在上文描述的接触步骤(i)之前或与上文的接触步骤(i)同时进行裂解。在上文步骤(i)之前进行时，裂解的生物样品随后可以形成步骤(i)中提到的样品。当裂解与步骤(i)同时进行时，包含所述核酸的所得组合物将是随后可以接受步骤(ii)处理的已裂解组合物。
技术人员将知晓根据本发明过滤之前样品中从生物材料释放核酸的合适裂解条件。一般，通过用盐、表面活性剂、螯合剂/或酶中一者或多者处理生物样品，引起裂解。因此可以将这类裂解组分在步骤(i)的醇和/或盐之前添加至含有核酸的样品，或可以作为相同混合物的部分作为步骤(i)的醇和/或盐添加。可以在提交组合物至该方法的步骤(i)之前净化裂解后形成的所得组合物(例如除去不想要的生物组分)。所产生的裂解组合物可以备选地在无任何净化下提交给步骤(i)(在这种情况时，所产生的组合物可以是向该方法的步骤(ii)直接提交的含有核酸的组合物)。如果裂解作为步骤(i)的部分进行，则将可以理解，所产生的裂解样品将是随后可以向该方法的步骤(ii)直接提交的裂解组合物。
在包括生物样品裂解步骤的实施方案中，裂解可以包括用水溶液裂解样品中的生物材料，以产生裂解的含水组合物以形成步骤(i)的样品。水溶液(用于裂解)可以包含表面活性剂。水溶液可以另外或备选包含蛋白酶，例如蛋白酶K和优选地螯合剂。在实施方案中，溶液可以含有盐。裂解步骤可以因此额外地或备选包括添加包含盐的水溶液。盐可以是无机盐或有机盐。盐可以例如是金属盐，如碱金属盐，例如锂盐。可以向相应的盐提供任何合适的反离子，如卤化物，例如金属卤化物，例如锂卤化物，优选地氯化锂。盐可以按溶液形式提供，例如按0.05至10M、如0.5至1.0M、例如约0.8M的溶液形式提供)。可以提供盐，从而在步骤(i)后获得的组合物中提供0.1M至0.5M，例如0.2M至0.3M，例如0.23M浓度。在实施方案中，水溶液可以包含醇。醇可以包括C1-3烷醇，例如乙醇或异丙醇。C1-3烷醇可以包含至少75％、任选地至少95％的乙醇或异丙醇。在实施方案中，水溶液可以包含盐，例如氯化锂。盐可以是氯化锂，其可以优选地在溶液中以约0.8M(例如0.8M)的浓度提供。
生物样品(例如细胞)可以彻底地与水溶液(例如通过抽吸)混合并且在环境温度持续合适的时间段实现裂解。15至25分钟(例如约20分钟)的时间段通常是合适的。在实施方案中，可以在40至60℃的温度实现裂解。例如在水溶液包含蛋白酶K的实施方案中，裂解可以在这个温度实现。裂解导致形成裂解的组合物。
可以离心裂解的组合物以形成沉淀物。沉淀物可以重悬于溶液中以形成步骤(i)的样品。
螯合剂，其最优选地是EDTA或其盐如碱金属(例如钠)盐，可以作为水溶液提供，例如其中溶液中EDTA或其盐的浓度是1至20mM/升，更优选地8至15毫摩尔/升，更优选地9至11毫摩尔/升和最优选地约10毫摩尔/升。优选地，螯合剂的量是这样的，从而所产生的包含核酸的组合物(例如随后在步骤(ii)中与滤器接触的组合物含有0.5-5mmol EDTA，如2-4mmol，例如约2.85mmol。
表面活性剂可以是非离子型表面活性剂，但是更优选地是阴离子表面活性剂，最优选地SDS(十二烷基硫酸钠)。水溶液可以包含0.1至1.5重量％，优选地约0.2至0.8重量％，最优选地约0.5重量％的量的表面活性剂。优选地，表面活性剂的量是这样的，使得所产生的包含核酸的组合物(例如随后在步骤(ii)中与滤器接触的组合物含有0.05-0.5％w/v表面活性剂(例如SDS)，如0.1-0.2％w/v表面活性剂(例如SDS)，例如约0.14％w/v)。
水溶液可以具有7至8的pH，但是在实施方案中不必然地在这个范围内的pH缓冲。因此，水溶液可以是未缓冲的组合物。
在某些实施方案中(例如裂解革兰氏阴性细菌)，可以在不用蛋白酶(例如蛋白酶K)处理细胞的情况下和无需加热步骤的情况下实现裂解。在其他实施方案中(例如处理组织如血液以裂解全血细胞)，可以在步骤(i)之前用蛋白酶(例如蛋白酶K)处理样品。在稍后的实施方案中，用蛋白酶(蛋白酶K)处理可以与用包含盐(例如锂盐)的裂解溶液处理同时有效。
在示例性裂解步骤中，使含有核酸的生物样品(例如细胞样品)与包含金属盐(优选地LiCl，更优选地浓度为约0.8M)、螯合剂(优选地SDS，如浓度约0.5％w/v)、酶(优选地蛋白酶，如蛋白酶K)和螯合剂(优选地EDTA，例如溶液中浓度为约10mM)的裂解溶液接触并且将组合物混合以裂解样品。随后可以任选地离心所得到的样品以从其他生物材料分离核酸。随后可以根据步骤(i)，使裂解后获得的含有核酸的样品与醇和盐接触。可以同时或依次地供应醇和盐。
在步骤(i)中，可以使醇和盐与核酸同时或依次地接触。例如，盐可以按盐溶液的形式添加，随后添加醇，或反之亦然。备选地，盐和醇可以作为相同组合物(例如溶液)内部的组分提供并且将组合物添加至核酸或反之亦然。如果进行裂解步骤，盐和醇可能在裂解步骤后已经存在，例如因为是裂解混合物的组分。
根据步骤(i)的盐可以是任何合适的无机或有机盐。盐可以包括(或在实施方案中可以是)离液剂。离液剂优选地包括或是胍盐(例如胍卤化物，例如氯化物，也称作盐酸胍或氯化胍，本文中它处称作“GuHCl”)。可以如此提供胍盐，从而在(步骤(i)后获得的)含有核酸、醇和盐的组合物中具有溶液中0.05至10M、优选地0.1至3M、优选地0.1至2M、更优选地0.5至0.9M和最优选地0.6至0.7M范围内的浓度，最优选地0.67M的浓度。以举例方式，盐(例如胍盐)可以作为具有下述浓度的溶液添加，其中一旦添加至含有核酸的样品，所述浓度就带来上述浓度。例如，盐(例如胍盐)可以作为1-5M(例如，约2M)溶液提供。这种盐一般作为如下文描述的醇溶液提供。
离液剂可以溶解于C1-3烷醇(例如乙醇或异丙醇)中。C1-3烷醇可以包含至少75％v/v、任选地至少95％v/v的乙醇或异丙醇。
为避免疑问，将理解对某百分比醇例如96％乙醇的提及指含有96％v/v乙醇(例如和直至4％v/v水)的含水液态组合物。
步骤(i)中提供的醇可以包含(或可以是)C1-3烷醇，例如异丙醇或乙醇。C1-3烷醇可以按如此量提供，从而从步骤(i)获得(即提交给步骤(ii))的包含核酸的组合物含有至少10％、至少20％、至少30％、或至少40％v/v醇。一般，步骤(i)中形成的组合物的醇含量不超过约60％v/v醇。在优选的实施方案中，步骤(i)中形成并提交给步骤(ii)的组合物中的醇浓度不超过约35％v/v，例如不超过约30％v/v。C1-3烷醇可以按如此量提供，从而从步骤(i)形成(即提交给步骤(ii))的包含核酸的组合物含有以体积计25至40％、任选地以体积计25至30％的醇。
在上文方法中，方法优选地(但不需要必然地)包含洗涤步骤(iii)。即，该方法包括步骤(i)、(ii)和(iv)并且优选地还包括洗涤步骤(iii)。技术人员将理解与若省略洗涤步骤相比，洗涤步骤(iii)将辅助提供更纯的核酸材料。因此合乎需要的是包括洗涤步骤(iii)。洗涤液一般将含有醇，所述醇可以是如上文所述的醇。在实施方案中，洗涤液可以进一步包含盐。盐优选地是锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍。用洗涤液处理意在移除杂质，以留下固定在滤器上的基本上纯的核酸。将滤器随后与液体分离，任选地通过离心分离。
盐可以在洗涤液中以0.05至小于10摩尔/升、优选地0.05至小于1摩尔/升、优选地0.1至0.9摩尔/升、更优选地0.6至0.9摩尔/升、甚至更优选地0.75至0.85摩尔/升和最优选地约0.8摩尔/升的浓度存在。在实施方案中，洗涤液可以按0.2至0.9M的浓度包含盐。
可以用多种洗涤液处理滤器。第一洗涤液可以包含醇和盐(例如锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍)，任选地以0.05至10M的浓度包含。将理解在每次洗涤后，可以将滤器与液体分离，任选地通过离心分离。
在包含第二洗涤液的实施方案中，第二洗涤液体可以含有醇。在实施方案中，第二洗涤液体可以包含醇和盐(例如锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍)并且这些组分可以按照与第一洗涤液不同的盐浓度提供。例如，如果第一洗涤液具有0.05至1M的盐浓度，则在实施方案中，第二洗涤可以按不是0.05至1M或低于或高于第一洗涤液的浓度实施。
醇可以包括C1-3烷醇，例如异丙醇或乙醇。C1-3烷醇可以是至少30％，至少50％，优选地至少70％v/v。在实施方案中，C1-3烷醇可以包含75％至100％v/v的乙醇。在实施方案中，C1-3烷醇可以包含90％v/v的乙醇。
本发明第三方面的方法可以用于从广泛类型的含核酸的生物起源样品分离核酸如DNA(特别地基因组DNA)。从中待分离核酸(例如DNA)的样品可以是或可以包括细胞、例如动物(包括哺乳动物)细胞、植物细胞、细菌细胞或酵母或其他真菌细胞。备选地，从中待分离核酸(例如DNA)的样品可以是或可以包括一个或多个病毒。从中待分离核酸(例如DNA)的细胞、病毒或其他含核酸的样品可以源自组织样品或体液如血液、痰、尿或CSF或已经存在于其中。样品可以是衍生自生物样品的分离的流体样品。例如，可以离心生物样品如细胞以形成细胞沉淀物。可以将所得到的沉淀物和/或上清液分离并重悬以形成用于本发明方法中的样品。在实施方案中，样品可以包含纯化的核酸。在其他实施方案中，样品可以包含来自如本文所述的含核酸的生物起源样品中的已裂解生物样品。
通过本发明方法获得的核酸，例如DNA，纯到足够用于通过本领域熟知技术进一步分析的目的。核酸，例如DNA，可以例如用于研究目的，或如要求，用于诊断医学病状。
将可以理解，在滤器与液体和/或溶液接触的情况下，液体和/或溶液可以流过滤器。可以例如通过离心法，如离心，或通过重力实现流动。随后可以在诸步骤之间从滤器分离液体和/或溶液。以这种方式，核酸可以保留在滤器上，同时剩余液体流过滤器，直至步骤(iv)为止，此时从滤器分离核酸。在流体流动期间，(最终待分离的)核酸变得与滤器装置结合并且大部分杂质(蛋白质等)穿过滤器处于随后可以收集并弃去的液体中。
对于从滤器洗脱核酸，这将理解指将结合于滤器的核酸转移到洗脱剂。如本领域普通技术人员将领会，洗脱剂指含有已分离核酸的溶液。因此，洗脱包含使滤器与洗脱缓冲液接触。
洗脱缓冲液可以包含缓冲的EDTA或其盐溶液(基本上由其组成或由其组成)。具体的合适洗脱溶液包含浓度约10mM的Tris-HCl和浓度约0.5mM的EDTA二钠盐二水合物，所述溶液具有8至9的pH。另一种合适的洗脱溶液可以包含DNA酶和无RNA酶水。
在实施方案中，步骤(iv)可以包括在室温至100℃的温度，任选地在65至90℃、任选地70至90℃的温度于洗脱缓冲液中温育滤器。不希望受理论约束，发明人认为，高于室温的温度改进所获得的DNA的长/短DNA比率和/或所获得DNA的产率。当使用70℃或之上的温度时，实施例显示特别有利的结果。在实施方案中，步骤(iv)可以包括在80℃的温度于洗脱缓冲液中温育滤器。在实施方案中，步骤(iv)可以包括在65℃的温度于洗脱缓冲液中温育滤器。在本发明的上下文中，室温将理解成10℃至20℃的温度。步骤(iv)中的温育可以持续30秒至2分钟、任选地1分钟的时间段。
可以通过离心，将核酸从滤器洗脱入洗脱缓冲液，从而离心力使核酸从滤器转移至洗脱缓冲液。随着洗脱缓冲液流过滤器以捕获核酸，这种洗脱缓冲液随后形成洗脱物。
在实施方案中，可以通过两个离心步骤，将核酸从滤器洗脱入洗脱缓冲液。在这类实施方案中，将可以理解，施加洗脱缓冲液至滤器，并且随后流过两次。一旦离心，洗脱液可以包含第二洗脱缓冲液(并且因此含有分离的核酸)。
离心可以处于如此速度，从而提供600至8000g的g力。在步骤(iv)中，离心可以按对应于600至2000g、任选地1000至2000g(例如1180g)的速度实施。离心可以按对应于至少2600g和不多于8000g的速度实现。在实施方案中，离心可以按对应于4000至5000g、任选地4722g的速度实现。
本发明方法产生高比率大核酸片段/小核酸片段的能力特别地令人惊讶的，考虑到可以按高g力实现任何离心步骤，对该比率无任何有害作用。
滤器可以作为如本文定义的核酸提取柱的组件提供。
在用含有核酸固定于其上的滤器的核酸提取柱、任选地离心柱实施本发明方法的情况下，可以将洗脱缓冲液添加至核酸提取柱，随后对后者离心以引起洗脱缓冲液从滤器洗脱核酸供收集。
收集的核酸随后可以按要求进一步分析或加工。
在实施方案中，该方法还包括在遵循步骤(iv)分离核酸之后的测序步骤。
根据本发明的第四方面，提供一种从样品分离核酸的方法，所述方法包括：
(i)使包含核酸的样品与醇和盐接触(任选地包含醇和盐的溶液)(即以形成含有核酸、醇和盐的组合物)，盐任选地在溶液中以0.05至10M的浓度提供；并且
(ii)使滤器与包含在步骤(i)后获得的核酸的组合物接触，以提供具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iii)优选地，用包含醇的洗涤液处理具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iv)从滤器洗脱核酸的至少一部分，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于70至90℃的温度温育滤器。
该方法可以在实施方案中进一步包括：(v)实施从滤器第二次洗脱核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于10至90℃的温度温育滤器，任选地随后对滤器离心。
将可以理解，如本文所述的第三方面的实施方案的相应方法条件和组分定义还适用于如下文描述的本发明第四方面和第五方面。
如根据本发明的第三方面所述那样，可以因此在步骤(i)之前或与步骤(i)同时地提供裂解步骤。对如本文所述的裂解步骤或含有裂解步骤的实施方案的任何定义可以因此适用于本发明的第四方面。
在步骤(i)中，可以使醇和盐与核酸同时或依次地接触。例如，盐可以按盐溶液的形式添加，随后添加醇，或反之亦然。备选地，盐和醇可以作为相同组合物(例如溶液)内部的组分提供并且将组合物添加至核酸或反之亦然。如果进行裂解步骤，盐和醇可能在裂解步骤后已经存在，例如因为是裂解混合物的组分。
步骤(i)中提供的盐可以是任何合适的无机的或有机盐。盐可以包括(或在实施方案中可以是)离液剂。离液剂优选地包括或是胍盐(例如胍卤化物，例如氯化物，也称作盐酸胍或氯化胍)。可以如此提供胍盐，从而在(步骤(i)后获得的)含有核酸、醇和盐的组合物中具有溶液中0.05至10M、优选地0.1至3M、优选地0.1至2M、更优选地0.5至0.9M和最优选地0.6至0.7M范围内的浓度。以举例方式，盐(例如胍盐)可以作为下述浓度的溶液添加，其中一旦添加至含有核酸的样品，所述浓度就带来上述浓度。例如，盐(例如胍盐)可以作为1-5M(例如，约2M)溶液提供。这种盐一般作为如下文描述的醇溶液提供。
离液剂可以溶解于C1-3烷醇(例如乙醇或异丙醇)中。C1-3烷醇可以包含至少75％、任选地至少95％的乙醇或异丙醇。
步骤(i)中提供的醇可以包含(或可以是)C1-3烷醇，例如异丙醇或乙醇。C1-3烷醇可以按如此量提供，从而从步骤(i)形成(即提交给步骤(ii))的包含核酸的组合物含有至少10％、至少20％、至少30％、或至少40％v/v醇。一般，步骤(i)中形成的组合物的醇含量不超过约60％v/v醇。C1-3烷醇可以按如此量提供，从而从步骤(i)形成(即提交给步骤(ii))的包含核酸的组合物含有以体积计25至40％、任选地以体积计25至30％(例如，28％v/v)的C1-3烷醇。
在上文方法中，方法优选地(但不需要必然地)包含洗涤步骤(iii)。即，该方法包括步骤(i)、(ii)和(iv)并且优选地还包括洗涤步骤(iii)。技术人员将理解与若省略洗涤步骤相比，洗涤步骤(iii)将辅助提供更纯的核酸材料。因此合乎需要的是包括洗涤步骤(iii)。洗涤液一般将含有醇，所述醇可以是如上文所述的醇。洗涤液可以进一步包含盐。盐可以如关于第三方面那样定义。例如，盐优选地是锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍。用洗涤液处理意在移除杂质，以留下固定在滤器上的基本上纯的核酸。将滤器随后与液体分离，任选地通过离心分离。盐可以在洗涤液中以0.05至小于10摩尔/升、优选地0.05至小于1摩尔/升、优选地0.1至0.9摩尔/升、更优选地0.6至0.9摩尔/升、甚至更优选地0.75至0.85摩尔/升和最优选地约0.8摩尔/升的浓度存在。在实施方案中，洗涤液可以按0.2至0.9M的浓度包含盐。
可以用多种洗涤液处理滤器。第一洗涤液可以包含醇并任选地还包含盐(例如锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍)，任选地以0.05至10M的浓度包含。将理解在每次洗涤后，可以将滤器与液体分离，任选地通过离心分离。
在包含第二洗涤液的实施方案中，第二洗涤液体可以含有醇。在实施方案中，第二洗涤液体可以包含醇和盐(例如锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍)并且这些组分可以按照与第一洗涤液不同的盐浓度提供。例如，如果第一洗涤液具有0.05至1M的盐浓度，则在实施方案中，第二洗涤可以按不是0.05至1M或低于或高于第一洗涤液的浓度实施。
洗涤液中的醇可以包括C1-3烷醇，例如异丙醇或乙醇。C1-3烷醇可以在溶液中是至少30％，至少50％，优选地至少70％v/v。在实施方案中，C1-3烷醇可以包含75％至100％v/v的乙醇。在实施方案中，C1-3烷醇可以包含90％v/v的乙醇。
洗脱缓冲液可以包含缓冲的EDTA或其盐溶液(或基本上由其组成或由其组成)。具体的合适洗脱溶液包含浓度约10mM的Tris-HCl和浓度约0.5mM的EDTA二钠盐二水合物，所述溶液具有8至9的pH。另一种合适的洗脱溶液包含DNA酶和无RNA酶水。
在实施方案中，步骤(iv)的温育温度可以是75至85℃，任选地80℃。已经发现80℃是特别有利的。步骤(iv)中的温育可以持续30秒至2分钟、任选地1分钟的时间段。
可以通过离心，将核酸从滤器洗脱入洗脱缓冲液，从而离心力使核酸从滤器转移至洗脱缓冲液。随着洗脱缓冲液流过滤器以捕获核酸，这种洗脱缓冲液随后形成洗脱液。
在实施方案中，可以通过两个离心步骤，将核酸从滤器洗脱入洗脱缓冲液。在这类实施方案中，将可以理解，施加洗脱缓冲液至滤器，并且随后流穿两次。一旦离心，洗脱液可以包含第二洗脱缓冲液(并且因此含有分离的核酸)。
离心可以处于与600至8000g的g力对应的速度。在步骤(iii)中，离心可以处于对应于600至2000g、任选地1000至2000g(例如1180g)的速度。离心可以按对应于至少2000g和不多于8000g的速度实现。在实施方案中，离心可以按对应于4000至5000g、任选地约4722g的速度实现。
滤器可以作为如本文定义的核酸提取柱的组件提供。
如用于以上方面的方法的滤器可以是二氧化硅或二氧化硅基材料。二氧化硅或二氧化硅基材料可以是玻璃、优选地硼硅酸盐玻璃。滤器可以包含纤维材料，并且优选地包含二氧化硅材料或二氧化硅基材料的纤维。滤器优选地包含硼硅酸盐玻璃纤维。出于优选，滤器为其中纤维是硼硅酸盐玻璃的纤维薄片或膜的形式。在优选的实施方案中，滤器(即如步骤(ii)中提供)可以是如根据本发明第一方面或其任何实施方案所述那样的任何滤器。
在用包含核酸固定于其上的滤器的核酸提取柱、任选地离心柱实施本发明方法的情况下，可以将洗脱缓冲液添加至核酸提取柱，随后对后者离心。在优选的实施方案中，柱可以是如根据本发明第二方面或其实施方案所述那样的柱。
在实施方案中，该方法还包括分离从步骤(iv)获得的核酸之后的测序步骤。
根据本发明的第五方面，提供一种纯化从样品分离的核酸的方法，所述方法包括：
(i)使核酸与醇和盐接触(任选地包含醇和盐的溶液)(即以提供含有核酸、醇和盐的组合物)，盐任选地在溶液中以0.05至10M的浓度提供；
(ii)使滤器与包含在步骤(i)后获得的核酸的组合物接触，以提供具有与其结合的核酸的滤器；
(iii)优选地，用包含醇(和任选地盐)的洗涤液处理具有与其结合的核酸的滤器；并且
(iv)实施从滤器第一次洗脱核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于70至90℃的温度温育滤器，随后对滤器离心；并且
(v)实施从滤器第二次洗脱核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中于不超过90℃(例如10-90℃)的温度温育滤器，任选地随后对滤器离心。
对于洗脱步骤，将可以理解在离心后，如必要，可以将洗脱的缓冲液(含有核酸)收集并储存/用于进一步分析。
在步骤(i)中，可以使醇和盐与核酸同时或依次地接触。例如，盐可以按盐溶液的形式添加，随后添加醇，或反之亦然。备选地，盐和醇可以作为相同组合物(例如溶液)内部的组分提供并且将组合物添加至核酸或反之亦然。
盐可以如上文就本发明第三和第四方面而言定义。盐可以例如包括如本文中就本发明第三和第四方面而言定义的离液剂。
步骤(i)和(iii)中的醇可以是如上文相对于本发明第三和第四方面描述的相应醇。
在上文方法中，方法优选地(但不需要必然地)包含洗涤步骤(iii)。即，该方法包括步骤(i)、(ii)、(iv)和(v)并且优选地还包括洗涤步骤(iii)。技术人员将理解与若省略洗涤步骤相比，洗涤步骤(iii)将辅助提供更纯的核酸材料。因此合乎需要的是包括洗涤步骤(iii)。洗涤液将一般含有醇，后者可以是如上文相对于本发明第三或第四方面所述的醇。
洗涤液可以进一步包含盐。盐可以如相对于第三或第四方面那样定义。例如，盐优选地是锂或胍卤化物，例如氯化锂或氯化胍。用洗涤液处理意在移除杂质，以留下固定在滤器上的基本上纯的核酸。将滤器随后与液体分离，任选地通过离心分离。盐可以在洗涤液中以0.05至小于10摩尔/升、优选地0.05至小于1摩尔/升、优选地0.1至0.9摩尔/升、更优选地0.6至0.9摩尔/升、甚至更优选地0.75至0.85摩尔/升和最优选地约0.8摩尔/升的浓度存在。在实施方案中，洗涤液可以按0.2至0.9M的浓度包含盐。
可以在步骤(iii)中用如上文相对于本发明第三方面和第四方面更详细描述的多种洗涤液处理滤器。洗涤液可以根据第三或第四方面中任一者定义。
本发明第五方面的纯化方法有利地合并从样品提取和纯化核酸。这消除对如本领域共知的分离纯化步骤的需要并且从而减少为制备基本上纯的核酸所要求的时间。
还改进易用性，因为需要更少的手工操作步骤。手工操作步骤减少也可以有利于降低长核酸破损的可能性。
步骤(v)的温育温度优选地在10-90℃之间实施并且在实施方案中低于步骤(iv)的温育温度。在实施方案中，步骤(v)的温育温度可以介于10和65℃、任选地20和65℃之间，任选地是室温。在实施方案中，步骤(iv)中的温育可以是75至85℃，任选地80℃。将可以理解超过90℃的温育温度可能导致核酸显著变性。
在本领域的语境下，术语纯化通常用来描述从核酸样品移除杂质，例如在从溶液或凝胶切片纯化核酸时。有利地，本发明人已经发现，上文方面的方法可以用来通过优先耗尽来自滤器装置的小核酸片段“净化”核酸。以这种方式，较大比例的长核酸片段保留在滤器装置上，随后洗脱这些长核酸片段。不希望受理论约束，本发明人已经发现洗脱步骤中使用的温度改进并且认为第一洗脱步骤的温度有助于耗尽小片段。
在本文所述的本发明方法的实施方案中，洗脱步骤后获得的样品中具有10kb-165.5kb长度的核酸片段的数目除以样品中具有1.3-10kb长度的核酸片段的数目(即作为比率)，是至少1.5，例如至少1.6和/或多达5，例如1.6至3.2。
根据本发明的另一个方面，提供从样品分离核酸的试剂盒，试剂盒包含：
(i)根据第一方面的滤器；
(ii)盐(优选地离液剂，例如胍盐)，
(iii)洗剂，任选地包含锂盐；
(iii)任选地，洗脱缓冲液；和
任选地裂解剂。
洗脱缓冲液可以包含缓冲的EDTA或其盐溶液(基本上由其组成或由其组成)。具体的合适洗脱溶液包含浓度约10mM的Tris-HCl和浓度约0.5mM的EDTA二钠盐二水合物，所述溶液具有8至9的pH。另一种合适的洗脱溶液包含DNA酶和无RNA酶水。
离液剂可以包含氯化胍，也称作盐酸胍或氯化胍。
锂盐可以是如本文其他处描述的任何锂盐。盐优选地是氯化锂。
滤器可以作为如本文定义的核酸提取柱的组件提供。诸试剂可以如相对于如本文定义的其他方面的任一者那样所述。
附图简述
将现在结合以下非限制性实施例1-6和附图的图1-8说明本发明，其显示：
图1显示比较使用本发明滤器分离的较长核酸/较短核酸的比率；
图2(A)显示在室温温育温度相对于DNeasy滤器和方法，使用本发明滤器和/或本发明方法所获得的长/短DNA的比率的比较，(B)显示在室温温育温度相对于DNeasy滤器和方法，使用本发明滤器和/或本发明方法所获得的DNA的平均碱基对长度的比较，(C)显示在80℃温育温度相对于DNeasy滤器和方法，使用本发明滤器和/或本发明方法所获得的长/短DNA的比率的比较和(D)显示在80℃温育温度相对于DNeasy滤器和方法，使用本发明滤器和/或本发明方法所获得的DNA的平均碱基对长度的比较。
图3显示LiCl浓度对使用本发明方法所获得的大/小DNA的比率的影响；
图4显示不同醇对使用本发明方法所获得的大/小DNA的比率的影响；
图5显示两个洗脱步骤中第二者的温度对使用本发明方法和滤器所获得的长/短DNA片段的比率的影响；
图6显示两个洗脱步骤中第二者的温度对不同滤器上使用本发明方法所获得的长/短DNA片段的比率的影响。对每种滤器测试65℃和80℃。(A)显示4F滤器的比率，(B)显示2F滤器的比率，(C)显示DF滤器的比率，(D)显示2DF滤器的比率，(E)显示F2D滤器的比率并且(F)显示DFD滤器的比率；
图7显示具有80℃温育温度的两个洗脱步骤对使用不同滤器所获得的长/短DNA的比率的影响；并且
图8显示本发明滤器相对于已知的大小排阻方案纯化较长DNA的能力。
实验方法和性能分析
实施例1
提取的DNA的比率
发明人决定针对本发明研究滤器对DNA分离方案中所获得长/短DNA的比率的影响。将本发明滤器的影响与未根据第一方面的滤器比较。
否则使用根据本发明第三方面的方法，实施该实施例。简而言之，从1ml马血液样品分离白细胞并且遵循以下程序：
(a)添加冰冷的低渗溶液至样品并且将样品在室温温育5至10分钟以破坏红细胞；
(b)将样品按250x G的速度离心3分钟；在不扰动沉淀物(含有白细胞)的情况下，弃去上清液(含有不想要的红细胞材料)；
(c)使样品(含有白细胞材料的沉淀物)与包含0.8M LiCl、0.5％SDS、蛋白酶K和10mM EDTA的裂解溶液接触并且抽吸混合以裂解样品；
(d)使样品与2M离液剂GuHCl溶液接触并且涡旋混合。
(e)添加75％异丙醇并且涡旋混合；
(f)将样品转移至核酸提取柱，在这个实施方案中，转移至包含滤器的离心柱；
(g)按4,722x g离心1分钟；
(h)弃去流穿液；
(i)添加包含LiCl和50％乙醇的洗涤液至离心柱并且按4722g离心1分钟。弃去流穿液。
(j)添加90％乙醇至离心柱并且按14,462x g离心3分钟。弃去流穿液。
(k)将离心柱按14,462x g离心1分钟。弃去流穿液。
(l)添加洗脱缓冲液(10mM Tris HCL，0.5mM EDTA)至离心柱并且在室温温育1分钟。按1,180g洗脱2分钟以获得级分A；并且
(m)任选地重复(l)，以获得级分B。
步骤(a)和(b)是用来从全血样品移除红细胞的任选步骤。它基本上发挥作用以沉淀来自样品的白细胞。随后在步骤(c)中裂解白细胞。如本领域普通技术人员将理解，若不需要裂解样品，则步骤(c)也是任选的。
表1中详述适用于本发明中的多孔区域。表1中的全部多孔区域均从GE LifeSciences(USA)可获得。本领域普通技术人员将可从商业途径获得例如滤板形式的其他合适的多孔区域。
表1
每个滤器可以切割成如需要的大小并且由硼硅酸盐玻璃形成。
为了形成每种滤器，测试多种不同的多孔区域组合(关于每个多孔区域的信息，参见表1，并且关于受测滤器的信息，参见表2)。简而言之，将每个多孔区域切割至0.38cm2直径以插入离心柱。由于多孔区域处于膜形式，为了形成每个滤器，使用由纯HP570R(Lyondellbasell,Milton Keynes,UK)形成的O型圈，将多孔区域合并在一起，以将滤器在其周缘固定在一起。
使用的命名指示每个多孔区域相对于使用时样品接触点的定位。因此，对于DF滤器，D多孔区域是“顶部”多孔区域，即最靠近离心柱开放末端的多孔区域和因此使用时将由样品首先接触的多孔区域，同时F多孔区域在D多孔区域之下。对于F2D滤器，F多孔区域是“顶部”多孔区域，而2D多孔区域在下方。
对于本发明实验，F多孔区域从Porex Corporation(亚琛，德国)获得，而D多孔区域从Whatman(GE Life Sciences(USA))获得。然而，技术人员将理解，等同性多孔区域可从众多的其他商业供应商获得。
表2
图1显示表2的滤器对使用上文方案所获得的长/短DNA片段的比率的影响。
使用FEMTO脉冲平行毛细管电泳仪(Advanced Analytical Technologies,Inc.,Milton Keynes,UK)，分析洗脱步骤(l)中提取的具有特定大小的DNA分子的数目。该仪器计算不同DNA成片条带组的纳摩尔/Lt。
该分析对以下成片条带范围计算DNA片段的数目：1.3kb至10kb和10kb至165.5kb。10kb至165.5kb范围随后除以1.3kb至10kb范围，以产生图1中所示的比率。因此，该比率将理解与“10kb临界值”有关。显示平均值，连同来自重复样品的标准差。
这些比率指示具有特定大小的分子的相对丰度。选择1.3kb大小和165.5kb kb大小，因为这些大小是FemtoPulse分子梯的下界和上界。选择临界值是10kb，因为大至这个大小的分子可以严重压倒长读段测序读出。选择10kb至165.5kb组，因为它涵盖长读段测序的寻常范围(25至35kb)，如用视为很长的50至165.5kb片段一起外部验证。
如本领域普通技术人员将领会，大于1的比率表示与长度较短的DNA片段相比，长度较长的DNA片段的数目较高。小于1的比率表示与长度较长的DNA片段相比，长度较短的DNA片段的数目较大。
图1A显示如与本发明滤器DF(即，其在标称孔径较小的多孔区域上方具有标称孔径较大的多孔区域)相比，针对对比滤器4F和2F所获得的比率。该图明确地显示，使用DF滤器产生较长/较短DNA片段的较大的比率(如与4F的1.10和2F的0.76相比，1.91)。
图1B显示如与本发明滤器DF相比，针对对比滤器FD所获得的比率。如对于图1A，使用DF滤器所获得的较长/较短DNA片段的比率(1.96)明显地大于针对FD滤器所获得的比率(1.10)。
图1C显示如与本发明滤器2DF和DFD相比，针对对比滤器2F和F2D所获得的比率。2DF(2.84)和DFD(3.03)二者均给出比对比滤器明显更大的比率(2F为1.17和F2D为0.91)，同时DFD获得最大的比率。
这些数据显示在核酸分离方案中使用时，本发明的滤器提供改进的较长/较短核酸片段比率。全部数据均衍生自65℃(而不是如步骤l中具体说明的室温)预温育1分钟后两次洗脱中的第一次洗脱。
实施例2
与DNeasy滤器相比提取的DNA比率和长度
将本发明的滤器(在这个实施方案中，如实施例1中所述的DFD滤器)和如实施例1中所述的方法随后与DNeasy DNA血液和组织提取方案和试剂盒(Qiagen,Germantown,MD,US)的已知滤器和方法比较。如实施例1那样，使用FEMTO Pulse仪分析样品。
样品是从1ml马血液分离的白细胞。
发明人想要确定提供的本发明滤器是否改进较长DNA的分离，无论方案是否使用滤器。图2中显示结果。这些结果显示，洗脱物中的已分离长/短DNA的比率(图2A和C)和已分离DNA片段的平均碱基对长度(图2B和2D)。对于这项分析，该比率的“临界值”是20KB；即20kb至165.5kb范围随后除以1.3kb至20kb范围，以产生所示的比率。对20至165.5kb范围内的已分离DNA群体计算平均碱基对长度。
对于全部方案，使用室温(图2A和2B)或80℃(图2C和2D)的洗脱前温育步骤，进行洗脱步骤。展示来自第二次洗脱的结果。
x标签限定以下条件：
FM/FM＝根据实施例1/DFD滤器的方法
DN/DN＝来自试剂盒的DNeasy方案和试剂/来自试剂盒的Dneasy滤器
DN/FM＝来自试剂盒的DNeasy方案和试剂/DFD滤器
结果显示，无论使用何种温育温度或方案和试剂，DFD滤器提供改进的已分离长/短DNA片段比率和与DNeasy滤器相比增加的平均碱基对长度。这表明，本发明的滤器用各种分离方法提供改进的结果。当DFD滤器配合本发明的方法使用时，如实施例1中例举，该比率和平均碱基对长度进一步改进。
对于全部滤器和方法，如与室温相比，通过使用80℃的洗脱前温育温度，改进了所获得的比率和平均碱基对长度。
实施例3
条件
随后考虑本发明方案中不同缓冲剂的影响。图3显示提供的氯化锂对已分离DNA的比率的影响。对于该图，根据实施例1的方案对1ml马血液样品实施DNA提取方案，例外是步骤(c)的溶液中使用0M LiCl或0.8M LiCl浓度并且在65℃实施步骤(l)中的温育。对于这个方案，使用4F滤器(即对比滤器)。以这种方式，可以单独评估方法的影响。
使用如与图1相同的临界值，确定比率。
图3表明在本发明方法的溶液中纳入LiCl增加所获得长/短DNA片段的比率。这表明，本发明的方法能够独立于本发明的滤器，提供改进的长/短DNA片段比率。全部数据均衍生自重复样品(1ml马血液的白细胞)并且显示在临界值10kb时来自65℃预温育1分钟后第一次洗脱的结果。
图4显示不同的醇和醇百分比对已分离DNA的比率的影响。如对于图3，根据实施例1的方案对1ml马血液样品实施DNA提取方案，例外是在65℃实施温育步骤(l)。但是，在方案的步骤(e)中测试75％异丙醇、75％乙醇、100％异丙醇和100％乙醇。使用如与图1相同的临界值，确定比率。若提供的醇是100％异丙醇或100％乙醇，提交用于过滤的组合物中所得的醇浓度是37％v/v。若使用的醇是75％异丙醇或75％乙醇，提交用于过滤的核酸组合物中所得的醇浓度是以体积计约28.57％。
使用75％乙醇提供了最大的比率(1.26)，随后是75％异丙醇(1.23)、100％乙醇(1.03)和100％异丙醇(0.57)。这还表明，本发明方法的参数影响所获得的比率，与本发明的滤器无关。全部数据均来源自一式两份样品(1ml马血液的白细胞)并且显示在临界值10kb时来自65℃预温育1分钟后第一次洗脱的结果。
实施例4
温度
随后考虑DNA分离方法的洗脱步骤中温育温度的影响。
对已知的长片段和短片段混合物的3μg DNA样品使用实施例1中详述的方案。以这种方式，改进的较长片段保留的效率可以与输入样品中DNA的比率直接比较。使用的滤器是DFD滤器。
在这个实施例中，实施两个洗脱步骤；每个洗脱步骤包括在图5中所示的温度洗脱前温育1分钟。随后使用FEMTO脉冲平行毛细管电泳仪，分析第二洗脱物中DNA分子的数目。20KB临界值用来如实施例2中所述那样计算该比率。
图5显示获得的比率。尽管如与全部洗脱前温度处的输入相比，本发明的方法改进长/短DNA的比率，但使用80℃洗脱前温度时，长/短DNA比率的增加最可观。
随后测试80℃洗脱前温度对本发明滤器和对比滤器的影响。图6中显示结果。对于这些数据，对来自1ml马血液样品的白细胞根据实施例1的方法实施。然而，实施两个洗脱步骤，各自用在65或80℃洗脱前温育1分钟。随后使用FEMTO脉冲平行毛细管电泳仪，分析第二洗脱物的DNA含量。使用20kb临界值。
A)显示4F滤器的比率，(B)显示2F滤器的比率，(C)显示DF滤器的比率，(D)显示2DF滤器的比率，(E)显示F2D滤器的比率和(F)显示DFD滤器的比率。对于全部滤器，80℃温育步骤大大增加所获得较长DNA片段的比率，这表明无论所用的滤器是什么，在洗脱之前将升高的温度用于温育的本发明方法产生改进的结果。这种影响对DFD滤器(F)特别明显。
图7显示在80℃两次洗脱前温育后，使用不同滤器从第二洗脱物获得的长/短DNA比率。对于这个数据，使用40kb临界值，即通过将40kb至165.5kb范围除以1.3kb至40kb范围，计算该比率。通过增加临界比率，这辅助显示哪些滤器在分离特别长的DNA片段方面最有用。否则使用实施例1的方法。
图7显示与对比滤器4F(0.62)和F2D(0.67)相比，本发明的滤器DFD(1.48)和2DF(1.16)给出增加的比率。这表明，本发明的滤器在80℃的温度以及65℃的较低温度给出相对于对比滤器改进的比率，如图1中所示。
实施例5
本发明方法在纯化核酸中的效用
除改进所获得长DNA片段的比例之外，它还可用于能够耗尽低于某个临界值(例如10kb)的DNA片段。这进一步改进来自已知核酸分离技术的DNA样品(如文库样品)或DNA提取物的纯度和/或效用，所述的已知核酸分离技术更不适于最佳提取用于长读段测序技术的较长核酸，如ONTs和PacBio。
如与已知的大小选择SPRI(固相可逆固定化珠)珠方案(Agencourt AMPure XP珠，Beckman Coultier)相比，考虑过本发明方案和滤器排除短DNA片段的能力。SPRI珠由ONT推荐用作提取DNA用于至多2kb的耗尽后的快速大小选择法。
SPRI方案如下：将50μl中的3μg DNA与35μl珠(在10mM Tris-HCl、1mM EDTA、1.6MNaCl、11％PEG8000中)混合并且将溶液在室温从上到下颠倒10分钟。随后对其短暂离心数秒并且在磁体上沉淀。抽吸上清液并将沉淀物用200μl的70％EtOH洗涤。在移除EtOH后，重复EtOH洗涤并且允许沉淀物干燥以移除任何残余EtOH。使沉淀物重悬于50μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8，1mM EDTA)中并且在50℃温育1分钟和在室温温育5分钟。随后在磁体上使珠沉淀并且下游使用上清液。
将多种滤器纯化DNA的能力与0.7x SPRI大小选择系统比较。使用低分子量和高分子量DNA的3μg混合物作为输入。简而言之，将体积直至100μl洗脱缓冲液中的3μg DNA与150μl包含0.8M LiCl、0.5％SDS、蛋白酶K和10mM EDTA的溶液、175μl 2M离液剂GuHCl BS溶液和200μl75％异丙醇的预混溶液混合，混合溶液在标准离心方案立即加载于柱上。在每次洗脱(该方案具有二次洗脱)之前，将洗脱缓冲液在80℃温育1分钟。使用20kb临界值，分析第二次洗脱物。如图8显示，全部滤器均比采用DFD滤器的SPRI表现得更好，提供最大比率2.03。升高的洗脱前温育温度可能有助于改进大小选择并因此通过以下方式有助于纯化：促进较小的分子从基质分离，因此可以更轻易地耗尽这些分子。
因此，本发明的方法可以用来分离和/或纯化核酸。当用来纯化核酸样品时，可能有益的是使用第二次洗脱。这是因为，不希望受理论约束，本发明人认为第一次洗脱可能含有更不适于下游测序应用的较小核酸片段。
实施例6
测序分析
使用离心柱中的DFD滤器装置，实施符合实施例1的方案，以分离DNA(使用洗脱物B)。
LSK109文库试剂盒(Oxford Nanopore Technologies,Oxford,UK)随后用来从每个DNA集合制备测序文库。LSK109方法导致修复DNA末端和加dA尾。随后将LSK109试剂盒中供应的测序接头连接到制备的末端上。此后，向MinION流动池(Oxford NanoporeTechnologies)载以DNA文库，以进行文库测序。
根据方案说明，用MinION流动池测序可以运行六小时。然而，由于流动池具有大约48小时的运行寿命，可以任由流动池运行这个时间长度。这提供更多的核酸序列供生物信息学分析。
因此，使用MinION流动池的测序运行48小时并且用提供数值的Nanoplot软件(https://pypi.org/project/NanoPlot/)分析前6小时和前48小时的测序总结。Q评分代表独立碱基调用准确度的度量，并且对于ONT测序通常是约10。ONT建议使用临界值7用于分析：
在6小时测序后，统计结果是：平均长度：27,080bp和N50：47,606bp并且在48小时测序后：平均长度：30,096bp并且N50：49,590bp。
如本领域普通技术人员将领会，N50就毗邻性而言定义组装质量。N50定义为在50％的基因组总长度时最短重叠群的序列长度。
Oxford Nanopore Technologies通常建议在DNA提取和文库制备之间使用SPRI珠步骤，以移除低于2kb的DNA链，后者否则将会占满MinIon流动池。然而，这个步骤对使用2DF或DFD滤器的本发明方法并非必备，原因在于2DF或DFD滤器在提取期间清理DNA并对其进行大小选择的能力。
对沉淀自2ml马血液的白细胞样品实施进一步测序分析。对于这些实验，使用符合实施例1的方案，平行提取DNA(使用洗脱物B)。使用2DF或DFD滤器装置。
LSK109文库试剂盒用来制备测序文库(未包括提取后SPRI步骤)，随后使用MinIon流动池对终体积60μl中的20μl DNA(根据生产商的说明)或终体积60μl中的47μl DNA测序6或48小时。
下表3中显示结果。
表3
当分析20μl输入时，使用DFD滤器获得的DNA具有约42kb的比2DF滤器较大的N50，相比之下，2DF是约40kb。对于47μl输入，6小时和48小时运行的N50高达约48kb和～50kb。
这些结果表明，本发明方法分离和纯化核酸的用途可以导致改进的下游结果，例如对测序应用而言。发明人认为，这归因于样品中增加的长/短DNA片段比率。另外，发明人已经发现，因为改进的比率，较小DNA片段的干扰更少从而可以使用增加的DNA体积作为测序输入。这转而提供改进的测序结果。
参考文献
Cavalier等人,2015–Cavelier L,Ameur A,
S, 
I,Cahill N, 
U,Hermanson M.(2015)Clonal distribution of BCR-ABL1mutations and splice isoforms by single-mol ecule long-read RNAsequencing.BMC Cancer.15:45.doi:10.1186/s12885-015-1046-y.
Claims (27)
1.一种从样品中分离核酸的方法，该方法包括：
(i)使包含核酸的样品与醇和盐接触，其中所述盐包含离液剂；和
(ii)使滤器与在步骤(i)之后获得的包含核酸的组合物接触以提供结合有核酸的滤器；和
(iii)从滤器洗脱至少一部分核酸，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中在70至90℃的温度下温育滤器。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括用包含醇的洗涤液处理所述结合有核酸的滤器的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤(iii)中的温育在75至85℃的温度下进行。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(iii)中的温育时间为30秒至2分钟。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中从所述滤器洗脱所述核酸包括离心。
6.根据权利要求5所述的方法，其中离心的g力为600至800g。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，还包括：(iv)对来自所述滤器的核酸进行第二次洗脱，其中所述第二次洗脱包括在不超过90℃的温度下将所述滤器在洗脱缓冲液中温育，任选地随后对滤器进行离心。
8.一种纯化从样品中分离的核酸的方法，该方法包括：
(i)使所述核酸与醇和盐接触，其中所述盐包含离液剂；
(ii)使滤器与在步骤(i)之后获得的包含核酸的组合物接触以提供结合有核酸的滤器；和
(iii)对来自滤器的核酸进行第一次洗脱，其中洗脱包括在洗脱缓冲液中在70至90℃的温度下温育滤器，任选地然后对滤器进行离心；和
(iv)对来自滤器的核酸进行第二次洗脱，其中洗脱包括在不超过90℃的温度下将滤器在洗脱缓冲液中温育，任选地然后对滤器进行离心。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括用包含醇的洗涤液处理结合有核酸的滤器的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(iv)的温育温度低于步骤(iii)的温育温度。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(iv)的温育温度为20至65℃。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的盐包括胍盐。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的盐的提供量使得由步骤(i)形成的包含核酸的组合物含有0.05至10M，任选地0.1至3M，优选0.1至2M，更优选0.5至0.9M，甚至更优选0.6至0.7M浓度的盐。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤(i)中的所述醇包括C1-3烷醇，优选异丙醇或乙醇。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述醇的提供量使得由步骤(i)形成的包含核酸的组合物含有按体积计25％至40％、任选地按体积计25％至30％的醇。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述滤器至少包括第一多孔区域和第二多孔区域，第一多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之前的样品接触，其中第一多孔区域具有大于第二多孔区域的标称孔径。
17.根据权利要求16所述的方法，其中第二多孔区域的标称孔径是0.5μm至1.8μm，任选地0.5μm至1.3μm。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中第一多孔区域的标称孔径是2μm至3μm。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中所述滤器包含多个第一多孔区域。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述滤器还包括第三多孔区域，第三多孔区域布置成使用时与第二多孔区域之后的样品接触，第三多孔区域具有大于第二多孔区域的标称孔径，并且任选地其中第三多孔区域的标称孔径基本上等于第一多孔区域的标称孔径。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中所述滤器包含硅酸盐，任选地其中第一、第二和任选地第三多孔区域中至少一个包含硅酸盐，任选地进一步其中所述滤器由硅酸盐构成。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述硅酸盐包括硅酸盐玻璃，任选地其中所述硅酸盐玻璃包括或是硼硅酸盐玻璃。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的方法，其中第一多孔区域和第二多孔区域由纤维材料形成。
24.根据权利要求23所述的方法，其中第一多孔区域和第二多孔区域各自由不同的纤维材料形成。
25.根据权利要求16至24任一项所述的方法，其中如按样品流过滤器的方向测量的滤器厚度是1000μm至2000μm。
26.根据权利要求25所述的方法，其中如按样品流过滤器的方向测量的滤器厚度是1500μm至2000μm。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述滤器作为核酸提取柱的组件提供。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB1902171.6 | 2019-02-15 | ||
| GB1902171.6A GB2581489B (en) | 2019-02-15 | 2019-02-15 | Purification method |
| PCT/GB2020/050348 WO2020165602A1 (en) | 2019-02-15 | 2020-02-14 | Purification method |
| CN202080014339.0A CN113423832A (zh) | 2019-02-15 | 2020-02-14 | 纯化方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080014339.0A Division CN113423832A (zh) | 2019-02-15 | 2020-02-14 | 纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114540343A true CN114540343A (zh) | 2022-05-27 |
Family
ID=65998630
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080014339.0A Pending CN113423832A (zh) | 2019-02-15 | 2020-02-14 | 纯化方法 |
| CN202210134209.1A Pending CN114540343A (zh) | 2019-02-15 | 2020-02-14 | 纯化方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202080014339.0A Pending CN113423832A (zh) | 2019-02-15 | 2020-02-14 | 纯化方法 |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220049243A1 (zh) |
| EP (2) | EP3924488A1 (zh) |
| JP (1) | JP2022520092A (zh) |
| KR (1) | KR20210128450A (zh) |
| CN (2) | CN113423832A (zh) |
| AR (2) | AR118098A1 (zh) |
| AU (1) | AU2020220830A1 (zh) |
| BR (1) | BR112021015952A2 (zh) |
| CA (1) | CA3130331A1 (zh) |
| EA (1) | EA202192261A1 (zh) |
| GB (1) | GB2581489B (zh) |
| IL (2) | IL287609B (zh) |
| MX (1) | MX2021009762A (zh) |
| SG (1) | SG11202108858UA (zh) |
| TW (1) | TW202045722A (zh) |
| WO (1) | WO2020165602A1 (zh) |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1539013A (zh) * | 2001-07-09 | 2004-10-20 | ������������ʽ���� | 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法 |
| US20050026153A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Iannotti Claudia A. | Devices and methods for isolating RNA |
| US20050026175A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | John Link | Devices and methods for isolating RNA |
| EP1626085A1 (en) * | 2004-08-10 | 2006-02-15 | Agilent Technologies, Inc. | Devices and methods for isolating RNA |
| US20060099605A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-11 | Hall Gerald E Jr | Devices and methods for isolating RNA |
| CN101117344A (zh) * | 2006-06-29 | 2008-02-06 | 米利波尔公司 | 用于分离核酸的过滤装置 |
| CN101153282A (zh) * | 2005-11-04 | 2008-04-02 | 株式会社日立高新技术 | 核酸精制方法及核酸精制器具 |
| US20090011469A1 (en) * | 2005-09-29 | 2009-01-08 | Aj Innuscreen Gmbh | Method and formulation for the extraction of nucleic acids from any complex starting materials |
| US20150225713A1 (en) * | 2014-02-10 | 2015-08-13 | Zymo Research Corporation | Methods for nucleic acid capture |
| CN105164509A (zh) * | 2012-08-28 | 2015-12-16 | 阿科尼生物系统公司 | 用于纯化核酸的方法和试剂盒 |
| CN106164270A (zh) * | 2014-04-11 | 2016-11-23 | 和光纯药工业株式会社 | 核酸纯化方法 |
| WO2017203225A1 (en) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | RevoluGen Limited | Isolating nucleic acids |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4034036C2 (de) * | 1990-10-26 | 1994-03-03 | Diagen Inst Molekularbio | Vorrichtung und Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellsuspensionen |
| DE4143639C2 (de) * | 1991-12-02 | 2002-10-24 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren |
| JP4690656B2 (ja) * | 2004-02-12 | 2011-06-01 | ジーエルサイエンス株式会社 | 核酸の分離精製方法及び分離吸着体 |
| US20060270843A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods for isolation of nucleic acids |
| US9428746B2 (en) * | 2007-10-31 | 2016-08-30 | Akonni Biosystems, Inc. | Method and kit for purifying nucleic acids |
| US7759112B2 (en) * | 2007-10-31 | 2010-07-20 | Akonni Biosystems, Inc. | Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids |
| CN102191226A (zh) * | 2010-03-08 | 2011-09-21 | 北京清大天一科技有限公司 | 细胞培养混合物的分离纯化方法 |
| GB201504459D0 (en) | 2015-03-17 | 2015-04-29 | Moorlodge Biotech Ventures Ltd | Isolation of DNA |
-
2019
- 2019-02-15 GB GB1902171.6A patent/GB2581489B/en active Active
-
2020
- 2020-02-13 TW TW109104483A patent/TW202045722A/zh unknown
- 2020-02-14 CA CA3130331A patent/CA3130331A1/en active Pending
- 2020-02-14 AU AU2020220830A patent/AU2020220830A1/en not_active Abandoned
- 2020-02-14 EA EA202192261A patent/EA202192261A1/ru unknown
- 2020-02-14 CN CN202080014339.0A patent/CN113423832A/zh active Pending
- 2020-02-14 BR BR112021015952-5A patent/BR112021015952A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2020-02-14 KR KR1020217029682A patent/KR20210128450A/ko unknown
- 2020-02-14 WO PCT/GB2020/050348 patent/WO2020165602A1/en unknown
- 2020-02-14 MX MX2021009762A patent/MX2021009762A/es unknown
- 2020-02-14 IL IL287609A patent/IL287609B/en unknown
- 2020-02-14 CN CN202210134209.1A patent/CN114540343A/zh active Pending
- 2020-02-14 JP JP2021547216A patent/JP2022520092A/ja active Pending
- 2020-02-14 SG SG11202108858UA patent/SG11202108858UA/en unknown
- 2020-02-14 EP EP20707784.3A patent/EP3924488A1/en not_active Withdrawn
- 2020-02-14 IL IL285615A patent/IL285615B/en unknown
- 2020-02-14 EP EP21205118.9A patent/EP3985112A1/en not_active Withdrawn
- 2020-02-14 US US17/431,113 patent/US20220049243A1/en active Pending
- 2020-02-14 AR ARP200100414A patent/AR118098A1/es unknown
-
2021
- 2021-06-30 AR ARP210101839A patent/AR122820A2/es unknown
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1539013A (zh) * | 2001-07-09 | 2004-10-20 | ������������ʽ���� | 应用非织造织物纯化和检测核酸的方法 |
| US20050026153A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | Iannotti Claudia A. | Devices and methods for isolating RNA |
| US20050026175A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | John Link | Devices and methods for isolating RNA |
| EP1626085A1 (en) * | 2004-08-10 | 2006-02-15 | Agilent Technologies, Inc. | Devices and methods for isolating RNA |
| US20060099605A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-11 | Hall Gerald E Jr | Devices and methods for isolating RNA |
| US20090011469A1 (en) * | 2005-09-29 | 2009-01-08 | Aj Innuscreen Gmbh | Method and formulation for the extraction of nucleic acids from any complex starting materials |
| CN101153282A (zh) * | 2005-11-04 | 2008-04-02 | 株式会社日立高新技术 | 核酸精制方法及核酸精制器具 |
| CN101117344A (zh) * | 2006-06-29 | 2008-02-06 | 米利波尔公司 | 用于分离核酸的过滤装置 |
| CN105164509A (zh) * | 2012-08-28 | 2015-12-16 | 阿科尼生物系统公司 | 用于纯化核酸的方法和试剂盒 |
| US20150225713A1 (en) * | 2014-02-10 | 2015-08-13 | Zymo Research Corporation | Methods for nucleic acid capture |
| US20180371450A1 (en) * | 2014-02-10 | 2018-12-27 | Zymo Research Corporation | Methods for nucleic acid capture |
| CN106164270A (zh) * | 2014-04-11 | 2016-11-23 | 和光纯药工业株式会社 | 核酸纯化方法 |
| WO2017203225A1 (en) * | 2016-05-24 | 2017-11-30 | RevoluGen Limited | Isolating nucleic acids |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CLOSE ELIZABETH D等: "Nucleic acid separations using superficially porous silica particles.", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
| LIU LIJIA等: "Extraction of genomic DNA using a new amino silica monolithic column", 《JOURNAL OF SEPARATION SCIENCE》 * |
| PETER E.VANDEVENTER等: "DNA Adsorption to and Elution from Silica Surfaces: Influence of Amino Acid Buffers", 《J PHYS CHEM B》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL285615B (en) | 2022-08-01 |
| BR112021015952A2 (pt) | 2021-10-05 |
| TW202045722A (zh) | 2020-12-16 |
| AR118098A1 (es) | 2021-09-15 |
| GB2581489B (en) | 2021-02-24 |
| IL287609B (en) | 2022-07-01 |
| IL285615A (en) | 2021-09-30 |
| AR122820A2 (es) | 2022-10-05 |
| CA3130331A1 (en) | 2020-08-20 |
| EA202192261A1 (ru) | 2021-12-21 |
| SG11202108858UA (en) | 2021-09-29 |
| IL287609A (en) | 2021-12-01 |
| GB201902171D0 (en) | 2019-04-03 |
| JP2022520092A (ja) | 2022-03-28 |
| US20220049243A1 (en) | 2022-02-17 |
| AU2020220830A1 (en) | 2021-10-07 |
| GB2581489A (en) | 2020-08-26 |
| KR20210128450A (ko) | 2021-10-26 |
| CN113423832A (zh) | 2021-09-21 |
| EP3985112A1 (en) | 2022-04-20 |
| WO2020165602A1 (en) | 2020-08-20 |
| EP3924488A1 (en) | 2021-12-22 |
| MX2021009762A (es) | 2021-11-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10745686B2 (en) | Method for separating DNA by size | |
| JP6689251B2 (ja) | Ｒｎａを高収率で単離するための方法 | |
| US6670128B2 (en) | Transfusion medicine leukodepletion filter devices as a source of genetic material for genotyping studies | |
| US20180291365A1 (en) | Method for separating dna by size | |
| JP6440616B2 (ja) | 高収量で小型ｒｎａを含むｒｎａを単離するための方法 | |
| US20070106071A1 (en) | Methods for nucleic acid isolation and instruments for nucleic acid isolation | |
| JP2010534476A (ja) | 法医学的試料から精子核酸を回収するための方法 | |
| US20240309355A1 (en) | Solid phase negative enrichment | |
| US20230357747A1 (en) | Method for isolating rna with high yield | |
| CN118103495A (zh) | 使用盐分级沉淀分离细胞外囊泡的方法 | |
| JP2006311803A (ja) | 核酸精製方法、及び核酸精製器具 | |
| CN114540343A (zh) | 纯化方法 | |
| GB2584562A (en) | Purification method | |
| EP4163371A1 (en) | Nucleic acid extraction method and application | |
| WO2020260620A1 (en) | Method for enriching nucleic acids by size | |
| US20030228600A1 (en) | DNA isolation method and kit |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220527 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |