CN114539369B

CN114539369B - ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用

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Publication number: CN114539369B
Application number: CN202011326971.7A
Authority: CN
Inventors: 张义荣; 徐瑞斌; 王成; 李毓锋; 兰田玉; 高路路; 倪中福
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN114539369A

Abstract

本发明公开了ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用。本发明提供了ZmEREB167蛋白或其相关生物材料在调控植物籽粒发育中的应用。所述相关生物材料为能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述ZmEREB167蛋白为SEQ ID No.1所示蛋白或其经一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白，或其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。实验证明，ZmEREB167及其编码基因可以调控玉米的籽粒发育。本发明对于培育高产植物新品种具有重要意义。

Description

ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用。

背景技术

玉米是我国产量和播种面积均居第一的主要粮食作物，玉米是重要的粮食和饲料来源，同时也是重要的工业原料，在整个国民经济中有着十分重要的作用。到2050年世界人口将达到90亿提高作物产量仍然是一个十分重要的问题。传统的作物育种方式如今已经不能满足粮食增长的需求，随着分子生物学的发展，运用分子生物学手段，寻找参与调控作物产量性状的相关基因，探究其功能，通过基因工程的手段对这些基因加以利用，将成为提高作物产量的主要方式。

种子大小是一个复杂的农艺性状，种子的大小受内在和外在因素的影响，比如：激素，糖的转运，转录因子的调控以及环境因素等。然而我们对决定粒重的分子机制的理解知之甚少。组织切片发现玉米籽粒由胚胎、胚乳和母体周围组织3部分组成(Doll etal.2020)。在遗传水平，玉米粒重通常由一系列微效基因或数量性状位点(QTL)调控(Zhanget al.2020)，粒重基因的这些特点使我们找到控制粒重基因更加困难。

在玉米中，利用关联分析和同源基因克隆等策略，鉴定了一些控制籽粒发育相关基因。包括ZmSweet4c、Dek35、o11、Emp16,DA1,Mn1和BG1等(Sosso et al.2015；Chen etal.2017；Feng et al.2018；Xiu et al.2016；Xie et al.2017；Li et al.2013；Simmonset al.2020)。Yang等利用关联分析的方法克隆到一个控制玉米粒重的关键基因ZmHKW1,超表达后该基因可以显著增加玉米百粒重(Yang et al.2019)。

发明内容

本发明的目的是提供ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用。

第一方面，本发明要求保护ZmEREB167蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

(a)调控植物籽粒发育；

(b)调控植物籽粒重量；

(c)调控植物籽粒长度；

(d)调控植物籽粒宽度；

(e)调控植物产量。

其中，所述相关生物材料可为能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达ZmEREB167的DNA，该DNA不但可包括启动ZmEREB167基因转录的启动子，还可包括终止ZmEREB167转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

构建含有所述ZmEREB167基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或Gateway系统载体等，如pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pGWB411、pGWB412、pGWB405、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用ZmEREB167构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

所述ZmEREB167蛋白可为如下任一所示蛋白质：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的且来源于玉米的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且来源于玉米的具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述应用中，所述ZmEREB167蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，抑制所述植物的籽粒发育。所述ZmEREB167蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，促进所述植物的籽粒发育。

在上述应用中，所述ZmEREB167蛋白在所述植物中的表达量和/或活性降低，所述植物的籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低。所述ZmEREB167蛋白在所述植物中的表达量和/或活性提高，所述植物的籽粒重量提高和/或籽粒长度增大和/或籽粒宽度增大和/或产量提高。

第二方面，本发明要求保护能够使植物中ZmEREB167蛋白的表达量和/或活性降低的物质在(a1)-(a5)中的应用：

(a1)抑制所述植物的籽粒发育；

(a2)降低所述植物的籽粒重量；

(a3)减小所述植物的籽粒长度；

(a4)减小所述植物的籽粒宽度；

(a5)降低所述植物的产量。

所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第三方面，本发明要求保护能够使植物中ZmEREB167蛋白的表达量和/或活性提高的物质在(b1)-(b5)中的应用：

(b1)促进所述植物的籽粒发育；

(b2)提高所述植物的籽粒重量；

(b3)增大所述植物的籽粒长度；

(b4)增大所述植物的籽粒宽度；

(b5)提高所述植物的产量。

所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

第四方面，本发明要求保护如下方法A或方法B。

方法A：一种抑制植物籽粒发育的方法，可包括使受体植物中ZmEREB167蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法B：一种培育籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低的植物的方法，可包括使受体植物中ZmEREB167蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述方法A和所述方法B均可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

第五方面，本发明要求保护如下方法C或方法D。

方法C：一种促进植物籽粒发育的方法，可包括使受体植物中ZmEREB167蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法D：一种培育籽粒重量提高和/或籽粒长度增大和/或籽粒宽度增大和/或产量提高的植物的方法，可包括使受体植物中ZmEREB167蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述方法C和所述方法D均可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

第六方面，本发明要求保护如下方法E或方法F。

方法E：一种培育籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低的转基因植物的方法，可包括如下步骤：对受体植物中能够表达ZmEREB167蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低。所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

方法F：一种培育籽粒重量提高和/或籽粒长度增大和/或籽粒宽度增大和/或产量提高的转基因植物的方法，可包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达ZmEREB167蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比籽粒重量提高和/或籽粒长度增大和/或籽粒宽度增大和/或产量提高。所述ZmEREB167蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

在所述方法E中，对所述受体植物中能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现，如通过序列特异核酸酶(如CRISPR/Cas9核酸酶)对所述核酸分子进行特异性剪切，从而降低其在所述受体植株中的表达。

在本发明中，具体是通过CRISPER/Cas9技术实现的；以所述植物基因组中ZmEREB167基因中存在的符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，在本发明的具体实施方式中，所述靶序列具体为SEQ ID No.3。

在所述方法F中，向所述受体植物中导入能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子可通过向所述受体植物中导入含有所述核酸分子的重组载体实现。

其中所述核酸分子(ZmEREB167基因)可先进行如下修饰，再导入所述受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

2)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV、MCMV和AMV)。

在上述方法中，将重组表达载体或基因编辑载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子具体可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2(CDS)或SEQ ID No.4(基因组)所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述ZmEREB167蛋白的DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述ZmEREB167蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

第七方面，本发明要求保护前文第四至六方面中任一所述的方法在植物育种中的应用。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述单子叶植物可为禾本科植物。

更进一步地，所述禾本科植物可为玉米。

在本发明的具体实施方式中，所述玉米为野生型玉米B73-329。

在上述各方面中，所述籽粒重量均可体现为百粒重。

实验证明，本发明运用CRISPR-Cas9的方法突变ZmEREB167基因，发现其能显著降低玉米籽粒的百粒重，粒长和粒宽。可见，ZmEREB167基因在调控玉米籽粒的百粒重，粒长和粒宽方面具有重要作用，本发明对于培育高产植物品种具有重要意义。

附图说明

图1为野生型和CRISPR突变体碱基序列比对结果。方框内为突变位点。

图2为野生型和CRISPR突变体氨基酸序列比对结果。

图3为ZmEREB167-KO突变体T3代玉米籽粒表型鉴定。A为百粒重；B为粒长；C为粒宽；D为野生型和突变体种子表型。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

野生型玉米B73-329：记载在“Wei Li,et al.Maize ZmRPH1 encodes amicrotubule-associated protein that controls plant and ear hight.PlantBiotechnology Journal(2020)18,pp.1345-1347”一文，公众可从申请人处获得，尽可用于重复本发明实验使用，不得他用。

实施例1、ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用

本实施例中所涉及的ZmEREB167基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2(CDS)和SEQ IDNo.4(基因组)，其编码的蛋白ZmEREB167的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

一、玉米CRISPR/Cas9系统载体的构建

1、ZmEREB167基因gRNA的设计

首先利用网站http://www.e-crisp.org/E-CRISP/index.html在ZmEREB167基因的结构域区域附近设计gRNA的编码序列(靶序列)：

5’-TCGAGAGCGCCGCTTAAAGAGG-3’(SEQ ID No.3)。

将此序列提交到中国农业大学玉米功能基因组平台进行初步检测，检测结果显示：此gRNA可以作为ZmEREB167基因的CRISPR/Cas9系统的载体。

2、gRNA序列扩增

(1)根据gRNA序列设计含有接头的引物(Cas9-1b-F和Cas9-1b-R)：

Cas9-1b-F：5’-GGCGTCGAGAGCGCCGCTTAAAG AGG-3’；

Cas9-1b-R：5’-AAACCCTCTTTAAGCGGCGCTCTC GA-3’。

(2)磷酸化及引物退火，反应体系如下：

轻轻混匀后，进行反应：37℃30min；95℃5min之后从95℃按5℃/min的速度降温至25℃，得到退火产物。

3、重组载体的构建

(1)用限制性内切酶BsaI对目的载体pBUN411进行单酶切，体系如下：

pBUN411质粒 1μg

CutSmart Buffer(10×) 5μL

BsaI(20units/μL) 1μL

ddH₂O至50μL

37℃1h，然后65℃20min使酶热失活。

(2)将获得的酶切产物在1％琼脂糖凝胶进行电泳，并回收载体pBUN411大片段。

(3)连接及及大肠杆菌转化

将上述步骤2的退火产物与上述载体pBUN411大片段连接，得到重组载体。

重组载体为将上述步骤2的退火产物插入pBUN411载体的BsaI位点间得到的载体，命名为pBUN411-ZmEREB167-KO，该载体表达SEQ ID No.3所示的gRNA，该载体即为CRISPR/Cas9载体。

二、CRISPR/Cas9系统载体转入玉米得到转基因玉米

1、重组农杆菌的制备

将上述步骤一制备的CRISPR/Cas9载体pBUN411-ZmEREB167-KO导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBUN411-ZmEREB167-KO。

实验同时设置向农杆菌EHA105中导入pBUN411载体的空载对照，所得重组农杆菌命名为EHA105/pBUN411。

2、转ZmEREB167-gRNA玉米的构建

(1)转ZmEREB167-gRNA玉米

将上述重组农杆菌EHA105/pBUN411-ZmEREB167-KO转入野生型玉米B73-329中，得到T0代转ZmEREB167基因玉米。

实验同时设置向野生型玉米B73-329中转入EHA105/pBUN411的空载对照。

(2)转ZmEREB167基因玉米阳性苗的PCR检测

根据gRNA所在的基因位置，在其上游及下游各180bp左右设计了引物，引物序列如下：

Cas9-403-F：5’-CATGGTTGTCACCGCATATTC-3’；

Cas9-403-R：5’-TGTTGGCGGTGAGACATTAG-3’。

CTAB法微量提取T0代转ZmEREB167基因玉米叶片DNA作为模板，用Cas9-403-F和Cas9-403-R作为引物进行PCR扩增，得到350bp的PCR扩增产物。以野生型玉米B73-329为对照。

将T0代转ZmEREB167基因玉米的350bp PCR扩增产物和野生型玉米的350bp PCR扩增产物进行测序，序列比对。

对转基因植株和野生型玉米gRNA目标区段进行PCR扩增，然后通过测序的方法获得转基因植株的碱基序列，并与野生型序列进行比对，将与野生型序列有差异的植株定义为转基因阳性植株。

结果显示：共得6株T0代阳性植株，有4种突变类型。选择序列变异为非同义突变并且纯合的单株(KO#1和KO#2)作为之后的实验研究对象。

突变植株KO#1和KO#2突变形式如图1和图2所示。可见突变植株KO#1和KO#2菌因发生移码突变导致翻译提前终止。

(3)ZmEREB167基因的玉米遗传转化和后代鉴定

将阳性T0代转ZmEREB167基因玉米单株收获的籽粒，按行种植，利用Cas9-403-F和Cas9-403-R特异引物对进行PCR扩增。

对PCR产物进行测序，测序结果发现，KO#1和KO#2两个单株的T1代ZmEREB167基因序列发生了纯合突变，突变的方式与T0代相同，证明这个两个单株不是嵌合体。

通过Cas9引物Cas9-F和Cas9-R对发生突变的T1代玉米植株进行PCR扩增，PCR产物跑胶检测，若不含500bp左右大小的条带，为不含载体的ZmEREB167基因的突变体，即为阳性T1代转ZmEREB167基因玉米。

Cas9-F：5’-CTAAGCGGAACAGCGACAAG-3’；

Cas9-R：5’-GGCCAGGTAGAGGAAGTTCAC-3’。

将阳性T1代玉米单株收获的籽粒，按行种植，每个株系种植2行，每行种植11株。

用引物Cas9-403-F和Cas9-403-R引物对DNA分子检测，T2代转基因玉米的ZmEREB167基因测序发现，序列都发生了突变且不含有Cas9载体，突变方式还是T0代两种突变方式。说明这些转基因植株已经是纯系。

T2代转ZmEREB167基因玉米播种，得到T3代玉米(按照上述方法鉴定确认为阳性)。

三、转ZmEREB167基因玉米的表型鉴定

将T3转ZmEREB167基因玉米(KO#1和KO#2)、转入pBUN411的空载对照和野生型种植于海南三亚中国农业大学南繁基地，行长2.5m，株距0.25m，行距0.5m，每行11株，每个重复两行，三次重复，双粒播种，苗期间苗，正常田间管理。

玉米果穗成熟后以株为单位进行单个网袋收获，将玉米果穗在阳光下曝晒1周左右至果穗完全干燥，将长势均一的果穗籽粒手动脱粒，随机挑选100-300粒籽粒，应用万深种子外观品质检测系统(杭州万深检测科技有限公司)对籽粒的百粒重(HKW)、粒长(KL)、粒宽(KW)等性状进行考察。

1、T3转ZmEREB167基因玉米籽粒表型分析

对收获的T3玉米KO#1和KO#2籽粒长度、宽度和百粒重测定后进行比较分析。

结果如图3和表1所示。结果显示，ZmEREB167-KO(KO#1和#2)粒长较野生型分别降低了22.25％和28.95％，粒宽较野生型玉米分别降低了8.81％和7.46％，百粒重较野生型玉米分别降低了9.49％和7.03％。而空载对照的百粒重、粒长和粒宽与野生型基本一致，无统计学差异。

表1、ZmEREB167-KO玉米T3籽粒表型

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国农业大学

<120> ZmEREB167基因在调控玉米籽粒发育中的应用

<130> GNCLN202987

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> Zea mays L.

<400> 1

Met Pro Ser Pro Pro Thr Lys Arg His Lys Pro Val Val Gly Lys Gly

1 5 10 15

Gln Gly Lys Leu Gln Asp Ser Met Ala Lys Asn Tyr Arg Glu Arg Arg

20 25 30

Leu Lys Arg Val Met Lys Ile Asp Glu Gly Glu Asp Asp Phe Glu Ala

35 40 45

Asp Tyr Gln Ala Phe Ser Lys Lys Tyr Asp Glu Lys Asp Glu Cys His

50 55 60

Tyr Lys Phe Met Ala Leu Leu Pro Phe Lys Asn Gly Leu Pro Asn Val

65 70 75 80

Ser Pro Pro Thr Lys Glu Lys Val Gly Leu His Phe Ala Met Lys Asp

85 90 95

Val Val Ile Ser Gln Lys Pro Thr Thr Thr Asn Glu Gly Ile Ile Val

100 105 110

Arg Pro Lys Cys Lys Arg Lys Thr Pro Tyr Arg Gly Ile Arg Arg Arg

115 120 125

Pro Trp Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Thr Lys Gly Val

130 135 140

Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Lys Thr Pro Glu Asp Ala Ala Arg Ala

145 150 155 160

Tyr Asp Ala Glu Ala Arg Lys Ile Arg Gly Asn Lys Ala Lys Val Asn

165 170 175

Phe Pro Asn Glu Pro Pro Asn Met Val Ser Asn Ser Pro Lys Leu Ile

180 185 190

Val Thr Ala Met Thr Thr Met Ala Ile Pro Ala Asp Lys Leu Asn Ala

195 200 205

Asn Glu Leu Met Cys His Lys Asn Tyr Ser Asn Glu Asp Phe Phe Ser

210 215 220

Met Val Asn Phe Ser Gly Asn Asn Gly Asn Phe Ile Ser Thr Ala Ala

225 230 235 240

Phe Gly Leu Gln Cys Ile Lys Lys Pro Arg Val Pro Tyr Gly Ile Pro

245 250 255

Arg Ile Gly Glu Cys Ser Asn Gln Asn Arg Met Thr Tyr Gly Leu Ser

260 265 270

Asn Gly Leu Gly Asn Glu Ala Ser Arg Asn Leu Asn Gly Cys Ser Phe

275 280 285

Leu Pro Gln Ala Gly Met Pro Ile Phe Ile Gln Pro Thr Phe Asp Gly

290 295 300

Pro Ser Arg Met Ile Gly Arg Asn Asp Gly Val Ile Val Pro Thr Leu

305 310 315 320

Thr Asn Ala Thr Pro Met Ala Gly Val Asp Ala Ala Lys Lys Met Asn

325 330 335

Gln Glu Pro Ile Phe Gln Glu Met Glu Ser Glu Asp Ile Pro Ser Ile

340 345 350

Leu Gln Gly Asp Val Ser Glu Asp Val Ala Ala Glu Ile Ser Met Trp

355 360 365

Glu Phe Tyr Asp Asn Leu Leu Asp Asn Lys Glu Asn

370 375 380

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 2

atgccatcac cacccacaaa aagacataag ccagttgtag ggaagggcca agggaaactt 60

caagatagta tggcgaagaa ctatcgagag cgccgcttaa agagggtgat gaagatagat 120

gagggagagg acgactttga agctgattac caagcattct ctaagaagta cgatgagaag 180

gatgagtgcc actataagtt catggcttta ttaccattca agaatggtct tcctaatgtc 240

tcaccgccaa caaaagagaa agttggactt cattttgcca tgaaagatgt tgtgattagt 300

caaaaaccaa ccaccaccaa tgaaggtatc attgtaaggc cgaagtgcaa gcgaaagacc 360

ccatataggg gcatccgccg acgcccttgg ggaaaatggg ctgcagaaat ccgcgatcct 420

acaaaaggtg ttcgtgtttg gttaggcacg tataaaacac cagaagatgc agctagagca 480

tatgacgctg aggcccgcaa gattaggggc aataaagcaa aggtgaattt ccctaatgaa 540

ccaccaaaca tggtgagcaa ttcaccaaaa ctaattgtta ctgcaatgac tacaatggct 600

atcccagcag acaagttgaa tgccaatgaa ttgatgtgcc ataaaaacta ctcaaatgag 660

gattttttct caatggtgaa ctttagtgga aacaatggta actttatttc tactgcggcc 720

tttggcttac aatgtatcaa aaagcctcgt gttccttatg gcatcccaag gattggtgag 780

tgttcaaatc aaaatagaat gacatatggt ttaagtaatg gattgggcaa tgaagctagt 840

aggaacctga atggatgctc tttcttacca caagctggca tgccaatttt cattcaacct 900

acttttgatg gcccttcaag gatgatagga agaaatgatg gcgtgattgt tcctactttg 960

actaatgcaa cacccatggc tggtgttgat gctgcgaaaa agatgaatca agagcctatt 1020

ttccaagaga tggaaagtga agatattcct tctattttgc aaggtgatgt cagtgaggac 1080

gtggcagctg agattagtat gtgggagttt tatgacaacc tattagataa taaggaaaat 1140

tga 1143

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

tcgagagcgc cgcttaaaga gg 22

<210> 4

<211> 5584

<212> DNA

<213> Zea mays L.

<400> 4

acgctagcca tccttctcct cttgggagtt attgtaggag cctttgatac cttcgacaat 60

tttggctctg ttggcgggct caagattttt ggtaccccta ccgtttcccc tagctctggc 120

tctttggccg cctttccttt agcttcggtg tcatgttttg gtgtttcgac taacccggtt 180

gcaggaacct tcggcaattc agccagttct tccctggggc tggtaggagc aggctgttct 240

gcctcagcag tggaagatgt cccttcacca agcttcggca ctgtggttgt ttcaatgtat 300

ctaggccggt gcgttaaaac cttgatcttt ttgcccttcg gcacagcaga aatggccgaa 360

gtggcagctt ttcttttctt tccctgcttt cgcgagggat agctataatc agggtatatg 420

aaaccaatga cgccaaaaac tctattcaaa cttttcttgc ctcgaccttc gaaggccaag 480

gtcattgcat catcttcgac ccttgtatag gccccaagca attcgtcact ggttgtctca 540

atactgctca accactcatc gtttggctca tcaaactcgc ctctatatat gaaggtatat 600

tttagataga ctaggccacc ctgactagac ccgaaagcag cttccttcgg catctcccac 660

tcactcacga gcggccatac tctctatagg cgatgtgctc ttgaaccaag tctcttgtgc 720

caataaaagt gcacacagtg ttgaagcttc tctagcatgc ttctatatca ttcccaagag 780

cagtggttgg cctcctgatg ccgaagtgag accaaatggg gcgttgaata acccatttta 840

tatcttccct ctcaactaag ttattcttca cataaaacca ttcttccatc caggctcctg 900

gccacctttt ccgaaatgtt ggaactggat aacttacatc agagcgaggc acgaagccag 960

aacaaccaaa gttttgtgat actgctcctt gtcagtagcc ttcgtctcat acagtagctc 1020

gtgcatgttg cagaagcatt ttgcgcttgg ctctagccct tggcttctca cggcccaaac 1080

aaaaccccca tcctgataat ggcttcaggg gtaatctgat gaaggaaact ttcgaaggtc 1140

tttagcactt caaccaggaa tttgcttaac gggaaccgaa gccctgcctt catgaagctc 1200

ctgtaaacaa ccacttcatc ttcttcggga gcaagggcgg cattataccc tctagctctc 1260

acaatggaaa tatctcggaa atatctccct ttcatagcat taatttgact ctgcttgatg 1320

gatgattttc cgaagatggt gtgacttggt cgccagggcc gattttcagc atcttcgtct 1380

tcactttcca tatcaaagct tctgctatca tcagaatctt cagacaaatc agctagcatt 1440

tcgtttgtaa tcttctctat gtttgtcttc tccatagcct cgtaaaaacc agctagtgca 1500

ggatcaaaaa ccttcttctc gtcagccatt tgatgggcac ttgaacaaat gccgaagctc 1560

acaaaacaag cgaaatctga cagagcaaga aaattaaaac ttgaaaaata gcacaagcaa 1620

ttgagatggc gcaacaaatg ctgtcgatgc gggttcctat ttatatgccc aagagcactg 1680

caacttggtg gaccctacat gtcattgact ttcgctattc tagtgaaggg aaggtgtttt 1740

ttcggacctt cggctaaaga ccttcgttca cgtcgcagtc taagtttgtt aaatacaaaa 1800

acaaattaat actgcgaggg gctactgttg gggacctttc tcttccaaag ttcctcaaaa 1860

aacttaacta acacgttttc cggtataaca tagactgtta caggaggctt cgactttgag 1920

atgaaggtgt gcgtggtatg aaggtgcagt ctgaacgaag gacaagctag ctccgaagct 1980

gtggctgaag gagcttcggc tcaacacgtt gacgatggtg aaaggagaaa ctgacttaaa 2040

ggggaaaaga ttgcttcgtc ctcgacaact tgccttatgg tcaacagtaa atgtcaagga 2100

catgaatgta atttcgtcca ggctgcgtcc tgtgcctata aatagatgaa cagtaacacc 2160

gtactcttca cgctgacttg taatcactcc tgcatcactc ccgctctttt accttctatc 2220

aagccgaagg tacaaatgta atataattac tattgatgtt tattcatgtt tataaaataa 2280

ggagatgaat aatctaatga tttggaatga ttgtttatat tctttttgtg ttttatatgt 2340

ctttattcat atctttactt actgaaatga tgaaggtatg tccttcatga ccttcgtctg 2400

aagatcatta tattccaagg gagataatgc ttcgaaggac gaaggtattt aatcattaac 2460

aattgtgttg cttttttctt ggtgtatagc attcaagaac aaggaccaac aggtattatc 2520

tctcaagaga gcctagacta gtataaatct tgtgtcttct atgctattac ttttggttct 2580

tagatctcat gaatacccac ttataaatta actatcaaga aatcctcgac acttaggaaa 2640

atatcacttt taatttaaac aaatggtata agtaaagttg tgatatgagc tttcattaga 2700

accttttaga atataatgca tcatgctttt agtgcttaat ttgttgaagc ttgcttgctt 2760

gcttgaactt ctaatctcac aagatccaaa cacaacatta gtatgtcatg cacaacacct 2820

tcttaagata tatagatggg tagattatag agatgtacta aaaattaaag caacttaaag 2880

atggaaaaga tagcatacca aaacaaagtg tggaagtaat caattcttta atgtaacaac 2940

atggtgcatg cttgtccctc tttttgtaat acaaaatgtt atgcaaacac aagtttctct 3000

tcacatgata aatgggaaaa tcacatgtcc catggttgtc accgcatatt cctttgtatc 3060

ttgccaaagc aatcttgtag ccaggttgtc atgccaggct ctaacaaagt gtaacagttt 3120

ggtcttttta gacttcaagt attatgccat caccacccac aaaaagacat aagccagttg 3180

tagggaaggg ccaagggaaa cttcaagata gtatggcgaa gaactatcga gagcgccgct 3240

taaagagggt gatgaagata gatgagggag aggacgactt tgaagctgat taccaagcat 3300

tctctaagaa gtacgatgag aaggatgagt gccactataa gttcatggct ttattaccat 3360

tcaagaatgg tcttcctaat gtctcaccgc caacaaaaga gaaagttgga cttcattttg 3420

ccatgaaagg tatgatttgc taccaaaggt gtgtgtttgt atgttcatca ctagcatatg 3480

tagccatata gatgaatcta tgtgattttt ttctcgcact atttatttag atgtagattt 3540

gcagaatgat ctttctttaa taaattttac gattaattta tggtttctca taatcataat 3600

ttagttgtga gcagtctagt tcattgtcat atactacttg tgctcatgct cacatttttc 3660

tcatatcttt gtttgttgtt ttcctgtaac aattcaatgg gtgggttaag gctgtgaggt 3720

atctaaaaag gctatattaa tatcactagt taaatcaata tttcaatacg aatttaatat 3780

tttcttagaa tataccaggt gaggtggttt atttattggg aattttatag ttctgacctt 3840

agttttggca cgccgctcat atctgccact agtttcagtt ggtgctcaat tttgtccccg 3900

tcaaaccaat gtgtcttcaa ttttaccact ccgtcagcat tctgttgctt cgcccactgt 3960

taccgacatg tgagacccac tacgcagtct ctagcccact tcggcgtcct atgggtccca 4020

cctatcaata acggtgcgcg aaacaacaga ttggtgacag agtggcaaaa ctgagcacaa 4080

attggtttga cagggataaa actgagcatc gactgaaact agtggccgat atgagcggtg 4140

tgccaaaact aaggtcagaa atgtaaaaat ctcttattta ttttatatgt tatatttcac 4200

atatactaga ctcattctgt gtgtcagttg cttcttgata gtgtgaatgt gtcttgatga 4260

aatttctcgg tgttctagtt tagatccctt ttttgcaaag aaccgccaat atgattgttt 4320

atctgatcat tagtatttta aagcaattgt tattcctcta tatagatgtt gtgattagtc 4380

aaaaaccaac caccaccaat gaaggtatca ttgtaaggcc gaagtgcaag cgaaagaccc 4440

catatagggg catccgccga cgcccttggg gaaaatgggc tgcagaaatc cgcgatccta 4500

caaaaggtgt tcgtgtttgg ttaggcacgt ataaaacacc agaagatgca gctagagcat 4560

atgacgctga ggcccgcaag attaggggca ataaagcaaa ggtgaatttc cctaatgaac 4620

caccaaacat ggtgagcaat tcaccaaaac taattgttac tgcaatgact acaatggcta 4680

tcccagcaga caagttgaat gccaatgaat tgatgtgcca taaaaactac tcaaatgagg 4740

attttttctc aatggtgaac tttagtggaa acaatggtaa ctttatttct actgcggcct 4800

ttggcttaca atgtatcaaa aagcctcgtg ttccttatgg catcccaagg attggtgagt 4860

gttcaaatca aaatagaatg acatatggtt taagtaatgg attgggcaat gaagctagta 4920

ggaacctgaa tggatgctct ttcttaccac aagctggcat gccaattttc attcaaccta 4980

cttttgatgg cccttcaagg atgataggaa gaaatgatgg cgtgattgtt cctactttga 5040

ctaatgcaac acccatggct ggtgttgatg ctgcgaaaaa gatgaatcaa gagcctattt 5100

tccaagagat ggaaagtgaa gatattcctt ctattttgca aggtgatgtc agtgaggacg 5160

tggcagctga gattagtatg tgggagtttt atgacaacct attagataat aaggaaaatt 5220

gatggatctt gacatcatgc atggtccata tggcttcttt cttgatgata ctagcaagtg 5280

gtaaggcacc tattggttac taatataggt gataattcaa tcaacttttg ttacttccat 5340

cttttactca cactaaatat atgtactttt tttgaaaaaa attgtaggtt cgaagcatgc 5400

atgatgggga tggggatgta gtcgcaaatg gcatattcat tttataatgt caagtaaatg 5460

cagccgtgtt atccatgtgt atcagtttgg actgtttatt tatgctttgt tgtaagctta 5520

caggcaacgg aacctgattg acattgtggg tgttattgta atgtaatgat aattttcaag 5580

cctt 5584

Claims

1.ZmEREB167蛋白或其相关生物材料在如下任一中的应用：

（a）调控植物籽粒重量；

（b）调控植物籽粒长度；

（c）调控植物籽粒宽度；

（d）调控植物产量；

所述ZmEREB167蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

（A2）在（A1）所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；

所述调控为：使所述ZmEREB167蛋白在所述植物中的表达量降低，所述植物的籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低；

所述植物为单子叶植物。

2.能够使植物中ZmEREB167蛋白的表达量降低的物质在（a1）-（a4）中的应用：

（a1）降低所述植物的籽粒重量；

（a2）减小所述植物的籽粒长度；

（a3）减小所述植物的籽粒宽度；

（a4）降低所述植物的产量；

所述ZmEREB167蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述能够使植物中ZmEREB167蛋白的表达量降低的物质为CRISPR/Cas9载体；所述CRISPR/Cas9载体是将SEQ ID No.3所示gRNA的DNA编码序列插入到pBUN411载体的BsaI位点间后得到的重组载体；所述植物为单子叶植物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子为SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述禾本科植物为玉米。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述籽粒重量为百粒重。

7.一种培育籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低的植物的方法，包括使受体植物中ZmEREB167蛋白的表达量降低的步骤；

所述ZmEREB167蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为单子叶植物。

8.一种培育籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达ZmEREB167蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比籽粒重量降低和/或籽粒长度减小和/或籽粒宽度减小和/或产量降低；

所述ZmEREB167蛋白为如下任一所示蛋白质：

（A1）氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

所述植物为单子叶植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对所述受体植物中能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子进行抑制表达通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：能够表达所述ZmEREB167蛋白的核酸分子为SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的DNA分子。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为玉米。

13.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述籽粒重量为百粒重。

14.权利要求7-13中任一所述的方法在植物育种中的应用。