CN114522274A - 聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备及应用 - Google Patents
聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明介绍了一种聚丙烯腈‑亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架，其由聚丙烯腈‑亚精胺纳米纤维制成，所述聚丙烯腈‑亚精胺纳米纤维的制备方法包括，S1、将聚丙烯腈加入到N,N‑二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌；S2、再加入0.05～0.15g的亚精胺，在室温下搅拌；S3、将共聚合物溶液转移到一个带有电纺喷嘴的10ml注射器中；S4、进行注射参数设定；S5、将铝箔粘在接收器上；S6、启动程序，在室温下进行电纺；S7、干燥后，将电纺纳米纤维收集在铝箔上。本申请通过静电纺丝技术合成光滑、均匀的纳米纤维，具有良好的生物相容性和机械性能，且提高了H2O2诱导的软骨细胞活力，有效地清除活性氧，减轻氧化应激对软骨细胞的损伤，并给治疗骨关节炎提供了一个新的思路。
Description
技术领域
本发明属于生物支架和静电纺丝领域，具体涉及一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备和应用。
背景技术
骨关节炎是一种慢性退行性疾病，通常影响中年人和老年人，导致他们关节疼痛和活动能力受损，严重降低了患者的生活质量。炎症反应与软骨细胞中过多的活性氧有很大关系。骨关节软骨细胞中过多的活性氧，如超氧阴离子、羟基自由基和过氧化氢，往往伴随着抗氧化酶的下调，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化酶。由此产生的氧化应激会造成对软骨细胞的损伤，进而导致基质金属蛋白酶分泌上调和细胞外基质降解，炎症因子分泌上调，软骨细胞死亡，从而加重了骨关节炎。
而关节腔内注射药物是治疗关节炎的主要方法之一，但药物容易在关节腔内发生酶促或化学降解，限制了其生物利用度。因此，需要大剂量或高频率注射来获得治疗效果，但这可能会导致毒性反应。亚精胺是一种具有良好抗氧化作用的天然多胺，但是由于亚精胺是可溶的，关节腔内给药后会迅速被酶解清除。因此，可以通过将亚精胺搭载在适当的载体后将其植入关节腔来解决上述问题，但目前寻找适当的载体仍然是一个挑战。
电纺技术是一种生产生物支架的方法，由于其具有许多优点，如良好的生物相容性、高灵活性，被广泛用于组织工程。所获得的纳米纤维的形态受到多种参数的影响，如施加的电压、共聚物的浓度、推注的流速以及收集器和注入器之间的距离。纳米纤维能够模仿人类细胞外基质的支架，以支持细胞生长。
中国专利CN01822613.2提供了一种治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的方法，其包含给所述对象施用一定量的亚精胺生物合成抑制剂，所述的量足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制。还提供了亚精胺生物合成抑制剂在治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象中的用途，其中所述的抑制剂的量足以实现对亚精胺生物合成的实质性抑制，还进一步提供了制备用于治疗有骨性关节炎的治疗需求的对象的治疗组合物的方法，并进一步提供了鉴定亚精胺生物合成抑制剂的方法，其中所述的抑制剂为亚精胺合酶抑制剂。但是其使用的是亚精胺合酶抑制剂。其进一步证明了亚精胺可以用作治疗骨关节炎。
中国专利CN201910420420.8提供一种聚丙烯腈纤维、聚丙烯腈基碳纤维及其制备方法，主要目的在于提供一种聚丙烯腈纤维，由该聚丙烯腈纤维能制备出性能优异的碳纤维，以使PAN基碳纤维复合材料同时具有较好的抗压性能和抗拉性能。进一步论述了聚丙烯腈可以用作制备纳米纤维。中国专利CN106906689A则进一步介绍了一种聚酰胺环氧氯丙烷树脂自交联聚丙烯腈纤维纸及其制备方法，并通过添加PAE树脂进而明显提高的聚丙烯腈纤维纸力学性能，PAE树脂在纤维周围形成自交联网络结构，起到类似纤维纸张骨架的作用，增强纤维间结合，从而提高聚丙烯腈纤维纸的紧度和强度。
但是目前依旧没有一种完整有效的技术方案，能够将亚精胺接枝到聚丙烯腈上，用于生成高分子共聚混合物以及将共聚混合物用于静电纺丝技术并成功产出纳米纤维用作抗氧化生物支架的制备。
发明内容
为解决上述问题，以求实现将亚精胺接枝到聚丙烯腈上，用于生成高分子共聚混合物以及将共聚混合物用于静电纺丝技术并成功产出纳米纤维用作抗氧化生物支架的制备。
一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架，其由聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维制成，所述聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维由亚精胺接枝到聚丙烯腈生成的高分子共聚混合物制成。
一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其制备方法包括以下步骤；
S21、将聚丙烯腈加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌；
S22、再加入0.05～0.15g的亚精胺，在室温下搅拌；
S23、将共聚合物溶液转移到一个带有电纺喷嘴的10ml注射器中；
S24、进行注射参数设定；
S25、将铝箔粘在接收器上；
S26、启动程序，在室温下进行电纺；
S27、干燥后，将电纺纳米纤维收集在铝箔上。
优选地，所述S21步骤中，聚丙烯腈比例为0.3～1.2g；N,N-二甲基甲酰胺比例为10ml。
优选地，所述S21步骤中，在室温下搅拌的时间为8-12小时。
优选地，所述S22步骤中，在室温下搅拌的时间为48小时。
优选地，所述S24步骤中，所述注射参数设定为推进速度为0.8-1.2ml/小时，电场电压被设定为10-15KV。
优选地，所述S25步骤中，所述接收器离注射器喷嘴距离约10-15cm。
优选地，所述S27步骤中，干燥环境条件为室温下干燥12小时。
本申请的优点和效果如下：
1、通过静电纺丝技术生产的聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维作为一种新型的ROS清除剂，可以有效地清除活性氧，从而减轻氧化应激对软骨细胞的损伤。
2、通过静电纺丝技术可以合成光滑、均匀的纳米纤维，并且具有良好的机械性能。
3、聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维具有良好的生物相容性，且可以提高H2O2诱导的软骨细胞的活力，结果显示该支架发挥了显著的抗氧化作用。
4、本申请通过电纺纳米纤维膜结合生物活性分子清除活性氧来治疗骨关节炎提供了一个新支架产品。
上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，从而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下以本申请的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
根据下文结合附图对本申请具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本申请的上述及其他目的、优点和特征。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法流程图；
图2为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维的扫描电镜图；
图3为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维膜机械性能检测图；
图4为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维总抗氧化能力图；
图5为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维清除DPPH自由基能力图；
图6为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维清除H2O2能力图；
图7为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维生物相容性图；
图8为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维提高H2O2诱导下软骨细胞活力图；
图9为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维清除细胞内ROS图。
具体实施例
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特定细节仅仅是为了帮助全面理解本申请的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本申请的范围和精神。另外，为了清楚和简洁，实施例中省略了对已知功能和构造的描述。
应该理解，说明书通篇中提到的“一个实施例”或“本实施例”意味着与实施例有关的特定特征、结构或特性包括在本申请的至少一个实施例中。因此，在整个说明书各处出现的“一个实施例”或“本实施例”未必一定指相同的实施例。此外，这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。
此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身并不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。
本文中术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B，同时存在A和B三种情况，本文中术语“/和”是描述另一种关联对象关系，表示可以存在两种关系，例如，A/和B，可以表示：单独存在A，单独存在A和B两种情况，另外，本文中字符“/”，一般表示前后关联对象是一种“或”关系。
本文中术语“至少一种”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和B的至少一种，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。
还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含。
实施例1
请参考图1，本实施例主要介绍一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架及其制备方法；
一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架由聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维制成，所述聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维由亚精胺接枝到聚丙烯腈生成的高分子共聚混合物制成。
一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其制备方法包括以下步骤；
S21、将聚丙烯腈加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌；
S22、再加入0.05～0.15g的亚精胺，在室温下搅拌；
S23、将共聚合物溶液转移到一个带有电纺喷嘴的10ml注射器中；
S24、进行注射参数设定；
S25、将铝箔粘在接收器上；
S26、启动程序，在室温下进行电纺；
S27、干燥后，将电纺纳米纤维收集在铝箔上。
优选地，所述S21步骤中，聚丙烯腈比例为0.3～1.2g；N,N-二甲基甲酰胺比例为10ml。
优选地，所述S21步骤中，在室温下搅拌的时间为8-12小时。
优选地，所述S22步骤中，在室温下搅拌的时间为48小时。
优选地，所述S24步骤中，所述注射参数设定为推进速度为0.8-1.2ml/小时，电场电压被设定为10-15KV。
优选地，所述S25步骤中，所述接收器离注射器喷嘴距离约10-15cm。
优选地，所述S27步骤中，干燥环境要求为室温下干燥12小时。
本申请通过静电纺丝技术生产的聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维作为一种新型的活性氧清除剂，可以有效地清除活性氧，从而减轻氧化应激对软骨细胞的损伤。
本申请通过静电纺丝技术可以合成光滑、均匀的纳米纤维，并且具有良好的机械性能。
本申请聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维具有良好的生物相容性，且可以提高H2O2诱导的软骨细胞的活力，发挥了显著的抗氧化作用。
本申请本申请通过电纺纳米纤维膜结合生物活性分子清除活性氧来治疗骨关节炎提供了一个新的思路。
实施例2
基于上述实施例1，本实施例主要介绍了聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的应用；
请参考图2，图2为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维的扫描电镜图，将纳米纤维裁剪成0.5×0.5cm正方形，放入真空干燥箱干燥过夜后，将纳米纤维贴附与金属板上，在其表面溅射一层薄薄的金离子，然后用扫描电子显微镜观察其表面形态和纤维直径。通过扫描电镜(SEM)观察纳米纤维的形态、分布，结果表明，纤维是均匀、光滑和随机分布的。
请参考图3，图3为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维膜机械性能检测图，将纳米纤维切成大小为10×20毫米的矩形(n＝5)，拉伸测试是通过单轴拉伸测试模块(Instron 5942，美国)进行的。测量长度被设定为20毫米，拉伸速率为10毫米/分钟。纳米纤维膜的抗拉伸强度为4.36±2.24MPa，杨氏模量为16.89±0.48MPa，表明纳米纤维具有良好的机械性能。随着SPD的加入，纳米纤维膜的抗拉伸强度相比对照组提高了50％以上，其中PAN-SPD(0.1)、PAN-SPD(0.15)组的抗拉伸强度均超过了6.5Mpa。随着抗拉伸强度的提高，纤维的最大拉伸形变减小。
图4为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维总抗氧化能力图，采用基于2,2-Azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6sulfonic酸(ABTS·+)脱色试剂盒对纳米纤维的总抗氧化能力进行了评价。ABTS原液与过硫酸钾混合，室温黑暗放置12h，生成ABTS+。得到的深蓝色自由基混合物，在使用前将稀释自由基混合物，并测定734nm处的吸光度，直到稀释倍数使得734nm处的吸光度为0.7左右。将稀释的ABTS·+工作液与纳米纤维混合室温黑暗10min。酶标仪检测734nm处吸光度。从图上可以明显得出加入SPD后的纤维均显示出较好的抗氧化性能。
图5为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维清除DPPH自由基能力图；将纳米纤维的20毫克浸入20毫升DPPH/MeOH溶液中，在每个设定的时间点以10000转/分钟的速度离心3分钟，之后取上清液在517nm处测定吸光度。通过测量实验组与对照组相比吸光度的变化来表示对DPPH自由基的抑制程度，根据公式计算抗氧化活性，结果以DPPH抑制率(％)表示。随着SPD的加入，纳米纤维清除DPPH自由基能力显著提升，其中PAN-SPD(0.1)、PAN-SPD(0.15)组的清除DPPH自由基能力均超过了50％，显示出纳米纤维具有良好的抗氧化能力，而单纯PAN纤维清除自由基能力不到20％。
图6为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维清除H2O2能力图，溶氧仪器在自动校准和归零后，将纳米纤维20ng浸泡在10ml的PBS缓冲液(pH7.4)中，然后在溶液中加入1ml30％的H2O2，用一个探头测量生成的氧气浓度，从结果可以看出纳米纤维具有良好的抗氧化能力。经实验评估纳米纤维的抗氧化能力，从结果可以看出PAN-SPD(0.1)、PAN-SPD(0.15)组纳米纤维具有良好的抗氧化能力，48小时清除率超过50％，显著高于单纯PAN纤维。
图7为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维生物相容性图；将纳米纤维裁剪成6孔细胞培养板大小铺于6孔板，75％酒精浸泡2小时，无菌PBS冲洗3遍，紫外光照射过夜。将P2代SD大鼠软骨细胞以15×104/孔的密度种于纳米纤维上72小时，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。结果表明纳米纤维具有良好的生物相容性。
图8为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维提高H2O2诱导下软骨细胞活力图；将纳米纤维裁剪成6孔细胞培养板大小铺于6孔板，75％酒精浸泡2小时，无菌PBS冲洗3遍，紫外光照射过夜。将P2代SD大鼠软骨细胞以15×104/孔的密度种于纳米纤维上，并用0.4mmol/L H2O2处理后，通过CCK-8实验评估H2O2诱导下细胞活力。结果表明纳米纤维可以有效提高H2O2诱导下的软骨细胞活力。
图9为聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维清除细胞内ROS图。用0.4mmol/L H2O2诱导后，将纳米纤维上的软骨细胞与1μM的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)在37℃，5％CO2下黑暗中培养30分钟。用PBS冲洗2-3次后，用激光扫描共聚焦显微镜(Leica-STELLARIS，德国)获得软骨细胞中ROS的图像。DCFH-DA荧光探针实验测定材料清除细胞内ROS能力，结果显示，PAN-SPD(0.1)组纳米纤维的细胞内ROS水平最接近于空白对照组。
通过将纳米纤维和软骨细胞共培养并用H2O2诱导体外骨关节炎模型，通过CCK-8实验评估材料的生物相容性和H2O2诱导下细胞活力，DCFH-DA荧光探针实验测定材料清除细胞内ROS能力，结果可以看出纳米纤维能够有效清除细胞内的ROS。
通过上述多种数据验证，可以明显判断出本申请的聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架具有良好的特性，可以作为有效的活性氧清除剂，从而减轻氧化应激对软骨细胞的损伤并发挥了明显的抗炎作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，其并非因此限制本发明的保护范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，通过常规的替代或者能够实现相同的功能在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行变化、修改、替换、整合和参数变更均落入本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架，其特征在于，其由聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维制成，所述聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维由亚精胺接枝到聚丙烯腈生成的高分子共聚混合物制成。
2.根据权利要求1所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，其制备方法包括以下步骤；
S21、将聚丙烯腈加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌；
S22、再加入0.05～0.15g的亚精胺，在室温下搅拌；
S23、将共聚合物溶液转移到一个带有电纺喷嘴的10ml注射器中；
S24、进行注射参数设定；
S25、将铝箔粘在接收器上；
S26、启动程序，在室温下进行电纺；
S27、干燥，将电纺纳米纤维收集在铝箔上。
3.根据权利要求2所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，所述S21步骤中，聚丙烯腈比例为0.3～1.2g；N,N-二甲基甲酰胺比例为10ml。
4.根据权利要求2所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，所述S21步骤中，在室温下搅拌的时间为8-12小时。
5.根据权利要求2所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，所述S22步骤中，在室温下搅拌的时间为48小时。
6.根据权利要求2所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，所述S24步骤中，所述注射参数设定为推进速度为0.8-1.2ml/小时，电场电压被设定为10-15KV。
7.根据权利要求2所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，所述S25步骤中，所述接收器离注射器喷嘴距离约10-15cm。
8.根据权利要求2所述的一种聚丙烯腈-亚精胺纳米纤维抗氧化生物支架的制备方法，其特征在于，所述S27步骤中，干燥环境条件为室温下干燥12小时。
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2022
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