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CN114457067B - 一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 - Google Patents

一种低成本快速去除dna合成中错误的方法 Download PDF

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CN114457067B CN202210115298.5A CN202210115298A CN114457067B CN 114457067 B CN114457067 B CN 114457067B CN 202210115298 A CN202210115298 A CN 202210115298A CN 114457067 B CN114457067 B CN 114457067B
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Abstract

本发明提供了一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。本发明将纤维素包被磁珠与错配结合蛋白二者进行组合，建立一种可用于DNA合成中有错DNA高效去除的方法。在该方法中，磁珠制备简单，材料成本低，错配结合蛋白的结合快速简便，对于有错DNA的去除快速有效。

Description

一种低成本快速去除DNA合成中错误的方法
技术领域
本发明涉及到生物技术领域。具体地，涉及通过构建一种纤维素包被的磁珠，快速结合错配结合蛋白(MutS)-纤维素结合域融合蛋白，去除与MutS结合的有错配的DNA。本发明可用于降低DNA合成中的错误，提高DNA合成效率，降低DNA合成成本。
背景技术
随着合成生物学的发展，对DNA从头合成的需求越来越大。DNA的从头合成通常先合成寡核苷酸，再将寡核苷酸组装成1Kb左右的DNA片段。需要更长的DNA时，可以通过将1Kb的DNA进一步组装获得。传统的寡核苷酸的合成方法采用的是在多空玻璃柱或其他材料上的固相亚磷酰胺三酯法合成，技术比较成熟，产量相对较大，但也使得成本较高。新型的基于芯片的高通量原位寡核苷酸合成技术是一类高通量并行合成寡核苷酸的技术，该技术可以在一张芯片上合成数千，甚至数万种不同的寡核苷酸，可以极大的降低单种寡核苷酸的合成成本(王冬梅et al.,2012)。但是由于寡核苷酸合成过程中难免会有错误，而芯片合成的寡核苷酸错误率更高，DNA合成中的错误去除或纠正就尤为重要。
DNA合成中错误去除的方法有两大类，即核酸酶切除法和错配结合蛋白(MutS)结合法(王冬梅et al.,2012)。当将DNA进行变性退火以后，正确和错误的DNA之间会形成错配，以上两种方法都可以将有错配的DNA去除。核酸酶法是通过一类能识别错配的核酸酶，找到DNA错配部分，并将其切断一条链，再切去错配的碱基，处理过的DNA可以通过DNA组装和扩增获得错误率大幅度降低的DNA片段。而错配结合蛋白方法，一般采用MutS结合有错配的DNA，再将MutS和有错配DNA复合物去除，获得无错DNA。上述两种方法，由于技术原因都不可能完全去除有错DNA。
错配结合蛋白结合法只需一种蛋白，而核酸酶法常常需要两种以上酶，因此，错配结合蛋白法更简单一些。错配结合蛋白结合错配DNA后与无错DNA的分离可以通过电泳分离(Carr et al.,2004)或固定化MutS的分离，并且已有报道证明通过MutS的方法，获得完全正确的DNA的比例比其他方法高(Lubock et al.,2017)。电泳方法相对麻烦，步骤多，而固定化法相对快捷、简便。固定MutS也有报道采用磁珠法，但是磁珠法中的磁珠需要进行链霉亲和素交联，价格昂贵，蛋白需要生物素标记，整个固定化过程繁琐(Geschwind et al.,1996)。本发明人前期建立了与纤维素结合域融合重组表达MutS蛋白，可以快速简便地将MutS融合蛋白固定到纤维素上，填充成纤维素柱进行DNA合成错误去除的方法，可大幅度降低成本(Wan et al.,2014；Wan et al.,2017)。该方法已经在大规模芯片合成的寡核苷酸的错误去除中证明有效，但是该方法不足之处是需要的DNA量相对较大，而且操作进行的体积较大(0.5mL)。
本发明将利用纤维素结合域在纤维素上的固定化的便利性，同时依据多糖包被磁珠制作方法，制作多糖包被的磁珠，然后将两者结合起来，建立一种小体积的快速DNA错误去除方法，并且以从头合成GFP基因DNA过程中的错误去除为例进行验证。
发明内容
本发明的目的是建立一种低成本、简便、快速的方法去除DNA合成中的错误，降低DNA合成成本，减小反应体积，为将来在自动化设备上应用做准备。
本发明的技术内容：
本发明中将栖热水生菌的错配结合蛋白MutS(TaqMutS)或大肠杆菌的错配结合蛋白MutS(EcoMutS)与纤维素结合域3(CBM3)融合表达；而需要纠错的DNA样本通过变性退火从而将合成错误的碱基展示为错配碱基；再利用融合蛋白中的MutS蛋白特异性识别并结合含有错配碱基对的双链DNA的能力，可以将这些有错误碱基的DNA双链结合到融合蛋白中的MutS上；再通过纤维素包被的磁珠与融合蛋白中的纤维素结合域3结合，从而与结合有错配DNA的MutS融合蛋白结合，在移除磁珠的同时将有错配DNA和MutS融合蛋白同时除去，从而实现去除含有错误的DNA的目标(其原理参见图1)。在本发明的方法中，先进行了含有错配的59bp的双链DNA的测试，意外发现并非所有融合蛋白均有效，其中仅TaqMutS融合蛋白有效，而EcoMutS融合蛋白无效。在此基础上通过合成绿色荧光蛋白的基因(GFP)进行了测试，证明EcoMutS融合蛋白有效，使错误率从3.01个/Kb降到了0.62个/Kb.
本发明涉及以下技术方案：
1、用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA。
2、根据项目1所述的方法，其中，在所述使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白与所述DNA样品混合，并常温放置。
3、根据项目2所述的方法，其中，所述常温放置持续时间为至少10分钟。
4、根据项目1所述的方法，其中，在所述使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述纤维素包被的磁珠添加到样品中，并用磁铁吸附磁珠，从而去除合成的有错误的DNA。
5、根据项目1所述的方法，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:28所示。
6、根据项目1所述的方法，其中所述纤维素包被的磁珠的制备方法包括：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
7、一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的试剂盒，其包括TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白，和纤维素包被的磁珠。
8、根据项目7所述的试剂盒，其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:28所示。
9、根据项目7所述的试剂盒，其中，所述纤维素包被的磁珠是通过以下制备的：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
具体地，本发明包括以下内容：
1)将TaqMutS和EcoMutS的大肠杆菌重组表达菌株(专利ZL201410023235.2)活化，蛋白表达纯化后进行错配DNA结合能力的测试，确定有结合能力后用于本发明。
2)将FeCl3，乙二醇和微晶纤维素混合后在200℃保温12h制备获得纤维素包被的磁珠，然后用磁铁在离心管外吸附磁珠，用纯水洗涤两次，最后加20％乙醇重悬，保存。
3)将第一项中的TaqMutS或EcoMutS与有错配的DNA结合，并用磁珠拉去MutS和结合的DNA，检测错配DNA去除情况，显示TaqMutS可有效去除错配DNA，而EcoMutS无效。
4)将可用于合成EGFP的20根寡核苷酸进行组装合成GFP基因全长DNA，并在100℃开始，缓慢降温，退火，使有错的DNA之间以及有错和无错的DNA之间形成错配。
5)将第1项中纯化的TaqMutS与第4项中的组装成的GFP基因DNA混合结合有错配的DNA，然后加入纤维素磁珠，通过磁铁吸附磁珠同时拉下MutS及结合的DNA。
6)上清经过PCR扩增，并连接到表达载体pET22b，转化大肠杆菌BL21(DE3),随机挑选克隆进行测序，对GFP基因DNA序列比对，分析错误率，发现以没有纠错的GFP DNA序列为对照，错误率由3.1个/Kb,降低到0.62个/kb。
在本发明中，所述“错配”是指在DNA合成中出现的碱基的缺失、插入、替换等错误合成。
在本发明中，所述“TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白”可简称为“TaqMutS融合蛋白”，二者在本文中可互换使用；在本发明中，所述“EcoMutS和纤维素结合域的融合蛋白”可简称为“EcoMutS融合蛋白”，二者在本文中可互换使用。
技术效果
首先，商业化的磁珠，虽然不同厂家和不同类型，价格不同，但是售价都很高，本发明利用乙二醇，FeCl3和纤维素制备的磁珠价格低廉(3.12元/g)，而每个纠错反应仅需0.4mg，换算成本约1分人民币；
其次，在现有技术中，将蛋白与磁珠的偶联，通常需要各种理化方法修饰，链接，周期长，步骤繁琐。比如磁珠表面的链霉亲和素修饰，需要将蛋白进行生物素标记；还有磁珠通过表面固定化抗体和其他蛋白，通过蛋白间相互作用来固定目标蛋白；还有些磁珠需要用修饰过琼脂糖进行包埋，有些磁珠需要先制备四氧化三铁磁核，再在四氧化三铁磁核上进行化学修饰，步骤多，而本发明方法简洁。
再次，本发明利用融合蛋白中所包含的纤维素结合域与包被有纤维素的磁珠结合，由于磁珠包被了纤维素，而纤维素结合域融合蛋白能够在常见的缓冲液中和纤维素快速结合(10分钟以内)，避免了其他结合蛋白磁珠的长时间孵育，本发明过程快速简便；
此外，磁珠还需要特异的固定MutS融合蛋白，且不能对DNA有明显的非特异的吸附。现有技术中的磁珠不仅可用于结合蛋白，也可结合核酸，而本发明的磁珠对DNA没有明显非特异性吸附，纠错效果更优(参见图3，完全配对的DNA(58bp)没有明显损失，表明本发明的磁珠对DNA没有明显非特异性吸附)。
最后，纠错过程快捷，使用MutS蛋白少。之前使用的MutS纠错过程中，需要的蛋白量较多，体积较大，不适合将来的自动化高通量错误去除，本发明的方法将纠错反应体积控制到10μl,可以减少材料成本同时便于自动化方面的应用，同时还能在很短的时间内完成纠错。
另外，发明人意外地发现，“TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白”和“EcoMutS和纤维素结合域的融合蛋白”均能结合错配的DNA，但是使用纤维素包被的磁珠仅能去除“TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白”所结合的错配DNA，而不能去除EcoMutS和纤维素结合域的融合蛋白”所结合的错配DNA。即，仅TaqMutS融合蛋白与磁珠结合并有效去除错配DNA，而EcoMutS融合蛋白无效，表明了并非所有错配蛋白均可用于本发明的方法中，而本发明通过一系列的研究，发现了仅TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白可用于本发明的方法中。其可能的原因是，在融合蛋白与磁珠结合时，可能由于磁珠表面的电荷等原因导致了MutS的结构发生改变，影响了MutS结合有错配DNA的能力。而TaqMuts结构稳定，不易改变，保持了结合有错配DNA的能力。
附图说明
图1显示了新型磁珠与错配结合蛋白MutS相结合去除有错DNA的原理。
图2显示了纯化的MutS融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；其中，A为EcoMutS融合蛋白，B为TaqMutS融合蛋白。
图3显示了MutS融合蛋白结合错配DNA的测试。其中，图3A显示了TaqMutS融合蛋白的结果；其中，1.TaqMutS，2.59和54bp DNA，其中59bp DNA有T/-错配，3.TaqMutS+DNA，4.TaqMuts+DNA+磁珠，M,DNA分子量标准。图3B显示了EcoMutS融合蛋白的结果；其中，1.EcoMutS，2.59和54bp DNA，其中59bp DNA有T/-错配，3.EcoMutS+DNA，4.EcoMuts+DNA+磁珠，M,DNA分子量标准。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
材料与试剂：
本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上试剂。微晶纤维素Avicel PH105购自FMC Co(Philadelphia,PA)；大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)购自擎科，用于表达重组蛋白质；包含1μmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，100μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)培养基用作表达培养基；FeCl3·6H2O，乙二醇，NaAc·3H2O，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
磁珠制作方法：
按现有技术文献(Huang et al.,2009)中所述的方法，将磁珠通过热熔剂的方法进行修改调整后(即将文献中的葡聚糖，壳聚糖和聚丙烯酸换成纤维素)进行合成，具体的步骤是：
1)将0.338g的六水氯化铁(FeCl3·6H2O,1.25mmol)溶于10ml的乙二醇中产生清澈的黄色溶液；
2)然后加入1.36g的醋酸钠(NaAc·3H2O,10mmol)和0.125g的微晶纤维素，将混合物剧烈搅拌30分钟，将混合物密封在压力容器中；
3)加热到200摄氏度，12个小时，室温冷却，用磁铁收集产物，使用50mL水清洗两遍，再用10mL 20％乙醇重悬，获得纤维素包被的词组。
EcoMutS和TaqMutS融合蛋白的制备：
上述两种融合蛋白的制备方法及序列与专利申请ZL 201410023235.2中相同，因此可参考现有技术ZL 201410023235.2制备两种融合蛋白，具体的制备方法可如下所述。
1)分别将包含质粒pEcoMutS-CBM-EGFP和pCBM-EGFP-TaqMutS的大肠杆菌BL21(DE3)细胞接种到含有100μg/ml Amp的LB液体培养基中(其中，所述质粒pEcoMutS-CBM-EGFP和pCBM-EGFP-TaqMutS的制备方法参见ZL 201410023235.2)，37℃，250rpm前培养至OD为0.6～0.8。然后加入终浓度为1μM的IPTG诱导目标蛋白的表达。对于TaqMutS，在37℃诱导表达4小时之后，离心回收(8000×g，10分钟，4℃)细胞用于TaqMutS纯化。对于EcoMutS，在16℃诱导表达16小时之后，离心(8000×g，10分钟，4℃)回收细胞用于纯化。
2)重组蛋白的纯化
将离心回收的细胞，重悬在细胞破碎缓冲液(20mM Tris–HCl缓冲液(pH 7.6),300mM KCl,5mM咪唑)中，通过超声破碎仪(Sonics Ultra-cell VCX 130)进行细胞破碎，设置为30％强度，破碎时间3分钟，破碎1秒停3s。离心(14000×g，15分钟，4℃)收集上清，获得的上清使用Ni柱(金斯瑞生物科技公司)按照使用说明书进行目的蛋白的纯化；简言之，首先将上清上样到Ni柱上，由于目的蛋白C端含有6×His纯化标签，可以结合到Ni柱上，然后使用清洗缓冲液(20mM Tris–HCl缓冲液pH 7.6,300mM KCl,40mM咪唑)洗去非特异性结合的蛋白，最后使用洗脱缓冲液(20mM Tris–HCl缓冲液(pH 7.6),300mM KCl,250mM咪唑,1mMDTT)，于4℃透析置换缓冲体系。目标蛋白使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)测定蛋白浓度，以牛血清蛋白BSA为标准蛋白，图2为纯化后的目标蛋白的SDS-PAGE分析结果，从图中可以看出，MutS纯度较高，但有少量降解带。从1L培养的细胞，经过纯化能够获得约30mg(～0.05μmol)且纯度高于90％的目标蛋白。
实施例1EcoMutS和TaqMutS融合蛋白与纤维素磁珠结合去除有错DNA。
1)首先对EcoMutS和TaqMutS融合蛋白的功能进行验证。
将6μl 10×退火缓冲液(100mM Tris–HCl,pH 7.6,500mM NaCl,10mM EDTA)，6μl寡核苷酸1(10μM,SEQ ID NO:1)和6μl寡核苷酸2(10μM,SEQ ID NO:2)混合，在100℃变性，缓慢退火，形成有腺嘌呤缺失错配(-/T)的双链DNA(59bp)。同样的将寡核苷酸3(SEQ IDNO:3)和寡核苷酸4(SEQ ID NO:4)进行退火，形成无错配的双链DNA(54bp)。然后取上述退火的双链DNA各0.5μl，5μM的MutS融合蛋白(TaqMutS或EcoMutS融合蛋白)4.5μl，10×结合缓冲液(20mM Tris–HCl,pH 7.6,100mM KCl，5mM MgCl2)1μl，加入3.5μl水，混合后室温放置10分钟，通过5％的PAGE自然胶进行电泳。结果如图3所示，TaqMutS和EcoMutS融合蛋白都能结合错配DNA，说明两种蛋白都有功能(图3A和B中第3道)。
2)通过磁珠去除结合错配DNA的MutS及所结合的错配DNA。
在1)中获得的结合了错配DNA的MutS溶液中加入0.4mg纤维素包被的磁珠，混合后，用磁铁吸住磁珠，取上清，按1)中所述进行电泳，发现使用TaqMutS融合蛋白的上清中错配DNA大幅度减少(图3A第4道)，而EcoMutS融合蛋白则无效(图3B第4道)。
实施例2将纤维素包被的磁珠和TaqMutS融合蛋白结合用于以GFP基因为例的基因合成中，证明本发明的方法有效。
1.GFP基因DNA的组装
合成的GFP基因的DNA序列见SEQ ID NO:5，通过软件DNAworks将GFP的DNA序列拆分成20条寡核苷酸(SEQ ID NO:6--SEQ ID NO:25)，通过PCA方法进行GFP基因DNA的组装(Stemmer et al.,1995)。本发明使用的寡核苷酸为从上海生工获得的脱盐处理的寡核苷酸，PCA方法可参考Stemmer et al.,1995，其具体步骤如下：
第一步 重叠PCR
50μl反应体系的组分如下：
寡核苷酸P1(SEQ ID NO:6)(10μM) 0.5μl
寡核苷酸P20(SEQ ID NO:25)(10μM) 0.5μl
寡核苷酸P2-P19(10μM)(SEQ ID NO:7-24) 各0.15μl
dNTP(2.5mM) 5μl
25mM MgSO4 4μl
KOD缓冲液 5μl
KOD plus DNA聚合酶 1μl
H2O 31.3μl
总计 50μl
PCR反应条件：
95℃5分钟
95℃30秒变性
55℃30秒退火
72℃,延伸1分钟，回到95℃变性，循环25次
4℃保温
第二步PCR的反应体系如下：
PCR反应条件：
95℃：5分钟
95℃：30秒变性
55℃：30秒退火
72℃：延伸1分钟，回到95℃变性，循环25次
4℃保温
2.有错DNA的错误去除
将上述获得的GFP基因组装第二步的产物，通过琼脂糖电泳，并用胶回收试剂盒(Promega，美国)进行切胶回收，然后取一定量进行加热变性再复性后使用磁珠法去除错误DNA。具体步骤如下：
(1)变性退火：
在1.5mL离心管中加入1μL变性缓冲液(10x变性退火缓冲液:10mM Tris-Cl(pH7.6),50mM NaCl,1mM EDTA)，再加入终浓度为0.1μmol的DNA(GFP)，再加水至总体积10μL。95℃水浴5分钟，缓慢降温到室温。
(2)错误DNA去除：
取1μl上述(1)获得的溶液加入1.5mL离心管中，并加入终浓度为5μMMutS(EcoMutS或TaqMutS融合蛋白)混合均匀，常温10分钟后加入终浓度0.4mg纤维素包被的磁珠(体积依据磁珠浓度调整)，混合后，用磁铁吸附磁珠，取上清作为去除的错误DNA。
3.合成的GFP基因序列的测定分析。
将用磁珠分离的去除的错误DNA进行测定分析，具体步骤如下(1)-(3)所示：
(1)载体的构建。
将pET22b(Novagen)(包含Nde I和Xhol I位点)和GFP基因同源重组，从而将错配的DNA进行PCR扩增之后，连接到载体pET22b中。
具体如下：
pET22b载体制备的反应体系如下：
37℃，酶切12h后，使用PCR clean试剂盒(Promega)回收酶切的pET22b载体。
然后将回收的pET22b载体与GFP基因(SEQ ID NO:5)通过重组酶CloneExpressIIone step cloning Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行连接，反应体系如下：
37℃保温30分钟，获得pET22b与GFP的连接产物。
(2)载体大肠杆菌的转化。
将上述连接产物与大肠杆菌BL21(DE3)感受态(擎科，中国)混合，按说明书转化，涂布到含有10μM氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。
(3)在平板上随机挑取菌落，进行序列测定(上海生工)。将测序结果，与要合成的GFP基因的理论序列进行对比，并分析进行纠错或未纠错的GFP DNA中的错误率。错误率对比见表1，可见通过本发明的方法，错误率由3.01/Kb，下降到了0.62/Kb。
表1纠错与不纠错的合成的GFP基因DNA中错误率比较
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
参考文献：
Carr,P.A.,Park,J.S.,Lee,Y.J.,Yu,T.,Zhang,S.G.,Jacobson,J.M.2004.Protein-mediated error correction for de novo DNA synthesis.NucleicAcids Research,32(20),e162.
Geschwind,D.H.,Rhee,R.,Nelson,S.F.1996.A biotinylated MutS fusionprotein and its use in a rapid mutation screening technique.Genetic Analysis-Biomolecular Engineering,13(4),105-111.
Huang,X.L.,Zhuang,J.,Chen,D.,Liu,H.Y.,Tang,F.Q.,Yan,X.Y.,Meng,X.W.,Zhang,L.,Ren,J.2009.General Strategy for Designing Functionalized MagneticMicrospheres for Different Bioapplications.Langmuir,25(19),11657-11663.
Lubock,N.B.,Zhang,D.,Sidore,A.M.,Church,G.M.,Kosuri,S.2017.Asystematic comparison of error correction enzymes by next-generationsequencing.Nucleic Acids Research,45(15),9206-9217.
Stemmer,W.P.C.,Crameri,A.,Ha,K.D.,Brennan,T.M.,Heyneker,H.L.1995.Single-Step Assembly of a Gene and Entire Plasmid from Large Numbersof Oligodeoxyribonucleotides.Gene,164(1),49-53.
Wan,W.,Li,L.,Xu,Q.,Wang,Z.,Yao,Y.,Wang,R.,Zhang,J.,Liu,H.,Gao,X.,Hong,J.2014.Error removal in microchip-synthesized DNA using immobilizedMutS.Nucleic Acids Res,42(12),e102.
Wan,W.,Lu,M.,Wang,D.,Gao,X.,Hong,J.2017.High-fidelity de novosynthesis of pathways using microchip-synthesized oligonucleotides andgeneral molecular biology equipment.Sci Rep,7(1),6119.
王冬梅,宛雯,洪泂.2012.DNA化学合成中的错误去除.生命的化学,32(1),34-38.
序列表
Seq ID No.1
GCGGACTATTTAACACAGCTTTAGGCGCTGGACGAGGTACTATGAATCGGCCTTGCTCC Seq IDNo.2
GGAGCAAGGC CGATTCATAG TACCTCGTTC AGCGCCTAAA GCTGTGTTAA ATAGTCCGC SeqID No.3
GCGGACTATTTAACACAGCTTTAGGCGCGAGGTACTATGAATCGGCCTTGCTCC Seq ID No.4
GGAGCAAGGC CGATTCATAG TACCTCGCGC CTAAAGCTGT GTTAAATAGT CCGC Seq IDNo.5
ATGGTGAGCAAGGGAGAAGAACTGTTCACCGGCGTGGTGCCGATTCTGGTGGAA
CTGGATGGCGATGTGAATGGCCACAAATTTAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAAGGG
GATGCGACCTATGGGAAACTGACCCTGAAGTTTATTTGCACCACCGGTAAACTGC
CGGTGCCGTGGCCGACCCTTGTTACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTTGC
GCGTTACCCGGATCACATGAAGCAGCATGACTTTTTCAAATCGGCGATGCCGGAA
GGCTATGTGCAGGAACGTACCATTTTCTTTAAGGATGATGGCAATTACAAAACCC
GTGCGGAAGTGAAATTTGAAGGCGATACCCTGGTTAATCGTATTGAACTGAAAGG
CATTGATTTCAAAGAGGATGGAAATATTCTGGGGCATAAACTGGAATATAACTATA
ACAGCCATAAGGTGTATATTACCGCGGACAAACAGAAGAATGGCATTAAAGTGAA
TTTCAAGACCCGTCATAACATTGAAGACGGCAGCGTGCAACTGGCCGATCATTAT
CAGCAGAATACCCCGATTGGTGATGGTCCGGTGCTGCTGCCGGATAATCACTATCT
GAGCACCCAAAGCGCGTTGTCCAAAGATCCGAATGAAAAACGTGACCACATGGT
GTTGCTGGAGTTTGTGACCGCGGCTGGTATTACATTGGGCATGGACGAACTGTAT
AAA
Seq ID No.6P1
GGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGAGAAGAACTGTTCACCGG Seq ID No.7P2
CACATCGCCATCCAGTTCCACCAGAATCGGCACCACGCCGGTGAACAGTTCTTCTC Seq IDNo.8P3
GAACTGGATGGCGATGTGAATGGCCACAAATTTAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAAGG Seq IDNo.9P4
GTGCAAATAAACTTCAGGGTCAGTTTCCCATAGGTCGCATCCCCTTCGCCCTCGCC Seq IDNo.10P5
GACCCTGAAGTTTATTTGCACCACCGGTAAACTGCCGGTGCCGTGGCCGACCCTTG Seq IDNo.11P6
GTAACGCGCAAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTAACAAGGGTCGGCCACG Seq IDNo.12P7
AGTGCTTTGCGCGTTACCCGGATCACATGAAGCAGCATGACTTTTTCAAATCGGCG Seq IDNo.13P8
GAAAATGGTACGTTCCTGCACATAGCCTTCCGGCATCGCCGATTTGAAAAAGTCAT Seq IDNo.14P9
GCAGGAACGTACCATTTTCTTTAAGGATGATGGCAATTACAAAACCCGTGCGGAAG Seq IDNo.15P10
GTTCAATACGATTAACCAGGGTATCGCCTTCAAATTTCACTTCCGCACGGGTTTTG Seq IDNo.16P11
CCCTGGTTAATCGTATTGAACTGAAAGGCATTGATTTCAAAGAGGATGGAAATATT Seq IDNo.17P12
CTGTTATAGTTATATTCCAGTTTATGCCCCAGAATATTTCCATCCTCTTTGAAATC Seq IDNo.18P13
GCATAAACTGGAATATAACTATAACAGCCATAAGGTGTATATTACCGCGGACAAAC Seq IDNo.19P14
GACGGGTCTTGAAATTCACTTTAATGCCATTCTTCTGTTTGTCCGCGGTAATATAC Seq IDNo.20P15
AGTGAATTTCAAGACCCGTCATAACATTGAAGACGGCAGCGTGCAACTGGCCGATC Seq IDNo.21P16
AGCACCGGACCATCACCAATCGGGGTATTCTGCTGATAATGATCGGCCAGTTGCAC Seq IDNo.22P17
GTGATGGTCCGGTGCTGCTGCCGGATAATCACTATCTGAGCACCCAAAGCGCGTTG Seq IDNo.23P18
GCAACACCATGTGGTCACGTTTTTCATTCGGATCTTTGGACAACGCGCTTTGGGTG Seq IDNo.24P19
TGACCACATGGTGTTGCTGGAGTTTGTGACCGCGGCTGGTATTACATTGGGCATGG Seq IDNo.25P20 CCGCTCGAGTTATTATTTATACAGTTCGTCCATGCCCAATGTAATACCA重组引物
Seq ID No.26，egfp-recomb-NdeII-F
CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGTGAGCAAGGGAGAAG Seq ID No.27，egfp-recomb-XholI-R
TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTATTATTTATACAGTTCGTCCATG Seq ID No.28，TaqMutS融合蛋白
MPVSGNLKVEFYNSNPSDTTNSINPQFKVTNTGSSAIDLSKLTLRYYYTVDGQKDQTFWC
DHAAIIGSNGSYNGITSNVKGTFVKMSSSTNNADTYLEISFTGGTLEPGAHVQIQGRFAK
NDWSNYTQSNDYSFKSASQFVEWDQVTAYLNGVLVWGKEPRPVDMEGMLKGEGPGPLPPL
LQQYVELRDQYPDYLLLFQVGDFYECFGEDAERLARALGLVLTHKTSKDFTTPMAGIPLR
AFEAYAERLLKMGFRLAVADQVEPAEEAEGLVRREVTQLLTPGTLLQESLLPREANYLAA
IATGDGWGLAFLDVSTGEFKGTVLKSKSALYDELFRHRPAEVLLAPELLENGAFLDEFRK
RFPVMLSEAPFEPEGEGPLALRRARGALLAYAQRTQGGALSLQPFRFYDPGAFMRLPEAT
LRALEVFEPLRGQDTLFSVLDETRTAPGRRLLQSWLRHPLLDRGPLEARLDRVEGFVREG
ALREGVRRLLYRLADLERLATRLELGRASPKDLGALRRSLQILPELRALLGEEVGLPDLS
PLKEELEAALVEDPPLKVSEGGLIREGYDPDLDALRAAHREGVAYFLELEERERERTGIP
TLKVGYNAVFGYYLEVTRPYYERVPKEYRPVQTLKDRQRYTLPEMKEKEREVYRLEALIR
RREEEVFLEVRERAKRQAEALREAARILAELDVYAALAEVAVRYGYVRPRFGDRLQIRAG
RHPVVERRTEFVPNDLEMAHELVLITGPNMAGKSTFLRQTALIALLAQVGSFVPAEEAHL
PLFDGIYTRIGASDDLAGGKSTFMVEMEEVALILKEATENSLVLLDEVGRGTSSLDGVAI
ATAVAEALHERRAYTLFATHYFELTALGLPRLKNLHVAAREEAGGLVFYHQVLPGPASKS
YGVEVAAMAGLPKEVVARARALLQAMAARREGALDAVLERLLALDPDRLTPLEALRLLQE
LKALALGAPLDTMKG

Claims (5)

1.用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的方法，其中，所述方法使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA，并使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA；
其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:28所示；
其中所述纤维素包被的磁珠的制备方法包括：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使用TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白结合所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白与所述DNA样品混合，并常温放置。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述常温放置持续时间为至少10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述使用纤维素包被的磁珠去除所述合成的有错误的DNA的步骤中，将所述纤维素包被的磁珠添加到样品中，并用磁铁吸附磁珠，从而去除合成的有错误的DNA。
5.一种用于除去合成的DNA样品中合成的有错误的DNA的试剂盒，其包括TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白，和纤维素包被的磁珠；
其中所述TaqMutS和纤维素结合域的融合蛋白的序列如SEQ ID NO:28所示；
其中，所述纤维素包被的磁珠是通过以下制备的：将六水氯化铁溶于乙二醇中，然后加入醋酸钠和微晶纤维素并搅拌，加热，然后冷却并收集。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109825431A (zh) * 2019-03-18 2019-05-31 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 寡核苷酸原位组装仪
CN115820625A (zh) * 2022-12-05 2023-03-21 中国科学技术大学 去除错配dna的方法、装置及装置的制备方法和试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103755815A (zh) * 2014-01-17 2014-04-30 中国科学技术大学 一种新型错配结合蛋白与纤维素结合域3的融合蛋白及其高通量去除dna合成中错误的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6027877A (en) * 1993-11-04 2000-02-22 Gene Check, Inc. Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, purification of amplified DNA samples and allele identification
US6120992A (en) * 1993-11-04 2000-09-19 Valigene Corporation Use of immobilized mismatch binding protein for detection of mutations and polymorphisms, and allele identification in a diseased human
CN100535004C (zh) * 2000-08-04 2009-09-02 洛马林达大学医学中心 用作神经变性疾病诊断的铁调节蛋白-2
CA2525540A1 (en) * 2003-05-30 2004-12-09 Intercell Ag Enterococcus antigens
CN1898385A (zh) * 2003-12-19 2007-01-17 莫道什大学 多毛结肠短螺旋体72kDa外膜蛋白及其诊断和治疗用途
BRPI1014137A2 (pt) * 2009-06-29 2015-08-25 Univ Western Australia Terpeno sintases de sândalo.
EP2768607B1 (en) * 2011-09-26 2021-08-18 Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH Multiwell plate for high efficiency, small volume nucleic acid synthesis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103755815A (zh) * 2014-01-17 2014-04-30 中国科学技术大学 一种新型错配结合蛋白与纤维素结合域3的融合蛋白及其高通量去除dna合成中错误的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A biotinylated MutS fusion protein and its use in a rapid mutation screening technique;Daniel H. Geschwind et al;《Genetic Analysis: Biomolecular Engineering》;第13卷;第105-111页 *
General Strategy for Designing Functionalized Magnetic Microspheres for Different Bioapplications;Xinglu Huang et al;《Langmuir》;第25卷(第19期);第11658页右栏第3段 *

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