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CN114424291A - 免疫组库健康评估系统和方法 - Google Patents

免疫组库健康评估系统和方法 Download PDF

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CN114424291A
CN114424291A CN202080044891.4A CN202080044891A CN114424291A CN 114424291 A CN114424291 A CN 114424291A CN 202080044891 A CN202080044891 A CN 202080044891A CN 114424291 A CN114424291 A CN 114424291A
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Abstract

本公开内容涉及用于评估个体的免疫组库和健康的系统和方法。本公开内容设想个体提交：(a)身份信息(例如家族病史、年龄、性别和其他身份信息)至服务器上的数据库或服务器可访问的数据库，通过将设备(例如智能手机)连接至网络应用程序；和(b)用于免疫组库处理的血液样品并将得到的数据提交至数据库。数据由访问数据库的服务器处理。然后，个体可以使用智能手机或其他互联网连接设备可访问的网络应用程序访问自定义报告。自定义报告显示个体的免疫组库指标。本文公开的三个免疫组库指标包括：(1)克隆型指标；(2)基本指标；和(3)多样性指标。在某些实施方案中，自定义报告包括个体免疫组库的图示，其中独特克隆型大小与这种克隆型的频率相对应。

Description

免疫组库健康评估系统和方法
背景技术
诊断检测目前可用并定期进行，以检测个体是否存在正常状态。然而，这些检测并未提供对个体免疫组库的明确评估，也未深入了解此类个体的免疫组库如何指示存在或不存在健康。因此，需要以有助于评估此类个体健康的方式为个体提供评估和展示其免疫组库的手段的系统和方法。
发明内容
在一些实施方案中，本公开内容涉及一种向用户呈现用户的免疫组库概况(profile)的方法，包括以下步骤：从所述用户获取血液样品；确定选自由克隆型指标、基本指标和多样性指标组成的组中的至少一个指标以产生所述用户的血液样品的免疫组库概况；和向所述用户输出关于所述用户的免疫组库概况的信息。在一些实施方案中，所述方法进一步包括获取与所述用户相关的一组特征数据的步骤，其中与所述用户相关的特征数据包括所述用户的年龄和性别。在一些实施方案中，所述特征数据进一步包括存在任何疾病。在一些实施方案中，所述血液样品包括全血。在一些实施方案中，所述血液样品包括干血斑(dried blood spot)。在一些实施方案中，所述方法包括以下另外的步骤：向所述用户提供包括采血卡的试剂盒，其中所述采血卡包括至少一个采血区和QR码；和所述用户扫描所述QR码以将所述血液样品与所述用户在软件应用程序上的账户相关联。在一些实施方案中，使用软件应用程序执行向所述用户输出信息的步骤。
在一些实施方案中，本公开内容涉及一种向用户呈现用户的免疫组库概况的方法，包括以下步骤：向所述用户提供包括采血卡的试剂盒，其中所述采血卡包括至少一个采血区和QR码；所述用户扫描QR码以将所述血液样品与所述用户在软件应用程序上的账户相关联；获取与所述用户相关的一组特征数据，其中与所述用户相关的特征数据包括所述用户的年龄、性别以及存在或不存在任何疾病；从所述用户获取血液样品；确定选自由克隆型指标、基本指标和多样性指标组成的组中的至少一个指标以产生所述用户的血液样品的免疫组库概况；和使用软件应用程序向所述用户输出关于所述用户的免疫组库概况的信息。
附图说明
图1是描绘用户提交以下项的过程的流程图：(a)身份信息(identifyinginformation)至数据库，通过将设备连接至网络应用程序；和(b)用于免疫组库处理的血液样品并将结果数据提交至数据库。
图2是描绘服务器处理用户身份信息和免疫组库数据的过程的流程图，参照数据库并将得到的信息纳入数据库，得到的克隆型指标、多样性指标和基本指标报告可以向用户展示。
图3是描绘用户可以通过使用设备经由网络应用程序连接至数据库来访问他们的克隆型指标、多样性指标和基本指标报告的过程的流程图。
具体实施方式
本公开内容涉及用于评估个体的免疫组库和健康的系统和方法。如图1所示，本公开内容设想个体提交：(a)身份信息(例如家族病史、年龄、性别和其他身份信息)至服务器上的数据库或服务器可访问的数据库，通过将设备(例如智能手机)连接至网络应用程序；和(b)用于免疫组库处理的血液样品并将得到的数据提交至数据库。数据由访问数据库的服务器处理，如图2所示，为用户创建自定义报告。然后，个体可以使用智能手机或其他互联网连接设备可访问的网络应用程序访问自定义报告，如图3所示。自定义报告显示个体的免疫组库指标。本文公开的三个免疫组库指标包括：(1)克隆型指标；(2)基本指标；和(3)多样性指标。在某些实施方案中，自定义报告包括个体免疫组库的图示，其中独特克隆型大小与这种克隆型的频率相对应。
在一些实施方案中，用户可以通过使用包括刺血针和无菌采血卡的试剂盒来采集血液样品。采血卡可以包括适合吸血的材料，包括但不限于纸和卡片材料。用户可以使用刺血针抽血，例如从用户的一个指尖抽血。采血卡包括一个或多个采血区，用户可以在其上放置血液样品并且该血液可以在该采血区干燥。采血卡可以进一步包括QR码，用户可以使用智能手机或其他设备扫描QR码以将QR码和血液样品与用户在软件应用程序上的账户相关联。然后，用户可以发送采血卡用于再水化、处理和确定用户的克隆型指标、基本指标和/或多样性指标以生成存储在数据库中的用户报告。然后，用户可以使用软件应用程序经由互联网连接的设备访问存储在数据库中的他或她的用户报告。
克隆型指标
本文公开的第一指标称为克隆型指标。个体的克隆型指标通过测量含有淋巴细胞的个体样品(例如血液样品)中独特克隆型的总数获得，并将独特克隆型的数量除以此类样品的单位读数数量。如本文所用，“血液样品”意指外周血、干血斑、脐带血或其他含有血液的样品。
基本指标
本文公开的第二指标被称为基本指标。在一个实施方案中，基本指标是个体的100,000个读数中前1000个公共CDR3(pCDR3)的数量。pCDR3是存在于多于一个个体中的CDR3。为了确定前1000个pCDR3，确定并排序一队列个体的pCDR3(指标池)。在其他实施方案中，评估少于前1000个pCDR。在其他实施方案中，评估多于前1000个pCDR3。在其他实施方案中，获取个体的少于100,000个读数。在其他实施方案中，获取个体的多于100,000个读数。
在本公开内容的一方面，如果个体的基本指标达到或超过最小百分比，则个体的免疫组库被认为正常，而个体的正常指标低于该最小百分比，则个体的免疫组库被认为异常。在一个实施方案中，该最小百分比为35％。
个体表达的CDR3表现出巨大的多样性，可能高达1015个独特CDR3。因此，CDR3可用作免疫系统多样性的基础。基于对7500万个CDR3的抽样，发明人已确定随机选择的CDR3中约81％对给定个体是独特的，并且不在多个个体之间共享。
本公开内容的方法可以使用以下步骤进行以识别个体的正常免疫状态或异常免疫状态，该方法包括以下步骤：(a)在包含靶标特异性嵌套引物的反应混合物中从来自个体的白细胞群扩增多核苷酸以产生一组第一扩增子，靶标特异性嵌套引物的至少一部分包含另外的核苷酸，在扩增过程中，该另外的核苷酸作为模板用于将至少一个共同引物的结合位点掺入第一扩增子；(b)将含有第一扩增子的第一反应混合物的一部分转移至包含至少一个共同引物的第二反应混合物；(c)使用至少一个共同引物扩增第一扩增子以产生一组第二扩增子；(d)对第二扩增子进行测序以鉴别白细胞亚群中的CDR3序列，以及(e)鉴别构成pCDR3的CDR3序列；(f)基于个体的pCDR3计算基本指标；以及(g)识别基本指标是否正常或异常，其中正常状态的特征在于存在最小百分比的pCDR3，并且异常状态的特征在于不存在最小百分比的pCDR3。
在某些实施方案中，测序包括每个样品获取的约100,000个读数。在某些实施方案中，使用随机选择进行多次读数，例如约10至100次。参考池的前1000个pCDR3中个体pCDR3的数量提供了百分比，称为“基本指标”，其是0％至100％之间的数值。例如，如果个体的样品含有前1000个pCDR3序列中的200个，则该个体的基本指标为0.20或20％。在其他实施方案中，获取至少10,000个读数。在其他实施方案中，获取多于100,000个读数。在其他实施方案中，进行少于10次读取。在其他实施方案中，进行多于100次读数。
在某些实施方案中，指标池由约1000个个体组成。在其他实施方案中，指标池含有100至1000个个体。在其他实施方案中，指标池含有少于100个个体。在其他实施方案中，指标池含多于过1000个个体。相对于个体，个体可以是年龄匹配的，性别匹配的，健康、疾病匹配的和/或本领域公知的控制变量时的其他标准。在某些实施方案中，指标池由健康对照组成。在其他实施方案中，指标池由健康对照和具有一种或多种疾病状态的个体的混合组成。在其他实施方案中，指标池由具有一种或多种特定疾病状态的个体组成。
在某些实施方案中，指标池(即，pCDR3)共享的CDR3序列通过比较来自指标池的每个样品并鉴别这些参考池中检测的至少50％的个体共享的那些CDR3来确定。在某些实施方案中，pCDR3包括约前1000个共享CDR3序列。在其他实施方案中，pCDR3包括至少100个CDR3序列。在其他实施方案中，pCDR3包括多于1000个CDR3序列。
先前很难以广泛的方式对免疫系统进行评估，因为人或动物免疫系统中细胞的数量和种类如此之多，以至于几乎不可能对一小部分细胞进行测序。发明人开发了一种半定量PCR方法(arm-PCR，在美国专利申请公开号20090253183中更详细描述)，与先前可用的方法相比，它提供了增加的灵敏度和特异性，同时产生半定量结果。正是这种提高特异性和灵敏度的能力，从而增加了单个样品中可检测的靶标数量，使该方法成为检测免疫组库的克隆型相对数量的理想选择。发明人最近发现，使用这种测序方法允许其将个体的CDR3序列与指标组共有的CDR3序列进行比较，这已导致本发明方法的发展。该方法可用于评价相对于个体指标池，受试者的免疫组库的多样性。例如，发明人已经证明疾病的存在与免疫组库多样性降低(例如CDR3序列多样性降低)相关，这可以使用本公开内容的方法容易地检测。因此，该方法可用作正常相对于异常免疫组库多样性的初始诊断指标，正如目前临床实践中使用的细胞计数和生化检测。
免疫组库的克隆型(即克隆类型)是由在免疫系统产生免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)的早期阶段通过体细胞重组的可变(Variable，V)、多样性(Diverse，D)和连接(Joining，J)基因区段的重排来确定。V(D)J重排可以从T细胞受体α、β、γ和δ链以及免疫球蛋白重链(IgH)和轻链(IgK、IgL)扩增和检测。例如，可以通过获得外周血、淋巴组织、癌组织或来自其他器官和/或器官系统的组织或流体从个体获得细胞。用于获得这些样品(例如血液样品)的技术是本领域技术人员已知的。细胞计数可以从通过PCR扩增和测序检测到的序列数量外推获得。
包含约30-90个核苷酸的CDR3区涵盖基因的重组可变(V)、多样性(D)和连接(J)区段的连接部。它编码受体的结合特异性并可用作序列标签以鉴别独特的V(D)J重排。
Wang等人公开了PCR可用于获得标本中靶分子数量的定量或半定量评估(Wang，M.等人，“Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction，”(1989)Proc.Nat’1.Acad.Sci.86：9717-9721)。发明人先前已经描述了用于实现定量扩增的特别有效的方法。一种此类方法被称为arm-PCR，其在美国专利申请公开号20090253183A1中描述。
本公开内容的方面包括来自T细胞、B细胞和/或T或B细胞亚型(subset)的CDR3的arm-PCR扩增。可以使用本领域已知的技术分选和分离此类细胞类型，包括但不限于FACS分选和磁珠分选。因此，如本文所用，术语细胞“群”涵盖通常称为细胞“群”或“亚群”的那些。然后大量的扩增产物可以使用下一代代测序使用平台(例如454或Illumina)进行有效测序。
Arm-PCR方法提供了多种多核苷酸在一个反应中的高灵敏度半定量扩增。Arm-PCR方法还可以通过自动化方法在封闭的盒系统(
Figure BDA0003418554590000061
Huntsville，阿拉巴马州)中进行，这在本发明的方法中是有益的，因为各种T和B细胞的组库例如是如此大。在arm-PCR方法中，靶标数量在DNA聚合酶驱动的反应中增加，这是将靶标特异性引物引入反应的结果。该扩增反应的另一个结果是将在随后的扩增中使用的共同引物的结合位点的如下引入：将含有第一组扩增子的第一反应混合物的一部分转移至包含共同引物的第二反应混合物。如本文所用，“至少一种共同引物”是指将与此类结合位点结合的至少一种引物，并且包括引物对，例如正向和反向引物。这种转移可以通过从第一扩增反应回收一部分反应混合物并将该样品引入第二反应管或反应室，或者通过从已完成的第一扩增中去除一部分液体，留下一部分，并在其中进行第一扩增的试管中加入新鲜试剂来进行。在任何一种情况下，然后可以将另外的缓冲液、聚合酶等与共同引物一起添加以产生用于检测的扩增产物。使用共同引物扩增靶分子会给出半定量结果，其中使用共同的、而不是靶标特异性的引物扩增在第一扩增中扩增的定量数量的靶标-使得产生显著更高数量的靶标用于检测，并确定个体血液样品中包含各种重排的细胞的相对数量成为可能。此外，将第二反应混合物与第一反应混合物的一部分组合允许将更高浓度的靶标特异性引物添加到第一反应混合物中，从而导致第一扩增反应更高的灵敏度。这是特异性和灵敏度的组合与通过使用诸如arm-PCR方法的方法实现定量结果的能力，一起允许对细胞群中表达的CDR3进行足够灵敏和定量的评估，以产生具有诊断用途的正常指标。
由于识别抗原引起的克隆扩增导致更大识别该抗原的细胞群，可能包括产生抗体的B细胞或携带受体的T细胞。这可能导致根据本文公开的方法获取的读数偏向于有利于抗原特异性扩增，从而降低检测到的pCDR3序列的百分比。所以，相对低的正态指标，例如低于最小百分比的指标，可能表明特定细胞群的扩增在已被诊断患有特定疾病的个体或在针对特定抗原最近接种疫苗的个体中是普遍的。
用于扩增和测序免疫系统细胞可变区的引物可商购获得，并且已经在出版物(例如发明人公开的专利申请WO2009137255和US201000021896A1)中进行描述。
有几种可商购获得的高通量测序技术，例如Hoffman-LaRoche，Inc.的
Figure BDA0003418554590000074
测序系统。例如，在
Figure BDA0003418554590000075
测序方法中，A和B衔接子在PCR期间连接至PCR产物上，或在PCR反应后连接。衔接子用于扩增和测序步骤。当结合arm-PCR技术进行时，A和B衔接子可用作扩增反应中的共同引物(有时称为“公有引物”或“超引物”)。在A和B衔接子物理附接至样品文库(例如PCR扩增子)后，使用本领域技术人员已知的技术制备单链DNA文库。单链DNA文库固定化在特别设计的DNA捕获珠子上。每个珠子携带独特的单链DNA文库片段。将珠子结合的文库在油包水混合物中用扩增试剂乳化，从而产生微反应器，每个含有刚好一个具有独特样品文库片段的珠子。将每个独特样品文库片段在其自己的微反应器中扩增，排除竞争或污染序列。平行地完成整个片段集合的扩增。对于每个片段，这导致每个珠子几百万的拷贝数。随后，乳液PCR被破坏，而扩增的片段仍与其特定的珠子结合。将克隆扩增的片段富集并加载至
Figure BDA0003418554590000071
设备上进行测序。
Figure BDA0003418554590000072
孔的直径允许每个孔仅一个珠子。添加测序酶后，测序仪的流控技术子系统将各个核苷酸以固定顺序流过成千上万个孔，每个孔含有单个珠子。一种(或多种)与模板链互补的核苷酸的添加产生由仪器内的CCD相机记录的化学发光信号。通过
Figure BDA0003418554590000073
设备生成的信号强度和位置信息的组合允许软件使用GS FLX系统确定多于1,000,000个单个读数的序列，每个读数高达约450个碱基对。
已使用定量和/或半定量方法获得序列后，然后可以计算正态指标，例如，通过确定由预先确定数量的个体样品的读数表示的pCDR3的百分比。可以将每个个体的正态指标与预先确定的阈值进行比较，以确定该个体的正态指标是否落在正常范围内，从而是正常的，还是低于阈值，从而是异常的。
本公开内容的方法为医生提供了用于诊断目的的另外的临床检测，以确定个体的免疫组库是否异常。此外，本公开内容的方法，特别是如果用于自动化系统，例如发明人在美国专利申请公开号201000291668A1中描述的系统，则可用于分析来自多个个体的样品，其中通过使用一个或多个微阵列来完成扩增的靶序列的检测。
实施例
个体样品
在肝素钠中采集的全血样品(40ml)或外周血单核细胞(PBMC)获自1100个个体，代表健康个体和患病个体的混合群体。1100个个体被随机分为11个不同的组，每组100个样品。
RNA提取和组库扩增
根据生产商的方案，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)进行RNA提取。对于每个靶标，使用在www.irepertoire.com上可获得的引物软件设计一组嵌套序列特异性引物(正向外侧引物(Forward-out，Fo)；正向内侧引物(Forward-in，Fi)；反向外侧引物(Reverse-out，Ro)；和反向内侧引物(Reverse-in，Ri))。一共同序列标签与所有内部引物(Fi和Ri)连接。一旦在最初的几个扩增循环中将这些标签序列掺入PCR产物，使用一对公有引物进行扩增的指数期。在第一轮扩增中，仅使用序列特异性嵌套引物。然后通过核酸外切酶消化去除嵌套引物，并通过添加公有引物以及新鲜酶和dNTP的混合物，将第一轮PCR产物用作第二轮扩增的模板。每个不同的条形码标签通过PCR引物被引入至来自相同样品的扩增子中。
测序
将来自不同样品的条形码标记的扩增子产物一起合并并加载至2％琼脂糖凝胶中。电泳后，从对应于从琼脂糖凝胶中提取的250-500bp片段的DNA条带中纯化DNA片段。使用具有钛试剂盒(SeqWright，Inc.)的454GS FLX系统和对DNA进行测序。
测序数据分析
根据条形码标签对每个样品的序列进行分类(sort out)。在序列分离之后，以与Wang等人(Wang C等人，High throughput sequencing reveals a complex pattern ofdynamic interrelationships among human T cell subsets.Proc Natl Acad Sci USA107(4)：1518-1523)报道的方法类似的方式进行序列分析。简言之，使用程序IRmap将从IMGT服务器(http：//www.imgt.org)下载的种系V和J参考序列定位(map)到序列读数上。参考序列中定义CDR3区的边界通过定位信息映射(mirror)到测序读数上。测序读数中封闭的CDR3区被提取并翻译成氨基酸序列。
下表1列出了来自脐带血的示例性pCDR3。下表2列出了来自成人血液的示例性pCDR3。
表1
IgH：
Figure BDA0003418554590000091
Figure BDA0003418554590000101
Figure BDA0003418554590000111
IgK：
Figure BDA0003418554590000112
Figure BDA0003418554590000121
Figure BDA0003418554590000131
Figure BDA0003418554590000141
IgL：
Figure BDA0003418554590000142
Figure BDA0003418554590000151
Figure BDA0003418554590000161
TRA：
Figure BDA0003418554590000162
Figure BDA0003418554590000171
Figure BDA0003418554590000181
TRB：
Figure BDA0003418554590000182
Figure BDA0003418554590000191
Figure BDA0003418554590000201
Figure BDA0003418554590000211
TRD：
Figure BDA0003418554590000212
Figure BDA0003418554590000221
Figure BDA0003418554590000231
TRG：
Figure BDA0003418554590000232
Figure BDA0003418554590000241
Figure BDA0003418554590000251
表2
IgH：
Figure BDA0003418554590000261
Figure BDA0003418554590000271
Figure BDA0003418554590000281
IgK：
Figure BDA0003418554590000282
Figure BDA0003418554590000291
Figure BDA0003418554590000301
IgL：
Figure BDA0003418554590000302
Figure BDA0003418554590000311
Figure BDA0003418554590000321
Figure BDA0003418554590000331
TRA：
Figure BDA0003418554590000332
Figure BDA0003418554590000341
Figure BDA0003418554590000351
TRB：
Figure BDA0003418554590000352
Figure BDA0003418554590000361
Figure BDA0003418554590000371
TRD：
Figure BDA0003418554590000381
Figure BDA0003418554590000391
Figure BDA0003418554590000401
TRG：
Figure BDA0003418554590000402
Figure BDA0003418554590000411
Figure BDA0003418554590000421
多样性指标
本文公开的第三指标被称为多样性指标。这种方法使用通常在正常健康个体中见到的免疫细胞多样性水平与在患有一种或多种疾病病况的个体中见到的普遍较低的多样性水平之间的差异，作为存在正常或异常免疫状态的诊断指标。在本发明的一方面，多样性水平被称为D50，其中D50被定义为占免疫系统的细胞群或亚群中总CDR3的至少半数的不同CDR3的最小百分比。第三互补决定区(CDR3)是其核苷酸序列对于每个T细胞或B细胞克隆是独特的区域，数量越高，多样性水平越高。D50可描述如下。当细胞总数的“显著百分比”为百分之五十(50％)时，多样性指标(D50)也可定义为在排序的优势配置中由S个不同CDR3组成的J个个体细胞免疫组库的多样性的量度(CDR3的总数)，其中ri是第i个最丰假设
Figure BDA0003418554590000431
如果
Figure BDA0003418554590000432
和
Figure BDA0003418554590000433
Figure BDA0003418554590000434
富的CDR3的丰度，r1是最丰富的CDR3的丰度，r2是第二最丰富的CDR3的丰度，依此类推。C是不同CDR3的最小数量，占总测序读数的50％。因此，D50由C/S×100提供。
本发明的方法可以使用以下步骤进行，以评估免疫组库的多样性水平：(a)在包含靶标特异性嵌套引物的反应混合物中扩增来自人或动物受试者的白细胞群的多核苷酸以产生一组第一扩增子，靶标特异性嵌套引物的至少一部分包含另外的核苷酸，在扩增过程中，该另外的核苷酸作为模板用于将至少一个共同引物的结合位点掺入第一扩增子；(b)将含有第一扩增子的第一反应混合物的一部分转移至包含至少一个共同引物的第二反应混合物；(c)使用至少一个共同引物扩增第一扩增子以产生一组第二扩增子；(d)对第二扩增子进行测序以鉴别白细胞亚群中的V(D)J重排序列，(e)使用鉴别的V(D)J重排序列定量免疫系统细胞群中的细胞总数和该群内鉴别的每个克隆型中的细胞总数；以及(f)鉴别在该群内计数的细胞总数中占显著百分比的克隆型的数量，其中正常状态的特征在于在细胞总数的显著百分比内表现为较多种类的克隆型的存在，并且异常状态的特征在于在细胞总数的显著百分比内表现为较少数量的克隆型细胞的存在。
先前很难以广泛的方式对免疫系统进行评估，因为人或动物免疫系统中细胞的数量和种类如此之多，以至于几乎不可能对一小部分细胞进行测序。发明人开发了一种半定量PCR方法(arm-PCR，在美国专利申请公开号20090253183中更详细描述)，与先前可用的方法相比，它提供了更高的灵敏度和特异性，同时产生半定量结果。正是这种提高特异性和灵敏度的能力，从而增加了单个样品中可检测的靶标数量，使该方法成为检测免疫组库的克隆型相对数量的理想选择。发明人最近发现，使用这种测序方法允许其比较个体受试者的免疫组库，这已导致本发明方法的发展。该方法已用于评价看起来正常、健康和无症状的受试者，以及已被诊断出患有例如各种形式癌症的受试者，并且发明人已经证明疾病的存在与免疫组库的多样性降低相关，这可以使用本发明的方法容易地检测。因此，该方法可用作诊断指标，正如目前临床实践中使用的细胞计数和生化检测。
免疫组库的克隆型(即克隆类型)是由在免疫系统产生免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)的早期阶段通过体细胞重组的可变(V)、多样性(D)和连接(J)基因区段的重排来确定。V(D)J重排可以从T细胞受体α、β、γ和δ链以及免疫球蛋白重链(IgH)和轻链(IgK、IgL)扩增和检测。例如，可以通过获得外周血、淋巴组织、癌组织或来自其他器官和/或器官系统的组织或流体从个体获得细胞。用于获得这些样品(例如血液样品)的技术是本领域技术人员已知的。如本文所用，“定量克隆型”意指计数或获得属于特定克隆型的细胞数量的可靠的近似值。细胞计数可以从通过PCR扩增和测序检测到的序列数量外推获得。
包含约30-90个核苷酸的CDR3区涵盖基因的重组可变(V)、多样性(D)和连接(J)区段的连接部。它编码受体的结合特异性并可用作序列标签以鉴别独特的V(D)J重排。
Wang等人公开了PCR可用于获得标本中靶分子数量的定量或半定量评估(Wang，M.等人，“Quantitation of mRNA by the polymerase chain reaction，”(1989)Proc.Nat’ 1.Acad.Sci.86：9717-9721)。发明人先前已经描述了用于实现定量扩增的特别有效的方法。一种此类方法被称为arm-PCR，其在美国专利申请公开号20090253183A1中描述。
本发明的方面包括来自T细胞、B细胞和/或T或B细胞亚型的CDR3的arm-PCR扩增。因此，如本文所用，术语细胞“群”涵盖通常称为细胞“群”或“亚群”的那些。然后，例如，大量的扩增产物可以使用下一代测序使用平台(例如454或Illumina)进行有效测序。如果选择的显著百分比为50％，则该数量可称为“D50”。然后，D50可以是占该样品中计数的总T或B细胞的百分之五十(50％)的优势和独特的T或B细胞克隆的百分比。例如，对于高通量测序，D50可以是所有独特CDR3中最优势的CDR3的数量，占总有效读数的50％，其中总有效读数定义为具有可鉴别的V和J基因区段的序列数，这些区段已通过一系列错误过滤器成功筛选。
Arm-PCR方法提供了多种多核苷酸在一个反应中的高灵敏度半定量扩增。Arm-PCR方法还可以通过自动化方法在封闭的盒系统(
Figure BDA0003418554590000451
Huntsville，阿拉巴马州)中进行，这在本本发明方法中是有益的，因为各种T和B细胞的组库例如是如此大。在arm-PCR方法中，靶标数量在DNA聚合酶驱动的反应中增加，这是将靶标特异性引物引入反应的结果。该扩增反应的另一个结果是将在随后的扩增中使用的共同引物的结合位点的如下引入：将含有第一组扩增子的第一反应混合物的一部分转移至包含共同引物的第二反应混合物。如本文所用，“至少一种共同引物”是指将与此类结合位点结合的至少一种引物，并且包括引物对，例如正向和反向引物。这种转移可以通过从第一扩增反应回收一部分反应混合物并将该样品引入第二反应管或反应室，或者通过从已完成的第一扩增中去除一部分液体，留下一部分，并在其中进行第一扩增的试管中加入新鲜试剂来进行。在任何一种情况下，然后可以将另外的缓冲液、聚合酶等与共同引物一起添加以产生用于检测的扩增产物。使用共同引物扩增靶分子会给出半定量结果，其中使用共同的、而不是靶标特异性的引物扩增在第一扩增中扩增的定量数量的靶标，-使得产生显著更高数量的靶标用于检测，并确定单个血液样品中包含各种重排的细胞的相对数量成为可能。此外，将第二反应混合物与第一反应混合物的一部分组合允许将更高浓度的靶标特异性引物添加到第一反应混合物中，从而导致第一扩增反应中更高的灵敏度。这是特异性和灵敏度的组合，与通过使用诸如arm-PCR方法的方法实现定量结果的能力，一起允许对细胞群中的克隆型的类型和数量进行足够灵敏和定量的评估，以产生具有诊断用途的多样性指标。
由于识别抗原引起的克隆扩增导致更大识别该抗原的细胞群，并且通过细胞的相对数量评价细胞提供了用于确定抗原暴露是否已影响产生抗体的B细胞或携带受体的T细胞的扩增的方法。例如，这有助于评价在已被诊断患有特定疾病的个体中特定细胞群是否是普遍的，并且可能特别有助于评价疫苗是否在接种疫苗的个体中已实现期望的免疫应答。
用于扩增和测序免疫系统细胞可变区的引物可商购获得，并且已经在出版物(例如发明人公开的专利申请WO2009137255和US201000021896 A1)中进行描述。
有几种可商购获得的高通量测序技术，例如Hoffman-LaRoche，Inc.的
Figure BDA0003418554590000461
测序系统。例如，在
Figure BDA0003418554590000462
则序方法中，A和B衔接子在PCR期间连接至PCR产物上，或在PCR反应后连接。衔接子用于扩增和测序步骤。当结合arm-PCR技术进行时，A和B衔接子可用作扩增反应中的共同引物(有时称为“公有引物”或“超引物”)。在A和B衔接子物理附接至样品文库(例如PCR扩增子)后，使用本领域技术人员已知的技术制备单链DNA文库。单链DNA文库固定化在特别设计的DNA捕获珠子上。每个珠子携带独特的单链DNA文库片段。将珠子结合的文库在油包水混合物中用扩增试剂乳化，从而产生微反应器，每个含有刚好一个具有独特样品库片段的珠子。每个独特样品库片段在其自己的微反应器中扩增，排除竞争或污染序列。平行地完成整个片段集合的扩增。对于每个片段，这导致每个珠子几百万的拷贝数。随后，乳液PCR被破坏，而扩增的片段仍与其特定的珠子结合。将克隆扩增的片段经富集并加载至
Figure BDA0003418554590000463
设备上进行测序。
Figure BDA0003418554590000464
孔的直径允许每个孔仅一个珠子。添加测序酶后，测序仪的流控技术子系统将各个核苷酸以固定顺序流过成千上万个孔，每个孔含有单个珠子。一种(或多种)与模板链互补的核苷酸的添加产生由仪器内的CCD相机记录的化学发光信号。通过
Figure BDA0003418554590000465
设备生成的信号强度和位置信息的组合使软件使用GS FLX系统确定多于1,000,000个个体读数的序列，每个读数高达约450个碱基对。
已使用定量和/或半定量方法获得序列后，然后可以计算D50，例如，通过确定占个体样品中检测到的总克隆的至少约50％的克隆的百分比。可以将正常范围与单独个体获得的数值进行比较，并且结果可以报告为数量和正常或异常结果。这为医生提供了用于诊断目的的另外的临床检测。来自健康个体、患有结肠癌个体和患有肺癌个体的个体样品的结果如下表1所示。这些结果来自T细胞群，表示为8个(年龄匹配的正常)至10个(结肠癌、肺癌)样品结果的平均值。
表1
健康状况 D50(Tc) D50(Tr) D50(Th)
健康/正常 23.6 43.5 38.9
结肠癌 4.5 21.7 28.3
肺癌 4.5 17.1 26.8
由于每个数量代表占被评估群中检测到的序列总数约50％的克隆的百分比，从以上数量可以清楚地看出，表示为偏离正常的免疫组库多样性的缺乏，可用于诊断检测组套(panel)中的有用标准。本发明的方法，特别是如果在自动化系统中使用时，例如本发明人在美国专利申请公开号201000291668A1中描述的系统，可用于分析来自多个个体的样品，其中扩增的靶序列的检测通过使用一个或多个微阵列完成。
利用至少一个微阵列的杂交还可用于确定个体免疫组库的D50。在这种方法中，D50将计算为占来自所有V和/或J基因的总信号的至少50％的最优势可变基因(V和/或J基因)的百分比。
表2示出了(8)正常、健康个体与(20)患有慢性淋巴细胞白血病个体和(12)狼疮个体之间的B细胞多样性差异，如D50所证明
表2
个体状况 D50(IgH)
健康/正常 95.3
慢性淋巴细胞白血病 17.86
狼疮 26.5
最近，多个实验室的研究人员已报道当健康状态变为更不健康的状态时，人或动物体内的微生物多样性(“微生物组”)也发生些许改变(shift)。例如，微生物群的些许改变与各种胃肠道疾病、肥胖和糖尿病有关。Zaura等人(Zaura，E.等人“Defining the healthy‘core microbiome’of oral microbial communities.”BMC Microbiology(2009)9：259)报道，无关的健康个体的大部分细菌序列相同，并且在患有口腔疾病的个体中比例发生些许改变。Arm-PCR方法，与高通量测序组合，为评价微生物群多样性提供了相对快速、高灵敏度、特异性和半定量的方法，以建立例如，用于各种人或动物组织的微生物D50值。Arm-PCR已被证明对于鉴别从临床样品中获得的混合群中的细菌非常有效。
实施例
个体样品
来自10个肺和10个结肠以及10个乳腺癌个体的在肝素钠中采集的全血样品(40m1)购自Conversant Healthcare Systems(Huntsville，阿拉巴马州)。来自8个正常对照样品的在肝素钠中采集的全血样品(40ml)购自ProMedDx(Norton，MA)。
T细胞亚群的分离
T细胞分离使用涂覆对每个T细胞亚型特异的单克隆抗体的超顺磁性聚苯乙烯珠(MiltenyiBiotec)进行。从全血中，通过Ficoll制备获得单核细胞，并使用抗CD14微珠去除单核细胞。然后将这种单核细胞耗竭的(depleted)单核级分用作特异性的T细胞亚型级分的来源。
通过使用抗CD4多分类(multisort)珠(MiltenyiBiotec)的阴性选择，然后使用抗CD8珠的阳性选择来分离细胞毒性CD8+T细胞。通过使用抗CD4珠的阳性选择来分离CD4+T细胞。抗CD25珠(MiltenyiBiotec)用于选择CD4+CD25+调节性T细胞。所有分离的细胞群立即重悬在RNAprotect(Qiagen)中。
RNA提取和组库扩增
根据生产商的方案，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)进行RNA提取。对于每个靶标，使用在www.irepertoire.com上可获得的引物软件设计一组嵌套序列特异性引物(正向外侧引物，Fo；正向内侧引物，Fi；反向外侧引物，Ro；和反向内侧引物，Ri)。一对共同的序列标签与所有内部引物(Fi和Ri)连接。一旦在最初的几个扩增循环中将这些标签序列掺入PCR产物，使用一对公有引物进行扩增的指数期。在第一轮扩增中，仅使用序列特异性嵌套引物。然后通过核酸外切酶消化去除嵌套引物，并通过添加公有引物以及新鲜酶和dNTP的混合物，将第一轮PCR产物用作第二轮扩增的模板。每个不同的条形码标签通过PCR引物被引入至来自相同样品的扩增子中。
测序
将来自不同样品的条形码标记的扩增子产物一起合并并加载至2％琼脂糖凝胶中。电泳后，从对应于从琼脂糖凝胶中提取的250-500bp片段的DNA条带中纯化DNA片段。使用具有钛试剂盒(SeqWright，Inc.)的454GS FLX系统对DNA进行测序。
测序数据分析
根据条形码标签对每个样品的序列进行分类。在序列分离之后，以与Wang等人(Wang C等人，High throughput sequencing reveals a complex pattern of dynamicinterrelationships among human T cell subsets.Proc Natl Acad Sci USA107(4)：1518-1523)报道的方法类似的方式进行序列分析。简言之，使用程序IRmap将从IMGT服务器(http！//www.imgt.org)下载的种系V和J参考序列定位到序列读数上。参考序列中定义CDR3区的边界通过定位信息映射到测序读数上。测序读数中封闭的CDR3区被提取并翻译成氨基酸序列。
本申请参考了各种出版物。这些出版物的公开内容在此通过引用以其全文并入本申请，以更全面地描述本申请所属领域的状态。对于在引用所依赖的句子中进行讨论的参考文献中所包含的材料，所公开的参考文献还通过引用单独且具体地并入本文。
本文描述的系统、方法及其各种实施方案是示例性的。本文描述的系统和方法的各种其他实施方案是可能的。

Claims (8)

1.一种向用户呈现用户的免疫组库概况的方法，包括以下步骤：
从所述用户获取血液样品；
确定选自由克隆型指标、基本指标和多样性指标组成的组中的至少一个指标以产生所述用户的血液样品的免疫组库概况；和
向所述用户输出关于所述用户的免疫组库概况的信息。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括获取与所述用户相关的一组特征数据的步骤，其中与所述用户相关的特征数据包括所述用户的年龄和性别。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述特征数据进一步包括任何疾病的存在。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品包括全血。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品包括干血斑。
6.根据权利要求5所述的方法，包括以下另外的步骤：
向所述用户提供包括采血卡的试剂盒，其中所述采血卡包括至少一个采血区和QR码；和
所述用户扫描所述QR码以将所述血液样品与所述用户在软件应用程序上的账户相关联。
7.根据权利要求1所述的方法，其中使用软件应用程序执行向所述用户输出信息的步骤。
8.一种向用户呈现用户的免疫组库概况的方法，包括以下步骤：
向所述用户提供包括采血卡的试剂盒，其中所述采血卡包括至少一个采血区和QR码；
所述用户扫描QR码以将所述血液样品与所述用户在软件应用程序上的账户相关联；
获取与所述用户相关的一组特征数据，其中与所述用户相关的特征数据包括所述用户的年龄、性别以及任何疾病的存在或不存在；
从所述用户获取血液样品；
确定选自由克隆型指标、基本指标和多样性指标组成的组中的至少一个指标以产生所述用户的血液样品的免疫组库概况；和
使用软件应用程序向所述用户输出关于所述用户的免疫组库概况的信息。
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