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CN114375338A - 生物催化制造二氢查尔酮的方法 - Google Patents

生物催化制造二氢查尔酮的方法 Download PDF

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CN114375338A
CN114375338A CN202080055306.0A CN202080055306A CN114375338A CN 114375338 A CN114375338 A CN 114375338A CN 202080055306 A CN202080055306 A CN 202080055306A CN 114375338 A CN114375338 A CN 114375338A
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seq
acid sequence
biocatalyst
dihydrochalcone
nucleic acid
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CN202080055306.0A
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托尔斯滕·盖斯勒
雅各布·彼得·莱
巴斯蒂安·齐佩尔
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Symrise AG
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Abstract

本发明涉及一种通过提供至少一种用于根皮素和/或其糖苷羟基化的第一生物催化剂系统以及至少一种用于3‑羟基根皮素甲基化的第二生物催化剂来制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的生物催化方法。本发明进一步公开了能够产生这种生物催化剂的微生物以及编码该生物催化剂的序列。此外，本发明涉及通过本发明中公开的方法获得的混合物的用途，以及适合用作甜味增强剂和/或调味剂的特定组合物。

Description

生物催化制造二氢查尔酮的方法
技术领域
本发明涉及一种通过提供至少一种用于根皮素和/或其糖苷羟基化的第一生物催化剂系统以及至少一种用于3-羟基根皮素甲基化的第二生物催化剂来制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的生物催化方法。本发明进一步公开了能够产生这种生物催化剂的微生物以及编码该生物催化剂的序列。本发明还提供了特别适用于上述方法的新突变酶。此外，本发明涉及通过本发明中公开的方法获得的混合物的用途，以及适合用作甜味增强剂和/或调味剂的特定组合物。
背景技术
二氢查尔酮是一类具有增加甜度潜力的化合物，常用于各种应用中，用于增加甜味印象或掩盖食品、药品、饮料或类似成品的苦味物质。因此，始终需要提供二氢查尔酮作为安全的食品添加剂，并因此需要以可靠的方式提供所述物质的方法。高圣草酚二氢查尔酮(1)的制造及其甜度增强特性在WO2007107596A1中进行了描述。此外，US20080227867中描述了调味组合物中高圣草酚二氢查尔酮(1)与唾液增加剂的混合物。US20080227867中还描述了用高圣草酚二氢查尔酮(1)掩蔽咖啡因的苦味印象。(1)的制造在WO2007107596A1中被描述为1，4-二-O-苯并苯乙酮与香兰素的哌啶的催化羟醛缩合反应。在该化学反应中，所获得的查尔酮的双键借助于Pd/C催化剂水合。其他方法包括使用保护基团、其他碱或还原剂。根据EC 1334/2008，所有描述的方法不能被声明为天然制造方法。
Figure BPA0000316770850000011
WO 2017186299A1中描述了橙皮素二氢查尔酮(2)用于改进不愉快味觉印象的用途和效果。这些特征也见述于J.Agric.Food Chem.1977，25(4)，763-772以及J.Med.Chem.1981，24(4)，408-428。WO2019080990A1中描述了(2)和果糖含量增加的玉米糖浆以及其他甜味剂的混合物。总之，在现有技术中未公开(1)和(2)的混合物。
WO2007107596A1公开了一种用于改进甜味印象的4-羟基查尔酮，其中4-羟基功能被描述为该物质的甜味增强特性所必需的。在该申请中，未明确公开2的结构，但描述了隐含公开2的结构的Markush公式。此外，结构2的效果未在实施例中得到支持或公开。
橙皮素二氢查尔酮(2)可通过WO2019080990A1中描述的新橙皮苷二氢查尔酮的酸水解来制造。此外，(2)可通过将橙皮素溶解在10wt.-％的KOH水溶液中并随后借助Pd/C催化剂用氢还原来制造。保护基团、其他碱或还原剂的使用以及酸催化的醛醇反应的可能性在本领域是众所周知的。所有已知方法都需要有机溶剂，因此根据EC1334/2008，也不能归类为天然制造方法。
在过去几年中，消费者对天然产品的认识稳步提高，因此，标示为天然产品或生态产品在今天成为强有力的购买理由。因此很明显，人们对具有与其化学制造的悬垂物相同特性的天然制造的二氢查尔酮的需求正在快速增加。值得注意的是，由于二氢查尔酮在天然化合物中的不可用性所致无法从天然原料中提取。因此，最有希望的自然制造方法是生物催化方法。这将为二氢查尔酮在具有“全天然”标签的成品中的应用打开市场。
因此，本发明的目的是开发用于生物催化制造高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮及其混合物的方法，其可归类为通过全天然制造方法生产。此外，其目的是通过定义包含这些产品的组合物的精确感官特性来表征所得产品并改进基于高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物和组合物作为调味剂和甜味增强剂的适用性。最后，其目的是鉴定和表征适合于增强生物催化制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的新酶变体。
发明内容
通过提供一种生物催化方法来解决上述目标，该方法用于使用至少一种氧化酶、至少一种还原酶和至少一种甲基转移酶以两步工艺从根皮素和/或其糖苷制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮。本发明进一步公开了能够将根皮素和/或其糖苷转化为3-羟基根皮素的可能的氧化酶和还原酶，以及能够使3-羟基根皮素甲基化以获得高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的可能的甲基转移酶。本发明进一步公开了高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的混合物作为甜味增强剂和/或调味剂在提供营养或风味的商品中的用途。
在本发明的第一方面中，提供了一种生物催化方法，其使用至少一种提供的生物催化剂系统和至少一种生物催化剂来制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮。首先，通过使用由至少一种氧化酶和至少一种还原酶组成的至少一种第一生物催化剂系统来氧化根皮素以获得3-羟基根皮素。然后3-羟基根皮素与O-甲基转移酶反应以获得高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮。
在所述第一方面的一个实施方式中，第一和第二至少一种生物催化剂系统或生物催化剂可作为酶、纯化酶、全细胞反应或作为编码所述生物催化剂的序列提供。
在所述第一方面的另一个实施方式中，第二生物催化剂可以是O-甲基转移酶。
根据第一方面的另一个实施方式，所述生物催化剂系统或生物催化剂可纯化或部分纯化。
在所述第一方面的另一个实施方式中，根皮素和/或其糖苷和/或3-羟基根皮素可纯化或部分纯化。
在所述第一方面的又一个实施方式，可获得高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的混合物，使其可根据所述第一方面的另一个实施方式纯化或部分纯化。
在根据本发明的第二方面中，高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的混合物可用作提供营养或愉悦的商品中的甜味增强剂和/或调味剂。
本发明进一步公开了生物体，其可用作生物催化剂或用作生产生物体以生产特别适合于编码本文公开的生物催化剂的这类生物催化剂和多肽。
在又一个方面中，提供一种适合作为根据本公开的第二生物催化剂的O-甲基转移酶，其中与根据SEQ ID NO：14的序列相比，O-甲基转移酶包含至少一个突变，并且其中O-甲基转移酶选自由SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76组成的组或其功能片段、或与SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列或其功能片段、或编码O-甲基转移酶的核酸序列或其功能片段。
最后，在另一方面，提供了一种组合物，所述组合物包含以下物质或由以下物质组成：(a)高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物，其重量比约为1,000∶1至1∶1,000，或重量比约为100∶1至1∶100，优选地约为50∶1至1∶50，更优选地约为10∶1至1∶10，甚至更优选地约为5∶1至1∶5，且最优选地约为1∶1；和(b)酸、另一风味剂、甜味剂和/或水中的至少一种。
本发明的方面和实施方式源于以下详细描述和实施例、附图、序列表和所附权利要求。
附图说明
图1：用表达McPFOMT的裂解大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。
图2：用表达AtCOMT的裂解大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。
图3：用表达CrOMT的裂解大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。
图4：用表达CbMOMT的裂解大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。
图5：用表达GmSOMT的裂解大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。
图6：用表达SynOMT的裂解大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。
图7：用根皮素培养PPS-9010_CH3H_ATR1。3-羟基根皮素是产物。
图8：用3-羟基根皮素孵育裂解的PPS-9010_SAM_MxSafC细胞。溶菌液用3mM 3-羟基根皮素、3mM S-腺苷甲硫氨酸和0.67mM MgCl2在25℃下孵育24小时。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚二氢查尔酮是产物。
图9：用3-羟基根皮素孵育裂解的PPS-9010_SAM_PsOMT细胞。溶菌液用3mM 3-羟基根皮素、3mM S-腺苷甲硫氨酸和0.67mM MgCl2在25℃下孵育24小时。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚二氢查尔酮是产物。
图10：用表达MxSafC(野生型(wt)，参见SEQ ID NOs：13、14、55)或其特定变体或突变体(参见SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：76)的裂解的大肠杆菌BL21(DE 3)细胞对3-羟基根皮素进行生物转化。橙皮素二氢查尔酮和高圣草酚(HED)二氢查尔酮是产物。3-羟基根皮素(30HP)的转化显示为浅灰色，产物对橙皮素二氢查尔酮的特异性显示为深灰色。
序列的简要描述
SEQ ID NO：1：编码甘油醛-3-磷酸启动子变体的变体的人工核酸序列。
SEQ ID NO：2：编码甘油醛-3-磷酸启动子变体的变体的人工核酸序列。
SEQ ID NO：3：编码博莱霉素抗性基因的人工核酸序列。
SEQ ID NO：4：编码博莱霉素抗性蛋白的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：5：编码氨基糖苷磷酸转移酶的人工核酸序列。
SEQ ID NO：6：编码氨基糖苷磷酸转移酶的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：7：描述了拟南芥中编码NADPH细胞色素P450还原酶1的核酸序列。
SEQ ID NO：8：描述了拟南芥中编码NADPH细胞色素P450还原酶1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9：描述了硫华菊中编码查尔酮-3-羟化酶的核酸序列。
SEQ ID NO：10：描述了硫华菊中编码查尔酮-3-羟化酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11：描述了酿酒酵母中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的核酸序列。
SEQ ID NO：12：描述了酿酒酵母中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13：描述了黄色粘球菌中编码O-甲基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：14：描述了黄色粘球菌中编码O-甲基转移酶的氨基酸序列。用于编号MxSafC突变位置的参考序列(参见以下SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：76)。
SEQ ID NO：15：描述了樟子松中编码O-甲基转移酶的核酸序列。
SEQ ID NO：16：描述了樟子松中编码O-甲基转移酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：18：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：19：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：20：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：21：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：22：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：23：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：24：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：25：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：26：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：27：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：28：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：29：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：30：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：31：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：32：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：33：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：34：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：35：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：36：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：37：枯草芽孢杆菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的核酸序列。
SEQ ID NO：38：枯草芽孢杆菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39：枯草芽孢杆菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的I317V突变体的核酸序列。
SEQ ID NO：40：枯草芽孢杆菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的I317V突变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41：大肠杆菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的核酸序列。
SEQ ID NO：42：大肠杆菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43：壮观链霉菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的核酸序列。
SEQ ID NO：44：壮观链霉菌中编码S-腺苷甲硫氨酸合酶的核酸序列。
SEQ ID NO：45：酿酒酵母中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列。
SEQ ID NO：46：酿酒酵母中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47：法夫驹形氏酵母中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的核酸序列。
SEQ ID NO：48：法夫驹形氏酵母中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：50：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：51：编码潮霉素抗性基因的人工核酸序列。
SEQ ID NO：52：编码潮霉素抗性基因的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：53：编码上游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：54：编码下游引物的人工核酸序列。
SEQ ID NO：55：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶(MxSafC)的人工核酸序列，包括标签(尤其包括N-末端HIS标签和连接子，其中当以下参考MxSafC中的突变位置时，不计算这些元素。以上SEQ ID NO：14用作这方面的参考序列)。
SEQ ID NO：56：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_L92Q)的人工核酸序列。
SEQ ID NO：57：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_W96A)的人工核酸序列。
SEQ ID NO：58：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_D119P)的人工核酸序列。
SEQ ID NO：59：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_T40P)的人工核酸序列。
SEQ ID NO：60：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_S173H)的人工核酸序列。
SEQ ID NO：61：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_T40P_S173H)的人工核酸序列。
SEQ ID NO：62：编码黄色粘球菌中O-甲基转移酶变体(MxSafC_M5)的人工核酸序列。本文中的“M5”系指结合突变T40P/L92Q/W96A/D119P/S173H的五倍或五重突变体。
SEQ ID NO：63：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_L92Q)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：64：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_W96A)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：65：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_D119P)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：66：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_T40P)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：67：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_S173H)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：68：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_T40P_S173H)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：69：带有标签的黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_M5)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：70：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_L92Q)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：71：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_W96A)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：72：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_D119P)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：73：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_T40P)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：74：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_S173H)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：75：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_T40P_S173H)的人工氨基酸序列。
SEQ ID NO：76：黄色粘球菌中O-甲基转移酶的变体(MxSafC_M5)的人工氨基酸序列。
具体实施方式
为了满足提供通过基于酶和同源底物的适当组合以生物催化手段充分制造的二氢查尔酮的需要，本发明人设计了一种通过代谢工程的途径，并提供了合适的酶及其变体，以从根皮素及其糖苷作为离析物开始生产相关的二氢查尔酮。
根据本发明的第一方面，可提供一种用于生物催化制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的方法，该方法包括以下步骤或由以下步骤组成。在第一步(i)中，可提供至少一种包含至少一种氧化酶或编码该氧化酶的序列的第一生物催化剂系统以及至少一种还原酶或编码该还原酶的序列。在第二步中，该方法可涉及(ii)使所述至少一种第一生物催化剂系统与根皮素和/或糖苷接触并孵育混合物以(iii)获得3-羟基根皮素。在步骤(iv)中，可提供至少一种第二生物催化剂，且任选地还可提供至少一种甲基基团供体，其中步骤(iv)中提供的至少第二生物催化剂可在根据本发明的方法的步骤(v)中与步骤(iii)中获得的3-羟基根皮素和任选地与步骤(iv)中提供的至少一种甲基基团供体接触，并孵育该混合物以在步骤(vi)中获得高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮。
令人惊讶地发现，使用根据本发明的方法，可以以生物催化方式制造高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮，并且可以获得高产率的功能性产品。与现有技术中公开的化学合成相比，这具有一些特殊的优点，诸如有可能声明产品为全天然工艺制造。此外，这种方法不是基于高纯度的离析物，也可以使用半成品和原离析物进行制造。仅通过使用酶就能实现高立体选择性，这是优于化学过程的主要优势。最后，不需要添加用于化学催化某些反应步骤的苛刻化学物质。总之，这种新的生物催化方法为以全天然方式制造高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮开辟了道路，因此，根据EC 1334/2008，这些产品可以被宣布为天然的。
在本发明的上下文中，术语生物催化剂是指能够催化所需反应的生物体或源自生物体的催化剂。在这种情况下，至少一种生物催化剂催化氧化和还原反应以及所获得的3-羟基根皮素的甲基化。因此，所述生物催化剂可以是任选地以纯化形式存在的酶，或者它可以暗示包含至少一种酶或编码该酶的序列的生物体。
在本发明的上下文中，包含至少一种氧化酶和至少一种还原酶的生物催化剂系统可以以相同形式或不同形式存在。在本发明的一个实施方式中，这两种至少一种酶在同一个微生物中表达。在另一个实施方式中，所述生物催化剂系统包含至少两种微生物，每种微生物表达一种相应的酶。
根据另一个实施方式，所述生物催化剂系统包含至少两种纯化或部分纯化的酶，或至少一种在微生物中表达的酶和至少一种纯化或部分纯化的酶。
在又一个实施方式中，所述至少一种氧化酶和/或至少一种还原酶存在于至少一种细胞裂解物中，其中术语细胞裂解物描述在发酵后经过机械或化学处理且不再存活的微生物。在优选的实施方式中，所述生物催化剂系统的至少一种酶也可在分泌信号的控制下产生，以便该酶将由宿主细胞分泌，并且所述一种或多种酶可容易地回收用于细胞培养上清液。
在另一个实施方式中，所述至少一种氧化酶和至少一种还原酶存在于至少两种细胞裂解物中，这两种细胞裂解物在根据本发明的方法的步骤ii)开始之前汇集在一起。
重组微生物或真菌或由根据本发明的公开内容的核酸序列编码的蛋白质或酶的培养、分离和纯化是本领域的技术人员已知的。
步骤i)中生物催化剂系统中提供的至少一种氧化酶对于催化根皮素和/或其糖苷的氧化是必需的，其中步骤i)中提供的至少一种还原酶对于还原氧化的根皮素和/或其氧化的糖苷并因此获得3-羟基根皮素是必需的。使用生物催化剂系统尤其有利，因为与化学催化剂相比，两种反应可以同时发生。
在本发明第一方面的一个实施方式中，根皮素的糖苷可选自由根皮苷、西伯丁、三叶苷、柚苷二氢查尔酮和根皮素-4’-O-糖苷组成的组。
合适的反应条件，诸如缓冲液、添加剂、温度和pH条件、合适的辅因子以及可选的其他蛋白质可以由了解所需酶知识的本领域技术人员容易地确定，因此，根据本公开的任何方面或实施方式，所述酶也确定了反应条件的选择。
根据本发明第一方面的优选实施方式，所述至少一种生物催化剂或生物催化剂系统的第一和第二种作为/以酶、纯化酶、细胞裂解物、全细胞反应中的至少一种或作为编码所述生物催化剂的序列或其组合提供。
在本发明的上下文中，纯化酶或部分纯化酶是指对生物技术制造的酶进行处理以减少副产物。这可以通过本领域众所周知的不同分离方法来实现，例如色谱法，包括亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、尺寸排阻色谱法等，沉淀、膜过滤、离心、结晶或沉积。纯化酶在此涉及相对于完整混合物的至少90％(w/v)酶的总含量，其中部分纯化酶涉及相对于完整混合物的最大90％(w/v)酶的总含量。在另一个实施方式中，例如，在酶可直接从细胞培养上清液中获得的情况下，或者在细胞裂解物对后续反应可能具有某些优势的情况下，或者在纯化过程中可能预期的酶的显著损失的情况下，可优选地使用纯化程度较低的酶混合物。本领域技术人员可以容易地确定所关注的细胞培养裂解物和/或上清液中至少一种所关注的酶的含量和纯度，并且如果需要，技术人员可以容易地结合至少一个、两个或至少三个或多个纯化步骤以获得更高的纯度。
在本发明的上下文中，全细胞反应可以是生物催化方法，其中不存在纯化或部分纯化的酶或细胞裂解物。其是指至少一种类型的生物体的反应混合物，其是存活的并表达所述至少一种生物催化剂。
在本发明第一方面的一个实施方式中，所述生物催化剂可作为编码该生物催化剂的序列存在。这是指氨基酸序列和相应的核酸序列或编码该生物催化剂的氨基酸序列，其中该序列需要转移到微生物中以表达相应的酶。在本文所公开的酶和变体的上下文中，术语氨基酸序列、多肽和酶可互换使用。
在本发明第一方面的又一个实施方式中，所述生物催化剂可以作为酶、纯化酶、细胞裂解物、全细胞反应存在或以其组合存在或作为编码该生物催化剂的序列存在。
一个实施方式可以是纯化或部分纯化酶的组合。另一个实施方式可以是纯化酶或部分纯化酶与细胞裂解物的组合。又一个实施方式可以是至少两种细胞裂解物的组合。一个实施方式可以是全细胞反应和至少一种纯化或部分纯化酶的组合。另一个实施方式可以是两个全细胞反应的组合。
根据本发明第一方面的另一个优选实施方式，至少一种第二生物催化剂可以是O-甲基转移酶或编码该转移酶的序列。
O-甲基转移酶以高度立体选择性的方式催化甲基基团从甲基基团供体转移到甲基基团受体。就根据本发明的方法而言，O-甲基转移酶催化甲基基团从供体转移到3-羟基根皮素以形成高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮。本领域已知大量不同的O-甲基转移酶，例如，来自黄色粘球菌、樟子松、冰菜、拟南芥、长春花、仙女扇和大豆的O-甲基转移酶。根据本发明的另一个实施方式，O-甲基转移酶也可以作为氨基酸序列及其编码该氨基酸序列的对应核酸序列存在。然后该序列在合适的表达系统中发生转化以表达至少一种O-甲基转移酶。
在本发明的又一个方面中，根据本发明，提供了一种适合作为第二生物催化剂的O-甲基转移酶，其中与根据SEQ ID NO：14的序列相比，O-甲基转移酶包含至少一个突变，并且其中O-甲基转移酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76或其功能片段、或与SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列或其功能片段、或编码O-甲基转移酶的核酸序列或其功能片段。上下文中使用的功能片段是指相应MxSafC突变序列的连续片段，该片段被截断，但仍具有与同源全长酶相同的酶特异性。功能片段可与标签结合，或可用作融合蛋白。鉴于以下事实，即与全长变体相比功能片段在空间上的要求较低，这些功能片段在某些情况下是有用的。
为了优化本文所公开的各种方法，如下文所公开，创建并测试了某些MxSafC突变体或变体(这些术语在本文中可互换使用)。可产生与野生型MxSafC(SEQ ID NO：14)相比具有改进特性的某些突变体，其可有利地用于本文所公开的方法中。鉴于这些新鉴定的突变体具有令人感兴趣的催化活性这一事实，这些突变体也可独立于本发明的方法作为3-羟基根皮素和相关结构的高活性和特异性O-甲基转移酶使用。
在某些实施方式中，对于平衡的高圣草酚二氢查尔酮/橙皮素二氢查尔酮产品混合物，可优选SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71的O-甲基转移酶或其功能片段。在其他的实施方式中，在对高橙皮素二氢查尔酮产率感兴趣的情况下，则可优选SEQ ID NO：72至SEQ IDNO：76的O-甲基转移酶或其功能片段。在某些实施方式中，在对底物3-羟基根皮素的高酶活性和/或转化率感兴趣的情况下，则可优选SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：75的O-甲基转移酶或其功能片段。在某些实施方式中，SEQ ID NO：70至SEQ ID NO：74中任一个的单突变可组合为其他单独的(双突变)，或产生三重和四重突变。
在某些实施方式中，例如，提供了编码变体O-甲基转移酶的核酸序列，具有SEQ IDNO：56至SEQ ID NO：62。鉴于这些序列可以被密码子优化这一事实，在本公开的范围内，相应核酸序列或其片段的变异是可能的，只要相关的核酸序列编码选自由SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76组成的组的氨基酸序列或其功能片段、或与SEQ ID NO：63至SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列或其功能片段。
在本发明第一方面的另一个优选实施方式中，所述至少一种第一和/或第二生物催化剂系统可以是纯化或部分纯化的生物催化剂或生物催化剂系统。术语纯化涉及与上述酶相同的纯化水平。纯化的生物催化剂是相对于完整混合物生物催化剂含量大于90％(w/v)的生物催化剂，而部分纯化的生物催化剂是相对于完整混合物生物催化剂含量小于90％(w/v)的生物催化剂。使用纯化或部分纯化的生物催化剂尤其有利，因为纯化或部分纯化的催化剂比全细胞反应或细胞裂解物更具反应特异性，其中不同的代谢途径可能导致不期望的副产物。使用纯化或部分纯化的生物催化剂可将副产物产生的可能影响降至最低。
在本发明的又一个优选实施方式中，至少一种第一生物催化剂系统可包含至少两个序列，所述至少两个序列由独立地选自由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10组成的组的氨基酸序列或其同系物、或编码相应氨基酸序列的核酸序列编码，或者由与根据SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码相应氨基酸序列的核酸序列编码，并且其中所述至少一种第二生物催化剂由选自由SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16、或其同系物、或编码相应氨基酸序列的核酸序列组成的组的氨基酸序列编码，或者由与SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码相应氨基酸序列的核酸序列编码。
SEQ ID NO：8描述了拟南芥中NADPH细胞色素P450还原酶的氨基酸序列，而SEQ IDNO：10描述了硫华菊中查尔酮-3-羟化酶的氨基酸序列。SEQ ID NO：14描述了来自黄色粘球菌的O-甲基转移酶，而SEQ ID NO：16描述了来自樟子松的O-甲基转移酶。相应序列具有示例性性质，并且可以被同源酶或编码源于不同生物体的序列交换，前提是相应的酶具有与SEQ ID NOs：8、10、14或16中任一个相关的底物特异性和催化活性。本领域的技术人员清楚地知道这样的同源酶存在于不同物种中这一事实。适用于本发明目的的同源酶可通过常用的用于序列比较的生物信息学工具识别，例如Needleman-Wunsch、Smith-Waterman、BLAST或FASTA算法。此外，本领域技术人员清楚地知道，与参考序列相比酶可包含至少一个取代基，只要这种修饰酶仍然包含相同的底物特异性和催化活性。
此外，根据本发明各个方面和实施方式的适合用作生物催化剂的酶可以是其来源的相应酶的催化活性域或片段。
关于合适的第二生物催化剂，下文实施例2下的表1中公开了合适的其他酶及编码该酶的序列。
每当本公开涉及核酸或氨基酸序列彼此的同一性百分比时，这些值定义了通过使用EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments(核苷酸)程序(https：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)核酸或用于氨基酸序列的EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments(蛋白质)程序(https：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/)获得的那些值。本文使用的比对或序列比较是指相互比较的两个序列的整个长度上的比对。欧洲分子生物学实验室(EMBL)欧洲生物信息学研究所(EBI)提供的用于局部序列比对的工具使用改进的Smith-Waterman算法(参见https：//www.ebi.ac.uk/Tools/psa/and Smith，T.F.&Waterman.M.S.″Identification of commonmolecular subsequences″Journal of Molecular Biology，1981147(1)：195-197)。进行比对时，使用EMBL-EBI定义的默认参数。那些参数是(i)用于氨基酸序列：Matrix＝BLOSUM62，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝0.5或(ii)用于核酸序列：Matrix＝DNAfull，空位开放罚分＝10，空位扩展罚分＝0.5。本领域技术人员清楚地知道，例如，如果与分子来源的原始生物体相比，在另一生物体中使用相应序列，则编码蛋白质的序列可以是“密码子优化”的。
在另一个优选实施方式中，所述至少一种第一生物催化剂系统可另外包含至少一种脱氢酶或编码该脱氢酶的序列，优选地为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6P脱氢酶)或编码该脱氢酶的序列，其中所述至少一种G6P脱氢酶由选自由SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48组成的组的氨基酸序列或其同系物、或编码相应氨基酸序列的核酸序列编码，或者由与根据SEQID NO：46和SEQ ID NO：48中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码相应氨基酸序列的核酸序列编码。
SEQ ID NO：46描述了来自酿酒酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的序列，而SEQ IDNO：48描述了来自法夫驹形氏酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的序列。
G6P脱氢酶在NADP+生成NADPH的条件下催化葡萄糖-6-磷酸转化为6-磷酸葡萄糖内酯。因在CYP450氧化酶的反应中NADPH被消耗为NADP+，因此有利地共表达G6P脱氢酶以为根皮素和/或其糖苷氧化为3-羟基根皮素提供足够的辅因子。
在根据本发明方法的又一个优选实施方式中，所述第一生物催化剂系统的至少一种氧化酶可以是CYP450氧化酶，并且其中所述第一生物催化剂系统的至少一种还原酶可以是CYP450还原酶，优选地其中所述至少一种CYP450氧化酶和/或至少一种CYP450还原酶如权利要求5所定义。
CYP450氧化酶和还原酶是细胞色素450氧化酶和还原酶，其存在于地球上几乎所有的生物中。它们用作单氧酶或单还原酶，且催化一个氧原子的转移。就本发明而言，使用此类氧化酶特别有益，因为它们普遍可用且容易转移到根据本发明的合适的生物催化剂系统中。
根据本发明第一方面的另一个优选实施方式中，所述生物催化剂由细胞产生或存在于细胞中，所述细胞选自由以下菌属组成的组：大肠杆菌属，诸如大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、优选地为大肠杆菌W3110；芽孢杆菌属，诸如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌；酵母菌属优选地为啤酒酵母；汉逊或毕赤酵母属，诸如法夫驹形氏酵母和多形汉逊氏酵母，优选地为法夫驹形氏酵母；耶氏酵母，诸如解脂耶氏酵母；克鲁维酵母属，诸如乳酸克鲁维酵母。
用于繁殖和培养根据本发明的重组微生物、酵母和真菌，并允许表达根据本发明的酶以及使用所公开的生物催化剂系统或生物催化剂来转化根据本发明的反应物的方法是本领域的技术人员已知的。
在另一个优选实施方式中，步骤ii)和iv)中的孵育可进行至少5、10、15、20、25分钟，优选地为至少30分钟。在本发明的一个实施方式中，孵育时间在5分钟到60分钟之间。在另一个实施方式中，孵育时间在10分钟到50分钟之间。在又一个实施方式中，孵育时间在15分钟到45分钟之间。
在又一个优选实施方式中，根据本发明的方法的步骤i)和ii)、或步骤i)、ii)、iv)和v)、或步骤iv)和v)可以同时进行。在第一实施方式中，提供所述至少一种生物催化系统的步骤可与使所述至少一种生物催化系统与根皮素和/或其糖苷接触并孵育该混合物一起发生。在第二实施方式中，提供所述至少一种生物催化系统的步骤可与使所述至少一种生物催化系统与根皮素和/或其糖苷接触以及提供第二生物催化剂并使两种生物催化剂与根皮素和/或其糖苷、产物3-羟基根皮素和任选地至少一种甲基基团供体接触并孵育该混合物以仅获得一种反应混合物的步骤同时发生。在第三实施方式中，提供所述至少一种第二生物催化剂的步骤可与使所述第二生物催化剂与3-羟基根皮素和任选地至少一种甲基基团供体接触并孵育该混合物的步骤同时发生。
根据第一方面的另一个优选实施方式，步骤ii)中提供的根皮素和/或其糖苷和/或步骤ii i)中获得的3-羟基根皮素可额外纯化或部分纯化。纯化是指相对于混合物的总含量为＞90％(w/v)的根皮素和/或其糖苷和/或3-羟基根皮素的混合物，而部分纯化的混合物涉及相对于混合物的总含量为＜90％(w/v)的根皮素和/或其糖苷和/或3-羟基根皮素的混合物。合适的纯化方法为本领域技术人员熟知，并且可选自由通过色谱分离、旋转蒸发、喷雾干燥、冷冻干燥和机械分离组成的组。
在又一个优选实施方式中，根据本发明的方法可包括添加至少一种甲基基团供体，并且其中所述至少一种甲基基团供体可选自S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸与S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAM)的组合，其中S-腺苷甲硫氨酸合酶可具有选自由SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44组成的组的氨基酸序列或其同系物、或编码相应氨基酸序列SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ IDNO：44的核酸序列、或与根据SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码相应氨基酸序列的核酸序列。
SEQ ID NO：12描述了来自酿酒酵母的S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列，而SEQID NO：38描述了来自枯草芽孢杆菌的S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列。SEQ ID NO：40描述了来自枯草芽孢杆菌的I317V突变体的S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列，而SEQ IDNO：42描述了来自大肠杆菌的S-腺苷甲硫氨酸合酶的氨基酸序列且SEQ ID NO：44描述了来自壮观链霉菌的S-腺苷甲硫氨酸合酶的核酸序列。
根据本发明所有考虑事项使用的S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAMS)由于其底物特异性和区域选择性所致而能够催化ATP和甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸。甲基基团供体是每一种具有甲基基团的组分，甲基基团可通过甲基转移酶转移到另一个组分，从而使其甲基化。
在另一个优选实施方式中，根据本发明的方法是用于生物催化制造高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物的方法，其中根据本发明方法的步骤v)包括获得高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物。
根据本发明第一方面的优选实施方式，该方法可包括纯化或部分纯化所获得的高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的附加步骤。纯化是指相对于混合物的总含量为＞90％(w/v)的高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的混合物，而部分纯化的混合物涉及相对于混合物的总含量为＜90％(w/v)的混合物。合适的纯化方法为本领域技术人员熟知，并且可选自由通过色谱分离、旋转蒸发、喷雾干燥、冷冻干燥和机械分离组成的组。
在本发明的第二方面中，本发明涉及根据本发明的混合物作为甜味增强剂和/或调味剂的用途，优选地其中所述甜味增强剂和/或调味剂用于选自由拟用于营养或享受的商品组成的组的成品中。
在另一个实施方式中，根据本发明的混合物可用作治疗制剂中的甜味增强剂和/或调味剂，以掩盖或改进液体、凝胶或固体形式的药品的任何不好的味道，从而通过改进其味道使得相关产品或组合物的吞咽和/或摄取变得容易。
在另一个方面中，提供一种组合物，其中该组合物可包含以下物质或由以下物质组成：(a)高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物，其重量比约为1,000∶1至1∶1,000，或重量比约为100∶1至1∶100，优选地约为50∶1至1∶50，更优选地约为10∶1至1∶10，甚至更优选地约为5∶1至1∶5，且最优选地约为1∶1；和(b)酸、另一风味剂、甜味剂和/或水中的至少一种。
基于通过本文公开的纯生物技术方法可获得的产品，这些产品的感官特性的进一步表征令人惊讶地表明，高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的特定混合物作为味道和甜味增强剂具有强烈的改进效果，因此依赖于该特定混合物的产品可以有利地用于成品消费品中。特别是，发现直接与仅包含单独的橙皮素二氢查尔酮或高圣草酚或单独的高圣草酚二氢查尔酮的组合物相比，基于高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的限定混合物具有显著改进的感官特性。
高圣草酚二氢查尔酮与橙皮素二氢查尔酮的最终重量比可因最终组合物或商品的复杂程度而异。因此，在较不复杂的组合物中，约为1,000∶1至1∶1,000的重量比，且优选地约为100∶1至1∶100的重量比可能是有利的。
在优选的实施方式中，高圣草酚二氢查尔酮与橙皮素二氢查尔酮的重量比将在约为50∶1至1∶50的范围内，更优选地约为10∶1至1∶10或5∶1至1∶5，且最优选地约为1∶1。
令人惊讶的是，高圣草酚二氢查尔酮与橙皮素二氢查尔酮的几乎相等的质量比1∶1可显著增加含有这些物质的水溶液的甜度和口感，因为所得混合物被发现更甜，且香草的香气更明显。
在某些实施方式中，可以优选产生多余的高圣草酚二氢查尔酮或橙皮素二氢查尔酮，这可以通过基于本公开平衡产品特性来实现。
在另一个实施方式中，包含高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物的组合物或由高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物组成的组合物可与包括柠檬酸、酒石酸和琥珀酸等的有机酸以及任选地至少一种其他的甜味剂结合。特别是，添加有机酸发现可改进口感，因为与仅使用橙皮素二氢查尔酮的相同混合物相比，所得混合物的酸味和涩味更少，特别是在使用高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的重量比约为10∶1至1∶10至约为1∶1的情况下。
在又一个实施方式中，上述重量比的高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物可与其他的苦味掩蔽剂、芳香剂或甜味剂或任何改进味道的物质一起使用。在一个实施方式中，该混合物可与莱鲍迪甙二硫醚结合，例如莱鲍迪甙A(RebA)。令人惊讶的是，与仅使用橙皮素二氢查尔酮的相同混合物相比，高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮重量比约为10∶1至1∶10至约为1∶1的所得混合物具有更浓郁的风味和更醇厚的香气。
根据本发明的甜味增强剂和/或调味剂的混合物可用于拟用于营养或享受的成品中，特别是下列产品：诸如烘焙产品(例如面包、饼干、蛋糕、其他烘焙食品)、糖果(例如巧克力、巧克力棒产品、其他棒产品、果胶、软硬太妃糖、口香糖)、酒精或非酒精饮料(例如咖啡、茶、葡萄酒、含酒饮料、啤酒、含啤酒饮料、利口酒、烈酒、白兰地、含水果的柠檬汽水、等渗饮料、清爽饮料、花蜜、水果和蔬菜汁、水果或蔬菜汁制剂)、速溶饮料(例如速溶可可饮料、速溶茶饮料、速溶咖啡饮料)、肉制品(例如火腿、加工香肠或生香肠制品、加香料或腌制的新鲜或咸肉制品)、蛋或蛋制品(干鸡蛋、蛋清、蛋黄)、谷类制品(例如谷物早餐、谷物棒、预煮即食米饭制品)、乳制品(例如乳饮料、奶昔、酸奶、开菲尔、新鲜奶酪、软奶酪、硬奶酪、干奶粉、乳清、黄油、酪乳、部分或完全水解的含乳蛋白产品)、大豆蛋白或其他大豆组分的产品(例如豆浆以及由其制备的产品、含有大豆卵磷脂的组合物、豆腐或豆豉等发酵产品或由其制备的产品)、水果制品(例如果冻、果冰、果酱、水果馅料)、蔬菜制品(例如番茄酱、酱汁、干蔬菜、冷冻蔬菜、预煮蔬菜、浓缩蔬菜)、小吃(例如烘焙或油炸土豆片或土豆面团产品、基于玉米或花生的挤压产品)、脂肪基和油基产品或其乳液(例如蛋黄酱、加料的蛋黄酱、色拉调料)、其他现成食品和汤(例如干汤、速溶汤、预煮汤)。
通过以下实施例进一步解释本发明，这些实施例并不旨在限制本发明的范围，而仅用作说明。
实施例
实施例1：质粒DNA在大肠杆菌细胞中的转化
将质粒DNA转化到具有化学活性的大肠杆菌(E.coli)DH5α细胞(德国法兰克福，新英格兰生物实验室)中，以繁殖所产生的质粒。将质粒DNA转化到具有化学活性的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中以产生表达菌株。
相应大肠杆菌菌株的50μl等分试样在冰上孵育5分钟。添加1μl质粒DNA后，在冰上混合该悬浮液并再孵育30分钟。通过将该悬浮液在42℃下在加热块中孵育45秒，然后在冰上孵育2分钟来进行转化。然后添加350μl SOC Outgrowth培养基(德国法兰克福，新英格兰生物实验室)，并在37℃和200rpm下孵育细胞1小时。然后将细胞悬浮液与相应的抗生素一起铺展在LB琼脂(德国卡尔斯鲁厄，卡尔罗斯有限责任公司)上，并在37℃下孵育16小时。然后将该细胞在37℃和200rpm下孵育1小时。
实施例2：大肠杆菌表达菌株的产生
如实施例1所述，在大肠杆菌BL21(DE 3)细胞中转化具有来自不同生物体的O-甲基转移酶的以下表达载体。
表1
Figure BPA0000316770850000181
Figure BPA0000316770850000191
McPFOMT及其编码序列对应于EP3050971中公开的SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：4。AtCOMT及其编码序列对应于EP 3050974中公开的SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：3。CrOMT及其编码序列对应于EP3050971中公开的SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：16。CbMOMT及其编码序列涉及如EP3050971中公开的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：7。GmSOMT及其编码序列涉及如EP3050971中公开的SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：5。SynOMT及其编码序列对应于如EP3050971中公开的SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：19。
MxSafC突变体变种对应于SEQ ID NO：56至SEQ ID NO：76。这些突变体被合成(德国海德堡BioCat有限责任公司)并分别在NcoI和HindIII限制性位点之间克隆到pET28a中。SEQ ID NOs：13、14和55显示出相应的野生型序列。通过人工设计，创建了某些突变体以优化MxSafC酶的活性和/或特异性。具体如图10中的结果所示，可以识别出有趣的单、双和五倍突变体。
首先，MxSafC(SEQ ID NO：14)内的不同位置随机突变。对所有突变体进行表征并检查其活性。在第二轮中，以迭代的方式对靶向突变及其组合进行测试，以确定具有良好活性和转化率，但同时具有良好甚至改进的产物特异性的用于商业目的的合适突变。事实上，可以确定满足这些需求的某些变体。
值得注意的是，所有突变体对橙皮素二氢查尔酮都有很强的产物特异性。有趣的是，对于L92Q和D119P变种，高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的特异性几乎是平衡的，这对于需要平衡的产品混合物的某些分析可能是更优选的。在橙皮素二氢查尔酮的产品特异性是最重要的情况下，W96A、T40P、S173H、T40P/S173H和M5五倍突变体似乎非常有希望，因为所有这些突变体或变种在特异性的相关特征方面都比野生型表现得更好。关于酶活性(图10中的浅灰色条)，所有突变体/变种都具有活性。T40P和S173H突变体在首次实验中被鉴定为特别有利。因此，另外还产生了一个双突变体(T40P/S173H)，该突变体显示出良好的特异性和技术上合理的活性二者。因此，在所使用的每个酶单位的高产量可能令人感兴趣的情况下，后一种突变体可能是优选的。
实施例3：大肠杆菌细胞的培养及生物转化
使用每个细胞含有表1中的质粒的大肠杆菌BL21(DE3)细胞与相应的抗生素接种5ml LB培养基(德国卡尔斯鲁厄，卡尔罗斯有限责任公司)。孵育16小时(37℃，200rpm)后，将20ml TB培养基(德国卡尔斯鲁厄，卡尔罗斯有限责任公司)用这些培养物中0.1的OD600接种。孵育这些主要培养物(37℃，200rpm)，直到达到0.5至0.8的OD600。添加1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷后，将培养物再孵育16小时(22℃，200rpm)。将主要培养物离心(10分钟，10000rpm)，根据制造商的规格，使用B-PER蛋白质提取试剂(德国波恩，赛默飞世尔科学公司)分解颗粒细胞。在额外离心(10分钟，14000rpm)后，将上清液与3mM 3-羟基根皮素、3mM S-腺苷甲硫氨酸、0.1mM MgCl2混合。所述反应混合物在25℃下孵育24小时。用20％三氯乙酸(5.7％最终浓度)停止测定后，离心样品，上清液用于LC-MS分析。生物催化的结果显示在图1至图6和图10中。
实施例4：生成法夫驹形氏酵母的表达载体
合成序列SEQ ID NO：1(德国海德堡BioCat有限责任公司)。pPICZalphaA(德国海德堡BioCat有限责任公司)的SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：1替换，以获得载体pG1Za_EV。因此，根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的以及SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：2O的pPICZalphaA，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
将载体pG1Za_EV的编码SEQ ID NO：4的SEQ ID NO：3替换为载体pPIC9K(德国海德堡BioCat有限责任公司)的编码SEQ ID NO：6的SEQ ID NO：5，以获得载体pG1Ga_EV。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22以及SEQID NO：5与SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的载体pG1Za_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
合成序列SEQ ID NO：51(德国海德堡BioCat有限责任公司)。载体pG1Za_EV的编码SEQ ID NO：4的序列SEQ ID NO：3用编码SEQ ID NO：52的SEQ ID NO：51替换，以获得载体pG1Ha_EV。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：22以及SEQ ID NO：51与SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：54的载体pG1Za_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。合成了编码SEQ ID NO：8的基因序列SEQ ID NO：7(德国海德堡BioCat)，并在SEQ IDNO：1和AOX1终止子之间的pG1Za_EV中克隆，以获得载体pG1Z_ATR1。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：7与SEQ IDNO：27和SEQ ID NO：28的载体pG1Za_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
合成了编码SEQ ID NO：10的基因序列SEQ ID NO：9(德国海德堡BioCat)，并在SEQID NO：1和AOX1终止子之间的pG1Ga_EV中克隆，以获得载体pG1G_CH3H。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的载体pG1Ga_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
合成了编码SEQ ID NO：12的基因序列SEQ ID NO：11(德国海德堡BioCat)，并在SEQ ID NO：1和AOX1终止子之间的pG1Za_EV中克隆，以获得载体pG1Z_SAM2。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的载体pG1Za_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
合成了编码SEQ ID NO：14的基因序列SEQ ID NO：13(德国海德堡BioCat)，并在SEQ ID NO：1和AOX1终止子之间的pG1Ga_EV中克隆，以获得载体pG1G_MxSafC。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26以及SEQ IDNO：13与SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的载体pG1Ga_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
合成了编码SEQ ID NO：16的基因序列SEQ ID NO：15(德国海德堡BioCat)，并在SEQ ID NO：1和AOX1终止子之间的pG1Ga_EV中克隆，以获得载体pG1G_PsOMT。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：15与SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的载体pG1Ga_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
合成了编码SEQ ID NO：46的基因序列SEQ ID NO：45(德国海德堡BioCat)，并在SEQ ID NO：1和AOX1终止子之间的pG1Ga_EV中克隆，以获得载体pG1H_G6PDH。根据专家已知的常规做法，通过聚合酶链反应(PCR)扩增SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26以及SEQ ID NO：45与SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的载体pG1Ha_EV，以1∶1的比率混合反应溶液，并在37℃下孵育1小时后将1.5μl混合物转化到大肠杆菌DH5α中，如实施例1所述。
实施例5：线性化质粒DNA在法夫驹形氏酵母细胞中的转化
创建了相应干细胞的电活性细胞(Lin-Cereghino等人，2005)，并用相应的线性化载体进行转化。200ng/μl载体用AvrII消化，4μl反应溶液用40μl等分试样的电转感受态细胞在1.8kV下转化。添加500μl 1M山梨醇和500μl YPD(10g/l酵母抽提物、20g/l蛋白胨、10g/l葡萄糖、0.67g/l含硫酸铵的酵母氮源、100mM磷酸盐缓冲液pH 6.5、10g/l甲硫氨酸)后，孵育细胞(30℃，200rpm，2小时)，并将50μl与相应的抗生素镀于YPD琼脂平板(佐菌素：100μg/ml，基因素：400μg/ml)。在30℃下孵育48小时后，选择转化株进行培养。
实施例6：法夫驹形氏酵母表达菌株的产生
菌株PPS-9010获自ATUM(加利福尼亚州纽瓦克)。
菌株PPS-9010用线性化载体pG1G_CH3H转化。随后用线性化载体pG1Z_ATR1转化所选的转化株以获得菌株PPS-9010_CH3H_ATR1。菌株PPS-9010_CH3H_ATR1的所选转化株随后用线性化载体pG1H_G6PDH转化以获得菌株PPS-9010_CH3H_ATR1_G6PDH。菌株PPS-9010用线性化载体pG1Z_SAM2转化。随后用线性化载体pG1G_MxSafC或pG1G_PsOMT转化所选的转化株以分别获得菌株PPS-9010_SAM_MxSafC或PPS-9010_SAM_PsOMT。
实施例7：法夫驹形氏酵母细胞的培养及生物转化
使用PPS-9010_CH3H_ATR1细胞接种10ml BMGYM培养基(10g/l酵母提取物，20g/l蛋白胨)。孵育16小时(30℃，200rpm)后，将所述先前培养物中的另一个25ml BMGYM接种至OD600＝0.2。孵育(30℃，200rpm)至高达OD600为0.8至1.0后，添加400ppm根皮素。在25℃下孵育20小时后，添加1％甘油和400ppm根皮素，并进一步孵育24小时。该培养物然后与20％三氯乙酸混合，离心并将上清液用于LC-MS分析。生物催化的结果描绘于图7中。
使用来自PPS-9010_SAM_MxSafC或PPS-9010_SAM_PsOMT的细胞接种10ml BMGYM培养基。孵育过夜(30℃，200rpm)后，离心5ml培养物，将颗粒重新悬浮在1.4ml Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，并在涡流器中用玻璃珠(直径0.25至0.5mm)分解所述细胞。然后将裂解物离心，并使上清液与3mM 3-羟基根皮素、3mM S-腺苷甲硫氨酸、0.67mM MgCl2混合。所述反应混合物在25℃下孵育24小时。用20％三氯乙酸(5.7％最终浓度)停止测定后，离心样品，上清液用于LC-MS分析。生物催化的结果描绘于图8和9中。
实施例8：混合物的抛光
在分液漏斗中用乙酸乙酯以1∶1(v/v)提取来自实施例3或实施例7的500mL生物催化溶液。随后，有机相在旋转蒸发器(30℃，100mBar)中浓缩至干。在Sepacore X10工厂(德国Büchi)通过快速色谱法分离所得提取物。为此，将约200mg提取物排放至硅胶60(德国默克)柱上，以己烷(a)/乙酸乙酯(B)为梯度(20mL/min下120分钟内2％A至100％A)。然后在旋转蒸发器(30℃，100mBar)中将含有3-羟基根皮素或高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物的馏分浓缩至干。
实施例9：感官分析
由于所建立的生物催化方法产生了大量的高圣草酚二氢查尔酮(HEDDC)和橙皮素二氢查尔酮(HC)二者，进一步纯化且直接获得的产物进一步进行了一系列感官分析。为此，HEDDC和HC以规定的比率(wt.-％)使用，从相当高的1,000∶1和1∶1,000开始，分别降至50/50混合物1∶1。
测试了各种比率。结果发现，所得最终产物强烈影响最佳重量比。我们已经发现了在某些情况中高HEDDC：HC的令人惊讶的结果。
为了使方案标准化，在第一比较数据集中使用了1∶1的比率(10ppm比10ppm)。然而，并非所有设置中都需要此最大剂量。
首先，相比于单独的HC、单独的高圣草酚(H)或单独的HEDDC对具有HEDDC与HC不同重量比的水溶液进行了测试。在所有标准化的口味设置中，香草味的味道被归类为更浓。在某些情况下，测试人员还确认混合物(接近1∶1比率时)更甜。
其次，添加糖和酸以确定相关效果。在一种设置中，测试了5wt.的糖和0.15％的有机酸，通常是柠檬酸。一致证实，在添加至少一种酸的情况下HEDDC/HC混合物始终优于单独的HC，因为感官特征被归类为更少的涩味和酸味。根据不同的比率，也确定了更醇厚的香气。
最后，我们测试了添加其他甜味增强剂、增香剂和调味物质。例如，使用RebA，且使用几乎相等的HEDDC/HC比率，与单独使用HC的相同组合物相比，初始试验确认了更浓郁的风味和更醇厚的香气。值得注意的是，我们还测试了是否可以通过单独使用更大量的HC来调整上述效果。然而，在所有不同的试验系列中，组合的HEDDC/HC混合物始终具有某种协同作用，这是我们无法通过单独添加更多HC或H来模拟的。
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Claims (15)

1.一种生物催化制造高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
i)提供至少一种第一生物催化剂系统，所述系统包含至少一种氧化酶或编码该氧化酶的序列，以及至少一种还原酶或编码该还原酶的序列；
ii)使所述至少一种第一生物催化剂系统与根皮素和/或其糖苷接触并孵育所述混合物；
iii)获得3-羟基根皮素；
iv)提供至少一种第二生物催化剂和任选地至少一种甲基基团供体；
v)使步骤iv)中提供的所述至少一种第二生物催化剂与步骤iii)中获得的3-羟基根皮素接触，并任选地与步骤iv)中提供的所述至少一种甲基基团供体接触并孵育所述混合物；以及
vi)获得高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮，
其中所述高圣草酚二氢查尔酮(1)和橙皮素二氢查尔酮(2)具有下式：
Figure FPA0000316770840000011
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种生物催化剂或生物催化剂系统中的第一和第二种作为/以酶、纯化酶、细胞裂解物、全细胞反应中的至少一种或者作为编码所述生物催化剂的序列或其组合提供。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第二生物催化剂是O-甲基转移酶或编码该酶的序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一和/或第二生物催化剂系统或生物催化剂是纯化或部分纯化的生物催化剂或生物催化剂系统。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一生物催化剂系统包括至少两个序列，所述序列由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列或其同系物编码，或者由与根据SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列编码，并且其中所述至少一种第二生物催化剂由SEQ ID NO：14或16的氨基酸序列或其同系物、或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列编码，或者由与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列编码。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第一生物催化剂系统另外包含至少一种脱氢酶或编码该脱氢酶的序列，优选地为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6P)或编码该脱氢酶的序列，其中所述至少一种G6P由选自由SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48组成的组的氨基酸序列或其同系物、或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列编码，或者由与根据SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：48中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列编码。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一生物催化剂系统的至少一种氧化酶为CYP450氧化酶，并且其中所述第一生物催化剂系统的至少一种还原酶为CYP450还原酶，优选地其中所述至少一种CYP450氧化酶和/或所述至少一种CYP450还原酶如权利要求5所定义。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物催化剂由细胞产生或存在于细胞中，所述细胞选自由大肠杆菌属如大肠杆菌BL21、大肠杆菌MG1655、优选地为大肠杆菌W3110；芽孢杆菌属如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌；酵母菌属优选地为啤酒酵母；汉逊或毕赤酵母属如法夫驹形氏酵母和多形汉逊氏酵母，优选地为法夫驹形氏酵母；耶氏酵母如解脂耶氏酵母；克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母组成的组。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤i)和ii)，或步骤i)、ii)、iv)和v)，或步骤iv)和v)同时进行。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤ii)中提供的根皮素和/或其糖苷和/或步骤iii)中获得的3-羟基根皮素额外纯化或部分纯化。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括添加至少一种甲基基团供体，并且其中所述至少一种甲基基团供体选自S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸与S-腺苷甲硫氨酸合酶(SAM)的组合，其中所述S-腺苷甲硫氨酸合酶具有选自由SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44组成的组的氨基酸序列或其同系物、编码所述相应氨基酸序列的核酸序列、或与根据SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：38、SEQID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44中任一个的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的氨基酸序列或编码所述相应氨基酸序列的核酸序列。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是用于生物催化制造高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物的方法，其中步骤v)包括获得高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物，和/或其中所述方法包括纯化或部分纯化所获得的高圣草酚二氢查尔酮和/或橙皮素二氢查尔酮的附加步骤。
13.一种O-甲基转移酶，所述O-甲基转移酶适宜用作权利要求1至12所定义的方法中的第二生物催化剂，其中与根据SEQ ID NO：14的序列相比，所述O-甲基转移酶包含至少一个突变，并且其中所述O-甲基转移酶选自由SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76组成的组或其功能片段、或与SEQ ID NO：69至SEQ ID NO：76的相应序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列或其功能片段、或编码所述O-甲基转移酶的核酸序列或其功能片段。
14.一种组合物，所述组合物包含以下物质或由以下物质组成：
(a)高圣草酚二氢查尔酮和橙皮素二氢查尔酮的混合物，其重量比约为1,000∶1至1∶1,000，或重量比约为100∶1至1∶100，优选地约为50∶1至1∶50，更优选地约为10∶1至1∶10，甚至更优选地约为5∶1至1∶5，且最优选地约为1∶1；以及
(b)酸、另一风味剂、甜味剂和/或水中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的组合物作为甜味增强剂和/或调味剂的用途，优选地其中所述甜味增强剂和/或调味剂用于选自由从拟用于营养或享受的商品组成的组的成品中。
CN202080055306.0A 2019-09-27 2020-09-25 生物催化制造二氢查尔酮的方法 Pending CN114375338A (zh)

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