CN114366092A - 基于电共沉积电子介体的微针传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电共沉积电子介体的微针传感器及其制备方法，微针传感器包括包括基底及位于基底上的微针阵列，微针阵列的表面覆盖导电层及复合材料电子介体层，复合材料电子介体由碳纳米管、水凝胶电子介体及酶组成，复合材料电子介体层通过电共沉积固定在微针阵列的导电层的表面。本发明实施例中微针传感器的电子修饰材料不易脱落、稳定性好且灵敏度高，可广泛应用于传感器技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，尤其涉及一种基于电共沉积电子介体的微针传感器及其制备方法。
背景技术
微针传感器广泛应用于多种生理指标的检测，如血糖值、胆固醇值或尿酸值等，但是相关技术中，微针传感器存在以下问题：1、容易受测试环境的影响，抗干扰能力差，灵敏度低；2、微针表面的电子修饰材料粘附不牢固，微针插入皮肤的过程非常容易脱落，导致电子修饰在体内组织扩散流失。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例的目的是提供一种基于电共沉积电子介体的微针传感器及其制备方法，电子修饰材料不易脱落、稳定性好且灵敏度高。
第一方面，本发明实施例提供了一种基于电共沉积电子介体的微针传感器，包括基底及位于所述基底上的微针阵列，所述微针阵列的表面覆盖导电层及复合材料电子介体层，所述复合材料电子介体由碳纳米管、水凝胶电子介体及酶组成，所述复合材料电子介体层通过电共沉积固定在所述微针阵列的导电层的表面。
可选地，所述微针阵列包括空心微针阵列和片状微针阵列。
可选地，所述微针阵列的材料包括不锈钢。
可选地，所述水凝胶电子介体包括还原性高分子。
可选地，所述还原性高分子包括金属锇络合物。
可选地，所述导电层的材料包括金、铬或铂中的任意一种。
第二方面，本发明实施例提供了一种基于电共沉积电子介体的微针传感器的制备方法，包括：
制备微针电极，并在所述微针电极的表面制备导电层；
制备复合材料电子介体溶液，所述复合材料电子介体溶液包括碳纳米管、水凝胶电子介体及酶；
采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面。
可选地，所述在所述微针电极的表面制备导电层，具体包括：
将所述微针电极进行清洗并烘干；
将烘干后的微针电极使用助焊剂处理；
将使用助焊剂处理后的微针电极放入含导电金属的溶液中，并通过电化学沉积制备导电层。
可选地，所述制备复合材料电子介体溶液，具体包括：
分别制备电子介体溶液及碳纳米管溶液；
将所述电子介体溶液及所述碳纳米管溶液按照第一预设比例进行离心制备掺杂溶液；
提供酶溶液；
将所述掺杂溶液及所述酶溶液按照第二预设比例进行离心制备酶掺杂溶液。
可选地，所述采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面，具体包括：
将包含导电层的微针电极浸入所述复合材料电子介体溶液中；
采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面；
将覆盖有导电层及复合材料电子介体层的微针电极浸入缓冲溶液预设时间。
实施本发明实施例包括以下有益效果：本发明实施例中的微针阵列的表面修饰有复合材料电子介体层，复合材料电子介体由碳纳米管、水凝胶电子介体及酶组成，复合材料电子介体层通过电共沉积固定在微针阵列的导电层的表面；通过修饰包括碳纳米管、水凝胶电子介体及酶的复合材料电子介体，减少测试环境的影响，增加检测信号的强度，提高稳定性和灵敏度；通过电共沉积技术将复合材料电子介体固定的更牢固，不易脱落，进一步提高稳定性。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种基于电共沉积电子介体的微针传感器的结构示意图；
图2是本发明实施例提供的一种基于电共沉积电子介体的微针传感器的制备方法的步骤流程示意图；
图3是本发明实施例提供的一种片状金属微针的SEM图；
图4是本发明实施例提供的一种采用电共沉积和物理浸涂制备水凝胶电子介体层的SEM对比图；
图5是本发明实施例提供的一种不同电子介体层电极的SEM对比图；
图6是本发明实施例提供的一种不同电子介体层电极对葡萄糖响应的i-t曲线对比图；
图7是本发明实施例提供的一种碳纳米管复合水凝胶电子介体层电极和锇电子介体层电极的i-t曲线对比图；
图8是本发明实施例提供的一种不同微针传感电极的循环伏安测试对比图；
图9是本发明实施例提供的一种微针血糖传感器用于动物皮下血糖测试的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。对于以下实施例中的步骤编号，其仅为了便于阐述说明而设置，对步骤之间的顺序不做任何限定，实施例中的各步骤的执行顺序均可根据本领域技术人员的理解来进行适应性调整。
如图1所示，本发明实施例提供了一种基于电共沉积电子介体的微针传感器，包括基底1-1及位于所述基底1-1上的微针阵列1-2，所述微针阵列1-2中的微针电极1-3的表面覆盖导电层1-4及复合材料电子介体层1-5，所述复合材料电子介体由碳纳米管、水凝胶电子介体及酶组成，所述复合材料电子介体层1-5通过电共沉积固定在所述微针阵列的导电层1-4的表面。其中，1-6表示导电层1-4及复合材料电子介体层1-5组成的传感层的电路结构示意图。
需要说明的是，酶包括葡萄糖氧化酶，乳酸酶，胆固醇酶、过氧化氢酶或尿酸酶等，酶具体根据应用实例确定，本发明实施例不做具体限制。
本领域技术人员可以理解的是，碳纳米管、水凝胶电子介体及酶复合材料体系中，碳纳米管溶液包括多壁碳纳米管的异丙醇溶液、多壁碳纳米管的醋酸溶液、单壁碳纳米管的水溶液、单壁碳纳米管的醋酸溶液等，从而提高响应效果和改善传感性能。
可选地，所述微针阵列包括空心微针阵列和片状微针阵列。
可选地，所述微针阵列的材料包括不锈钢。
本领域技术人员可以理解的是，微针阵列的微针的形状包括但不限于空心微针或片状微针，如还可以为实心微针等；微针阵列的材料包括但不限于不锈钢，如通过3d打印聚合物成型再进行铬或铂溅射；微针阵列的微针的具体形状或材料根据实际应用确定，本发明实施例不做具体限制。
可选地，所述水凝胶电子介体包括还原性高分子。
可选地，所述还原性高分子包括金属锇络合物。
需要说明的是，水凝胶电子介体的具体材料包括但不限于还原性高分子及金属锇络合物，水凝胶电子介体的具体材料需要根据实际应用确定，本发明实施例不做具体限制。
可选地，所述导电层的材料包括金、铬或铂中的任意一种。
本领域技术人员可以理解的是，金、铬或铂是良好的导电材料，导电性好且稳定。导电层的材料包括但不限于金、铬或铂，本发明实施例不做具体限制。
实施本发明实施例包括以下有益效果：本发明实施例中的微针阵列的表面修饰有复合材料电子介体层，复合材料电子介体由碳纳米管、水凝胶电子介体及酶组成，复合材料电子介体层通过电共沉积固定在微针阵列的导电层的表面；通过修饰包括碳纳米管、水凝胶电子介体及酶的复合材料电子介体，减少测试环境的影响，增加检测信号的强度，提高稳定性和灵敏度；通过电共沉积技术将复合材料电子介体固定的更牢固，不易脱落，进一步提高稳定性。
本实施例通过激光微切割或微加工等方式制备导电不锈钢微针阵列，微针具有无痛透皮的性能，可以降低植入电极在体内引起疼痛或组织损伤等风险。该电极以金属微针阵列(不锈钢基底及表面金/铂导电层)为基体材料，其表面由碳纳米管/水凝胶电子介体/酶复合材料体系的电子介体传感层组成，采用共混碳纳米管、水凝胶电子介体、酶电沉积技术进行处理，其中电子介体层为碳纳米管/水凝胶电子介体/酶复合材料体系，水凝胶电子介体主要包含金属锇(或钌)络合物-聚乙烯吡咯烷酮(或联吡啶或其衍生物)等金属配合物高分子，酶可以是葡萄糖氧化酶，乳酸酶，胆固醇酶、尿酸酶、过氧化氢酶等等多种类型的氧化酶，通过共电沉积制备在微针表面形成均匀涂层。通过采用碳纳米管/水凝胶电子介体/酶复合材料体系作为电子介体层，能够使得微针阵列基于电子介体的二代血糖传感原理，电化学测试过程能够使用低电压作为偏压(例如～0.1V)，能够有效避免体内其他氧化还原物质例如维生素的干扰。同时，基于二代血糖传感原理的电极的检测传感依赖于电子从酶活性中心直接转移到电极，不需经过过氧化氢作为中间态电子载体，因此对于氧气浓度不具有依赖性，因此所制得的微针血糖电极，可以克服体内传感时组织内氧气匮乏的难题。该传感电极的传感材料层的共混电沉积制备方法，比常规的浸涂、滴涂等方式所制得的电极涂层相比，具有优良的均匀性和机械稳定性，并且极大地提高了微针血糖电极的检测线性范围，使得能够在活体进行检测血糖波动。
如图2所示，本发明实施例提供了一种基于电共沉积电子介体的微针传感器的制备方法，包括：
S100、制备微针电极，并在所述微针电极的表面制备导电层。
具体地，微针电极的制备过程如下：取长度为10/20/30mm的GB 23g、26g、28g、30g的注射器针管5～20根，使用打标机对微针进行激光刻蚀，功率50～90w，行进速度20～50mm/s，行进次数100～400次，把空心微针切成均匀的4/6/8/10mm长度。
可选地，所述在所述微针电极的表面制备导电层，具体包括：
S110、将所述微针电极进行清洗并烘干；
S120、将烘干后的微针电极使用助焊剂处理；
S130、将使用助焊剂处理后的微针电极放入含导电金属的溶液中，并通过电化学沉积制备导电层。
具体地，导电层的制备过程如下：1、使用无水乙醇对切割后的微针进行浸泡，在超声中清洗20～40min，取出后放入40～80℃烘箱中，烘干备用。2、配制含ZnO24％、NH4Cl30％、HCl6％、CH3COOH30％、H2O12％、表面活性剂3％体积比的不锈钢助焊剂。3、将微针浸入不锈钢助焊剂中超声，200s/300s/400s后取出，用无尘纸轻轻吸走微针表面的多余溶液。4、取出微针，连接电化学工作站，以微针作为工作电极，以金片电极作为对电极，银氯化银电极作为参比电极。在10mL烧杯中加入8mL浓度为2/4/6mmol/L的亚硫酸金钠水溶液，将三根电极浸入溶液中，使用多步恒流法在亚硫酸金钠电镀金溶液对微针进行电化学沉积金，参数如下：第一阶段：0.00006A，15s；第二阶段：-0.00006A，15s；第三阶段：-0.02A，200s/300s/400s。沉积后放入去离子水溶液中轻轻涮洗，取出后自然烘干。
对电极的制备过程如下：取已经完成电化学沉积金的微针，连接电化学工作站，以微针作为工作电极，以铂片电极作为对电极，银氯化银电极作为参比电极。在10mL烧杯中加入8mL浓度为2/4/6mmol/L的亚硫酸铂钠水溶液，将三根电极浸入溶液中，使用多步恒流法在亚硫酸铂钠电镀铂溶液对微针进行电化学沉积铂，参数如下：第一阶段：0.00006A，15s；第二阶段：-0.00006A，15s；第三阶段：-0.02A，200s/300s/400s。沉积后放入去离子水溶液中轻轻涮洗，取出后自然烘干。
参比电极的制备过程如下：取已经完成电化学沉积金的微针，使用银/氯化银油墨进行涂覆，在40℃/60℃/80℃烘箱中烘干。烘干后取出，使用质量分数为0.5％/1％/1.5％/2％聚乙烯醇缩丁醛的甲醇溶液(PVB的甲醇溶液)进行浸没涂覆，在室温下晾干超过12/14/16小时。
S200、制备复合材料电子介体溶液，所述复合材料电子介体溶液包括碳纳米管、水凝胶电子介体及酶。
可选地，所述制备复合材料电子介体溶液，具体包括：
S210、分别制备电子介体溶液及碳纳米管溶液；
S220、将所述电子介体溶液及所述碳纳米管溶液按照第一预设比例进行离心制备掺杂溶液；
S230、提供酶溶液；
S240、将所述掺杂溶液及所述酶溶液按照第二预设比例进行离心制备酶掺杂溶液。
具体地，复合材料电子介体溶液的制备过程如下：1、使用硫代甜菜碱丙烯酸甲酯(SBMA)与锇配合物NH2-(CH2)6(m-bim)Os(bpy)2·2PF6进行共聚反应以形成锇电子介体溶液，并准备等体积的溶于异丙醇(isopropanol，IPA)的多壁碳纳米管(Carbon NanoTube，CNT)溶液一份。在15mL的离心管中，分别按照体积比为5:0、4:1、3:2、2:3、1:4、0:5的比例分别配制碳纳米管浓度为0％、20％、40％、60％、80％、100％(v/v)的锇电子介体和碳纳米管掺杂溶液(以下称掺杂溶液)。2、准确称取500mg葡萄糖氧化酶溶解于10mLPBS缓冲溶液中，配制浓度为50mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液。3、在15mL的离心管中，分别按照体积比为1:1、1:3、1:4的比例分别加入掺杂溶液和葡萄糖溶液，配制体积分数为50％、25％、20％(v/v)的锇电子介体、碳纳米管和葡萄糖氧化酶的掺杂溶液(以下称酶掺杂溶液)。
S300、采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面。
可选地，所述采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面，具体包括：
S310、将包含导电层的微针电极浸入所述复合材料电子介体溶液中；
S320、采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面；
S330、将覆盖有导电层及复合材料电子介体层的微针电极浸入缓冲溶液预设时间。
具体地，复合材料电子介体的电共沉积方法如下：取已经完成电化学沉积金的微针，连接电化学工作站，以微针作为工作电极，以铂片电极作为对电极以及参比电极。在10mL烧杯中加入8mL体积分数为50％/25％/20％的酶掺杂溶液，将三根电极浸入溶液中，控制微针针尖约0.5/1/2mm的长度浸入不同浓度的酶掺杂溶液中，使用多步恒压法在酶掺杂溶液对微针进行电化学共沉积，参数如下：第一阶段：1A，200s/300s/400s。沉积后取出电极，在室温下晾干超过12/14/16小时，将制备好的微针检测电极放入PBS缓冲溶液中静置，8/10/12小时后取出，室温下自然风干4/6/8小时后，将电极置于25℃恒温箱中保存。
需要说明的是，通过电共沉积的复合材料电子介体可以通过以下方法进行表征：取制备好的金属微针电极，在喷金溅射仪中以80％的功率溅射100s，使得电极表面均匀镀上一层金材料，然后在扫描电镜下观察形貌。
本领域技术人员可以理解的是，通过上述方法制备的微针电极，可以通过电位扫描法对微针电极的性能进行表征，具体方法如下：取10mL烧杯一只，以修饰好的工作电极为工作电极，取商用铂电极为对电极，取Ag/AgCl电极为参比电极，放入烧杯中，在烧杯中加入10mL的PBS缓冲溶液，将电极浸入溶液中。打开电化学工作站软件，选择Cyclic-Voltammetry选项。设置参数：Init E:-0.2V，High E：0.8V，Low E:-0.2V，Final E：-0.2V，Initial Scan Polarity：Negative，Scan Rate:0.1V/s，Sweep Segments:10，SampleInterval:0.001V。观察测量得出的峰值。
需要说明的是，微针电极对葡萄糖响应的性能表征过程如下：取10mL烧杯一只，以修饰好的工作电极为工作电极，取商用铂电极为对电极，取Ag/AgCl电极为参比电极，放入烧杯中，在烧杯中加入10mL的PBS缓冲溶液，将电极浸入溶液中。打开电化学工作站软件，选择Amperometric i-t Curve选项。设置参数：Init E：0.5V，Sample Interval：0.1s，RunTime：300s，Sensitivity：0.00001A/V。在溶液中加入不同浓度的葡萄糖溶液，使得溶液的浓度变化：2mM/4mM/6mM/8mM/10mM/12mM/14mM/16mM/18mM/20mM，测量不同浓度下的葡萄糖响应。
具体地，微针传感电极葡萄糖电极动物实验测试过程如下：1、实验大鼠的准备工作：购入已满10周龄的STZ-Type 1DR大鼠，经检查无明显异常，进行适应性饲养7天后，选取连续两天血糖水平超过250mg/dL的大鼠、连续两天血糖水平不超过160mg/dL的大鼠各3只开展实验。2、麻醉方法：将大鼠固定稳妥后通过腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(0.2mL/100g)进行全身麻醉。使用恒温电热板保持大鼠体温恒定。实验装置(微针传感器)安置完成后，继续置于恒温电热板直至其苏醒。可肌肉注射苏醒溶液减少麻醉意外死亡的几率。3、大鼠完全麻醉后，对其背部皮肤进行备皮，备皮面积约3.5*3.5cm2。根据实验分组(详见下述)开展对应实验。4、组1大鼠(连续两天血糖水平超过250mg/dL)备皮完成后，将微针传感器施加于背皮位置，使用鼠用小背心进行固定。对传感通路每间隔15分钟测量一次皮下组织液葡萄糖信号。持续穿戴微针传感器72小时，期间大鼠正常饮食进水，并在特定间隔时间点对大鼠注射葡萄糖溶液，诱导血糖波动。前24小时每间隔30min，后48小时每间隔1小时对大鼠尾部采血，使用商用血糖计检测实际血糖值做对照。移除背心和微针传感器后再培养24小时，采用腹腔注射过量麻醉剂(2％戊巴比妥钠溶液)处死大鼠。取微针施加位置的局部皮肤，固定、包埋、切片后，采用苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin,H&E)对切片染色，观察皮肤结构、炎症细胞以及可能的穿刺伤口的变化。5、组2大鼠(连续两天血糖水平不超过160mg/dL)将微针传感器施加于背皮位置，使用鼠用小背心进行固定。对传感通路每间隔15分钟测量一次皮下组织液葡萄糖信号。持续穿戴微针传感器72小时，期间大鼠正常饮食进水，并在特定间隔时间点对大鼠注射葡萄糖溶液，诱导血糖波动。前24小时每间隔30min，后48小时每间隔1小时对大鼠尾部采血，使用商用血糖计检测实际血糖值做对照。移除背心和微针传感器后再培养24小时，采用腹腔注射过量麻醉剂(2％戊巴比妥钠溶液)处死大鼠。取微针施加位置的局部皮肤，固定、包埋、切片后，采用苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin,H&E)对切片染色，观察皮肤结构、炎症细胞以及可能的穿刺伤口的变化。6、评估修正后的血糖监测的准确性、灵敏度等性能指标。移除背心和微针传感器后再培养24小时，采用腹腔注射过量麻醉剂处死大鼠。
下面通过几个实施例对微针传感器的制备及测试等进行说明。
实施例一
基于电共沉积碳纳米管复合水凝胶电子介体的微针血糖传感电极，制备方法如下：
A.微针电极的制备(工作电极微针的预处理)
制备的片状微针的SEM图如图3所示。使用无水乙醇对切割后的微针进行浸泡，在超声中清洗40min，取出后放入80℃烘箱中，烘干备用。配制含ZnO24％、NH4Cl30％、HCl6％、CH3COOH30％、H2O12％、表面活性剂3％体积比的不锈钢助焊剂。将微针浸入不锈钢助焊剂中超声，200s后取出，用无尘纸轻轻吸走微针表面的多余溶液。取出微针，连接电化学工作站，以微针作为工作电极，以金片电极作为对电极，银氯化银电极作为参比电极。在10mL烧杯中加入8mL浓度为2mmol/L的亚硫酸金钠水溶液，将三根电极浸入溶液中，使用多步恒流法在亚硫酸金钠电镀金溶液对微针进行电化学沉积金，参数如下：第一阶段：0.00006A，15s；第二阶段：-0.00006A，15s；第三阶段：-0.02A，400s。沉积后放入去离子水溶液中轻轻涮洗，取出后自然烘干。
B.碳纳米管复合水凝胶电子介体溶液的制备
使用硫代甜菜碱丙烯酸甲酯(SBMA)与锇配合物NH2-(CH2)6(m-bim)Os(bpy)2·2PF6进行共聚反应，形成锇电子介体溶液，并准备等体积的溶于异丙醇(isopropanol，IPA)的多壁碳纳米管(Carbon NanoTube，CNT)溶液各一份。在15mL的离心管中，按照体积比为4:1的比例配制碳纳米管浓度为20％(v/v)的锇电子介体和碳纳米管掺杂溶液(下称掺杂溶液)。准确称取500mg葡萄糖氧化酶溶解于10mLPBS缓冲溶液中，配制浓度为50mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液。在15mL的离心管中，分别按照体积比为1:1的比例分别加入掺杂溶液和葡萄糖溶液，配制体积分数为50％(v/v)的锇电子介体、碳纳米管和葡萄糖氧化酶的掺杂溶液(以下称酶掺杂溶液)。
C.电共沉积法电子介体层修饰酶电极的制备
取已经完成电化学沉积金的微针，连接电化学工作站，以微针作为工作电极，以铂片电极作为对电极以及参比电极。在10mL烧杯中加入8mL体积分数为50％的酶掺杂溶液，将三根电极浸入溶液中，控制微针针尖约2mm的长度浸入酶掺杂溶液中，使用多步恒压法在酶掺杂溶液对微针进行电化学共沉积，参数如下：第一阶段：1A，300s。沉积后取出电极，在室温下晾干超过16小时，将制备好的微针检测电极放入PBS缓冲溶液中静置，8小时后取出，室温下自然风干8小时后，将电极置于25℃恒温箱中保存。
实施例二
实施例二与实施例一区别在于，将步骤B中碳纳米管复合水凝胶电子介体溶液的制备的步骤替换为以下步骤：
使用硫代甜菜碱丙烯酸甲酯(SBMA)与锇配合物NH2-(CH2)6(m-bim)Os(bpy)2·2PF6进行共聚反应，形成锇电子介体溶液，并准备等体积的溶于异丙醇(isopropanol，IPA)的多壁碳纳米管(Carbon NanoTube，CNT)溶液各一份。在15mL的离心管中，按照体积比为1:1的比例配制碳纳米管浓度为50％(v/v)的锇电子介体和碳纳米管掺杂溶液(下称掺杂溶液)。
准确称取500mg葡萄糖氧化酶溶解于10mLPBS缓冲溶液中，配制浓度为50mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液
在15mL的离心管中，分别按照体积比为1:1的比例分别加入掺杂溶液和葡萄糖溶液，配制体积分数为50％(v/v)的锇电子介体、碳纳米管和葡萄糖氧化酶的掺杂溶液(以下称酶掺杂溶液)。
实施例三
采用实施例一制备的基于电共沉积电子介体的微针血糖传感电极，进行活体动物实验测试，测定步骤如下：
1、实验大鼠的准备工作：购入已满10周龄的STZ-Type 1DR大鼠，经检查无明显异常，进行适应性饲养7天后，选取连续两天血糖水平超过250mg/dL的大鼠、连续两天血糖水平不超过160mg/dL的大鼠1只开展实验。
2、麻醉方法：将大鼠固定稳妥后通过腹腔注射2％戊巴比妥钠溶液(0.2mL/100g)进行全身麻醉。使用恒温电热板保持大鼠体温恒定。实验装置(微针传感器)安置完成后，继续置于恒温电热板直至其苏醒。可肌肉注射苏醒溶液减少麻醉意外死亡的几率。
3、大鼠完全麻醉后，对其背部皮肤进行备皮，备皮面积约3.5*3.5cm2，开展实验。
4、大鼠(连续两天血糖水平超过250mg/dL)备皮完成后，将微针传感器施加于背皮位置，使用鼠用小背心进行固定。对传感通路每间隔15分钟测量一次皮下组织液葡萄糖信号。持续穿戴微针传感器72小时，期间大鼠正常饮食进水，并在特定间隔时间点对大鼠注射葡萄糖溶液，诱导血糖波动。前24小时每间隔30min，后48小时每间隔1小时对大鼠尾部采血，使用商用血糖计检测实际血糖值做对照。移除背心和微针传感器后再培养24小时，采用腹腔注射过量麻醉剂(2％戊巴比妥钠溶液)处死大鼠。取微针施加位置的局部皮肤，固定、包埋、切片后，采用苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin，H&E)对切片染色，观察皮肤结构、炎症细胞以及可能的穿刺伤口的变化。
5、评估修正后的血糖监测的准确性、灵敏度等性能指标。移除背心和微针传感器后再培养24小时，采用腹腔注射过量麻醉剂处死大鼠。
实施例四
与实施例一的区别在于：采用物理浸涂方法替换电共沉积工艺。
实施例五
与实施例一的区别在于：采用普鲁士蓝电子介体替换碳纳米管复合水凝胶电子介体，将步骤B与步骤C替换成如下步骤：
连接电化学工作站，以镀金完成的微针作为工作电极，以铂片电极作为对电极，银氯化银电极作为参比电极。在10mL烧杯中加入8mL浓度为2mmol/L的亚硫酸铂钠水溶液，将三根电极浸入溶液中，使用多步恒流法在亚硫酸金钠电镀金溶液对微针进行电化学沉积金，参数如下：第一阶段：0.00006A，15s；第二阶段：-0.00006A，15s；第三阶段：-0.02A，100s。沉积后放入去离子水溶液中轻轻涮洗，取出后自然烘干。
连接电化学工作站，以镀铂完成的微针作为工作电极，以铂片电极作为对电极，银氯化银电极作为参比电极。在10mL烧杯中加入2.5mM FeCl3、100mM KCl、2.5mM K3Fe(CN)6和100mM HCl的溶液，利用伏安扫描法以20mV/S的速率和0-0.5V的范围扫描8个循环，沉积普鲁士蓝。
酶粘附剂的制备：溶液1：取葡萄糖氧化酶溶于PBS，配成葡萄糖氧化酶溶液；溶液2：取牛血清蛋白(BSA)溶于PBS中，配成BSA溶液(BSA@PBS，浓度80mg/mL)；溶液3：100uL的戊二醛(Glutaric dialdehyde，GA，2.5％)。取上述溶液1-2-3按照50-250-100(单位uL)均匀混合，静置除去气泡后使用(此为粘附剂)。
将镀好普鲁士蓝的微针电极缓慢伸入粘附剂溶液中，缓慢提拉2s离开，形成传感层。
实施例六
与实施例一的区别在于：采用碳纳米管电子介体替代碳纳米管复合水凝胶电子介体，将步骤B中【溶液配制】替换为以下步骤：
准备溶于异丙醇(isopropanol，IPA)的多壁碳纳米管(Carbon NanoTube，CNT)溶液一份。准确称取500mg葡萄糖氧化酶溶解于10mLPBS缓冲溶液中，配制浓度为50mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液。在15mL的离心管中，分别按照体积比为1:1的比例分别加入碳纳米管溶液和葡萄糖溶液，配制体积分数为50％(v/v)的碳纳米管和葡萄糖氧化酶的掺杂溶液(以下称酶掺杂溶液)。
实施例七
与实施例一的区别在于：采用锇电子介体替代碳纳米管复合水凝胶电子介体，将步骤B中【溶液配制】替换为以下步骤：
使用硫代甜菜碱丙烯酸甲酯(SBMA)与锇配合物NH2-(CH2)6(m-bim)Os(bpy)2·2PF6进行共聚反应，形成锇电子介体溶液。准确称取500mg葡萄糖氧化酶溶解于10mLPBS缓冲溶液中，配制浓度为50mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液。在15mL的离心管中，分别按照体积比为1:1的比例分别加入锇电子介体溶液和葡萄糖溶液，配制体积分数为50％(v/v)的锇电子介体和葡萄糖氧化酶的掺杂溶液(以下称酶掺杂溶液)。
上述各实施例中的传感层的分析如下：
参阅图4，图4(a)为采用电共沉积工艺制备的修饰碳纳米管复合水凝胶电子介体层的SEM图，图4(b)为物理浸涂工艺制备的修饰碳纳米管复合水凝胶电子介体层的SEM图。从图4可知，采用物理浸涂制备的传感层的碳纳米管材料与电极基底的粘附不牢靠，修饰效果不均匀，成膜性差，机械磨损耐性弱，容易脱落，导致电极响应范围有限，传感性能弱。相比于物理浸涂方法修饰碳纳米管，采用电共沉积工艺修饰碳纳米管复合水凝胶电子介体葡萄糖传感电极，与电极基底的粘附紧密，修饰均匀，成膜性好，机械磨损耐性强。
参阅图(5)，图5(a)为以碳纳米管复合水凝胶作为电子介体层电极的SEM图，图5(b)为以普鲁士蓝作为电子介体层电极的SEM图，图5(c)为以碳纳米管电化学镀铂作为电子介体层电极的SEM图，图5(d)为单纯以锇电子介体作为电子介体层电极的SEM图。从图5可知，以普鲁士蓝作为电子介体层修饰的传感层受表面张力影响，容易开裂，与电极基底的粘附不牢靠，成膜性差，在低电压下的响应范围有限，灵敏度低，传感性能弱；单纯以锇电子介体修饰的传感层与金属基底层粘附性差，材料分布不均匀，成膜性差，灵敏度低，传感性能较弱；相比于使用普鲁士蓝电子介体、锇电子介体，采用水凝胶电子介体层进行修饰获得复合水凝胶电子介体葡萄糖传感电极，与电极基底的粘附紧密，修饰均匀，成膜性好，机械磨损耐性强，不易脱落。
上述各实施例中的对葡萄糖响应的性能测试结果如下：
取10mL烧杯一只，以修饰好的工作电极为工作电极，取商用铂电极为对电极，取Ag/AgCl电极为参比电极，放入烧杯中，在烧杯中加入10mL的PBS缓冲溶液，将电极浸入溶液中。打开电化学工作站软件，选择Amperometric i-t Curve选项。设置参数：Init E:0.2V，Sample Interval:0.1s，Run Time：300s，Sensitivity:0.00001A/V。
在20mL溶液中，每隔50秒加入一定浓度的葡萄糖溶液，使得溶液的浓度变化为0mM/2mM/4mM/6mM/8mM/10mM/12mM/14mM/16mM/18mM/20mM，测量不同浓度下的葡萄糖响应。
测量结果参阅图6、图7及表一，图6(a)为以碳纳米管复合水凝胶作为电子介体层电极的i-t曲线，图6(b)为以不同配比碳纳米管复合水凝胶作为电子介体层电极的i-t曲线，图6(c)为以普鲁士蓝作为电子介体层电极的i-t曲线，图6(d)为以碳纳米管电化学镀铂作为电子介体层电极的i-t曲线，图7为碳纳米管复合水凝胶电子介体层电极与锇电子介体层电极的i-t曲线，表一为不同实施例在PBS缓冲溶液中的葡萄糖响应测试数据。
表一
| 性能 | 实施例一 | 实施例五 | 实施例六 | 实施例七 |
| 检测区间 | 0-20mM | 0-1mM | 1-10mM | 0-16mM |
| 检出限 | 200uM | 200uM | 200uM | 200uM |
| 灵敏度 | 120nA/mM | 20nA/mM | 7nA/mM | 30nA/mM |
从图图6、图7及表一可知：相较于实施例五及实施例六，实施例一能够在<0.2V低电压下进行电化学传感，且对葡萄糖的线性区间拓宽，有明显的台阶，对葡萄糖的检测的灵敏度大幅提升；相较于实施例七，实施例一有明显的台阶，对葡萄糖的检测的灵敏度大幅提升。
对上述各实施例中制备的微针血糖传感电极进行循环伏安测试的结果如下：
参阅图8，图8(a)为以碳纳米管复合水凝胶作为电子介体层电极的CV图，图8(b)为以普鲁士蓝作为电子介体层电极的CV图，图8(c)为以碳纳米管电化学镀铂作为电子介体层电极的CV图。相较于实施例五及实施例六中明显未出现CV峰，实施例1有明显的CV峰，峰值约在0.2V；由CV和It测试结果可见，相比于普鲁士蓝电子介体、碳纳米管电子介体、锇电子介体葡萄糖传感电极，采用碳纳米管复合水凝胶电子介体葡萄糖传感电极作为工作电极在进行葡萄糖检测时，其检出限明显提高、传感性能好，灵敏度较高，线性范围提高到20mM。作为工作电极在进行葡萄糖检测时，其稳定性大大上升。
采用实施例1制备的基于电共沉积电子介体的微针血糖传感电极，进行活体动物血糖测试。参阅图9，图9(a)为微针血糖传感电极的活体动物实验测试第一天，图9(b)为微针血糖传感电极的活体动物实验测试第二天，图9(c)为微针血糖传感电极的活体动物实验测试第三天。从图9可知，基于复合水凝胶电子介体的微针电极在以大鼠为对象的活体实验中表现出较好性能，不同于其他结构，在<0.2V的电压下也能进行检测，与商用检测设备的测得的血糖变化趋势相符合，可在活体连续稳定检测3天血糖波动，体内检测范围达到0-25mM，准确性高和灵敏度好。
从上述的测试结果可知：本发明实施例通过共电沉积技术将碳纳米管/水凝胶电子介体/酶复合材料体系复合材料电子介体层固定到微针表面形成均匀涂层，并制备出微针血糖传感电极。该复合材料电子介体层极大提高了微针血糖电极的检测线性范围，使电极具有优良的均匀性和机械稳定性；使用共电沉积技术在微针表面形成均匀涂层，有效的解决了在微针电极表面处理工艺中，常见的电子介体粘附不牢固、容易脱落、不均匀等问题。显著提升了微针血糖电极的传感性能，循环伏安测试(CV)曲线均匀、对称，具有明显的氧化还原峰，安培-时间测试(It)曲线稳定、梯度大，且能够在<0.2V低电压下进行电化学传感。对比其他的传感材料，对葡萄糖传感线性范围有明显提高，微针血糖传感体外线性范围可以达到0-20mM，并且可以较低电压在活体中连续稳定检测血糖波动，活体内检测范围达到0-25mM。与传统BG方法相比较，误差减小，线性范围加宽，响应范围提高，区分度更加明显，灵敏度提高，稳定性上升。
以上是对本发明的较佳实施进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可做作出种种的等同变形或替换，这些等同的变形或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (10)
1.一种基于电共沉积电子介体的微针传感器，其特征在于，包括基底及位于所述基底上的微针阵列，所述微针阵列的表面覆盖导电层及复合材料电子介体层，所述复合材料电子介体由碳纳米管、水凝胶电子介体及酶组成，所述复合材料电子介体层通过电共沉积固定在所述微针阵列的导电层的表面。
2.根据权利要求1所述的微针传感器，其特征在于，所述微针阵列包括空心微针阵列和片状微针阵列。
3.根据权利要求1所述的微针传感器，其特征在于，所述微针阵列的材料包括不锈钢。
4.根据权利要求1所述的微针传感器，其特征在于，所述水凝胶电子介体包括还原性高分子。
5.根据权利要求4所述的微针传感器，其特征在于，所述还原性高分子包括金属锇络合物。
6.根据权利要求1所述的微针传感器，其特征在于，所述导电层的材料包括金、铬或铂中的任意一种。
7.一种基于电共沉积电子介体的微针传感器的制备方法，其特征在于，包括：
制备微针电极，并在所述微针电极的表面制备导电层；
制备复合材料电子介体溶液，所述复合材料电子介体溶液包括碳纳米管、水凝胶电子介体及酶；
采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述在所述微针电极的表面制备导电层，具体包括：
将所述微针电极进行清洗并烘干；
将烘干后的微针电极使用助焊剂处理；
将使用助焊剂处理后的微针电极放入含导电金属的溶液中，并通过电化学沉积制备导电层。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述制备复合材料电子介体溶液，具体包括：
分别制备电子介体溶液及碳纳米管溶液；
将所述电子介体溶液及所述碳纳米管溶液按照第一预设比例进行离心制备掺杂溶液；
提供酶溶液；
将所述掺杂溶液及所述酶溶液按照第二预设比例进行离心制备酶掺杂溶液。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面，具体包括：
将包含导电层的微针电极浸入所述复合材料电子介体溶液中；
采用电共沉积将所述复合材料电子介体固定在所述微针电极的导电层表面；
将覆盖有导电层及复合材料电子介体层的微针电极浸入缓冲溶液预设时间。
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