CN114306758A - 一种长效抗凝血涂层、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种长效抗凝血涂层、制备方法及其应用。该抗凝血涂层为覆于高分子材料表面的包括生物素、亲和素和抗凝血物质组成的多层形态，其中生物素与高分子材料表面结合，亲和素分别与生物素和抗凝血物质结合。通过利用亲和素分别与生物素、抗凝血物质(如肝素、水蛭素、生物蛋白等)的特异性结合能力，将抗凝血物质锚定于高分子材料表面，形成长效、稳定的抗凝血效果。

Description

一种长效抗凝血涂层、制备方法及其应用

技术领域

本申请涉及医用生物材料领域，特别是涉及一种与血液接触的医疗器械表面的抗凝血处理的涂层、制备方法及其应用。

背景技术

临床上与血液接触的医疗器械产品在使用时容易激发凝血机制并形成血栓。血液接触器械表面后，血小板和纤维蛋白原会黏附在器械表面，形成血栓。血栓容易随血液进入人体并阻塞血管，导致严重的疾病甚至致死。因此，血栓的形成严重影响器械使用的安全性，与血液长时间接触的医疗器械表面的抗凝血处理是非常有必要的。

目前临床上通常使用注射抗凝剂的方式来预防器械表面的血栓形成。然而抗凝剂的使用剂量过大可能会造成系统性的出血并发症。可见，抗凝血功能的涂层对于长期使用的血液接触医疗器械是非常重要的。以体外膜肺氧合(ECMO)为例，进行ECMO治疗的病人需要借助血泵和氧合器代替心脏和肺的功能，血液与血泵及氧合器、循环管路不仅接触面积大，而且接触时间长，如果不对器械表面进行抗凝处理，治疗过程中仅依靠注射抗凝药物非常容易产生血栓。

目前已有的抗凝血涂层，通常将抗凝血物质通过物理吸附或者化学结合的方法固定在材料表面。采用物理吸附的方法，抗凝血物质容易流失，抗凝血效果不长。

采用化学结合的方法，如CN105899244B公开了一种具有抗血栓形成的涂层的聚氨酯(PUR)，其中PUR表面与聚乙烯亚胺(PEI)结合，PEI进一步与抗血栓形成的物质结合。

生物素是动、植物体内广泛存在的一种小分子生长因子，又名辅酶或维生素。其结构特点为含有一个咪唑酮环和一个四氢噻吩环，其中咪唑酮环为亲和素的结合位点，四氢噻吩环侧链末端含有羧基，可以结合蛋白质和其他含氨基的生物分子或有机物。

亲和素(avidin)亦称抗生物素蛋白，是最早从蛋清中提取出的一种碱性糖蛋白，是由4个相同亚基组成的复合四聚体，是自然界中发现的与生物素具有最强亲和力的物质。

生物素和亲和素之间可发生特异性的结合，且每个亲和素分子4个生物素结合位点。亲和素通过其结构中的色氨酸残基与生物素中的咪唑酮环反应结合，二者以1:4的比例共价结合，其解离常数为10-15mol/L，且酸、碱、变性剂、高温、蛋白溶解酶以及有机溶剂对其结合均不产生干扰。此外，亲和素和生物素的特异结合能力是抗原抗体的100万倍，其反应高度专一，不会因反应试剂浓度的高低受影响，两者一经结合就极其稳定。而且当生物素结合了大分子量的分子后仍可被亲和素识别并结合。这一相互作用已广泛应用于生物医学研究中的特异性标记技术。

目前未发现将生物素和亲和素之间特异性结合原理应用于高分子材料抗凝血涂层的制备。

发明内容

发明要解决的问题

本申请利用生物素和亲和素之间特异性结合原理，提供一种长效抗凝血涂层及其制备方法。

用于解决问题的方案

一方面，本申请提供一种抗凝血涂层，该抗凝血涂层为覆于高分子材料表面的包括生物素、亲和素和抗凝血物质的多层形态，其中生物素与高分子材料表面结合，亲和素分别与生物素和抗凝血物质结合。

另一方面，本申请提供一种抗凝血材料的制备方法，包括以下步骤：

a.将高分子材料进行等离子体处理；

b.制备生物素化PEI溶液；

c.将高分子材料浸泡于生物素化PEI溶液中，在高分子材料表面形成生物素化PEI膜；

d.将步骤c制备的高分子材料浸泡于亲和素溶液中，在生物素化PEI膜表面形成亲和素层；

e.将步骤d制备的高分子材料浸泡于抗凝血物质的溶液中，使亲和素与抗凝血物质结合。

另一方面，本申请涉及所述制备方法制备得到的抗凝血涂层。

另一方面，本申请涉及所述抗凝血涂层在制备抗凝血药物或医疗器械中的应用。

发明的效果

(1)本申请通过对生物素改造，将生物素上羧基与聚乙烯亚胺(PEI)上氨基结合形成酰胺键，制备成生物素化PEI，提高生物素在材料上结合能力。

(2)利用亲和素分别与生物素、抗凝血物质(如肝素、水蛭素、生物蛋白等)的特异性结合能力，将抗凝血物质锚定于高分子材料表面，形成长效、稳定的抗凝血效果。

附图说明

图1：未涂层和带肝素生物涂层的PMP材料的甲苯胺蓝染色情况。

图2：抗凝涂层血小板粘附实验的SEM图片。

图3：未加抗凝涂层的血小板黏附实验的SEM图片。

图4：进行6天ECMO动物实验后带涂层的管路图片

具体实施方式

为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过列举具体实施例(实施方式)进行详细说明。除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语与本申请所属的技术领域中的技术和科学术语的含义相同。

一方面，本申请提供一种抗凝血涂层，该抗凝血涂层为涂覆于高分子材料表面的包括生物素、亲和素和抗凝血物质组成的多层形态，其中生物素与高分子材料表面结合，亲和素分别与生物素和抗凝血物质结合。

在一些实施方式中，所述生物素为生物素化PEI。

在一些实施方式中，所述生物素化PEI通过生物素上的羧基与PEI上氨基结合形成酰胺键而制备。

在一些实施方式中，所述高分子材料表面经过等离子体处理。

在一些实施方式中，所述抗凝血物质选自肝素、水蛭素、血清蛋白、乳蛋白等中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述抗凝血物质是经过生物素处理得到的生物素化抗凝血物质，例如生物素化肝素，生物素化水蛭素，生物素化血清蛋白，生物素化乳蛋白等。

在一些实施方式中，所述高分子材料选自聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚-4-甲基-1-戊烯、聚砜、聚醚等。

在一些实施方式中，本申请提供一种抗凝血涂层，该抗凝血涂层为涂覆于高分子材料表面的包括生物素化PEI、亲和素和抗凝血物质组成的多层形态，其中生物素化PEI与高分子材料表面结合，亲和素分别与生物素化PEI和抗凝血物质结合，所述高分子材料经过等离子体处理，所述抗凝血物质是经过生物素处理的。

在一些实施方式中，本申请提供一种抗凝血涂层，该抗凝血涂层为涂覆于聚碳酸酯材料表面的包括生物素化PEI、亲和素和抗凝血物质组成的多层形态，其中生物素化PEI与聚碳酸酯材料表面结合，亲和素分别与生物素化PEI和生物素化肝素结合，所述聚碳酸酯材料经过等离子体处理，所述抗凝血物质选自生物素化肝素、生物素化水蛭素、生物素化血清蛋白、生物素化乳蛋白中的一种或多种。

另一方面，本申请提供一种抗凝血涂层的制备方法，包括以下步骤：

a.将高分子材料进行等离子体处理；

b.制备生物素化PEI溶液；

c.将高分子材料浸泡于生物素化PEI溶液中，在高分子材料表面形成生物素化PEI膜；

d.将步骤c制备的高分子材料浸泡于亲和素溶液中，在生物素化PEI膜表面形成亲和素层；

e.将步骤d制备的高分子材料浸泡于抗凝血物质的溶液中，使亲和素与抗凝血物质结合。

在一些实施方式中，所述生物素化PEI通过生物素上的羧基与PEI上氨基结合形成酰胺键而制备。

在一些实施方式中，所述抗凝血物质选自肝素、水蛭素、血清蛋白、乳蛋白等中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述抗凝血物质是经过生物素处理得到的生物素化抗凝血物质，例如生物素化肝素，生物素化水蛭素，生物素化血清蛋白，生物素化乳蛋白等。

在一些实施方式中，所述高分子材料选自聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚-4-甲基-1-戊烯、聚砜、聚醚等。

在一些实施方式中，本申请提供一种抗凝血涂层的制备方法，包括以下步骤：

a.将高分子材料进行等离子体处理；

b.制备生物素化PEI溶液，所述生物素化PEI通过生物素上的羧基与PEI上氨基结合形成酰胺键而制备；

c.将高分子材料浸泡于生物素化PEI溶液中，在高分子材料表面形成生物素化PEI膜；

d.将步骤c制备的高分子材料浸泡于亲和素溶液中，在生物素化PEI膜表面形成亲和素层；

e.将步骤d制备的高分子材料浸泡于抗凝血物质的溶液中，使亲和素与抗凝血物质结合。所述抗凝血物质是经过生物素处理得到的生物素化抗凝血物质，例如生物素化肝素，生物素化水蛭素，生物素化血清蛋白，生物素化乳蛋白等。

在本申请的实施方式中，所述等离子体处理是指通过对物体表面进行等离子轰击，可以达到对物体表面活化的目的，通过与聚合物分子发生反应，经低温等离子体处理后使物体表面形成C＝O羰基、-COOH羧基、-OH羟基等基团。从而显著增加了材料表面的表面能以及润湿性。例如采用真空等离子清洗机将材料放入两个电极板中间，氧气氛围下在200W功率下两电极板之间产生等离子体，处理120s，等离子体与材料表面发生化学作用形成羟基、羧基等活性基团。

在本申请的实施方式中，所述高分子材料可以是聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚-4-甲基-1-戊烯、聚砜、聚醚醚酮等，所述高分子材料经过等离子体处理后，材料表面含有羟基、羧基等活性基团。

在本申请的实施方式中，所述抗凝血物质是指能够阻止血液凝固的化学试剂或物质，例如肝素、水蛭素、血清蛋白、乳蛋白。

在一些实施方式中，所述抗凝血物质可以与生物素通过二胺类化合物连接，如通过乙二胺连接，形成生物素化抗凝血物质，如通过乙二胺连接的生物素化肝素、生物素化水蛭素、生物素化血清蛋白、生物素化乳蛋白等。所述乙二胺连接的生物素化抗凝血物质中，乙二胺的氨基分别与生物素以及抗凝血物质上的羧基形成酰胺键连接，形成生物素化的抗凝血物质。

在本申请的实施方式中，所述生物素化PEI是指生物素上的羧基与聚乙烯亚胺(PEI)上氨基结合形成酰胺键而制备，所述酰胺键可以采用本领域常规的缩合反应制备，例如在缩合剂DCC，DIC，EDCI，BOP，NHS，EDC，4-ppy或其组合的存在下进行缩合制备。

实施例1：具有抗凝血功能的生物肝素涂层制备

1.将待涂层的聚-4-甲基-1-戊烯(PMP)材料用等离子设备(型号：PLAUX-PR60LN真空等离子体清洗机；昆山乐普斯电子有限公司)在100sccm供氧量，200W的功率下处理60s；

2.配制10mL浓度为50mM、pH为5.6的2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，依次加入10mg生物素(0.04mmol)(Sigma试剂，货号B4501)，8mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC，0.04mmol)和9.6mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS，0.08mmol)，配制好溶液后静置30min活化，加入0.28g聚乙烯亚胺(PEI,Mw7000)，37℃下反应2h，将反应后的溶液浸泡在步骤1处理的表面，2h后取出，清洗吹干，这样就在材料表面引入一层生物素化的PEI膜；

3.将步骤2处理过的材料表面浸泡在10mL pH为7.4，浓度为0.1mg/ml的亲和素(Sigma公司，货号189730)的TBS缓冲溶液中静置12h，亲和素与PEI膜上的生物素结合，这样在材料表面引入亲和素；

4.配制10mL浓度为50mM、pH为5.6的MES缓冲液，依次加入40mg肝素(0.04mmol)(阿拉丁试剂，H104201)、10mg生物素(0.04mmol)(Sigma试剂，货号B4501)，16mg EDC(0.08mmol)和19.2mg NHS(0.16mmol)，配制好溶液后静置30min活化，加入4.8mg乙二胺(0.04mmol)，37℃下反应2h；

5.将步骤3处理的材料表面浸泡在步骤4配置的生物素化肝素溶液中，肝素上的生物素与材料表面的亲和素结合，在材料表面形成肝素涂层。

6.用0.5％的甲苯胺蓝溶液染色，如图1所示，PMP材料表面变成紫色，说明了肝素在PMP材料表面。

实施例2：具有抗凝血功能的生物水蛭素涂层制备

1.将待涂层的聚碳酸酯材料用等离子设备(型号：PLAUX-PR60LN真空等离子体清洗机；昆山乐普斯电子有限公司)在100sccm供氧量，300W的功率下处理60s；

2.配制10mL浓度为50mM、pH为5.6的MES缓冲液，依次加入5mg生物素(0.02mmol)(Sigma试剂，货号B4501)，4mg EDC(0.02mmol)和2.4mg NHS(0.02mmol)，配制好溶液后静置30min活化，加入0.28g PEI(Mw14000)，37℃下反应2h，将反应后的溶液浸泡在步骤1处理的表面，2h后取出，清洗吹干，这样就在材料表面引入一层生物素化的PEI膜；

3.将步骤2处理过的材料表面浸泡在10mL pH为7.4，浓度为0.1mg/ml的亲和素(Sigma公司，货号189730)的TBS缓冲溶液中静置12h，亲和素与PEI膜上的生物素结合，这样在材料表面引入亲和素；

4.配制10mL浓度为50mM、pH为5.6的MES缓冲液，依次加入29mg水蛭素(0.02mmol)(源叶生物，S31625)、5mg生物素(0.02mmol)(Sigma试剂，货号B4501)，8mg EDC(0.04mmol)和4.8mg NHS(0.04mmol)，配制好溶液后静置30min活化，加入2.4mg乙二胺(0.02mmol)，37℃下反应2h；

5.将步骤3处理的材料表面浸泡在步骤4配置的生物素化水蛭素溶液中，水蛭素上的生物素与材料表面的亲和素结合，在材料表面形成水蛭素涂层。

实施例3：具有抗凝血功能的牛血清白蛋白涂层制备

1.将待涂层的聚氯乙烯材料用等离子设备(型号：PLAUX-PR60LN真空等离子体清洗机；昆山乐普斯电子有限公司)在100sccm供氧量，200W的功率下处理120s；

2.配制10mL浓度为50mM、pH为5.6的MES缓冲液，依次加入10mg生物素(0.04mmol)(Sigma试剂，货号B4501)，8mg EDC(0.04mmol)和7.2mg NHS(0.06mmol)，配制好溶液后静置30min活化，加入0.28g PEI(Mw7000)，37℃下反应2h，将反应后的溶液浸泡在步骤1处理的表面，2h后取出，清洗吹干，这样就在材料表面引入一层生物素化的PEI膜；

3.将步骤2处理过的材料表面浸泡在10mL pH为7.4，浓度为0.1mg/ml的亲和素(Sigma试剂，货号189730)的TBS缓冲溶液中静置12h，亲和素与PEI膜上的生物素结合，这样在材料表面引入亲和素；

4.配制10mL浓度为50mM、pH为5.6的MES缓冲液，加入10mg生物素化牛血清白蛋白(生物素化BSA)(索莱宝，SHB263)；

5.将步骤3处理的材料表面浸泡在步骤4配置的生物素化蛋白溶液中，蛋白上的生物素与材料表面的亲和素结合，在材料表面形成生物蛋白涂层。

实施例4：抗血小板黏附实验

将血液离心后得到含有血小板的血浆PRP，以未处理的PMP材料作为对照，将实施例1制得的样品和对照样品浸没在PRP中，37℃，2小时。用生理盐水漂洗样品，然后用戊二醛固定，再用乙醇/水梯度脱水，最后用电子扫描显微镜观察血小板在管材内表面的黏附情况。根据图2和图3结果可见，将未经处理的PMP材料浸没至血浆PRP 2h后，其表面会黏附有大量的血小板，而且血小板的伪足表明在未涂层的材料表面血小板被激活。而本申请制备得到的样品表面则几乎是没有血小板黏附，由此可以看出本申请制备得到的产品具有优异的抗血小板黏附功效。

实施例5：动物实验

根据本申请实施例1制备抗凝血涂层的方法，在氧合器、血泵、循环管路等产品表面进行涂层，灭菌后在健康的12个月大的猪身上进行为期6天的动物实验。如图4所示，进行6天ECMO动物实验后带涂层的管路图片发现，带涂层的产品表面几乎无血栓形成，说明本申请制备得到的产品具有优异的抗凝血的作用。

应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。

Claims (12)

1.一种抗凝血涂层，其特征在于，该抗凝血涂层为覆于高分子材料表面的包括生物素、亲和素和抗凝血物质的多层形态，其中生物素与高分子材料表面结合，亲和素分别与生物素和抗凝血物质结合。

2.根据权利要求1所述的抗凝血涂层，其特征在于，所述生物素为生物素化PEI。

3.根据权利要求1-2任意一项所述的抗凝血涂层，其特征在于，所述抗凝血物质选自肝素、水蛭素、血清蛋白、乳蛋白中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的抗凝血涂层，其特征在于，所述抗凝血物质是生物素化抗凝血物质，所述生物素化抗凝血物质选自生物素化肝素，生物素化水蛭素，生物素化血清蛋白，生物素化乳蛋白中的一种或多种。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的抗凝血涂层，其特征在于，所述高分子材料选自聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚-4-甲基-1-戊烯、聚砜、聚酰胺、聚醚醚酮。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的抗凝血涂层，其特征在于，所述高分子材料是经过等离子体处理的。

7.一种抗凝血材料的制备方法，包括以下步骤：

a.将高分子材料进行等离子体处理；

b.制备生物素化PEI溶液；

c.将高分子材料浸泡于生物素化PEI溶液中，在高分子材料表面形成生物素化PEI膜；

d.将步骤c制备的高分子材料浸泡于亲和素溶液中，在生物素化PEI膜表面形成亲和素层；

e.将步骤d制备的高分子材料浸泡于抗凝血物质的溶液中，使亲和素与抗凝血物质结合。

8.根据权利要求7所述的抗凝血涂层的制备方法，其特征在于，所述抗凝血物质选自肝素、水蛭素、血清蛋白、乳蛋白中的一种或多种。

9.根据权利要求7-8任意一项所述的抗凝血涂层的制备方法，其特征在于，所述抗凝血物质是生物素化抗凝血物质，所述生物素化抗凝血物质选自生物素化肝素，生物素化水蛭素，生物素化血清蛋白，生物素化乳蛋白中的一种或多种。

10.根据权利要求7-9任意一项所述的抗凝血涂层的制备方法，其特征在于，所述高分子材料选自聚氯乙烯、聚氨酯、聚碳酸酯、聚-4-甲基-1-戊烯、聚砜、聚醚醚酮、聚酰胺。

11.根据权利要求7-10任意一项所述制备方法制备得到的抗凝血涂层。

12.权利要求1-6、权利要求11任意一项所述抗凝血涂层在制备抗凝血药物或医疗器械中的应用。

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