CN114306585A - 一种鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗原乳剂的制备技术领域，公开了一种鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，进行鱼类的获取，并在获取的鱼类的鱼体上进行组织的获取，得到鱼类组织；采用Trizol法提取总RNA；进行鱼类高纯度抗原乳剂制备前的准备；使用均匀的佐剂‑抗原混合液进行鱼类高纯度抗原乳剂的制备。本发明提供的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法中，合成的氟节胺半抗原既最大程度的保留了氟节胺的化学结构，又有合适长度的连接臂，使用制备的半抗原制备的抗原呈现出特异性的氟节胺抗原决定簇，使得筛选出高特异性的氟节胺单克隆抗体成为可能；产生的抗体特异性高、灵敏度高；同时，本发明提供的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法制备的抗原乳剂纯度高。
Description
技术领域
本发明属于抗原乳剂的制备技术领域，尤其涉及一种鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法。
背景技术
免疫原性是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性，一种物质能否成为抗原，首先取决于该物质自身的性质，如凡具有免疫原性的物质的分子量都较大，通常在10000以上，低于4000者一般不具有免疫原性；抗原物质必须具有一定的化学组成和结构等。有些简单的有机分子本身不能引起免疫应答，但能与已产生的相应抗体或致敏淋巴细胞结合，这种物质称为半抗原(半抗原不具有免疫原性)，半抗原与蛋白质结合后，可以获得免疫原性，成为完全抗原。抗原在免疫动物前，需要与佐剂混合并乳化，形成稳定的油包水乳剂，目前抗原乳化方法主要有三种，研磨法、注射器混合法和超声法；然而，现有鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法采用的抗原产生的抗体特异性低、灵敏度差；同时，制备的抗原乳剂纯度低。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法采用的抗原产生的抗体特异性低、灵敏度差；同时，制备的抗原乳剂纯度低。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法。
本发明是这样实现的，一种鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，所述鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，采用Trizol法提取总RNA：进行鱼类的获取，并在获取的鱼类的鱼体上进行组织的获取，得到鱼类组织；将鱼类组织置于液氮环境中充分研磨，得到处理后的鱼类组织；将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA；
步骤二，进行鱼类高纯度抗原乳剂制备前的准备：按照质量份数称取鱼类RNA、佐剂、抗原，得到鱼类高纯度抗原乳剂的制备原料；将佐剂与抗原注入乳化容器中进行混合得到佐剂-抗原混合液；在搅拌杆的顶端连接电机，启动电机带动搅拌杆和连接在搅拌杆上的刀头旋转，对佐剂-抗原混合液进行搅拌，得到均匀的佐剂-抗原混合液；
步骤三，使用均匀的佐剂-抗原混合液进行鱼类高纯度抗原乳剂的制备：对均匀的佐剂-抗原混合液进行加热，并对加热的混合液进行超声分散，得到分散液；使用两个注射器分别进行分散液与鱼类RNA的吸取，在两个注射器的12#针头间套接一根长10cm的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起；将针头插进塑料管2cm然后缓缓推动针蕊，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，完全混合得到佐剂-抗原混合液。
进一步，步骤一中，所述将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA，包括：
(1)将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行混合，并至于25～30℃环境下进行裂解得到裂解液；
(2)向裂解液中加入氯仿，震荡后进行离心，取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的酚-氯仿混合液充分混匀，2～6℃进行离心；
(3)取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的氯仿充分混匀，2～6℃进行离心；
(4)取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的氯仿充分混匀，至于-20℃环境下静置1～2h，2～6℃进行离心；
(5)弃除上清液，加入乙醇，洗涤沉淀，离心，移液器吸干乙醇，真空干燥2～4min得到固态物质；
(6)向固态物质中加入RNase-FreeWater，室温溶解10～20min，混匀后瞬时离心，-80℃保存。
进一步，所述酚-氯仿混合液中，酚与氯仿的体积比为25～24。
进一步，步骤二中，所述抗原的制备方法为：
1)取2-氯-1,3-二硝基-5-三氟甲基苯1.00g，加15mL无水乙醇溶解，得到A液；另取3-氨基-3-(2-氯-6-氟苯基)-丙酸0.88g，加11mL无水乙醇溶解，加1mL含有0.37g碳酸氢钠的水溶液，得到B液，将A液滴加到B液中，室温反应3h；TLC检测，原料基本反应完全；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加80mL水溶解，用1mol/L盐酸调节pH值到6，加85mL乙酸乙酯振荡分层，有机相水洗，旋蒸，上硅胶柱，用体积比为10:2的正己烷与乙酸乙酯洗脱分离，得到中间体3-(2-氯-6-氟苯基)-3-(2,6-二硝基-4-三氟甲基-苯氨基)-丙酸1.53g；
2)取中间体3-(2-氯-6-氟苯基)-3-(2,6-二硝基-4-三氟甲基-苯氨基)-丙酸1.50g加55mL乙腈溶解，加氢氧化钾0.20g，加碘乙烷0.57g，50℃反应4h，检测，原料反应完全，停止反应，旋蒸除去乙腈，加100mL水，溶解，用1mol/L盐酸调节pH值到6，加80mL乙酸乙酯萃取，有机相水洗干燥，蒸干，得到黄色油状物，用体积比为1:1的正己烷与二氯甲烷溶液重结晶，得到氟节胺半抗原产物1.51g。
进一步，步骤二中，所述抗原和佐剂的体积之和占乳化容器底部容积的3/5。
进一步，步骤二中，所述搅拌的转速为2000～2500rpm。
进一步，步骤三中，所述加热的温度为25～40℃。
进一步，步骤三中，所述超声分散的频率为55～60kHz，超声分散的时间为10～20min。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法制备的鱼类高纯度抗原乳剂。
进一步，所述鱼类高纯度抗原乳剂按照质量份数由鱼类RNA2～8份、佐剂30份、抗原10份组成。
本发明的优点及积极效果为：本发明提供的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法中，合成的氟节胺半抗原既最大程度的保留了氟节胺的化学结构，又有合适长度的连接臂，使用制备的半抗原制备的抗原呈现出特异性的氟节胺抗原决定簇，使得筛选出高特异性的氟节胺单克隆抗体成为可能；产生的抗体特异性高、灵敏度高；同时，本发明提供的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法制备的抗原乳剂纯度高。
附图说明
图1是本发明实施提供的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法流程图。
图2是本发明实施提供的采用Trizol法提取总RNA流程图。
图3是本发明实施提供的将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA流程图。
图4是本发明实施提供的进行鱼类高纯度抗原乳剂制备前的准备流程图。
图5是本发明实施提供的使用均匀的佐剂-抗原混合液进行鱼类高纯度抗原乳剂的制备流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示，本发明实施例提供的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法包括以下步骤：
S101，采用Trizol法提取总RNA；
S102，进行鱼类高纯度抗原乳剂制备前的准备；
S103，使用均匀的佐剂-抗原混合液进行鱼类高纯度抗原乳剂的制备。
如图2所示，本发明实施例提供的采用Trizol法提取总RNA，包括：
S201，进行鱼类的获取，并在获取的鱼类的鱼体上进行组织的获取，得到鱼类组织；
S202，将鱼类组织置于液氮环境中充分研磨，得到处理后的鱼类组织；
S203，将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA。
如图3所示，步骤S203中，本发明实施例提供的将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA，包括：
S301，将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行混合，并至于25～30℃环境下进行裂解得到裂解液；
S302，向裂解液中加入氯仿，震荡后进行离心，取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的酚-氯仿混合液充分混匀，2～6℃进行离心；
S303，取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的氯仿充分混匀，2～6℃进行离心；
S304，取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的氯仿充分混匀，至于-20℃环境下静置1～2h，2～6℃进行离心；
S305，弃除上清液，加入乙醇，洗涤沉淀，离心，移液器吸干乙醇，真空干燥2～4min得到固态物质；
S306，向固态物质中加入RNase-FreeWater，室温溶解10～20min，混匀后瞬时离心，-80℃保存。
本发明实施例提供的酚-氯仿混合液中，酚与氯仿的体积比为25～24。
如图4所示，本发明实施例提供的进行鱼类高纯度抗原乳剂制备前的准备，包括：
S401，按照质量份数称取鱼类RNA、佐剂、抗原，得到鱼类高纯度抗原乳剂的制备原料；
S402，将佐剂与抗原注入乳化容器中进行混合得到佐剂-抗原混合液；
S403，在搅拌杆的顶端连接电机，启动电机带动搅拌杆和连接在搅拌杆上的刀头旋转，对佐剂-抗原混合液进行搅拌，得到均匀的佐剂-抗原混合液。
步骤S401中，本发明实施例提供的抗原的制备方法为：
取2-氯-1,3-二硝基-5-三氟甲基苯1.00g，加15mL无水乙醇溶解，得到A液；另取3-氨基-3-(2-氯-6-氟苯基)-丙酸0.88g，加11mL无水乙醇溶解，加1mL含有0.37g碳酸氢钠的水溶液，得到B液，将A液滴加到B液中，室温反应3h；TLC检测，原料基本反应完全；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加80mL水溶解，用1mol/L盐酸调节pH值到6，加85mL乙酸乙酯振荡分层，有机相水洗，旋蒸，上硅胶柱，用体积比为10:2的正己烷与乙酸乙酯洗脱分离，得到中间体3-(2-氯-6-氟苯基)-3-(2,6-二硝基-4-三氟甲基-苯氨基)-丙酸1.53g；
取中间体3-(2-氯-6-氟苯基)-3-(2,6-二硝基-4-三氟甲基-苯氨基)-丙酸1.50g加55mL乙腈溶解，加氢氧化钾0.20g，加碘乙烷0.57g，50℃反应4h，检测，原料反应完全，停止反应，旋蒸除去乙腈，加100mL水，溶解，用1mol/L盐酸调节pH值到6，加80mL乙酸乙酯萃取，有机相水洗干燥，蒸干，得到黄色油状物，用体积比为1:1的正己烷与二氯甲烷溶液重结晶，得到氟节胺半抗原产物1.51g。
步骤S402中，本发明实施例提供的抗原和佐剂的体积之和占乳化容器底部容积的3/5。
步骤S403中，本发明实施例提供的搅拌的转速为2000～2500rpm。
如图5所示，本发明实施例提供的使用均匀的佐剂-抗原混合液进行鱼类高纯度抗原乳剂的制备，包括：
S501，对均匀的佐剂-抗原混合液进行加热，并对加热的混合液进行超声分散，得到分散液；
S502，使用两个注射器分别进行分散液与鱼类RNA的吸取，在两个注射器的12#针头间套接一根长10cm的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起；
S503，将针头插进塑料管2cm然后缓缓推动针蕊，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，完全混合得到佐剂-抗原混合液。
步骤S501中，本发明实施例提供的加热的温度为25～40℃。
步骤S501中，本发明实施例提供的超声分散的频率为55～60kHz，超声分散的时间为10～20min。
本发明实施例提供的鱼类高纯度抗原乳剂按照质量份数由鱼类RNA 2～8份、佐剂30份、抗原10份组成。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，所述鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法包括以下步骤：
步骤一，采用Trizol法提取总RNA：进行鱼类的获取，并在获取的鱼类的鱼体上进行组织的获取，得到鱼类组织；将鱼类组织置于液氮环境中充分研磨，得到处理后的鱼类组织；将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA；
步骤二，进行鱼类高纯度抗原乳剂制备前的准备：按照质量份数称取鱼类RNA、佐剂、抗原，得到鱼类高纯度抗原乳剂的制备原料；将佐剂与抗原注入乳化容器中进行混合得到佐剂-抗原混合液；在搅拌杆的顶端连接电机，启动电机带动搅拌杆和连接在搅拌杆上的刀头旋转，对佐剂-抗原混合液进行搅拌，得到均匀的佐剂-抗原混合液；
步骤三，使用均匀的佐剂-抗原混合液进行鱼类高纯度抗原乳剂的制备：对均匀的佐剂-抗原混合液进行加热，并对加热的混合液进行超声分散，得到分散液；使用两个注射器分别进行分散液与鱼类RNA的吸取，在两个注射器的12#针头间套接一根长10cm的医用无毒塑料管，将两个注射器连接在一起；将针头插进塑料管2cm然后缓缓推动针蕊，使管内溶液进入塑料管道至对侧注射器内，完全混合得到佐剂-抗原混合液。
2.如权利要求1所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行RNA的提取，得到鱼类RNA，包括：
(1)将处理后的鱼类组织转移至离心管中，加入Trizol进行混合，并至于25～30℃环境下进行裂解得到裂解液；
(2)向裂解液中加入氯仿，震荡后进行离心，取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的酚-氯仿混合液充分混匀，2～6℃进行离心；
(3)取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的氯仿充分混匀，2～6℃进行离心；
(4)取上清液并将上清液转移至试管中，向试管内加入与上清液等体积的氯仿充分混匀，至于-20℃环境下静置1～2h，2～6℃进行离心；
(5)弃除上清液，加入乙醇，洗涤沉淀，离心，移液器吸干乙醇，真空干燥2～4min得到固态物质；
(6)向固态物质中加入RNase-FreeWater，室温溶解10～20min，混匀后瞬时离心，-80℃保存。
3.如权利要求2所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，所述酚-氯仿混合液中，酚与氯仿的体积比为25～24。
4.如权利要求1所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述抗原的制备方法为：
1)取2-氯-1,3-二硝基-5-三氟甲基苯1.00g，加15mL无水乙醇溶解，得到A液；另取3-氨基-3-(2-氯-6-氟苯基)-丙酸0.88g，加11mL无水乙醇溶解，加1mL含有0.37g碳酸氢钠的水溶液，得到B液，将A液滴加到B液中，室温反应3h；TLC检测，原料基本反应完全；停止反应，旋蒸，除去乙醇，加80mL水溶解，用1mol/L盐酸调节pH值到6，加85mL乙酸乙酯振荡分层，有机相水洗，旋蒸，上硅胶柱，用体积比为10:2的正己烷与乙酸乙酯洗脱分离，得到中间体3-(2-氯-6-氟苯基)-3-(2,6-二硝基-4-三氟甲基-苯氨基)-丙酸1.53g；
2)取中间体3-(2-氯-6-氟苯基)-3-(2,6-二硝基-4-三氟甲基-苯氨基)-丙酸1.50g加55mL乙腈溶解，加氢氧化钾0.20g，加碘乙烷0.57g，50℃反应4h，检测，原料反应完全，停止反应，旋蒸除去乙腈，加100mL水，溶解，用1mol/L盐酸调节pH值到6，加80mL乙酸乙酯萃取，有机相水洗干燥，蒸干，得到黄色油状物，用体积比为1:1的正己烷与二氯甲烷溶液重结晶，得到氟节胺半抗原产物1.51g。
5.如权利要求1所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述抗原和佐剂的体积之和占乳化容器底部容积的3/5。
6.如权利要求1所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述搅拌的转速为2000～2500rpm。
7.如权利要求1所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述加热的温度为25～40℃。
8.如权利要求1所述的鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述超声分散的频率为55～60kHz，超声分散的时间为10～20min。
9.一种应用如权利要求1～8所述鱼类高纯度抗原乳剂的制备方法制备的鱼类高纯度抗原乳剂。
10.如权利要求9所述鱼类高纯度抗原乳剂，其特征在于，所述鱼类高纯度抗原乳剂按照质量份数由鱼类RNA 2～8份、佐剂30份、抗原10份组成。
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