CN114287367B - 一种人工诱导黄鳝直接定向发育为雄性的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产动物遗传育种技术领域，公开了一种人工诱导黄鳝直接发育为雄性的培育方法，其步骤：A：驯化黄鳝幼鱼摄食配合饲料；B：饲喂含有来曲唑的配合饲料；C：饲喂来曲唑的黄鳝生长到6月龄时性腺转化为精巢，黄鳝直接发育为雄性。方法易行，操作简便，将1年龄的黄鳝直接诱导为雄性且具备正常的生殖能力。该方法可以直接获得不经过雌性成熟阶段而直接发育为雄性的黄鳝，能有效应用于黄鳝苗种生产和遗传育种研究，具有重要的应用价值。

Description

一种人工诱导黄鳝直接定向发育为雄性的培育方法

技术领域

本发明属于水产动物遗传育种技术领域，更具体涉及一种人工诱导黄鳝直接定向发育为雄性的培育方法，采用该方法可将1年龄的黄鳝直接培育为具有生殖能力的雄性。适用于黄鳝养殖中短时间、大规模获得雄性黄鳝亲鱼用于苗种生产，以及黄鳝遗传育种过程中快速获得性状改良的黄鳝新种质。

背景技术

鱼类性别分化受遗传因子和环境因素影响。鲤鱼、鳜鱼等雌雄异体鱼类中性激素在性别分化中发挥重要的作用，雌激素具有维持雌性性征的功能，雄激素具有维持雄性性征的作用。因此，人们普遍采用增加雌激素诱导鱼类分化为雌性，增加雄激素则促使其向雄性转变。如：采用投喂含雌激素和氟他胺的饲料诱导遗传雄性的鲤鱼转变为有功能的雌鱼(Jiang et al.,2018)；采用投喂含甲基睾酮的饲料诱导雌鳜逆转为伪雄鳜(Liu et al.,2021)；雌性虹鳟幼鱼采用甲基睾酮水溶液浸泡可性逆转为雄性(Weber et al.,2020)。

根据雌雄异体鱼中应用雄激素处理成功获得性逆转雄鱼的方法，研究人员也都是尝试采用雄激素处理，希望能将雌性黄鳝性逆转为雄性。然而，已有的研究报道和生产实践均表明增添雄激素无法诱导雌性黄鳝性逆转为有功能的雄性(Tang et al.,1974；赵云芳等，1992)。

黄鳝作为一种雌雄同体先雌后雄的鱼类，性腺分化发育与雌雄异体的鱼类不同，黄鳝的性腺首先发育为卵巢，产卵后再逐渐转化为精巢。黄鳝雌性先熟然后转换为雄性的繁殖方式导致雄性亲鱼培育时间需要3年以上，且获得的高质量雄鱼数量较少。黄鳝是我国重要的名特优养殖对象，但养殖黄鳝的苗种还主要依赖于捕捞野生幼鱼。苗种来源不稳定，存活率低，养殖性状参差不齐是当前黄鳝养殖的主要困境。黄鳝养殖生产和遗传育种研究均需要大量的高质量雄性亲本。但是，黄鳝雌雄同体、先雌后雄的特征导致养殖生产和研究工作中雄性亲本的获得极为困难。

性激素在鱼类雌雄性别分化中扮演重要角色，性腺处于雌激素环境发育卵巢，性腺处于雄激素环境发育为精巢。雄激素处理常用于诱导遗传雌性的鱼性逆转为生理雄性。然而，雄激素处理雌性黄鳝无法获得提前性逆转的有功能的雄性。成熟的雌鳝采用多剂量的雄性激素(包括甲基睾酮、睾酮、11-酮睾酮等)处理均不能诱导其卵巢转化为有功能的精巢(TangF,Chan S T,Lofts B,Effect of steroid hormones on the process ofnatural sex reversal in the rice-field ee,Monopterus albus.Gen CompEndocrinol,1974,24(3):227-242.)。黄鳝胚胎时期以及仔鳝进行甲基睾酮处理可诱导部分黄鳝提早性逆转，但诱导性转换效率非常低，其无法获得有功能的精子(赵云芳，柯熏陶，外源激素诱导黄鳝性转化的效果。西南农业学报,1992，5(1)：74-78)。常规的采用雄激素处理不使用于诱导黄鳝发育类雄性。

因此，建立快速、有效的雄性黄鳝培育方法是黄鳝养殖业和遗传育种研发亟待解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种诱导黄鳝直接定向发育为雄性的培育方法，方法易行，操作简单，避免了性激素处理。该方法可大规模培育黄鳝雄性亲本，用于黄鳝苗种的人工繁育；该方法还可将同一家系的部分个体诱导为雄性，同时获得雌、雄全同胞亲本群体用于繁殖自交后代，加快优良品系的建立，从而提高遗传育种的效率。人工诱导黄鳝直接定向发育为雄性的方法可快速获得雄性亲本，将显著缩短优良养殖性状黄鳝新品种的培育周期，具有明显的应用价值。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施：

一种诱导黄鳝直接定向发育为雄性的培育方法，包括以下步骤：

(1)驯化黄鳝摄食配合饲料：人工繁育的黄鳝幼鱼驯化至摄食配合饲料；

(2)来曲唑诱导：黄鳝幼鱼通过摄食含来曲唑的配合饲料诱导黄鳝的性腺向雄性定向发育，获得不经过雌性成熟阶段直接发育为有功能的雄性黄鳝；所述的配合饲料中的来曲唑的含量为100-1000毫克/千克饲料。

以上所述的方法中，优选的，摄食含来曲唑的配合饲料的时间为4-5个月。

本发明的保护范围还包括上述培育方法在培育雄性黄鳝或是黄鳝育种中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

申请人首次发现雌激素在黄鳝性逆转过程中的功能，黄鳝从由雌向雄转化需要减少性腺内雌激素的水平而非增加雄激素含量，因此，本发明首创采用合成雌激素的芳香化酶抑制剂来曲唑处理以降低黄鳝体内雌激素水平，建立了一种人工诱导黄鳝不经过雌性成熟发育阶段而直接定向发育为雄性的培育方法，受精孵化出的1年龄黄鳝即发育成为具有生殖能力的雄性亲本，亲本存活率高，雄性化率可达100％，而且生殖力与野生雄性黄鳝生殖力没有显著差异。采用天然性逆转方式培育黄鳝雄性亲本至少需要3年时间，且获得雄性个体数量少，精子质量不稳定。

本方法可以在同胞子代雌性成熟的同时诱导获得性成熟的雄性个体，解决黄鳝新品种培育过程中全同胞自交纯化优良性状的难题。本发明建立的人工诱导黄鳝直接发育为雄性的方法可解决黄鳝繁育和新品种培育中雄性亲本不足，雌雄个体成熟时间差异大的问题，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中的来曲唑处理诱导黄鳝定向发育为雄性操作示意图。

图2为来曲唑诱导后黄鳝性腺结构随时间变化切片分析图。

图3为人工诱导的雄性黄鳝生殖能力检测分析示意图；

其中：A为对照组的雌性黄鳝卵巢结构性腺切片；B为诱导定向发育为雄性的黄鳝精巢结构的性腺切片；C，诱导定向发育为雄性的黄鳝繁育产生正常子代；D，诱导定向发育为雄性的黄鳝精子受精率、孵化率与野生雄性黄鳝精子没有显著差异。

具体实施方式

为了更清楚地了解本发明的技术方案，通过以下具体实施例对本发明进一步描述。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

一种人工诱导黄鳝不经过雌性成熟阶段直接定向发育为雄性的培育方法，包括下述步骤：

1，人工繁育

亲本挑选：本发明所用的亲本黄鳝购买自武汉白沙洲水产市场。挑选腹部隆起、饱满具有颗粒感的怀卵雌鳝和体型较大，体色偏黄，泄殖孔内凹的雄鳝。室内水箱中浅水安静环境放置适应一段时间后用于人工催产繁殖。

人工催产：雌性黄鳝的体重约为100克，每尾雌鳝注射的催产剂量为：3毫克鲤鱼垂体、300单位绒促性素HCG、0.8微克促黄体素释放激素A2。大部分雌鳝注射激素后36小时卵细胞成熟。雄鳝不需要注射催产剂可直接用于人工繁殖。

人工授精：解剖雄鳝取出精巢加精子保存液后剪碎并挤压将精子排放到溶液中。卵细胞成熟的雌鳝将泄殖孔剪开一个口子，挤压腹部待卵细胞排出。精子加入足量水中激活之后放入卵细胞，轻轻晃动均匀，受精30分钟。

孵化及出苗：将清洗干净的受精卵放置在28℃的静水中孵化，每天更换曝气水。黄鳝胚胎孵化7天可出膜。

2，黄鳝饲养与驯食

黄鳝苗出膜后5天用水蚯蚓诱食开口，黄鳝苗喜栖息在水葫芦等水生植物的根须间，弱光、28℃水温环境生活。幼鳝采用水蚯蚓饲养直至1.5月龄开始驯化摄食干饲料，减少水蚯蚓的投喂量，逐渐添加小颗粒配合饲料诱导黄鳝摄食。经过两周的驯食，2月龄的黄鳝可完全摄食配合饲料。

3，来曲唑诱导黄鳝定向发育为雄性

含来曲唑饲料的制备：每千克饲料添加300毫克来曲唑。来曲唑用95％的酒精溶解，然后喷洒于饲料上并搅拌均匀。饲料放置在通风柜内晾干，待酒精完全挥发后置于-20℃冰箱保存。对照组饲料仅添加相同量的95％酒精搅拌均匀晾干放置在相同的环境存储。

2月龄驯食后的黄鳝持续投喂含来曲唑的干饲料，对照组黄鳝投喂不含来曲唑的饲料。处理后的30、80、120天取样切片观察性腺结构特征(图2)。结果表明，来曲唑处理后30天对照组和实验组黄鳝均为典型的卵巢结构,实验组黄鳝卵巢内的生殖上皮层增厚。增殖的上皮层内观察到卵细胞发生凋亡，上皮层内出现多种类型的间质细胞以及核质比大的精原细胞(图2左)。来曲唑处理后80天的黄鳝性腺已发生性逆转，性腺发育为间性。性腺内分布着处于减数分裂的精子生成细胞，少量精细胞发育到接近成熟。此时卵巢内仍可观察到处于退化状态的卵细胞(图2中)。来曲唑处理120天的黄鳝完全性逆转为雄性，性腺为典型的精巢结构。性腺内可观察到处于分裂相的精子生成小囊，包括精原细胞、粗线期精母细胞、双线期精母细胞、成熟的精细胞等不同阶段的精子发生细胞(图2右)。因此，本发明将6月龄的黄鳝定向诱导发育为雄性，但是黄鳝繁殖力检测需到1年龄性成熟的繁殖季节检测。

按照上述方法，一定浓度范围的来曲唑(如100-1000毫克/千克饲料)均可有效诱导黄鳝性逆转。使用低于100毫克/千克饲料诱导的雄性化率可能显著降低，过高浓度的来曲唑可能导致黄鳝生长缓慢、性腺发育异常。

实施例2：

定向诱导直接发育为雄性的黄鳝的生殖力检测：

利用实施例1所述的方法，来曲唑诱导直接发育为雄性的黄鳝在停止处理后饲喂普通饲料继续养殖6个月后生长到1年龄性成熟，此时为野生黄鳝的繁殖期(湖北地区黄鳝的繁殖季节为每年的5月-7月)。在黄鳝繁殖期开展定向诱导直接发育为雄性黄鳝的生殖力检测分析。解剖定向诱导为雄性的黄鳝性腺，组织学切片观察性腺形态结构。收集定向诱导为雄性黄鳝的成熟精子对野生雌鳝卵子受精，可获得正常发育的黄鳝胚胎和幼鱼。

(一)定向诱导直接发育为雄性的黄鳝的解剖学特征

利用实施例1的方法定向培育的雄性黄鳝喂食普通饲料6个月后到达1年龄性成熟，性腺组织学形态分析观察精子发育状况。随机取5条定向诱导发育为雄性的黄鳝和5条未经处理的对照组黄鳝，解剖取性腺组织。性腺组织经波恩氏液固定24小时，样品采用酒精浓度梯度脱水，二甲苯透化后石蜡包埋。石蜡包埋的样品制成4微米厚的切片，贴附在载玻片。性腺组织切片采用苏木精-伊红染色法染色。光学显微镜观察性腺组织结构并拍照。分析结果对照组的1年龄黄鳝性腺都为典型的卵巢结构，内部均为处于初级生长和次级生长阶段的卵细胞(图3中A)。来曲唑定向诱导发育为雄性的黄鳝性腺为典型的精巢结构，性腺内充斥着生殖上皮褶包裹着的精子发生细胞，此时性腺内已观察不到退化卵细胞残存。精巢内充满了处于减数分裂后期的精子发生细胞(包括粗线期精母细胞、双线期精母细胞)和大量成熟的精子。成熟精子主要分布在输精管内，解剖过程的轻微挤压即可促使精子排出(图3中B)。

(二)定向诱导直接发育为雄性的黄鳝繁殖力分析

黄鳝繁殖时期，取本发明定向发育为雄性的黄鳝5条和购自武汉白沙洲农贸市场的野生雄性黄鳝5条解剖出精巢。两组黄鳝的精巢加精子保存液研磨分别制备精子悬液。挑选活力好的雌性怀卵黄鳝，注射实施例1中的催产剂促进卵细胞成熟排卵。每条雌鱼可获得约200-300枚成熟卵，平均分成两份。其中一份用定向发育为雄性的黄鳝精子受精，另一份采用野生雄性黄鳝的精子受精。受精方法与实施例1的操作相同。受精卵置于28℃静水中发育。受精后2-4小时解剖镜下观察、统计正常发育的受精卵数量，正常发育的受精率与总卵数的比值为受精率。正常发育的胚胎置于28℃静水中发育，每天早晚更换曝气水。受精后7-10天正常发育的幼鱼出膜，统计存活并出膜的幼鱼数量。出膜幼鱼数与总受精卵数的比值为孵化率。

统计分析结果表明定向发育为雄性的黄鳝受精率为平均值为84.91％，胚胎孵化率的平均值为20.30％；野生雄性黄鳝的受精率平均值为86.13％,胚胎孵化率为26.08％。两者的受精率和孵化率在统计学上没有显著差异(图3中C和D)。因此，本发明定向诱导发育为雄性的黄鳝生殖能力与野生雄性黄鳝的生殖能力相似。定向诱导为雄性的黄鳝适合用于黄鳝人工繁殖。

(三)定向诱导黄鳝直接发育为雄性的效率

为了统计定向诱导黄鳝直接发育为雄性的效率，本发明将驯化摄食配合饲料的2月龄幼鳝共计40条平均分为两组。一组20条黄鳝饲喂普通的配合饲料作为对照组，另一组20条黄鳝采用实施例1的方法来曲唑处理定向诱导雄性化为实验组。实验组经实施例1的方法处理至6月龄时然后饲喂普通饲料养殖到1年龄。

本发明采用性腺组织学切片分析方法观察判断对照组和实验组黄鳝雌雄的数量。数据统计表明喂食普通饲料的20条黄鳝性腺都为典型的卵巢结构，性腺内具有初级生成生长阶段和卵黄蛋白原积累的卵细胞。对照组的黄鳝均为雌性。定向诱导雄性化的20条黄鳝性腺均为典型的精巢结构，性腺内仅有精原细胞、粗线期精母细胞、双线期精母细胞、成熟的精细胞等不同阶段的精子发生细胞。实验室黄鳝全部发育为雄性。因此，本发明诱导黄鳝雄性化效率达100％。

综上所述：

本方法培育的1年龄的定向发育为雄性的黄鳝性腺为典型精巢结构，雄鳝精子可繁殖子代，受精率和孵化率与野生雄鳝精子没有显著差异。因此，本方法诱导直接发育为雄性的黄鳝具有正常的生殖力。

Claims (3)

1.一种诱导黄鳝直接定向发育为雄性的培育方法，包括以下步骤：

（1）驯化黄鳝摄食配合饲料：人工繁育的黄鳝幼鱼驯化至摄食配合饲料；

（2）来曲唑诱导：黄鳝2月龄幼鱼通过摄食含来曲唑的配合饲料诱导黄鳝的性腺向雄性定向发育，摄食含来曲唑的配合饲料的时间为4-5个月，获得不经过雌性成熟阶段直接发育为有功能的雄性黄鳝；所述的配合饲料中的来曲唑的含量为100-1000毫克/千克饲料。

2.权利要求1所述的培育方法在培育雄性黄鳝中的应用。

3.权利要求1所述的培育方法在黄鳝育种中的应用。

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