CN114269375A

CN114269375A - 抗cd38抗体和配制品

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Publication number: CN114269375A
Application number: CN202080030148.3A
Authority: CN
Inventors: B·卡梅伦; B·M·凯龙; J·杜马斯; A·福尼尔; J·金斯伯里; C·莱莫因; B·穆雷; N·奥斯特伯格; S·帕克; A·瓦罗内-奥多斯; Z·张
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2022-04-01
Also published as: BR112021021060A2; AU2020261039A1; KR20220003562A; JP2022529502A; MA55761A; WO2020219681A1; SG11202111602YA; TW202104269A; CO2021015462A2; IL287477A; MX2021012967A; EP3958898A1; CA3137365A1

Abstract

本文提供了特异性结合人CD38的抗体、包含所述抗体的配制品和单位剂型、制备所述抗体的方法以及使用所述抗体的方法。

Description

抗CD38抗体和配制品

相关申请

本申请要求2019年4月23日提交的美国临时申请号62/837,518；2019年6月10日提交的美国临时申请号62/859,699；2020年2月17日提交的欧洲专利申请号20305145.3；以及2020年2月17日提交的欧洲专利申请号20305146.6的权益，将所述申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。于2020年4月17日创建的所述ASCII副本被命名为为704023_SA9-289PC_ST25.txt且大小为44,783个字节。

技术领域

本文提供了具有改善的细胞毒活性的抗CD38抗体及其稳定配制品。

背景技术

CD38是II型糖基化的45千道尔顿(kDa)膜蛋白，其被鉴别为淋巴细胞标记。CD38通过调节造血细胞存活和分化在白细胞稳态中发挥作用(Richards JO,等人,Mol CancerTher.2008；7(8):2517-27)。CD38充当与CD31结合的受体并且参与细胞粘附和信号转导。CD38在信号转导中的功能显得多种多样，这取决于细胞谱系、分化阶段以及可能与不同共受体的缔合(Richards JO,等人,2008)。CD38也是催化将环腺苷二磷酸核糖(cADPR)从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)合成和水解为ADP-核糖的胞外酶(DiLillo DJ,Ravetch JV.,Cell.2015；161(5):1035-45)。这些反应产物涉及钙动员和细胞内信号传导(Derer S,等人,MAbs.2014；6(2):409-21)。

CD38在健康人类中的表达可以在NK细胞、单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、粒细胞、激活的T和B细胞、和浆细胞上检测到。相比之下，在造血干细胞、静息T和B细胞或组织巨噬细胞中尚未检测到表达。此外，若干种血液恶性肿瘤表达CD38，如恶性浆细胞病(例如，多发性骨髓瘤(MM)、淀粉样变性)和其他造血源性癌症(包括、包括例如瓦尔登斯特伦氏病(Waldenstrom’s disease)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML))。

CD38的表达在MM中尤其明显，因为>98％的患者对这种蛋白质呈阳性(ReinherzEL,等人,Proc Natl Acad Sci USA.1980；77(3):1588-92；Lin P,等人,Am J ClinPathol.2004；121(4):482-8)。CD38在恶性克隆MM细胞上的强烈且一致的表达与在正常细胞上有限的表达模式形成对比，这表明此抗原可用于特异性靶向肿瘤细胞。

MM是恶性浆细胞疾病，其特征在于细胞表面上的CD38表达、骨髓(BM)中浆细胞的克隆增殖和过量单克隆免疫球蛋白(通常为IgG或IgA型或游离尿轻链(也称为副蛋白、M蛋白或M组分)的产生。这是一种主要与年龄的增长有关的疾病，超过80％的患者年龄在60岁以上。

MM的病程随疾病的侵袭性和相关预后因素而变化。多发性骨髓瘤的某些染色体异常已被证明与不良的临床结果有关。高风险细胞遗传学改变包括del(17p)、t(4；14)和t(14；16)、和1q增加等。在过去的二十年中，中位生存期从3年提高到6年；然而，一些患者可以活超过10年(Ocio EM,等人,Expert Rev Hematol.2014；7(1):127-41)。治疗选择和生存期取决于患者的年龄、健康和疾病状况。年龄低于约65岁、身体健康良好、表现为症状性活动性疾病的患者将通常首先接受自体干细胞移植(ASCT)疗法。为了在收集干细胞之前实现疾病的细胞减少，给予诱导化疗。诱导治疗方案包括烷基化剂、单独的地塞米松、沙利度胺加地塞米松，以及长春新碱、

(阿霉素)和地塞米松(VAD；或对此方案的修改)；然而，后两种方案伴随较高的毒性(Richardson PG,等人,Blood.2010；116(5):679-86；Arnulf B,等人,Haematologica.2012；97:1925-8)。使用单独的

(硼替佐米)、硼替佐米组合以及

(来那度胺)加地塞米松的治疗作为诱导疗法已显示出改善的结果，并且这些药剂显示出更高的反应率和更低的毒性(Richardson PG 2010,Kumar S,等人,Blood.2012；119(19):4375-82；Roussel M,等人,J Clin Oncol.2014；32:2712-7；Durie BGM,等人,Lancet.2017；389:519-27)。另外批准的药物包括泊马度胺(与来那度胺属于同一类

)以及卡非佐米和伊沙佐米(与硼替佐米属于同一类蛋白酶体抑制剂)。除了这些新治疗，单克隆抗体(特别是抗CD38抗体)也已经开始在骨髓瘤患者的治疗中发挥重要作用。达雷木单抗是抗CD38抗体，其已被批准作为单一药剂或与其他MM治疗组合用于治疗MM(Touzeau C,Moreau P.,Expert Opin Biol Ther.2017；17(7):887-93；Tzogani K.等人,Oncologist.2018；23:1-11)。据报道，抗CD38抗体伊沙妥昔单抗在复发性或难治性多发性骨髓瘤中作为单一药剂诱导25％-29％反应率且以组合疗法的形式诱导60％反应率(Martin T,等人,Blood.2017；129(25):3294-303)；最近的3期研究结果指示，在复发性和难治性多发性骨髓瘤中，添加伊沙妥昔单抗能够提高使用泊马度胺-地塞米松治疗的无进展生存期(J Clin Oncol 37,2019(增刊；摘要8004))。另外，抗Slam-F7抗体艾洛珠单抗已被批准与来那度胺和地塞米松组合用于治疗接受过一至三种先前疗法线(line)的成人MM患者，并且与泊马度胺和地塞米松组合用于治疗接受过至少两种包括来那度胺和蛋白酶体抑制剂的先前疗法的成人MM患者(Bristol-Myers Squibb Company.

(艾洛珠单抗)[包装说明书]。美国食品和药物管理局网站：www-dot-accessdata-dot-fda.gov/drugsatfda_docs/label/2018/761035s008lbl.pdf.修订于2018年11月。

用于这些表达CD38的疾病的疗法的当前目标是尽可能有效地控制疾病、最大限度地提高生活质量和延长生存期。例如，MM患者在其一生中平均会接受4到8种不同的治疗方案。因此，尽管更新疗法改善了患者的预后，但MM仍然是致命的疾病。因此，对已经接受了包括抗体疗法的当前疗法并且进展的患者的治疗仍然是未满足医疗需求的重大挑战。

发明内容

与目前可用的表达CD38的疾病的治疗(包括抗体治疗)相比，设想到本文所提供的抗体、用途和治疗方法可以提供所述疾病的优越的临床反应或治疗。本文提供了特异性结合人CD38并介导对表达CD38的细胞的优越杀伤的抗体、包含所述抗体的配制品和单位剂型、制备所述抗体的方法以及使用所述抗体的方法。

一方面，提供了特异性结合人CD38的抗体。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有选自SEQ ID NO:7、8和9的氨基酸序列的轻链(LC)和具有选自SEQ ID NO:2、3、4、5和6的氨基酸序列的重链(HC)。

在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC和具有选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC。

在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC和具有选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC和具有SEQID NO:6的氨基酸序列的HC。

在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC和具有选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HC。在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LC和具有SEQID NO:7的氨基酸序列的HC。

另一方面，本文提供了包含配制的抗体的药物组合物。在所述药物组合物的一些实施方案中，所述抗体包含具有如上所述的氨基酸序列的HC和LC，与蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80组合。在一些实施方案中，所述抗体以50mg/mL的浓度存在，所述蔗糖以8％(w/v)的浓度存在，所述L-组氨酸以10mM的浓度存在，所述聚山梨酯80(PS80)以0.05％(v/v)的浓度存在，并且所述配制品具有6.2的pH。在一些实施方案中，所述药物组合物是冻干的。

另一方面，本文提供了包含配制的抗体的单位剂型。在一些实施方案中，所述抗体包含具有如上所述的氨基酸序列的HC和LC，并且所述单位剂型包含215mg所述抗体、6.21mgL-组氨酸、344mg蔗糖和2.15mg聚山梨酯80。在一些实施方案中，所述抗体的单位剂型是冻干的。

另一方面，本文提供了用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含特异性结合人CD38的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含具有如上所述的氨基酸序列的HC和LC，其中所述方法包括在细胞培养物中表达所述抗体，使所述抗体经受色谱纯化步骤和超滤步骤中的至少一个以产生纯化的抗体溶液；以及调节所述纯化的抗体溶液以产生抗体配制品。在一些实施方案中，所述抗体配制品包含所述纯化的抗体、蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80。在一些实施方案中，抗体配制品包含浓度为50mg/mL的抗体、浓度为8％w/v的蔗糖、浓度为10mM的L-组氨酸和浓度为0.05％v/v的聚山梨酯80(PS80)。在一些实施方案中，所述抗体配制品经制备以使得其具有6.2的pH。在用于制备所述抗体配制品的方法的一些实施方案中，所述抗体配制品是冻干的。

另一方面，提供了用于制备重构的抗体配制品的方法。在一些实施方案中，所述冻干抗体配制品包含蔗糖、L-组氨酸、PS80和特异性结合人CD38的抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含具有如上所述的氨基酸序列的HC和LC。在一些实施方案中，将所述冻干的抗体配制品在稀释剂中重构，由此制备所述重构的抗体配制品。在一些实施方案中，所述重构的抗体配制品包含浓度为50mg/mL的抗体、浓度为8％w/v的蔗糖、浓度为10mM的L-组氨酸和浓度为0.05％v/v的PS80。在一些实施方案中，所述重构的抗体配制品具有6.2的pH。

另一方面，提供了治疗患有多发性骨髓瘤的患者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述患者给予一个或多个剂量的特异性结合人CD38的抗体，其中所述抗体包含具有如上所述的氨基酸序列的HC和LC。

另一方面，提供了在治疗多发性骨髓瘤的方法中使用的抗体。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合人CD38，其中所述抗体包含具有如上所述的氨基酸序列的HC和LC。

附图说明

图1是示出了mAb 1、2、3、5、6、7和8出现去折叠的图。

图2是示出了mAb 1、3、5、6、7和8的等电点(PI)的图。

具体实施方式

本文提供了抗CD38抗体，其对在细胞表面上表达高、中等和低水平的CD38的细胞具有优越的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，本文所提供的抗CD38抗体还对在细胞表面上表达CD38的细胞具有优越的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。在一些实施方案中，本文所提供的抗体具有低于预期的等电点(pI)。尽管pI低于预期并且蛋白质在较低温度下发生去折叠，这可能对抗体的稳定性(特别是在商业生产过程中)产生负面影响，但本文所提供的抗体以适用于向人患者给予的稳定形式提供。

抗体

本文提供了特异性结合人CD38的抗CD38抗体。可使用重组方法产生本文所提供的抗CD38抗体。为了重组产生抗抗原抗体，将编码抗体的核酸分离，并将其插入可复制载体中用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离编码抗体的DNA并对其测序。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下各项中的一个或多个：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。载体典型地被转化到适用于核酸表达的宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞或原核细胞。在一些实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(293或亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293细胞,Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL 10)；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo,编辑,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第255-268页。可使用例如羟基磷灰石色谱、疏水相互作用色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱(其中亲和色谱是一种通常优选的纯化步骤)来纯化由细胞制备的抗CD38抗体。通常，用于制备供研究、测试和临床应用使用的抗体的各种方法是本领域已完善建立的、与上文所述方法是一致的和/或被本领域技术人员认为是适当的。

在一些实施方案中，使用以补料分批模式操作的500L一次性生物反应器，由CHO8D6宿主细胞系(DXB11衍生物)表达抗体。细胞培养过程是从解冻主细胞库小瓶开始，接着是一系列种子培养(train)细胞扩增步骤。然后将细胞转移到生物反应器中并且使用无血清的化学成分确定的细胞培养基进行培养。10-14天后终止培养以收获抗体。可以通过深层过滤从收获的细胞培养物去除细胞和细胞培养物碎屑。

接着通过色谱和过滤步骤进一步加工收获的材料以产生纯化的抗体。在液体溶液中配制纯化的抗体并将其在≤-30℃下储存。

在将配制的抗体分配到合适的小瓶中之前，将液体溶液解冻并使用0.2μm过滤装置进行无菌过滤。将配制的抗体分配到合适的容器(如USP 1型玻璃小瓶，4.3mL/小瓶)中。在一些实施方案中，填充的小瓶包含0.3mL过量的配制的抗体。在一些实施方案中，配制的抗体在小瓶中冻干。

术语“抗体”通常是指包含两条重链(HC)和两条轻链(LC)的四聚体蛋白。每个这种四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对多肽链具有一条LC(通常具有约25kDa的分子量)和一条HC(通常具有约50-70kDa的分子量)。如本文所用，术语“HC”和“LC”是指具有足以赋予对靶抗原的特异性的可变结构域序列的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分包含约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域，所述可变结构域通常负责抗原识别。每条链的羧基末端部分通常定义负责效应子功能的恒定结构域。因此，在典型抗体中，全长HC免疫球蛋白多肽包含一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中所述VH结构域位于多肽的氨基末端并且所述CH3结构域位于羧基末端，并且全长LC免疫球蛋白多肽包含一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，其中所述VL结构域位于多肽的氨基末端并且所述CL结构域位于羧基末端。

术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且具体地包括如上所述的典型抗体，其包括单克隆抗体和多特异性抗体(例如，二特异性和三特异性抗体，只要它们展现所需的生物活性(包括与CD38靶标的特异性结合以及触发ADCC和ADCP的能力)即可)。

如本文所用术语“Fc”是指包含由抗体消化得到或通过其他手段产生的非抗原结合片段的序列的分子，所述分子呈单体或多聚体形式，并且所述“Fc”可以含有铰链区。Fc分子由可通过共价(即，二硫键)和非共价结合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。取决于类别(例如，IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2和IgG4)，典型Fc分子的单体亚基之间分子间二硫键的数量在1至4范围内。Fc的一个例子是由IgG的木瓜蛋白酶消化产生的二硫键键合的二聚体。

本文所述的抗体可以是分离的。术语“分离的蛋白质”、“分离的多肽”或“分离的抗体”是指如下蛋白质、多肽或抗体，所述蛋白质、多肽或抗体由于其起源或衍生来源而：(1)与在其天然状态下伴随其的天然缔合组分非缔合，(2)基本上不含来自相同物种的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，和/或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成或在与其天然起源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将与其天然缔合组分“分离”。也可以使用本领域熟知的蛋白质纯化技术，通过分离使蛋白质基本上不含天然缔合组分。

在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含如表1中提供的HC和LC氨基酸序列。

表1

结合特性

术语“亲和力”是指两种多肽(例如像受体/配体或抗原/抗体)之间吸引的量度。两种多肽之间的内在吸引力可以表示为特定相互作用的结合亲和力平衡常数(KD)。当KD≤1μM、优选≤100nM时，抗体被说成与抗原特异性地结合。KD结合亲和力常数可以例如通过表面等离子体共振(SPR)

或生物膜层干涉技术(Bio-Layer Interferometry)来测量。

术语“k解离”是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率常数。k解离解离速率常数可以例如通过生物膜层干涉技术来测量。

与CD38的结合

在一些实施方案中，本文所提供的抗体包含含有两条HC和两条LC的四聚体蛋白质并且当通过如下所述的表面等离子体共振(SPR)测量时以约1.91x10^-10M至约6.7x10^-10M的亲和力或KD与人CD38结合。在一些实施方案中，HC和LC分别具有以下氨基酸序列：SEQ IDNO:2和7(mAb 2)、3和7(mAb 3)、4和7(mAb 4)、5和8(mAb 5)、5和9(mAb 6)、6和8(mAb 7)、或6和9(mAb 8)。

在一些实施方案中，抗体包含分别具有SEQ ID NO:3和7的氨基酸序列的HC和LC，并且抗体可以以约2x10^-10M的亲和力或KD与人CD38结合。在一些实施方案中，抗体包含分别具有SEQ ID NO:5和8的氨基酸序列的HC和LC，并且抗体可以以约6.7x10^-10M的亲和力或KD与人CD38结合。在一些实施方案中，抗体包含分别具有SEQ ID NO:5和9的氨基酸序列的HC和LC，并且抗体可以以约4.15x10^-10M的亲和力或KD与人CD38结合。在一些实施方案中，抗体包含分别具有SEQ ID NO:6和8的氨基酸序列的HC和LC，并且抗体可以以约3.85x10^-10M的亲和力或KD与人CD38结合。在一些实施方案中，抗体包含分别具有SEQ ID NO:6和9的氨基酸序列的HC和LC，并且抗体可以以约1.91x10^-10M的亲和力或KD与人CD38结合。

与FcγRIIIa(CD16a)和FcγRIIa(CD32a)的结合

本文所提供的抗体还能够以分别少于一个数量级内的KD和以如通过SPR所测量小于100nM的KD与在氨基酸位置158处具有苯丙氨酸(F)的较低亲和力FcγRIIIa(CD16a)变体(158F)结合并且能够与在氨基酸位置158处具有缬氨酸(V)的较高亲和力FcγRIIIa(CD16a)变体(158V)结合。在一些实施方案中，本文所提供的抗体以如通过SPR所测量的小于100nM的KD与FcγRIIIa(CD16a)的158F变体和158V变体结合并且其中与158F和158V变体的结合相差小于2倍。在一些实施方案中，当通过例如SPR测量时，本文所提供的抗体以约59nM或更小的KD与FcγRIIIa(CD16a)变体(158F)结合。

在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC和具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的LC，并且能够以约53nM的KD与FcγRIIIa(158F)结合并且以约47nM的KD与FcγRIIIa(158V)结合，如通过例如SPR所测量。在一些实施方案中，抗体包含具有SEQID NO:3的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC，并且能够以约59nM的KD与FcγRIIIa(158F)结合并且以约75nM的KD与FcγRIIIa(158V)结合，如通过例如SPR所测量。在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC，并且能够以约51nM的KD与FcγRIIIa(158F)结合并且以约47nM的KD与FcγRIIIa(158V)结合，如通过例如SPR所测量。

本文所提供的抗体还能够以≤690nM的KD与在氨基酸位置131处具有精氨酸的较低亲和力FcγRIIa(CD32a)变体(131R)结合并且以小于约270nM的KD与在位置131处具有组氨酸的较高亲和力FcγRIIa(CD32a)变体(131H)结合，如通过例如SPR所测量。

在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC和具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的LC，并且能够以约690nM的KD与FcγRIIa(CD32a)(131R)结合并且以约120nM的KD与FcγRIIa(CD32a)(131H)结合，如通过例如SPR所测量。在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC，并且能够以≤约125nM或≤100nM的KD与FcγRIIa(CD32a)(131R)结合并且以约220nm的KD与FcγRIIa(CD32a)(131H)结合，如通过例如SPR所测量。在一些实施方案中，抗体包含具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC，并且能够以约510nM的KD与FcγRIIa(CD32a)(131R)结合并且以约60nM的KD与FcγRIIa(CD32a)(131H)结合，如通过例如SPR所测量。

在一些实施方案中，抗体还能够以约70nM或更小的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158F结合并且以约32nM或更小的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158V结合，如分别通过与表达FcγRIIIa(CD16a)158F或158V的HEK细胞的结合所测量。在一些实施方案中，包含具有SEQID NO:2的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC的抗体还能够以约70nM的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158F结合并且以约18nM的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158V结合，如分别通过与表达FcγRIIIa(CD16a)158F或158V的HEK细胞的结合所测量。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC的抗体还能够以约60nM的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158F结合并且以约32nM的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158V结合，如分别通过与表达FcγRIIIa(CD16a)158F或158V的HEK细胞的结合所测量。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC和具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的LC的抗体还能够以约44nM的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158F结合并且以约28nM的表观KD与FcγRIIIa(CD16a)158V结合，如分别通过与表达FcγRIIIa(CD16a)158F或158V的HEK细胞的结合所测量。

在一些实施方案中，抗体还能够以约890nM或更小的表观KD与在氨基酸位置131处具有精氨酸的FcγRIIa(CD32a)变体(131R)结合并且以约840nM或更小的表观KD与FcγRIIa(CD32a)变体131H结合，如分别通过与表达FcγRIIa(CD32a)131R或131H的HEK细胞的结合所测量。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HC和具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的LC的抗体还能够以约890nM的表观KD与FcγRIIa(CD32a)131R结合并且以约840nM的表观KD与FcγRIIa(CD32a)131H结合，如分别通过与表达FcγRIIa(CD32a)131R或131H的HEK细胞的结合所测量。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC的抗体还能够以约87nM的表观KD与FcγRIIa(CD32a)131R结合并且以约222nM的表观KD与FcγRIIa(CD32a)131H结合，如分别通过与表达FcγRIIa(CD32a)131R或131H的HEK细胞的结合所测量。在一些实施方案中，包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的HC和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的LC的抗体还能够以约467nM的表观KD与FcγRIIa(CD32a)131R结合并且以约544nM的表观KD与FcγRIIa(CD32a)131H结合，如分别通过与表达FcγRIIa(CD32a)131R或131H的HEK细胞的结合所测量。

作用机制

本文所提供的抗体能够通过在细胞表面上表达高(约400,000个/细胞)、中等(约100,000个/细胞)和低(约13,000个/细胞)水平的CD38分子的细胞的抗体依赖性细胞毒性来杀伤表达CD38的细胞。本文所提供的抗体在存在自然杀伤(NK)细胞的情况下触发这种ADCC，所述NK细胞表达较低亲和力的FcγIIIa(CD16a)受体变体(158F)和/或表达较高亲和力的FcγIIIa(CD16a)受体变体(158V)。ADCC可以使用本领域已知的方法测量，例如通过在基于细胞的效能测定中在存在抗体和效应细胞的情况下测量靶细胞溶解来测量。靶细胞可以是例如表达CD38的细胞，如KMS12-BM、RPMI-8226或MOLP-8。另外，效应细胞可以是例如可被诱导以通过ADCC杀伤靶细胞的任何细胞。在一些实施方案中，效应细胞是从人血液分离的原代细胞，如外周血单核细胞(PBMC)或从PBMC纯化的人NK细胞。在另一个实施方案中，细胞是自然杀伤细胞系(如NK-92细胞)，其在细胞表面上表达FcγRIIIa(158V)或FcγRIIIa(158F)(参见WO 06/023148)。在仍其他实施方案中，NK细胞系是诸如Jurkat细胞系的细胞系，其已被工程化以表达FcγIIIa(CD16a)158F或158V(参见例如Promega,G701A)。

本文所提供的抗体能够通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)杀伤在细胞表面上表达高水平的CD38的细胞。本文所提供的抗体在存在人PBMC的情况下触发这种ADCP。在一个实施方案中，本文所提供的抗体以212.6pM的相对EC50通过表达FcγRIIIa(158V)的人PMBC触发对表达CD38的细胞的约41％吞噬作用。

药物组合物和配制的抗体

术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对接受制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。此类配制品通常是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可以合理地给予受试哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。

本文所提供的抗体的药物组合物和配制品可以通过将具有所需纯度的抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))混合来制备，并且可以以冻干配制品或水溶液的形式提供。

在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物包含配制的抗体，所述配制的抗体包含抗体和一种或多种下列赋形剂：蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80(PS80)。在一些实施方案中，抗体包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体以5mg/mL至50mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，抗体以5mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，抗体以10mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，抗体以20mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施方案中，抗体以50mg/mL的浓度存在于药物组合物中。选择每种赋形剂的浓度使得药物组合物可被稀释用于通过输注给予。例如，在一些实施方案中，蔗糖以8％(w/v)至10％(w/v)的浓度存在。在一些实施方案中，蔗糖以8％(w/v)的浓度存在。在一些实施方案中，蔗糖以10％(w/v)的浓度存在。在一些实施方案中，L-组氨酸以10mM至20mM的浓度存在。在一些实施方案中，L-组氨酸以10mM的浓度存在。在一些实施方案中，L-组氨酸以20mM的浓度存在。在一些实施方案中，PS80以0.005％(v/v)至0.05％(v/v)的浓度存在。在一些实施方案中，PS80以0.005％(v/v)的浓度存在。在一些实施方案中，PS80以0.02％(v/v)的浓度存在。在一些实施方案中，PS80以0.05％(v/v)的浓度存在。在一些实施方案中，将药物组合物的pH优化以维持例如在药物组合物呈液体形式时抗体的稳定性。在一些实施方案中，配制的抗体的pH具有约6.0至约6.5的pH。在一些实施方案中，配制的抗体具有约6.0的pH。在一些实施方案中，配制的抗体具有约6.2的pH。在一些实施方案中，配制的抗体具有约6.5的pH。在一些实施方案中，配制的抗体具有6.0的pH。在一些实施方案中，配制的抗体具有6.2的pH。在一些实施方案中，配制的抗体具有6.5的pH。

在一些实施方案中，本文所提供的药物组合物的抗体和/或配制的抗体包含一种或多种带电同种型。带电同种型通常被描述为主要同种型、酸性同种型和碱性同种型。主要同种型是指在给定批次的抗体中最普遍的同种型。一种或多种酸性同种型与主要同种型相比具有较低的等电点(pI)，并且碱性同种型与主要同种型相比具有较高的pH。带电同种型可以通过对HC和/或LC的氨基酸序列的翻译后修饰而产生。例如，脱酰胺基、糖化和唾液酸化的增加可能导致抗体pI的降低。N末端谷氨酸向焦谷氨酸(或pyroQ)的转化导致失去一个正电荷，这可能导致pI的降低。另外，C末端赖氨酸的存在可能导致抗体pI的增加。此外，C末端脯氨酸的酰胺化可能导致抗体pI的增加。

在本文所提供的抗体(包括药物组合物中的抗体和配制的抗体)的一些实施方案中，在HC氨基酸序列的位置1处的氨基酸是焦谷氨酰胺。在本文所提供的抗体的一些实施方案中，HC具有由甘氨酸组成的C末端氨基酸。

本文所提供的抗体的带电同种型可以使用本领域已知的用于基于电荷分离多肽的方法来分离和量化。例如，在一些实施方案中，可以在具有磷酸盐/氯化钠梯度缓冲液的高效液相色谱(HPLC)系统中使用弱阳离子交换柱。在此系统中，将抗体加载到柱上之后，首先将抗体的酸性同种型洗脱，接着是抗体的主要同种型，然后是酸性同种型。在另一个实施方案中，可以使用毛细管等电聚焦(cIEF)。毛细管等电聚焦是将蛋白质通过其等电点(pI)值来分离的方法。在cIEF中，抗体样品在毛细管内的pH梯度上迁移到其等电点，从而沿毛细管长度解析不同的带电同种型。为了鉴定和表征cIEF变体，可以通过强阳离子交换色谱(SCX)分离带电同种型并通过cIEF对其进行分析。采用全柱检测和测量在280nm处的吸光度，使用电荷耦合器件照相机来采集毛细管中解析出的带电同种型的图像。使用cIEF将测试样品的带电同种型分布与参考标准相比较以鉴定抗体的带电同种型。在一些实施方案中，cIEF被用作质量控制措施以便在商业生产期间确认抗体的身份，并通过与参考标准相比(例如，具有在预先定义的分布型式内的带电同种型分布型式的测试抗体)或与参考标准的分布型式相比确定抗体的带电同种型分布。

在一些实施方案中，抗体(包括药物组合物中的抗体和配制的抗体)包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列，以及选自至少约70％主要同种型、不多于约30％酸性同种型和小于4％碱性同种型的一种或多种带电同种型参数。在一些实施方案中，抗体包含71％主要同种型、28％酸性同种型和小于4％碱性同种型。在一些实施方案中，抗体含有具有在约5.8至约9.0范围内的等电点的带电同种型。在一些实施方案中，抗体含有具有在约5.85至约8.97范围内的等电点的带电同种型。

在一些实施方案中，抗体(包括药物组合物中的抗体和配制的抗体)是冻干的。抗体(包括药物组合物中的抗体和配制的抗体)可以在容器(例如小瓶)中使得可从容器移取处方剂量的抗体以用于向患者给予。

本文提供了特异性结合CD38的配制的抗体的单位剂型。在一些实施方案中，抗体包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列，并且单位剂型包含抗体和选自蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80的一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，单位剂型包含约215mg抗体、约6.21mg L-组氨酸、约344mg蔗糖和约2.15mg聚山梨酯80。在一些实施方案中，单位剂型包含215mg抗体、6.21mg L-组氨酸、344mg蔗糖和2.15mg聚山梨酯80。在一些实施方案中，单位剂型是冻干的。单位剂型可以在容器(例如小瓶)中使得可从容器移取处方剂量的抗体以用于向患者给予。在一些实施方案中，抗体、药物配制品和/或配制的抗体是在装有弹性封闭件(closure)的玻璃小瓶中。在一些实施方案中，小瓶含有约215mg抗体。在一些实施方案中，小瓶含有215mg抗体。在一些实施方案中，已确定小瓶的填充体积，以使得能够移取约4mL。在一些实施方案中，已确定小瓶的填充体积，以使得能够移取4mL。

制备方法

本文提供了用于制备抗体、药物组合物和单位剂型的方法。在一些实施方案中，抗体包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列。在一个实施方案中，方法包括在合适的细胞培养物中表达抗体。使抗体经受至少一个色谱步骤和至少一个超滤步骤，从而产生纯化的抗体溶液。对纯化的抗体溶液进行调节以浓缩抗体并添加赋形剂和调节pH。在一个实施方案中，将抗体的浓度调节至约50mg/ml；添加蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80，并将pH调节至至少约6.0。在一个实施方案中，将抗体的浓度调节至50mg/ml；添加蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80，并将pH调节至至少6.0。在一些实施方案中，pH为约6.2。在一些实施方案中，pH为6.2。在一些实施方案中，蔗糖的浓度为约8％w/v，L-组氨酸的浓度为约10mM；并且聚山梨酯80的浓度为约0.05％v/v。在一些实施方案中，蔗糖的浓度为8％w/v，L-组氨酸的浓度为10mM；并且聚山梨酯80的浓度为0.05％v/v。在一些实施方案中，抗体、药物组合物和/或配制的抗体是冻干的。

在一些实施方案中，提供了制备重构的配制的抗体的方法，其中配制的抗体是以冻干形式提供并且包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列、浓度为约8％w/v的蔗糖、浓度为约10mM的L-组氨酸和浓度为约0.05％v/v的聚山梨酯80。在一些实施方案中，提供了制备重构的配制的抗体的方法，其中配制的抗体是以冻干形式提供并且包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列、浓度为8％w/v的蔗糖、浓度为10mM的L-组氨酸和浓度为0.05％v/v的聚山梨酯80。在一些实施方案中，在使用之前，在合适体积的注射用水中重构配制的抗体以产生这样的溶液，所述溶液包含浓度为约50mg/mL的抗体、浓度为约8％w/v的蔗糖、浓度为约10mM的L-组氨酸和浓度为约0.05％v/v的聚山梨酯80，其中重构的抗体的pH为约6.2。在一些实施方案中，在使用之前，在合适体积的注射用水中重构配制的抗体以产生包含这样的溶液，所述溶液包含浓度为50mg/mL的抗体、浓度为8％w/v的蔗糖、浓度为10mM的L-组氨酸和浓度为0.05％v/v的聚山梨酯80，其中重构的抗体的pH为6.2。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指被设计为改变临床病理学过程中被治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。希望的治疗效果包括降低疾病进展速率、改善或缓和疾病状态、以及消退或者预后改善。例如，如果与癌症相关的一种或多种症状减轻或消除，则成功“治疗”个体，包括但不限于减少癌细胞的增殖、破坏癌细胞、减少由所述疾病产生的症状、提高患所述疾病的那些个体的生活质量、减少治疗所述疾病所需要的其他药物的剂量和/或延长个体的生存期。

本文提供了用于治疗个体的多发性骨髓(如复发性多发性骨髓瘤或复发性和难治性多发性骨髓瘤)或延迟其进展的方法，所述方法包括向有需要的受试者给予有效量的本文所提供的抗CD38抗体。在一些实施方案中，抗体包含表1中提供的任一种单克隆抗体的HC和LC氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体能够提高鼠MM模型中小鼠的生存期，其中模型中的小鼠表达低亲和力人CD16a变体(158F)，并且其中已向小鼠注射500,000个表达人CD38的EL4细胞。在一些实施方案中，一个或多个剂量的抗CD38抗体是以冻干配制品的形式提供，其中在给予之前，将冻干配制品重构从而形成重构的抗体配制品，使得重构的抗体配制品具有6.2的pH并且在包含约10mM L-组氨酸、约8％w/v蔗糖和约0.05％v/v聚山梨酯80的液体中包含浓度为约50mg/mL的抗体。在一些实施方案中，一个或多个剂量的抗CD38抗体是以冻干配制品的形式提供，其中在给予之前，将冻干配制品重构从而形成重构的抗体配制品，使得重构的抗体配制品具有6.2的pH并且在包含10mM L-组氨酸、8％w/v蔗糖和0.05％v/v聚山梨酯80的液体中包含浓度为50mg/mL的抗体。

在一些实施方案中，向患者给予一个或多个剂量的抗体。在一些实施方案中，剂量可以是约0.1、约0.2、约0.3、约0.5、约1.0、约2.5、约5、约10或约20mg/kg的抗体。在一些实施方案中，剂量可以是0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.5、5、10和20mg/kg的抗体。在一些实施方案中，抗体是静脉内给予的。在一些实施方案中，抗体是皮下给予的。

定义

除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种分子”任选地包括两种或更多种这样的分子的组合等。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)涉及所述值或参数本身的实施方案。在一些实施方案中，术语“约”表示规定值加上或减去所述值的10％；例如，“约10mg/kg”可以涵盖9至11mg/kg。在一些实施方案中，术语“约”表示规定值加上或减去所述值的5％；例如，“约20mg/kg”可以涵盖19至21mg/kg。

“受试者”或“个体”出于治疗目的是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家禽和农场动物，以及动物园动物、运动项目用动物或宠物诸如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人类。

为了说明和描述本发明的某些具体实施方案，下面阐明了实施例。然而，权利要求的范围不应以任何方式受到本文所阐明的实施例的限制。

实施例

1.抗体设计：

生成了Fc工程化抗CD38抗体，其在抗体的Fc部分中具有突变以提高对于效应细胞上的激活FcγRIIIa和FcγRIIa受体的亲和力。

两条人源化重链(HC)(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)在框架区携带14和10个突变(与SEQ ID NO:1相比)，这导致智人生殖(germinality)得分从74.49％分别增至88.78％和84.69％。两条人源化轻链(LC)(SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9)在框架区携带17和15个突变(与SEQ ID NO:7相比)，这导致智人生殖得分从64.36％分别增至81.19％和79.21％。另外，在LC 2和3中，用亮氨酸取代位置11处的甲硫氨酸以避免潜在的有问题的甲硫氨酸氧化。HC和LC序列提供于表2中，并且mAb HC与LC配对提供于表3中。

表2

表3

2.生化表征：

A:与CD38的结合

在一个实验中，使用

仪器通过SPR测量mAb 1-8对于人CD38的结合亲和力和动力学常数。简言之，将抗CD38抗体捕获至已由抗Fc抗体共价结合的CM5芯片。在被测试的捕获抗体上注射多种浓度的huCD38。使用Biacore评价软件生成结合曲线(传感图)并进行动力学分析。

如表4所示，mAb 3和8对于人CD38具有最高亲和力(针对每种变体的T检验：p值>2)。

表4对于人CD38的亲和力(n＝3)

在另一个实验中，如上所述使用的

仪器通过SPR测量mAb 1和3对于人CD38的结合亲和力。mAb 1具有0.22nM的Kd，并且mAb 3具有0.20nM的Kd。

热应力对人CD38的结合亲和力的影响：使用

仪器通过SPR测量在mAb经受热应力(在40℃下，在10mM组氨酸pH 6、8％蔗糖、0.02％PS80中14天)之后mAb 1-8对于人CD38的结合亲和力和动力学常数。已使用以上段落中所述的相同方案。

如表5所示，经受热应力的样品显示与相应的非应力样品CD38(表4)(针对每种变体的T检验：p值>2)非常相似的亲和力和动力学常数。

表5热应力对针对人CD38的亲和力的影响(n＝3)

B:通过计算机测量对于FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIb的亲和力

在一个实验中，使用表面等离子体共振(SPR)测量mAb对于FcγRIIIa158V受体或FcγRIIIa 158F受体的亲和力。根据供应商(ThermoFisher Scientific)通过瞬时转染在HEK293细胞中产生mAb，并且根据供应商(GE Healthcare)通过蛋白A亲和色谱将其纯化。根据供应商(Ni-Sepharose GE,Healthcare)通过瞬时表达在HEK293细胞中产生带有C末端histag的具有V158或F158的FcγRIIIa(CD16a)胞外结构域，并通过固定金属亲和色谱(IMAC)将其纯化。使用在CM5芯片上固定的抗His IgG，通过捕获测定在BIACore2000(GEHealthcare)上经由SPR测量亲和力。然后将FcγRIIIa-histag添加至运行缓冲液中，接着是浓度在8至256nM范围内的抗CD38 mAb。使用BIAevaluation Software 4_1(GEHealthcare)，利用两态反应进行分析，其中可接受的χ²值小于5(意味最高测试浓度的2％)并且最大理论共振单位的百分比大于25(意味超过1/4生产性相互作用)。

如表6所示，与mAb 1相比，mAb 2-4对于FcγRIIIa 158V具有高9倍的亲和力，并且与mAb 1相比，mAb 2-4对于FcγRIIIa 158F受体具有高超过27倍的亲和力。

表6

在另一个实验中，使用如上所述的SPR测量mAb 1和3对于FcγRIIIa 158V受体或FcγRIIIa 158F受体的亲和力。mAb 3以75nM的KD结合FcγRIIIa 158V，并且mAb 3以59nM的KD结合FcγRIIIa 158F。

使用AlphaScreen亲近测定来测量mAb对于在氨基酸位置131处具有精氨酸(FcγRIIa 131R)或在氨基酸位置131处具有组氨酸(FcγRIIa 131H)的FcγRIIa受体的亲和力。

分别由R&D System(批次1330-CD)或Biorbyt(批次ORB138408)提供具有R131或H131的FcγRIIa胞外结构域。测定是由供应商(Perkin Elmer)所描述的基于珠的亲近测定，其允许通过与具有天然IgG1的抗CD38竞争对抗CD38 Fc变体进行排序。在供体珠上捕获具有天然IgG1的生物素化抗CD38，并且在受体珠上捕获FcγRIIa histag蛋白。当抗CD38与FcγRIIa相互作用时，珠变得亲近。在680nm处供体珠的激发引起单线态氧的释放，当处于亲近状态时，所述单线态氧扩散并触发来自受体珠的520-620nm处的光的发射。光的量与相互作用的程度成正比，并且用EnVision多模式读板器(Perkin Elmer)来测量。在竞争测定期间，未标记的竞争性mAb抗CD38 Fc变体DE(S239D/I332E，Eu编号)、ADE(G236A/S239D/I332E，Eu编号)或ADLE(G236A/S239D/F243L/I332E，Eu编号)用于竞争具有天然IgG1的生物素化抗CD38与FcγRIIa-histag蛋白之间的相互作用。生物素化抗CD38的浓度是由预先完成的校准曲线设定。未标记的竞争性mAb是在不同水平下使用，以使得递增浓度的未标记的mAb可以取代生物素化抗CD38并且降低信号。关于最大信号将数据进行归一化。运行了两个实验并且通过BIOST@T-SPEED-LTS 2.1.0评估IC50。

如表7所示，与mAb 1相比，mAb 3显示分别对于FcγRIIa 131R和FcγRIIa131H的高超过14倍和18倍的亲和力。

表7对于FcγRIIa R131和FcγRIIa H131的亲和力

C：在体外对于FcγRIIa、FcγRIIIa和FcγRIIb的亲和力的测量

将HEK293T-FcγRIIIa-158F、HEK293T-FcγRIIIa-158V、HEK293T-FcγRIIa-131H、HEK293T-FcγRIIa-131R、HEK293T-FcγRI或HEK293T-FcγRIIb以10⁵个细胞/孔接种在96孔微型板中。将这些板在800g下离心1分钟并在4℃下重悬于含有不同浓度的抗体的50μL PBS中持续30分钟。然后添加200μL PBS 1％FBS以洗涤细胞，接着在800g下离心1分钟。总共重复洗涤步骤三次，之后在4℃下将细胞用与FITC缀合的二抗(片段山羊抗人IgG(H+L)FITC，编号109-546-088Jackson ImmunoResearch，最终10μg/mL)染色30分钟。用200μL PBS1％FBS洗涤细胞三次并将其重悬于100μL PBS中，之后在MACSVYB(B1通道)上获取。如表8所示，与mAb 1相比，mAb 2、3和4对于在HEK细胞上表达的FcγRIIIa 158F分别具有高32倍、38倍和51倍的亲和力，并且与mAb 1相比，mAb 2、3和4对于在HEK细胞上表达的FcγRIIIa158V分别具有高9倍、5倍和6倍的亲和力。

表8

如表9所示，与mAb 1相比，mAb 3对于在HEK细胞上表达的FcγRIIa 131H具有高约5倍的亲和力，并且与mAb 1相比，mAb 3对于在HEK细胞上表达的FcγRIIa 131R具有高约16倍的亲和力。

表9

如表10所示，与mAb 1相比，mAb 2、3和4对于FcγRI具有相似的结合亲和力水平，并且与mAb 1相比，mAb 2、3和4对于在HEK细胞上表达的FcγRIIb具有低1.8至3.9倍的亲和力。

表10

D：在体外的细胞毒活性的测量

抗体依赖性细胞毒性(ADCC)：

使用钙黄绿素-乙酰氧基甲基(Calcein-AM；Invitrogen)释放测定来检查使用被工程化以过表达FcγRIIIa受体的NK92细胞系作为效应细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定。在活细胞中，将非荧光钙黄绿素AM转化成绿色荧光钙黄绿素。将标记的靶细胞与SAR442085抗体和NK-92效应细胞一起孵育。通过ADCC对靶细胞的溶解导致荧光钙黄绿素的释放。荧光强度与所存在的ADCC活性水平成比例。

将多发性骨髓瘤靶细胞(MOLP-8、RPMI 8226、MM1R或KMS12-BM)用钙黄绿素-AM(50μg稀释于25μL DMSO中，然后将10μL钙黄绿素稀释于4mL RPMI 1640+1％FBS+1％丙磺舒中，用于4×10⁶个细胞的染色)标记30min，然后洗涤并以2×10⁴个细胞/孔的密度铺板于96孔圆底板上。添加从10μg/mL至0.01pg/mL的不同浓度的所示测试mAb或对照同型mAb持续30min以允许调理作用，之后添加用所示FcγRIIIa变体转导的自然杀伤(NK)细胞。以5:1的E:T比率(1×10⁵个NK细胞对于2×10⁴个靶细胞)添加表达158F或158V的NK细胞作为效应细胞。然后将这些板在37℃下在具有5％CO₂的湿润培养箱中孵育1h，并且收获100μL上清液并将其转移到不透明的96孔微型板中，以供在Tecan Infinite M1000上使用荧光测定法进行分析以测量钙黄绿素释放(激发滤光片：492nm；发射：515nm)。为了最大释放，用2％Triton X-100溶解细胞。从实验释放(A)、靶细胞自发释放(B)和靶细胞最大释放(C)的荧光值中减去培养基背景的荧光值。使用下式计算每种板(一式两份)的细胞毒性和ADCC百分比：

细胞毒性(％)＝(A-B)/(C-B)×100％

每个实验至少重复3次。通过使用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州)将数据点拟合至4参数方程来计算半最大有效浓度(EC50)值。

高CD38受体密度靶细胞

如上所述在体外评估多发性骨髓瘤细胞系MOLP-8的ADCC。MOLP-8细胞展现出在细胞表面上的高CD38受体密度(约400,000个/细胞)。

表11示出了在存在表达158V的NK细胞的情况下每种测试抗体针对MOLP-8细胞的EC50。如表11所示，在存在表达高亲和力FcγRIIIa变体(158V)的NK细胞的情况下，mAb 2、3和4以比mAb 1低24至33倍的EC50触发MOLP-8细胞的ADCC。

表11

表12示出了在存在表达158F的NK细胞的情况下每种测试抗体针对MOLP-8细胞的EC50。如表12所示，在存在表达低亲和力FcγRIIIa变体(158F)的NK细胞的情况下，mAb 4显示出针对MOLP-8细胞的最强ADCC活性，其中EC50比mAb 1低约97倍。在存在表达低亲和力FcγRIIIa变体(158F)的NK细胞的情况下，mAb 2和3以比mAb 1低约59至69倍的EC50触发MOLP-8细胞的ADCC。

表12

中等CD38受体密度靶细胞

如上所述在体外评估多发性骨髓瘤细胞系RPMI-8226的ADCC。RPMI-8226细胞展现出在细胞表面上的中等CD38受体密度(约70,000个/细胞)。

表13示出了在存在表达158V的NK细胞的情况下每种测试抗体针对RPMI-8226细胞的EC50。如表13所示，在存在表达较高亲和力FcγRIIIa变体(158V)的NK细胞的情况下，mAb2-4显示出相似提高的触发针对表达中等CD38受体密度的MM细胞的ADCC的能力水平，其中与mAb 1相比，EC50低27倍。

表13

表14示出了在存在表达158F的NK细胞的情况下每种测试抗体针对RPMI-8226细胞的EC50。在存在表达低亲和力FcγRIIIa变体的NK细胞的情况下，与mAb 1相比，mAb 4显示出约73倍提高的触发针对表达中等CD38受体密度的MM细胞的ADCC的能力；而在存在表达低亲和力FcγRIIIa变体的NK细胞的情况下，与mAb 1相比，mAb 3显示出约65倍提高的触发针对表达中等CD38受体密度的MM细胞的ADCC的能力并且mAb 2显示出约49倍提高的所述触发的能力。

表14

低CD38受体密度靶细胞

如上所述在体外评估多发性骨髓瘤细胞系KMS-12BM的ADCC。KMS-12BM细胞展现出在细胞表面上的低CD38受体密度(约13,000个/细胞)。

表15示出了在存在表达较高亲和力FcγRIIIa变体(158V)的NK细胞的情况下每种测试抗体针对KMS-12BM细胞的EC50。有趣的是，如表15所示，在存在表达较高亲和力FcγRIIIa变体(158V)的NK细胞的情况下，与mAb 1相比，mAb 2、3和4显示出提高的触发针对表达低CD38受体密度的MM细胞的ADCC的能力。mAb 3具有比mAb 1低约69倍的EC50，并且mAb 4具有比mAb 1低约91倍的EC50。

表15

表16示出了在存在表达较低亲和力FcγRIIIa变体(158F)的NK细胞的情况下每种测试抗体针对KMS-12BM细胞的EC50。显著地，如表16所示，在存在表达较低亲和力FcγRIIIa变体(158F)的NK细胞的情况下，与mAb 1相比，mAb 2、3和4显示出提高的触发针对表达低CD38受体密度的MM细胞的ADCC的能力。mAb 3具有比mAb 1低约145倍的EC50，并且mAb4具有比mAb 1低约269倍的EC50。

表16

抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)：

首先从来自法国血液研究机构(Etablissement

du Sang)的七名健康供体的血沉棕黄层分离人PBMC。所有这些供体都展现出相同的FCGR3A和FCGR2A基因型(FcγRIIIa-158V/V和FcγRIIa-131H/H)。首先将血液收集在50mL Falcon试管中。将15mLFicoll-Plaque^TM PLUS 96％轻轻地添加到Sepmate试管的底部，然后将血液缓慢地添加到试管中，之后在1,300g下离心10分钟。然后收集PBMC环并将其用50mL PBS洗涤并且在300g下进行另一轮离心持续5分钟。重复洗涤过程两次，之后根据制造商说明书(Miltenyi；编号130-050-201)用抗CD14磁珠对PBMC染色：在4℃下孵育时间基本上为15分钟，之后经由AutoMACS pro(Posseld选择)进行阳性选择。收集单核细胞，然后将其用50mL PBS洗涤。将单核细胞在T75烧瓶中的RPMI1640、10％FBS、2％灭活的人血清、50ng/ml GM-CSF中在37℃、5％CO₂下培养5天。5天培养之后，单核细胞分化为巨噬细胞。为了收集巨噬细胞，将细胞消化液(ThermoFisher，编号：A1110501)在37℃下置于烧瓶中持续15分钟以分离细胞，然后添加20mL RPMI 10％FBS 1％谷氨酰胺以终止细胞消化液活性。将所收集的细胞在350g下离心10分钟，接着在20mL PBS中洗涤，并在300g下进行另一轮离心持续10分钟。对于两个实验，所用的巨噬细胞是来自在液氮中冷冻的巨噬细胞批次。

将巨噬细胞以20x10⁶个细胞/mL重悬于稀释剂C中(在来自Sigma Aldrich的制造商染色试剂盒号PKH26GL-1KT中提供)。对于1体积的巨噬细胞，将1体积的PKH26(20μL稀释于1mL稀释剂C中)添加至细胞中以在黑暗中孵育5分钟。然后添加5mL FBS以使染色过程失活并持续1分钟，之后用RPMI1640 10％FBS补充至50mL。将表达CD38的MOLP-8细胞用PKH67荧光染料染色，并将由纯化的单核细胞得到的巨噬细胞用PKH26染色，使得可通过流式细胞术对它们进行鉴别。然后将MOLP-8细胞和巨噬细胞在存在mAb1或mAb 3的情况下置于培养物中过夜，之后通过流式细胞术进行双阳性群体(吞噬MOLP-8细胞的巨噬细胞)分析。

如通过在所有实验中获得的较高总吞噬作用百分比(％)和较低EC50(相对)值(EC50rel)所证明，与mAb 1相比，mAb 3展现出提高的针对MOLP-8细胞系的ADCP活性。总吞噬作用％的几何平均值对于mAb 3是40.85％，而对于mAb 1是18.57％，并且EC50rel的几何平均值对于mAb 3是31.87ng/mL(或212.57pM)，而对于mAb 1，所述值超过64.86ng/mL(或超过432.62pM)。基于EC50rel值，mAb 3在ADCP活性方面比mAb 1要好至少2.035倍。

体内功效

评价mAb 3的体内功效。在第0天向人源化FcγR C57BL/6小鼠(Smith P,DiLilloDJ,Bournazos S,Li F,Ravetch JV；Proc Natl Acad Sci USA.2012；109(16):6181-6)静脉内注射500,000个EL4-huCD38肿瘤细胞。使人源化FcγRC57BL/6小鼠的所有编码FcγR的鼠基因缺失并将编码为转基因的人FcγR插入小鼠基因组中。人源化FcγR C57BL/6小鼠概括了huFcγR表达模式和表达水平并且在炎症、细胞毒性和肿瘤清除的多个huIgG介导的模型中是功能性的。关于激活的FcγRIIIa和FcγRIIa受体，插入小鼠模型中的人变体分别是huFcγRIIIa 158F和huFcγRIIa 131R(受体的低亲和力变体)。人FcγR表达模式和表达水平的特征概括在小鼠中。

从注射肿瘤细胞后第1天开始，在第1、4、7和14天腹膜内给予测试或对照mAb。同型对照mAb是以10mg/kg给予。mAb 1、3和10是以10和1.25mg/kg给予。在此生存期模型中，主要功效终点是中位生存时间(MST)、延长寿命百分比(ILS％)和长期存活者(定义为优于或等于对照组MST的2倍的生存持续时间)。用Cox模型评价各组之间的生存期差异。

如表17所示，同型对照组具有39天的MST。百分之二十的同型对照组在此模型下展现出长期生存。用10mg/kg的mAb 1治疗的组具有超过82.5天的MST、大于112％的延长寿命。用10mg/kg的mAb 1治疗的组中有百分之五十是长期存活者。用1.25mg/kg的mAb 1治疗的小鼠具有大于46.5天的MST和大于19％的延长寿命。用1.25mg/kg的mAb 1治疗的组中有百分之三十是长期存活者。

用10mg/kg的mAb 10治疗的组具有大于70天的MST、70％的延长寿命。用10mg/kg的mAb 10治疗的组中有百分之五十是长期存活者。用1.25mg/kg的mAb 10治疗的小鼠具有大于42天的MST和8％的延长寿命。用1.25mg/kg的mAb 10治疗的组中仅10％是长期存活者。

用10mg/kg的mAb 3治疗的组具有超过90天的MST、大于131％的延长寿命。显著地，用10mg/kg的mAb 3治疗的组中有90％是长期存活者。与同型对照组相比，10mg/kg的mAb 3在统计上显著地更有活性(p＝0.0351)。甚至更惊人地，用1.25mg/kg的mAb 3治疗的小鼠也具有大于90天的MST和大于131％的延长寿命。此外，用1.25mg/kg的mAb 3治疗的组中有90％是长期存活者。与同型对照组相比，1.25mg/kg的mAb 3在统计上显著地更有活性(p＝0.0380)，并且在统计上显著地优于相同剂量下的mAb 10(p＝0.0380)。

用10mg/kg剂量下的mAb 1、mAb 3和mAb 10治疗携带低亲和力huFcγRIIIa(F158/F158)的小鼠中的该肿瘤模型导致寿命和长期存活者数量的统计上显著的改善。然而，惊人的是，在1.25mg/kg剂量下，mAb 3仍展现出寿命和长期存活者数量的统计上显著的改善，而mAb 1和mAb 10则无活性。

表17

E.稳定性研究

热稳定性

使用Malvern MicroCal VP热量计，通过差示扫描量热法(DSC)测量mAb1、3、5、6、7和8的热稳定性。在包含10mM组氨酸HCl的缓冲液(pH 6.0)中测试样品。将所制备的样品连同作为参照的缓冲液一起加载到Wheaton 96孔圆底板的各孔中，一式三份。使用1℃/min的温度斜率和20℃-120℃的温度范围，收集热扫描并使用origin软件2.0进行处理。

如表18所示，mAb 3、5、6、7和8在约40℃下显示出现蛋白质构象变化，此温度比mAb1的出现温度低约17℃，并且比mAb的典型的温度低约15℃-20℃(图1)。此外，在约50℃下相对于70℃下，mAb 3、5、6、7和8的CH2结构域的去折叠比mAb 1开始得要早得多。

表18热稳定性(℃)

等电点

通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量mAb 1、3、5、6、7和8中的每一个的等电点(pI)。理论pI是使用分析平台SEDNTERP并假设以下氨基酸pKa值：Arg＝12，Asp＝4.5，Glu＝4.6，His＝6.2，Lys＝10.4且Tyr＝9.7，由组合物确定的。假设在Cys残基中的所有巯基侧链是二硫键键合的，没有贡献pKa(Laue TM,Shah BD,Ridgeway TM和Pelletier SL.Computer-aidedinterpretation of analytical sedimentation data for protein.In AnalyticalUltracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science.Harding SE,Rowe AJ和Horton Jc编辑第90-124页.Royal Society of Chemistry,1991)。

惊人的是，如表19所示，基于序列，mAb 3的pI测量值低于pI计算值。

表19

mAb	pI计算值	pI测量值	“酸性”形式％	“碱性”形式％
					1	7.46	7.47	16.6	19.0
3	7.46	6.95	20.1	44.0
					5	6.72	5.67	20.7	23.6
6	6.72	5.66	16.8	21.5
					7	7.11	6.01	25.8	48.5
8	7.11	6.22	11.5	25.7

mAb 3配制品的开发

基于热稳定性结果，开发冻干的配制品以确保mAb 3的足够稳定性以适合于mAb在≤-30℃下储存和冻干的mAb在2℃-8℃下储存。在稳定性研究中测试使用不同缓冲系统且在不同pH下的mAb 3配制品，所述稳定性研究包括冻融循环、搅动研究以及在40℃、25℃、5℃、-30℃和-80℃的应力、加速和预期储存条件下的短期(12周)孵育。在这些实验中，除了粒子形成(目测检查、基于光模糊的粒子计数和微流成像)之外，还评价了蛋白质的聚集和化学降解。

基于来自配制品开发研究的结果，选择含有10mM L-组氨酸-HCl、8％w/v蔗糖和0.05％w/v聚山梨酯80的配制品(pH 6.2)。

冻干工艺开发

开发mAb 3的冻干工艺以确保配制的抗体在冻干之后具有可接受的稳定性和饼属性。使用实验室规模的冻干器(由SP Scientific制造的Genesis EL35)，基于多次开发运行确定冻干循环的工艺参数(干燥温度、室压力等)。循环的稳健性是通过在冷冻速率、干燥温度和室真空压力的受控偏移下进行一系列冻干运行来建立。对冻干的配制的抗体的稳定性研究包括在40℃、25℃和5℃的应力、加速和预期储存条件下的短期(12周)孵育。在这些实验中，除了聚集、化学降解和粒子形成之外，还评价了冻干粉末属性(饼外观、重构时间、氧气顶部空间、水分含量)。基于配制品和冻干开发研究，mAb 3的组合物被选择为50mg/mLmAb 3、10mM L-组氨酸-HCl、8％w/v蔗糖、0.05％w/v聚山梨酯80并且pH为6.2。将配制的抗体在≤-30℃下储存并将冻干的配制的抗体在2℃-8℃下储存。

序列表

<110> 赛诺菲股份有限公司

建新公司

<120> 抗CD38抗体和配制品

<130> 704023: SA9-289PC

<150> US 62/837,518

<151> 2019-04-23

<150> US 62/859,699

<151> 2019-06-10

<150> EP 20305145.3

<151> 2020-02-17

<150> EP 20305146.1

<151> 2020-02-17

<160> 14

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 2

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 3

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly

225 230 235 240

Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 4

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成多肽

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

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195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种特异性结合人CD38的抗体，其中所述抗体包含

a)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链(LC)，或

b)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链(LC)，或

c)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链(LC)，或

d)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链(LC)，或

e)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链(LC)，或

f)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链(LC)，或

g)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链(LC)。

2.一种包含配制的抗体的药物组合物，其中所述配制的抗体包含抗体、蔗糖、L-组氨酸和聚山梨酯80(PS80)，其中所述抗体特异性地结合人CD38并且以50mg/mL的浓度存在，所述蔗糖以8％(w/v)的浓度存在，所述L-组氨酸以10mM的浓度存在，并且所述PS80以0.05％(v/v)的浓度存在，其中所述配制品具有6.2的pH，并且其中所述抗体包含

3.一种特异性结合人CD38的配制的抗体的单位剂型，其中所述配制的抗体包含215mg所述抗体、6.21mg L-组氨酸、344mg蔗糖和2.15mg聚山梨酯80，其中所述配制的抗体是冻干的，并且其中所述抗体包含

4.根据权利要求2所述的药物组合物或根据权利要求3所述的单位剂型，其中所述配制的抗体是冻干的。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中所述HC氨基酸序列的位置1处的氨基酸是焦谷氨酰胺。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中当通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量时，所述抗体具有5.8至9.0的等电点(pI)。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中所述抗体包含主要带电变体和至少一种酸性带电变体且其中所述抗体具有以下各项中的至少一项

a)所述至少一种带电变体的HC包含选自如根据SEQ ID NO:1编号的N289、N318、N387和N392的至少一个脱酰胺基的天冬酰胺，或

b)所述抗体包含主要带电变体和至少一种酸性带电变体，其中所述主要带电变体占所述抗体的至少71％并且所述酸性带电变体占所述抗体的不多于30％，或

c)当通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量时，所述主要带电变体具有7.5的等电点(pI)并且其中所述一种或多种酸性带电变体具有5.8的pI。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中所述抗体包含至少一种碱性带电变体，并且其中所述抗体具有以下各项中的至少一项

a)所述碱性带电变体占所述抗体的不多于4％，或

b)当通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量时，所述一种或多种碱性带电变体具有9.0的pI。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中所述抗体

a)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的158F、158V、或158F和158V变体二者的自然杀伤细胞的情况下能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)杀伤表达CD38的细胞，其中所述细胞在所述细胞表面上具有≤13,000个CD38位点的CD38受体密度，和/或

b)以如通过表面等离子体共振(SPR)所测量的59nM的K_D结合在氨基酸位置158处具有苯丙氨酸的CD16a(FcγRIIIa)(158F)，并且其中所述抗体以如通过SPR所测量的75nM的K_D结合在氨基酸位置158处具有缬氨酸的CD16a(158V)，和/或

c)以如通过与表达FcγRIIIa 158F的HEK细胞的结合所测量的96nM的K_D结合在氨基酸位置158处具有苯丙氨酸的CD16a(FcγRIIIa)(158F)，并且其中所述抗体以如通过与表达FcγRIIIa 158V的HEK细胞的结合所测量的40nM的K_D结合在氨基酸位置158处具有缬氨酸的FcγRIIIa(158V)，和/或

d)以如通过与表达FcγRIIa 131R的HEK细胞的结合所测量的94nM的K_D结合在氨基酸位置131处具有精氨酸(131R)的CD32a(FcγRIIa)，并且其中所述抗体以如通过与表达FcγRIIa 131H的HEK细胞的结合所测量的222nM的K_D结合在氨基酸位置131处具有组氨酸(131H)的FcγRIIa。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中

a)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的158F、158V、或158F和158V变体二者的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC杀伤表达CD38的细胞，其中所述细胞在所述细胞表面上具有>400,000个的CD38受体密度；并且能够通过ADCC杀伤表达CD38的细胞，其中所述细胞在所述细胞表面上具有≥100,000个的CD38受体密度；并且能够通过ADCC杀伤表达CD38的细胞，其中所述细胞在所述细胞表面上具有≤13,000个的CD38受体密度，和/或

b)所述抗体能够在存在人外周血单核细胞(PMBC)的情况下通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)杀伤表达CD38的细胞，其中所述细胞在所述细胞表面上具有>400,000个的CD38受体密度。

11.根据权利要求9或10所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中

a)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较高亲和力变体(158V)的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC以约0.6ng/mL的EC 50杀伤KMS-12BM细胞，和/或

b)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较低亲和力变体(158F)的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC以约0.65ng/mL的EC 50杀伤KMS-12BM细胞，和/或

c)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较高亲和力变体(158V)的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC以约0.09ng/mL的EC 50杀伤RPMI-8226细胞，和/或

d)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较低亲和力变体(158F)的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC以约0.09ng/mL的EC 50杀伤RPMI-8226细胞，和/或

e)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较高亲和力变体(158V)的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC以约0.14ng/mL的EC 50杀伤MOLP-8细胞，和/或

f)在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较低亲和力变体(158F)的自然杀伤细胞的情况下，所述抗体能够通过ADCC以约0.28ng/mL的EC 50杀伤MOLP-8细胞。

12.根据权利要求9-11中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中在存在表达CD16a(FcγRIIIa)的较高亲和力变体(158V)的人PMBC的情况下，所述抗体能够通过ADCP以约31.87ng/mL的EC 50杀伤MOLP-8细胞。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的抗体、药物组合物或单位剂型，其中所述抗体能够提高鼠肿瘤模型中小鼠的生存期，其中在所述模型中的小鼠表达人CD16a(158F)，并且其中已向小鼠注射500,000个表达人CD38的EL4细胞。

14.一种用于制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含特异性结合人CD38的抗体，其中所述抗体包含

g)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链(LC)，

所述方法包括以下步骤：

i)在细胞培养物中表达所述抗体；

ii)使所述抗体经受选自色谱和超滤的至少一个纯化步骤以产生纯化的抗体溶液；和

iii)调节所述纯化的抗体溶液以产生配制的抗体，所述配制的抗体包含

-浓度为50mg/mL的所述纯化的抗体，

-浓度为8％w/v的蔗糖，

-浓度为10mM的L-组氨酸，和

-浓度为0.05％v/v的聚山梨酯80，

其中所述配制的抗体具有6.2的pH；以及

iv)冻干所述配制的抗体；

由此制备所述药物组合物。

15.一种用于制备重构的配制的抗体的方法，其包括

a)提供冻干的抗体配制品，其包含蔗糖、L-组氨酸、聚山梨酯80和特异性结合人CD38的抗体；以及

b)在稀释剂中重构所述冻干的抗体配制品，其中所述重构的抗体配制品包含

-浓度为50mg/mL的所述抗体，

-浓度为8％w/v的蔗糖，

-浓度为10mM的L-组氨酸，和

-浓度为0.05％v/v的聚山梨酯80，

其中所述重构的抗体配制品具有6.2的pH；

其中所述抗体包含

i)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链(LC)，或

ii)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链(LC)，或

iii)具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链(LC)，或

iv)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链(LC)，或

v)具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链(LC)，或

vi)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链(LC)，或

vii)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链(HC)和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链(LC)。

16.一种治疗有需要的患者的方法，其包括向所述患者给予一个或多个剂量的特异性结合人CD38的抗体，其中所述患者患有包含表达CD38的细胞的疾病，其中所述抗体包含

17.一种用于在治疗包含表达CD38的细胞的疾病中使用的抗体，其中所述抗体特异性地结合人CD38，其中所述抗体包含

18.根据权利要求16所述的方法或根据权利要求17所述的用于所述用途的抗体，其中所述疾病是血液起源的。

19.根据权利要求18所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述血液起源的疾病选自：淀粉样变性、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、瓦尔登斯特伦氏病(Waldenstrom’s disease)、多发性骨髓瘤(MM)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)。

20.根据权利要求16-19中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述一个或多个剂量的抗体是以冻干的抗体配制品的形式提供并且其中在给予之前，将所述冻干的抗体配制品重构从而形成重构的抗体配制品，使得所述重构的抗体配制品具有6.2的pH并且在包含10mM L-组氨酸、8％(w/v)蔗糖和0.05％(v/v)聚山梨酯80的液体中包含浓度为50mg/mL的所述抗体。

21.根据权利要求16-20中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述抗体是以20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、3mg/kg或1.5mg/kg的剂量给予。

22.根据权利要求16-21中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述药物组合物包含配制的抗体，其中所述配制的抗体包含以50mg/mL的浓度存在的所述抗体、浓度为8％(w/v)的蔗糖、浓度为10mM的L-组氨酸和浓度为0.05％(v/v)的聚山梨酯80(PS80)，其中所述配制的抗体具有6.2的pH。

23.根据权利要求16-22中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中当通过毛细管等电聚焦(cIEF)测量时，所述抗体具有5.8至9.0的等电点(pI)。

24.根据权利要求16-23中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述HC氨基酸序列的位置1处的氨基酸是焦谷氨酰胺。

25.根据权利要求16-25中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述抗体包含主要带电变体和至少一种酸性带电变体且其中所述抗体具有以下各项中的至少一项

26.根据权利要求16-25中任一项所述的方法或用于所述用途的抗体，其中所述抗体包含至少一种碱性带电变体，并且其中所述抗体具有以下各项中的至少一项

a)所述碱性带电变体占所述抗体的不多于4％，或