[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN114258405A - 用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法 - Google Patents

用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114258405A
CN114258405A CN202080058518.4A CN202080058518A CN114258405A CN 114258405 A CN114258405 A CN 114258405A CN 202080058518 A CN202080058518 A CN 202080058518A CN 114258405 A CN114258405 A CN 114258405A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
seq
amino acid
acid sequence
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080058518.4A
Other languages
English (en)
Inventor
卢根民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alexion Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alexion Pharmaceuticals Inc filed Critical Alexion Pharmaceuticals Inc
Publication of CN114258405A publication Critical patent/CN114258405A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本披露内容涉及可用于生成因子Xa蛋白及其衍生物的蛋白序列。这些蛋白序列包括因子Xa轻链部分、重链催化结构域部分、和该重链催化结构域部分的C‑末端的活化肽。据发现，当将活化肽（AP）与该因子Xa蛋白或衍生物的重链的C‑末端融合时，所得蛋白可以更高效地表达，并且活化肽（AP）附接至该重链不影响该蛋白的活性。

Description

用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2019年8月8日提交的美国临时申请序列号62/884,652、以及2020年3月17日提交的62/990,885的权益，将每个申请的内容通过引用以其全文并入本披露内容。
背景技术
重组因子Xa(fXa)及其衍生物(如Andexanetα)可以由宿主哺乳动物细胞系制成。Andexanetα(或简称Andexanet)是已在美国和欧洲获批用于用利伐沙班或阿哌沙班治疗的患者在因出血危及生命或不受控而需要逆转抗凝时的一种药物。利伐沙班和阿哌沙班是因子Xa抑制剂，因子Xa抑制剂是一组抗凝(抗血液凝结)药物，还包括贝曲沙班和艾多沙班，以及低分子量肝素(LMWH)。Andexanet是因子Xa(fXa)的经修饰的重组衍生物。它充当诱饵分子，并且与抑制剂结合并解除其对fXa的抑制，从而恢复fXa的正常凝血活性。
因子Xa和Andexanet具有两条链，这两条链之间通过二硫键连接。重组天然fXa通常如下制备：首先表达无活性的前体因子X(fX)，随后是通过生理酶(例如，FVIIa/TF、FIXa/FVIIIa)或通过非生理活化剂(例如，RVV-X)将表达的fX活化为fXa的第二步骤。fX与fXa之间的区别在于在fX重链的N-末端处的活化肽(AP)的52个氨基酸残基的去除。对于将无活性的fX转化为天然fXa，活化步骤是必需的，因为典型的生产细胞系(例如CHO细胞)不能加工和去除AP。
相比之下，andexanet直接表达为经完全加工并具有功能性的分子，其可以直接从收获的细胞培养液中纯化。这是通过以下实现的：用-RKR-三肽替代天然fX中的AP序列以在重链和轻链之间形成-RKRRKR-接头，该接头可以由CHO细胞加工。
发明内容
本披露内容提供了用于制备活化的双链因子Xa蛋白或其衍生物的组合物和方法。据发现，当将活化肽(AP)与该因子Xa蛋白或衍生物的重链的C-末端融合时，所得蛋白可以更高效地表达，并且活化肽(AP)附接至该重链不影响该蛋白的活性。相比之下，将活化肽添加到该蛋白的其他部分对增强表达无用(例如，当附接至轻链的C-末端时)，或者甚至呈现对制造的挑战(例如，当附接至重链的N-末端时)。进一步地，传统观点(参见例如Branchini等人,J Thromb Haemost[血栓与止血杂志]2015；13:1468-74，和Ferrarese等人,Thrombosis Res.[血栓形成研究]2019,173:4-11)认为，FX重链的末端20个氨基酸残基(β肽)的去除不会对因子X的蛋白表达产生负面影响，与此相反，本文发现这种大的截短对于fXa和衍生物的高效表达是不希望的。更令人惊讶的是，可以通过将AP与FXa及其衍生物的C-末端融合来拯救C-末端截短对蛋白表达的影响。
在一个实施例中，本披露内容提供了一种蛋白，该蛋白包含具有式(I)的氨基酸序列：
LC-L1-HC-L2-AP (I)
其中：
LC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽，
L1是包含蛋白酶识别位点的肽接头，
HC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽，
L2不存在或者是不能被该蛋白酶加工的肽接头，并且
AP包含活化肽，其中当该L1被该蛋白酶加工时，该蛋白能够产生包含在通过二硫键连接的单独的链上的LC和HC的双链多肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
在另一实施例中，提供了一种蛋白，该蛋白包含具有式(II)的氨基酸序列：
HSA-L2-LC-L1-HC (II)
其中：
HSA是人血清白蛋白(HSA)或与该HSA具有至少85％序列同一性的变体；
L1是包含蛋白酶识别位点的肽接头；
L2不存在或者是不能被该蛋白酶加工的肽接头；
LC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽；并且
HC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽，其中当该L1被该蛋白酶加工时，该蛋白能够产生包含在单独的链上的LC和HC的双链多肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
在另一实施例中，提供了一种蛋白，该蛋白包含具有式(II)的氨基酸序列：
LC-L1-HC-L2-HSA (III)
其中：
HSA是人血清白蛋白(HSA)或与该HSA具有至少85％序列同一性的变体；
L1是包含蛋白酶识别位点的肽接头；
L2不存在或者是不能被该蛋白酶加工的肽接头；
LC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽；并且
HC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽，其中当该L1被该蛋白酶加工时，该蛋白能够产生包含在单独的链上的LC和HC的双链多肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
在一些实施例中，该LC不包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-45。在一些实施例中，L2不存在。
在一些实施例中，还提供了包含轻链和重链的双链多肽，该轻链包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽，该重链包含第一片段和第二片段，该第一片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽，该第二片段在该第一片段的C-末端侧并包含活化肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
还提供了包含轻链和重链的双链多肽，该轻链包含第一片段和第二片段，该第一片段包含人血清白蛋白(HSA)或与该HSA具有至少85％序列同一性的变体，该第二片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽，该重链包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合，并且其中该轻链不包括SEQ ID NO:2的氨基酸残基1-45。
在一些实施例中，还提供了多核苷酸、用该多核苷酸转染的细胞、以及方法以制备该双链多肽。
附图说明
图1展示了构建体C01-C14的结构。
图2A-2D示出了C05、C007、C08和C10的表达和活性测试结果。
图3示出了使用andexanet前体(AnXa)C08和C10作为参考的C12-C14的表达和活性测试结果。
具体实施方式
I.定义
所有数字表达，例如pH、温度、时间、浓度和分子量(包括范围)都是近似值，其以0.1的增量变化(+)或(-)。应当理解的是，尽管不总是明确陈述，在所有数字表达前面加上术语“约”。还应当理解的是，尽管不总是明确陈述，本文所述的试剂仅是示例性的并且此类试剂的等同物在本领域中是已知的。
术语“蛋白”和“多肽”可互换地使用并且在它们最广泛的意义上是指两个或更多个亚基氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。这些亚基可以通过肽键连接。在另一实施例中，该亚基可以通过其他键(例如酯、醚等)连接。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以包含蛋白的或肽的序列的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L光学异构体两者、氨基酸类似物和肽模拟物。下文列出了天然存在的氨基酸的单字母和三字母缩写。如果肽链短，三个或更多个氨基酸的肽通常称为寡肽。如果肽链长，该肽通常称为多肽或蛋白。
“因子Xa”或“fXa”或“fXa蛋白”是指凝血途径中的丝氨酸蛋白酶，其由无活性的因子X(fX)产生。因子Xa由因子IXa及其辅因子(因子VIIIa)在称为内在X酶(Xase)的复合物中活化，或由因子VIIa与其辅因子(组织因子)在称为外在X酶的复合物中活化。fXa与因子Va形成膜结合的凝血酶原酶复合物，并且是凝血酶原酶复合物中催化凝血酶原转化为凝血酶的活性组分。凝血酶是催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白的酶，该转化最终导致血液凝块形成。因此，fXa的生物活性在本文中有时被称为“促凝血活性”。
因子Xa是两条链之间通过一个二硫键连接的双链分子。轻链(LC)具有139个氨基酸(SEQ ID NO:2的氨基酸1到139)残基，并含有富含γ-羧基谷氨酸(Gla)的结构域(SEQ IDNO:2的氨基酸1-45)，包括短芳香堆叠(AS)(SEQ ID NO:2的氨基酸40-45)，随后是两个表皮生长因子(EGF)样结构域(EGF1：氨基酸46-84，EGF2：SEQ ID NO:2的氨基酸85-128)。
在活化前，重链(HC)具有306个氨基酸并含有52个氨基酸的活化肽(AP：SEQ IDNO:2的氨基酸143-194)，随后是催化结构域(SEQ ID NO:2的氨基酸195-448)。胰凝乳蛋白酶编号中H57-D102-S195的催化三联体等同物位于fX序列(SEQ ID NO:2)中的His236、Asp282、和Ser379(SEQ ID NO:2的氨基酸236、282和379)处。重链含有丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶样活性位点和糖基化的N-末端活化肽。重链具有至少三种形式：α、β、和γ，这三种形式因重链中C-末端肽的切割而不同。
编码人因子X(“fX”)的核苷酸序列可以在GenBank“NM_000504”中找到。fX的相应氨基酸序列和结构域结构描述于Leytus等人,Biochemistry[生物化学],1986,25:5098-5102。成熟的fX的结构域结构也描述于Venkateswarlu,D.等人,Biophysical Journal[生物物理学杂志],2002,82:1190-1206。在重链的前52个残基的催化裂解后，fX被活化为fXa(SEQ ID NO:3)。FXa含有轻链(谷氨酸残基翻译后为γ-羧基谷氨酸)和重链。该轻链的前45个氨基酸残基称为Gla结构域，因为它含有11个翻译后修饰的γ-羧基谷氨酸残基(Gla)。它还含有短的(6个氨基酸残基)芳香堆叠序列。胰凝乳蛋白酶消化选择性地去除1-44残基，导致无Gla结构域的fXa。fXa的丝氨酸蛋白酶催化结构域位于C-末端重链。fXa的重链与其他丝氨酸蛋白酶(如凝血酶、胰蛋白酶、和活化的蛋白C)高度同源。
表1.人因子X的多肽序列(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0003510337470000061
表2.成熟的人因子X的多肽序列(SEQ ID NO:2)
Figure BDA0003510337470000062
表3.因子Xa的多肽序列(SEQ ID NO:3)
Figure BDA0003510337470000063
“天然fXa”或“野生型fXa”是指天然存在于血浆中或以其原始的未修饰形式分离的fXa，其具有活化凝血酶原的生物活性，因此促进血液凝块的形成。该术语包括从组织样品中分离的天然存在的多肽以及重组产生的fXa。“活性fXa”是指具有活化凝血酶原的生物学活性的fXa。“活性fXa”可以是保留促凝血活性的天然fXa或经修饰的fXa。
“fXa衍生物”或“经修饰的fXa”或“因子Xa蛋白的衍生物”是指已被修饰但仍可直接或间接地与因子Xa抑制剂结合的fXa蛋白。
衍生物可以具有修饰的活性位点和/或修饰的Gla结构域。还预期额外的修饰。预期可以按以下一种或多种方式进行此类修饰：从序列中缺失一个或多个氨基酸、用一个或多个不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基、和/或操纵一条或多条氨基酸侧链或其“C”或“N”末端。
术语“活性位点”是指酶或抗体中发生化学反应的部分。“修饰的活性位点”是已经在结构上修饰以提供具有增加或降低的化学反应性或特异性的活性位点的活性位点。预期活性位点不仅包括实际的位点，还包括含有活性位点的结构域。活性位点的实例包括但不限于包含235-488氨基酸残基的人因子X的催化结构域、和包含195-488氨基酸残基的人因子Xa的催化结构域。胰凝乳蛋白酶编号中H57-D102-S195的催化三联体等同物位于His236、Asp282、和Ser379处。修饰的活性位点的实例包括但不限于单个的或组合的催化三联体残基。一种修饰涉及具有修饰的活性位点Ser379Ala的fXa衍生物。额外的实例包括对人因子Xa的催化结构域的修饰，该催化结构域包含在位置Arg306、Glu310、Arg347、Lys351、Lys414、或Arg424处具有至少一个氨基酸取代的195-448氨基酸残基。
术语“因子Xa抑制剂”或“因子Xa的抑制剂”是指可以直接或间接地抑制凝血因子Xa在体外和/或体内催化凝血酶原转化为凝血酶的活性的化合物。已知的fXa抑制剂的实例包括但不限于艾多沙班、磺达肝素、艾屈肝素、生物素化的艾屈肝素、依诺肝素、替地肝素、NAP-5、rNAPc2、组织因子途径抑制剂、DX-9065a(如描述于例如Herbert,J.M.,等人,JPharmacol Exp Ther.[药理学与实验治疗学杂志]1996276(3):1030-8)、YM-60828(如描述于例如Taniuchi,Y.等人,Thromb Haemost.[血栓和止血]1998 79(3):543-8)、YM-150(如描述于例如Eriksson,B.I.等人,Blood[血液]2005；106(11),摘要1865)、阿哌沙班、利伐沙班、PD-348292(如描述于例如Pipeline Insight:Antithrombotics-Reaching theUntreated Prophylaxis Market[渠道洞察：抗血栓药物——进入未经治疗的预防市场],2007)、奥米沙班、雷扎沙班(DPC906)、BAY59-7939(如描述于例如Turpie,A.G.等人,J.Thromb.Haemost.[血栓和止血杂志]2005,3(11):2479-86)、艾多沙班(如描述于例如Hylek EM,Curr Opin Invest Drugs[研究药物的当前观点]2007 8(9):778-783)、LY517717(如描述于例如Agnelli,G.等人,J.Thromb.Haemost.[血栓和止血杂志]2007 5(4):746-53)、GSK913893、贝曲沙班以及它们的衍生物。低分子量肝素(“LMWH”)也被认为是因子Xa抑制剂。
在一个实施例中，本发明的衍生物直接或间接地与因子Xa抑制剂结合。如本文所用，术语“结合(binding、binds)”、“识别(recognition或recognize)”意指包括可以使用例如杂交测定来检测的分子之间的相互作用。这些术语还意指包括分子之间的“结合”相互作用。本质上，相互作用可以是例如蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-小分子或小分子-核酸的。结合可以是“直接的”或“间接的”。“直接”结合包括分子之间的直接物理接触。分子之间的“间接”结合包括这些分子同时与一种或多种中间分子具有直接物理接触。例如，预期本发明的衍生物间接地结合并基本上中和低分子量肝素和因子Xa的其他间接抑制剂。这种结合可导致包含相互作用的分子的“复合物”的形成。“复合物”是指通过共价或非共价键、相互作用或力保持在一起的两个或多个分子的结合。
“中和”、“逆转”或“抵消”fXa的抑制剂的活性或类似短语是指抑制或阻断fXa抑制剂的因子Xa抑制或抗凝功能。此类短语是指功能的部分抑制或阻断，以及在体外和/或体内抑制或阻断大部分或全部fXa抑制剂活性。这些术语还指对至少约20％的fXa抑制剂依赖性药效学或替代标记的校正。标记的实例包括但不限于INR、PR、aPTT、ACT、抗fXa单元、凝血酶生成(Technothrombin TGA)、血栓弹力图、CAT(校准的自动血栓形成图)等。
“组合物”旨在意指活性剂和另一惰性的(例如，可检测的试剂或标签)或活性的化合物或组合物(如佐剂)的组合。
“药物组合物”旨在包括活性剂与运载体(惰性的或活性的)的组合，使得该组合物适合体外、体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文所用，当提及参考蛋白、多肽或核酸时，术语“其等同物”意在指具有最小同源性同时仍保留所需功能的那些。预期本文提到的任何修饰的蛋白也包括其等同物。例如，同源性可以是至少75％的同源性，并且可替代地至少80％、或者可替代地至少85％、或者可替代地至少90％、或者可替代地至少95％、或者可替代地98％的同源性百分比，并且展现出与该参考多肽或蛋白基本上等同的生物活性。多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％、或95％)的“序列同一性”意指当比对时，在比较两个序列时，碱基(或氨基酸)相同的百分比。应当注意，当仅使用fXa(或相关的丝氨酸蛋白酶)的重链时，总体同源性可以低于75％，如例如65％或50％，但是保留所需的功能性。
多核苷酸或多核苷酸区(或多肽或多肽区)与另一序列具有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”意指当比对时，在比较两个序列时，碱基(或氨基酸)相同的百分比。
II.因子Xa和衍生物的制备
Andexanetα(或简称Andexanet)是已在美国和欧洲获批用于用利伐沙班或阿哌沙班治疗的患者在因出血危及生命或不受控而需要逆转抗凝时的经修饰的因子Xa多肽。andexanet也称为r-解毒剂，其结构和活性描述于美国专利号8,153,590中。
Andexanet是在-RKRRKR-(SEQ ID NO:7)接头裂解后的、经加工的SEQ ID NO:4的双链多肽加工产物。Andexanet由SEQ ID NO:5表示，其包括轻链(SEQ ID NO:6)和重链(SEQID NO:8)。该轻链和该重链以该轻链的半胱氨酸98(Cys98)和该重链的半胱氨酸108(Cys108)之间的单个二硫键连接。与野生型fXa类似，在某些生产批次中，Andexanet经历翻译后修饰，导致在某些氨基酸残基(例如轻链的Ser56、Ser72、Ser76和Thr82以及重链的Thr249)处的糖基化，以及修饰的残基(轻链Asp29处的(3R)-3-羟基Asp)。进一步地，除了链间二硫键外，在轻链的半胱氨酸16与27、21与36、38与47、55与66、62与75、和77与90之间，以及在重链的半胱氨酸7与12、27与43、156与170、和181与209之间，还可以形成链内二硫键。
表4.在去除-RKRRKR-接头之前的andexanet前体的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)
Figure BDA0003510337470000091
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表5.andexanet的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0003510337470000092
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
Andexanet的前体(SEQ ID NO:4)相对于野生型fXa含有三个突变。第一个突变是fX的Gla结构域中6-39aa的缺失。第二个突变是用-RKR-替代活化肽序列143-194aa。这产生连接轻链和重链的-RKRRKR-(SEQ ID NO:7)接头。分泌后，该接头被裂解，产生双链多肽(Andexanet)。第三个突变是活性位点残基S379突变为Ala残基。
由于这些结构变化，Andexanet不与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物，并且具有降低的催化活性或不具有催化活性。因此，Andexanet可以在不干扰天然凝血机制的情况下隔离循环fXa抑制剂。还已披露了类似的解毒剂，包括进一步具有在EGF-1或EGF-2结构域中的缺失的解毒剂。
SEQ ID NO:4是在宿主细胞中表达以产生Andexanet的前体蛋白，其可以被靶向-RKRRKR-(SEQ ID NO:7)接头的内源性或超转染的弗林蛋白酶消化。据信，来自野生型fX的活化肽(AP)不是必需的，因为它已被人工-RKRRKR-接头替代。
然而，本文发现纳入AP可以增强加工的双链产物的表达。然而，将AP纳入前体蛋白中(如在重链的N-末端处)对制造提出了挑战。典型地，蛋白制造使用CHO细胞进行，这些CHO细胞不具有天然用于在AP与重链(SEQ ID NO:2)的N-末端之间的裂解位点-LTR-的加工因子X的酶活性。因此，fXa衍生物包括可以被CHO细胞中的内源性弗林蛋白酶裂解或与识别-RKR-和-RKRRKR-(SEQ ID NO:7)接头的弗林蛋白酶共转染的某些接头。
在此上下文中，发现如果AP通过弗林蛋白酶可识别的接头(例如，C04-C06)附接至蛋白，弗林蛋白酶可能过早地加工它，破坏增强表达的目的。额外地，如果弗林可识别的接头未被正确加工，则加工后的双链分子可能会无活性。另一方面，如果AP以不可裂解的方式(例如，C07)与轻链融合，则它不具有增强蛋白表达的能力。只有当AP以不可裂解的方式与重链的C-末端融合时，它在增强蛋白表达和功能活性方面才具有最佳效果。
另一发现是，重链的13个甚至15个C-末端氨基酸残基(分别为ΔHC-13和ΔHC-15)的缺失对蛋白的表达或活性没有显著影响。相比之下，从HC的C-末端缺失20个C-末端氨基酸残基(ΔHC-20)显著降低了蛋白的表达。从传统观点来看，这是出人意料的，如在例如Branchini等人,Journal of Thrombosis and Haemostasis[血栓与止血杂志]13:1468-1474(2015)中表明的，传统观点认为，天然FX截短多达20个氨基酸残基不显著影响因子X的表达。更令人惊讶的是，可以通过将AP与FXa及衍生物的C-末端融合来拯救C-末端截短对蛋白表达的影响。
因此，根据本披露内容的一个实施例，提供了一种前体蛋白，该前体蛋白包括具有式(I)的序列：
LC-L1-HC-L2-AP (I)。
LC表示包括以下的氨基酸序列的蛋白片段：SEQ ID NO:13或生物等同物，如与SEQID NO:13具有至少85％序列同一性的肽。HC表示包括以下的氨基酸序列的蛋白片段：SEQID NO:11或生物等同物，如与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽。在一些实施例中，L2包括至少β肽(RGLPKAKSHAPEVITSSPLK，SEQ ID NO:38)的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸残基。
L1表示包括蛋白酶识别位点的蛋白接头。在一些实施例中，该蛋白酶可以是弗林蛋白酶。另一方面，L2可以是空的(换言之，任选的)或肽接头。然而，当L2是接头时，L2不能被蛋白酶加工。因此，当蛋白与蛋白酶一起孵育时，蛋白酶可以消化蛋白以制成双链多肽，其中一条链包括LC，另一条链包括HC-L2-AP。在一些实施例中，所产生的双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
有趣的是，在第一组实验中，用人血清白蛋白(HSA)(一种通常用于增强表达或经表达的蛋白的稳定性的蛋白)没有观察到AP的表达增强作用。参见实例2中的C10。然而，在另外的实验(实例3)中，具有与轻链的N-末端融合的HSA的两个前体构建体C13和C14展现出大为改善的表达和活性。因此，预期Gla结构域的完全缺失(C10具有部分缺失的Gla结构域)增强了HSA的作用。换言之，当HSA与EGF1结构域直接融合时，HSA的表达增强作用更加明显。
因此，根据本披露内容的另一实施例，提供了一种前体蛋白，该前体蛋白包括具有式(II)的序列：
HSA-L2-LC-L1-HC (II)。
在另一实施例中，还提供了一种前体蛋白，该前体蛋白包括具有式(III)的序列：
LC-L1-HC-L2-HSA (III)。
此处，HSA表示人血清白蛋白(HSA)或与该HSA具有至少85％序列同一性的变体；L1是包含蛋白酶识别位点的肽接头；L2不存在或者是不能被该蛋白酶加工的肽接头；LC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽；并且HC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽。其中当该L1被该蛋白酶加工时，具有式(II)的蛋白产生包含在单独的链上的LC和HC的双链多肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。在一些实施例中，该LC不包括SEQ IDNO:2的氨基酸残基1-45。在一些实施例中，L2不存在。
在一些实施例中，具有式(I)的蛋白可以进一步包括与轻链的N-末端或重链的C-末端融合的HSA。在一些实施例中，具有式(II)的蛋白可以进一步包括与重链的C-末端融合的AP。在一些实施例中，具有式(III)的蛋白可以进一步包括与轻链的N-末端融合的AP。
在一些实施例中，本披露内容的任何蛋白都可以与免疫球蛋白的Fc片段融合。片段结晶区(Fc区)是抗体的尾区，该尾区与称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白相互作用。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域的两个相同的蛋白片段组成。
在一些实施例中，使用的Fc片段是IgG(如IgG1、IgG2或IgG4)的Fc片段。在一些实施例中，除CH2和CH3区外，Fc片段还包括CH1区。实例Fc片段序列提供于表24，SEQ ID NO:46。在一些实施例中，融合蛋白包括信号肽，如SEQ ID NO:34-36或45。
在一些实施例中，只有一条Fc片段的链与fXa衍生物融合。在一些实施例中，Fc片段的两条链都与fXa衍生物融合。
如本文所用，术语“弗林蛋白酶”或“配对的碱性氨基酸裂解酶”是指具有与GenBank登录号NP_002560(人)、NP_001074923(小鼠)或NP_062204(大鼠)的任一代表性弗林蛋白酶序列基本相同的氨基酸序列的蛋白。合适的编码弗林蛋白酶的cDNA提供于GenBank登录号NM_002569(人)、NM_001081454(小鼠)或NM_019331(大鼠)。在特定的方面，弗林蛋白酶是指人弗林蛋白酶。
人血清白蛋白(HSA)是在人血液中发现的血清白蛋白。HSA占血清蛋白的约一半。它在肝脏中产生并溶于水。白蛋白转运激素、脂肪酸、和其他化合物，缓冲pH，并维持渗透压等功能。白蛋白在肝脏中合成为具有N-末端肽的前白蛋白原，该N-末端肽在新生蛋白从粗面内质网释放之前被去除。产物白蛋白原转而在高尔基体囊泡中裂解以产生分泌的白蛋白。如本文所测试的，HSA可以具有天然序列或带有单个Cys34Ser突变(SEQ ID NO:15)以去除天然HSA中的游离半胱氨酸。
AP表示包括活化肽的蛋白片段。“活化肽”是共价或非共价地附接至蛋白并维持该蛋白无活性直到去除该活化肽的肽。在一些实施例中，该活化肽包括四个或更多个糖基化位点。已知氨基酸残基如Asp、Ser、Tyr、和Thr是合适的糖基化位点。在一些实施例中，AP是从10至100个氨基酸残基长(或者可替代地，从10至80、从15至70、从20至60、或从10至50个氨基酸残基长)并且包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个糖基化位点。
活化肽存在于野生型蛋白(如因子IX(fIX)、因子X(fX)、因子XIII(fXIIII)、因子II(凝血酶原)和蛋白C的前体)中。它们各自的序列列于表6中。
表6.实例活化肽
Figure BDA0003510337470000131
在一些实施例中，该活化肽包括SEQ ID NO:12、31、32、33、39或40的氨基酸序列，或包括与SEQ ID NO:12、31、32、33、39或40具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括与SEQ ID NO:12具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括衍生自SEQ ID NO:12的具有一个、两个或三个氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括与SEQ ID NO:31具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括衍生自SEQ ID NO:31的具有一个、两个或三个氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括与SEQ ID NO:32具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括衍生自SEQ ID NO:32的具有一个、两个或三个氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括与SEQ ID NO:33具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括衍生自SEQ ID NO:33的具有一个、两个或三个氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括与SEQ ID NO:39具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括衍生自SEQ ID NO:39的具有一个、两个或三个氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括与SEQ ID NO:40具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽包括衍生自SEQ ID NO:40的具有一个、两个或三个氨基酸添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一些实施例中，该活化肽是从10至100个氨基酸残基长(或者可替代地，从10至80、从15至70、从20至60、或从10至50个氨基酸残基长)并且包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个糖基化位点。
在一些实施例中，该蛋白酶是弗林蛋白酶，但其他蛋白酶也在本披露内容的范围内，例如，其他前蛋白转化酶如PC5或凝血的酶如FXa和凝血酶。适用于弗林蛋白酶的肽接头的实例包括-RKR-和-RKRRKR-(SEQ ID NO:7)。
如所提供的，在一些实施例中，L2不存在(空的)。在一些实施例中，L2是长度为1-50(或1-40、1-30、1-25、1-20、5-40、10-30、15-35)个氨基酸残基的肽接头。该肽接头优选地是柔性的，如具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％Gly和/或Ser的那些。
在一些实施例中，产生的双链多肽适合用作基于因子fXa抑制剂的抗凝治疗的解毒剂。在一些实施例中，该双链多肽不能与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物，具有降低的组装成凝血酶原复合物的能力，或不能组装成凝血酶原复合物。组装成凝血酶原复合物需要功能性Gla结构域。在一些实施例中，该LC不包括Gla结构域的基本部分，如不包括SEQ IDNO:2的氨基酸6-39。在一些实施例中，该LC不包括SEQ ID NO:2的氨基酸1-45。
在一些实施例中，该LC包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列或包括与SEQ ID NO:6具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，该LC包括野生型fXa的完整轻链序列(即，SEQ ID NO:3的氨基酸残基1-139)或与野生型fXa的全长轻链序列具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，如与野生型人因子Xa相比，产生的双链多肽具有降低的催化活性。这可以通过例如以下来实现：突变重链中的一个或多个活性位点，例如，His236、Asp282、和Ser379(SEQ ID NO:2的氨基酸236、282和379)。
在一些实施例中，该HC包括至少SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该HC包括至少SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该HC包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，该HC包括野生型fXa的完整重链序列(即，SEQ ID NO:3的氨基酸残基140-393)或与野生型fXa的全长重链序列具有至少85％，或者可替代地至少70％、75％、80％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，该蛋白(或该HC)不包括重链的13个C-末端氨基酸残基(SEQ IDNO:2的436-448)。在一些实施例中，该蛋白(或该HC)不包括重链的15个C-末端氨基酸残基(SEQ ID NO:2的434-448)。
蛋白序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:25和26。
在一些实施例中，信号肽(或与前肽组合)包含在蛋白的N-末端。实例信号/前肽列于表7中。
表7.信号肽或信号/前肽
Figure BDA0003510337470000161
所披露的前体蛋白可以具有与野生型fX相同的氨基酸残基(除了指定的缺失外)。在优选的实施例中，引入了某些氨基酸取代(如SEQ ID NO:4中示出的Ser379Ala取代)，导致产生fXa抑制剂的有效解毒剂。在一些实施例中，当该L1和L2被消化时，前体蛋白能够产生能够与因子Xa抑制剂结合的双链多肽。在一些实施例中，如与野生型人因子Xa相比，当引入氨基酸取代时，经消化的双链多肽不能与fXa竞争组装成凝血酶原酶复合物，具有降低的组装成凝血酶原复合物的能力，或不能组装成凝血酶原复合物，和/或具有降低的催化活性。
在一些实施例中，还提供了可以通过加工本披露内容的前体蛋白获得的双链多肽。在一个实施例中，提供了包含轻链和重链的双链多肽，该轻链包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:13或与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的肽，该重链包含第一片段和第二片段，该第一片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:11或与SEQ ID NO:11具有至少85％序列同一性的肽，该第二片段在该第一片段的C-末端侧并包含活化肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。此类双链多肽的实例提供在下表8和9中。
表8.构建体C08的活化的产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)
Figure BDA0003510337470000171
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表9.构建体C09的活化的产物的氨基酸序列(SEQ ID NO:30)
Figure BDA0003510337470000172
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
多核苷酸和宿主细胞
本披露内容还提供了编码所披露蛋白的多核苷酸、以及含有一种或多种多肽的宿主细胞。在一个方面，这些多肽在细胞表面(细胞外)表达和存在。含有本发明多肽的合适细胞包括原核和真核细胞，这些细胞包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、鼠细胞、大鼠细胞、绵羊细胞、猿细胞和人细胞。细菌细胞的实例包括大肠杆菌(Escherichia coli)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)和戈登链球菌(Streptococcus gordonii)。这些细胞可以从商业供应商如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC，美国马里兰州洛克威尔市)购买或使用本领域已知的方法从分离物培养。合适的真核细胞的实例包括但不限于293T HEK细胞，和仓鼠细胞系CHO、BHK-21；命名为NIH3T3、NS0、C127的鼠细胞系，猿细胞系COS、Vero；以及人细胞系HeLa、PER.C6(可从Crucell公司商购)、U-937和Hep G2。昆虫细胞的非限制性实例包括草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。用于表达的酵母的实例包括但不限于酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、耶氏酵母属(Yarrowia)、或毕赤酵母属(Pichia)。参见例如，美国专利号4,812,405、4,818,700、4,929,555、5,736,383、5,955,349、5,888,768和6,258,559。
在一些实施例中，用编码弗林蛋白酶蛋白的多核苷酸进一步转染宿主细胞。
除了物种特异性之外，这些细胞可以是任何特定的组织类型的细胞，如神经元或者可替代地体细胞或胚胎干细胞，如能或不能分化为神经元细胞的干细胞，例如胚胎干细胞、脂肪干细胞、神经元干细胞和造血干细胞。该干细胞可以是人或动物来源的，如哺乳动物的。
实例
通过参考以下仅仅旨在示例本发明的实例来进一步理解本发明。本发明不被示例性实施例局限在仅仅旨在是本发明的单个方面的说明的范围内。任何功能等同的方法均在本发明的范围内。除了在本文描述的那些之外，从上文描述和附图，本发明的不同修改对本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。此类修改落入所附权利要求书的范围内。
实例1.表达载体的制备
本实例生成了编码可用于产生因子Xa衍生物的前体蛋白的多核苷酸构建体，这些因子Xa衍生物包括可用于中和因子Xa抑制剂的Andexanet。这些前体蛋白序列在表10-20中列出并在图1中展示，称为C01-C11。
与Andexanet的前体(SEQ ID NO:4)相比，C01(SEQ ID NO:18)含有重链的20个C-末端氨基酸残基的缺失。类似地，C02(SEQ ID NO:19)和C03(SEQ ID NO:20)分别含有13和15个C-末端氨基酸残基的缺失。
在C03的基础上，将因子Xa活化肽(AP)添加回前体C04(SEQ ID NO:21)中。与野生型fX不同，将-RKRRKR-接头放在AP与重链之间以促进通过弗林蛋白酶加工(如在野生型fX中，轻链与AP之间还有-RKR-接头)。还制备了该前体的另一版本C05(SEQ ID NO:22)，其不具有C-末端截短，但去除了轻链的N-末端的11个氨基酸。还制备了又另一前体C06(SEQ IDNO:23)，其含有N-末端的11个氨基酸截短和C-末端的15个氨基酸截短两者。在C07(SEQ IDNO:24)中，在轻链与AP之间去除了天然-RKR-接头
在前体C08(SEQ ID NO:25)和C09(SEQ ID NO:26)中，AP置于重链的C-末端侧。AP在C08中与重链紧接融合，并且在C09中通过人工接头(-KSS(GSS)9GSS-，SEQ ID NO:14)融合。
在前体C10(SEQ ID NO:27)和C11(SEQ ID NO:28)中，人血清白蛋白(HSA，SEQ IDNO:15)与N-末端或C-末端融合，其中HSA可以具有天然序列或带有单个Cys34Ser突变(SEQID NO:15)以去除天然HSA中的游离半胱氨酸。在C10中，重链是完整的，并且在C11中，重链在C-末端处具有15个氨基酸截短。
表10.构建体C01的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)
Figure BDA0003510337470000191
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表11.构建体C02的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)
Figure BDA0003510337470000201
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表12.构建体C03的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)
Figure BDA0003510337470000202
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表14.构建体C05的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)
Figure BDA0003510337470000211
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表15.构建体C06的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)
Figure BDA0003510337470000212
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表16.构建体C07的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)
Figure BDA0003510337470000213
Figure BDA0003510337470000221
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表17.构建体C08的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)
Figure BDA0003510337470000222
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表18.构建体C09的氨基酸序列(SEQ ID NO:26)
Figure BDA0003510337470000223
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表19.构建体C10的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)
Figure BDA0003510337470000224
Figure BDA0003510337470000231
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表20.构建体C11的氨基酸序列(SEQ ID NO:28)
Figure BDA0003510337470000232
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
从头合成编码这些前体蛋白(具有合适的信号肽)的多核苷酸。在验证这些多核苷酸序列后，将它们连接到适合转染至哺乳动物宿主细胞的表达载体中。实例表达载体是AB1载体。使用的另一表达载体是pcDNA3.3载体(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))。
将这些表达载体转染到宿主细胞CHO-DUXB11、CHO-S(赛默飞世尔科技公司)、ExpiCHO-S(赛默飞世尔科技公司)、DG44(赛默飞世尔科技公司)、或CHO-M中。根据制造商的建议，使用以下进行转染：ExpiFectamineTM CHO转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)、或用试剂和电穿孔器(Maxcyte公司)进行的电穿孔。
将经转染的CHO细胞在摇瓶中培养并监测随时间推移的蛋白表达。在不事先使用抗生素选择稳定的细胞的情况下瞬时监测蛋白表达。还使用稳定的CHO细胞池监测蛋白表达。扩增稳定的池，并且制备细胞库并储存在液氮中。与瞬时表达类似，通过解冻细胞库的小瓶来培养具有稳定的池的蛋白表达。
为了改善接头连接fXa衍生物的重链和轻链的过程，在某些样品中共转染了编码人弗林蛋白酶蛋白的第二多核苷酸序列。使用单独的载体引入该弗林蛋白酶构建体。对于稳定的细胞生产，首先使用具有fXa衍生物的pcDNA3.3和G-418(0-1500μg/mL)选择稳定的细胞池以生成稳定的池(亲本池)。进一步用具有弗林蛋白酶的第二载体转染(超转染)这些亲本池。使用抗生素进一步选择经超转染的池并为细胞库做准备。
细胞培养物中的蛋白表达水平通过ELISA(FX-EIA，酶研究实验室(EnzymeResearch Laboratories))进行测量，并使用针对FX/FXa重链和轻链的单克隆抗体通过蛋白质印迹表征。使用Andexanet来构建标准曲线。通过基于亲和力的方法使用STI-树脂以捕获功能性蛋白来纯化收获的细胞培养液中的蛋白。
实例2.表达水平和活性的测试
本实例测试了实例1中制备的fXa衍生物的表达水平和活性。
在瞬时转染(与弗林蛋白酶共转染)中测试了Andexanet(AnXa)前体(SEQ ID NO:4)和C01-C03的表达和功能活性。条件包括用Expifectamine进行化学转染，随后在37℃、8％CO2、135rpm下24小时后添加增强剂和进料。结果示于下表中。
Figure BDA0003510337470000241
Figure BDA0003510337470000251
*BLQ：低于量化水平
生成了这些构建体的稳定的池。总细胞培养体积为30mL。将这些细胞每3天传代，直至细胞完全恢复，活力>97％。滴定条件如下：32℃、5％CO2、135rpm；在第1、4、7、10天添加进料。结果示于下表中。
Figure BDA0003510337470000252
下表示出了当进一步用弗林蛋白酶转染这些细胞时的测试结果。
Figure BDA0003510337470000253
*BLQ：低于量化水平
结果示出了在瞬时表达和稳定表达两者中，C01具有低表达水平，而C02和C03的表现与Andexanet前体类似。因此，从重链截短13或15个C-末端残基不影响蛋白表达或活性，但20个末端残基的缺失具有显著的负面影响。
与C01-C03相比，C04-C11进一步包括因子X活化肽(AP)或人血清白蛋白(HSA)。当野生型因子X被活化时，AP被去除。在Andexanet的产生中，AP不是构建体的一部分。如以下结果中所示出，AP的纳入显著增强了蛋白表达。进一步地，当AP与重链的C-末端(与轻链相对)融合时，该构建体得到了最具功能活性的产物(C08和C09)。与HSA融合也有助于增强表达和活性，但如与AP相比，该影响没那么明显。
通过ELISA测量的表达水平
Figure BDA0003510337470000254
Figure BDA0003510337470000261
功能活性
C04 C05 C06 C07 C08 C09 C10 C11
第1天 0.2 0.1 0.0 0.22 0.2 0.2 0.3 0.3
第2天 0.3 0.2 0.2 0.27 1.1 0.5 2.3 2.4
第3天 0.8 0.5 0.4 0.32 5.0 2.6 6.4 8.3
第4天 1.1 1.1 0.5 0.55 11.3 5.0 13.1 19.9
第5天 2.6 2.9 0.7 0.63 32.8 10.7 27.0 32.7
第6天 3.5 4.8 1.0 0.66 36.3 22.6 43.5 42.4
第7天 6.9 10.3 1.5 1.61 43.9 32.3 33.0 43.3
第8天 10.8 15.4 2.9 4.99 53.9 36.2 50.5 50.9
第9天 11.1 26.1 6.0 10.06 74.0 - 58.4 56.0
第10天 7.0 30.3 7.3 15.55 74.0 70.5 29.7 60.5
基于上述结果，进一步研究了C05、C07、C08和C10的表达和功能活性。如图2A-2D所示出，在大多数情况下，这些构建体与弗林蛋白酶的共转染有助于增加功能性蛋白滴度。然而，在C05、C07、C08和C10中，只有C08保留了高表达水平和功能活性两者。
进一步地，如下表所示出，在来自ELISA和功能定量分析两者的计算中，C08与5％弗林蛋白酶的共转染得到了最高的皮克/细胞/天(PCD)，约1.9。
基于ELISA和功能活性的比产量
Figure BDA0003510337470000262
Figure BDA0003510337470000271
实例3.额外的构建体的制备和测试
基于实例2中的测试结果，本实例制备并测试了一些额外的构建体，这些构建体的序列在下表中提供。
表21.构建体C12的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)
Figure BDA0003510337470000272
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表22.构建体C13的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)
Figure BDA0003510337470000273
Figure BDA0003510337470000281
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表23.构建体C14的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)
Figure BDA0003510337470000282
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
这些构建体的结构域结构也在图1中展示。与C08相比，C12具有完整的重链和插入在EGF2与重链之间的额外的AP。C13与C10类似，但具有N-末端截短的轻链。最后，C14包括在N-末端处的HSA(像C14)和在C-末端处的AP(像C08)两者。
测量了这些构建体以及作为对照的Andexanet前体(AnXa)、C10和C12的表达水平和活性。结果在下表中示出并在图3中绘图。
Figure BDA0003510337470000283
Figure BDA0003510337470000291
Figure BDA0003510337470000292
Figure BDA0003510337470000293
具有与轻链的EGF1结构域直接融合的HSA的C13、和在重链的C-末端处进一步包括AP结构域的C14展现了最高的表达和活性。有趣的是，尽管C10与C13之间的唯一区别是C10进一步包括来自Gla结构域(A1至K11)的某些氨基酸，但C10的表达明显降低，表明在HSA与EGF1结构域之间的直接融合是有益的。此外，C12的结果表明在轻链与重链之间添加额外的AP不是必要的。
本实例进一步表明了在这些构建体中在轻链的N-末端处融合HSA和在重链的C-末端处融合AP结构域的益处。
实例4.Fc融合体的制备和测试
本实例测试了Fc片段以及Fc片段与因子Xa衍生物(如Andexanet)之间的融合体。
制备了两种融合构建体，如表25和26中所示出，这两种融合构建体包括表24的Fc片段和两种不同的信号肽。
表24.Fc片段(SEQ ID NO:46)
Figure BDA0003510337470000301
表25.Fc融合构建体F01(SEQ ID NO:47)
Figure BDA0003510337470000302
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
表26.Fc融合构建体F02(SEQ ID NO:48)
Figure BDA0003510337470000303
Figure BDA0003510337470000311
氨基酸残基编号是基于成熟的无活性的fX(SEQ ID NO:2)
在瞬时转染中测试这些构建体的表达。条件包括用Expifectamine进行化学转染，随后在37℃、8％CO2、135rpm下24小时后添加增强剂和进料。如以下结果中所示出，fXa的信号肽(构建体F01)有助于增强融合蛋白的表达。
通过ELISA测量的表达水平
Figure BDA0003510337470000312
***
应理解，虽然已经结合上述实施例对本发明进行了描述，但上文描述和实例旨在说明而非限制本发明的范围。本发明范围内的其他方面、优点和修改对于本发明所属领域的技术人员而言将是显而易见的。

Claims (46)

1.一种蛋白，该蛋白包含具有式 (I) 的氨基酸序列：
LC-L1-HC-L2-AP (I)
其中：
LC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13或与SEQ ID NO: 13具有至少85%序列同一性的肽，
L1是包含蛋白酶识别位点的肽接头，
HC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 11或与SEQ ID NO: 11具有至少85%序列同一性的肽，
L2不存在或者是不能被该蛋白酶加工的肽接头，并且
AP包含活化肽，
其中当该L1被该蛋白酶加工时，该蛋白能够产生包含在单独的链上的LC和HC的双链多肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
2.如权利要求1所述的蛋白，其中该蛋白酶是弗林蛋白酶。
3.如权利要求2所述的蛋白，其中该L1包含RKR或RKRRKR的氨基酸序列（SEQ ID NO:7）。
4.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中L2的长度是0-50个氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的蛋白，其中至少50%的L2的氨基酸残基是Gly或Ser。
6.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该活化肽包含糖基化位点。
7.如权利要求1-5中任一项所述的蛋白，其中该活化肽是因子IX、因子X、因子XIII、因子II、或蛋白C的活化肽或与因子IX、因子X、因子XIII、因子II、或蛋白C的活化肽具有至少85%序列同一性。
8.如权利要求1-5中任一项所述的蛋白，其中该活化肽包含SEQ ID NO: 12、31、32、33、39或40的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO: 12、31、32、33、39或40具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，该蛋白进一步包含在该LC的N-末端侧的人血清白蛋白（HSA）。
10.如权利要求9所述的蛋白，其中该HSA包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
11.如权利要求9所述的蛋白，其中LC不包括SEQ ID NO: 2的氨基酸残基1-45。
12.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中如与野生型fXa相比，产生的双链多肽具有降低的组装成凝血酶原复合物的能力。
13.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，该蛋白不包括SEQ ID NO: 2的氨基酸残基6-39。
14.如权利要求13所述的蛋白，其中该LC包含SEQ ID NO: 6的氨基酸序列或包含与SEQID NO: 6具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
15.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中如与野生型人因子Xa相比，产生的双链多肽具有降低的催化活性。
16.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该HC包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO: 10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
17.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该HC包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
18.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该蛋白不包括SEQ ID NO: 2的氨基酸残基436-448。
19.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，其中该蛋白不包括SEQ ID NO: 2的氨基酸残基434-448。
20.一种蛋白，该蛋白包含具有式 (II) 的氨基酸序列：
HSA-L2-LC-L1-HC (II)
其中：
HSA是人血清白蛋白（HSA）或与该HSA具有至少85%序列同一性的变体；
L1是包含蛋白酶识别位点的肽接头；
L2不存在或者是不能被该蛋白酶加工的肽接头；
LC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13或与SEQ ID NO: 13具有至少85%序列同一性的肽；并且
HC包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 11或与SEQ ID NO: 11具有至少85%序列同一性的肽，
其中当该L1被该蛋白酶加工时，该蛋白能够产生包含在单独的链上的LC和HC的双链多肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
21.如权利要求20所述的蛋白，其中该HSA包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。
22.如权利要求20所述的蛋白，其中LC不包括SEQ ID NO: 2的氨基酸残基1-45。
23.如权利要求22所述的蛋白，其中L2不存在。
24.如权利要求22-23中任一项所述的蛋白，其中该蛋白酶是弗林蛋白酶。
25.如权利要求24所述的蛋白，其中该L1包含RKR或RKRRKR的氨基酸序列（SEQ ID NO:7）。
26.如权利要求20-25中任一项所述的蛋白，该蛋白进一步包含在该HC的C-末端侧融合的活化肽（AP）。
27.如权利要求26所述的蛋白，其中该活化肽包含糖基化位点。
28.如权利要求26或27所述的蛋白，其中该活化肽是因子IX、因子X、因子XIII、因子II、或蛋白C的活化肽或与因子IX、因子X、因子XIII、因子II、或蛋白C的活化肽具有至少85%序列同一性。
29.如权利要求28所述的蛋白，其中该活化肽包含SEQ ID NO: 12、31、32、33、39或40的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO: 12、31、32、33、39或40具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
30.如权利要求20-29中任一项所述的蛋白，其中该LC包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO: 13具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
31.如权利要求20-30中任一项所述的蛋白，其中如与野生型人因子Xa相比，产生的双链多肽具有降低的催化活性。
32.如权利要求31所述的蛋白，其中该HC包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列或包含与SEQ ID NO: 10具有至少85%序列同一性的氨基酸序列。
33.如权利要求32所述的蛋白，其中该HC包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。
34.如前述权利要求中任一项所述的蛋白，该蛋白进一步包含信号肽或信号/前肽。
35.如权利要求34所述的蛋白，其中该信号肽或信号/前肽选自由SEQ ID NO: 34-37组成的组。
36.一种蛋白，该蛋白包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。
37.一种蛋白，该蛋白包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列。
38.一种蛋白，该蛋白包含SEQ ID NO: 42的氨基酸序列。
39.一种蛋白，该蛋白包含SEQ ID NO: 43的氨基酸序列。
40.一种多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-39中任一项所述的蛋白。
41.一种细胞，该细胞包含如权利要求40所述的多核苷酸。
42.如权利要求41所述的细胞，该细胞进一步包含编码该蛋白酶的多核苷酸。
43.一种制备蛋白的方法，该方法包括培养如权利要求41或42所述的细胞并从培养物中收集双链蛋白。
44.一种包含轻链和重链的双链多肽，该轻链包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13或与SEQ ID NO: 13具有至少85%序列同一性的肽，该重链包含第一片段和第二片段，该第一片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 11或与SEQ ID NO: 11具有至少85%序列同一性的肽，该第二片段在该第一片段的C-末端侧并包含活化肽，
其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合。
45.一种包含轻链和重链的双链多肽，该轻链包含第一片段和第二片段，该第一片段包含人血清白蛋白（HSA）或与该HSA具有至少85%序列同一性的变体，该第二片段包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 13或与SEQ ID NO: 13具有至少85%序列同一性的肽，该重链包含以下的氨基酸序列：SEQ ID NO: 11或与SEQ ID NO: 11具有至少85%序列同一性的肽，其中该双链多肽能够与因子Xa抑制剂结合，并且其中该轻链不包括SEQ ID NO: 2的氨基酸残基1-45。
46.一种双链多肽，该双链多肽可通过用该蛋白酶加工如权利要求1-39中任一项所述的蛋白获得。
CN202080058518.4A 2019-08-08 2020-08-05 用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法 Pending CN114258405A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962884652P 2019-08-08 2019-08-08
US62/884,652 2019-08-08
US202062990885P 2020-03-17 2020-03-17
US62/990,885 2020-03-17
PCT/US2020/045039 WO2021026254A2 (en) 2019-08-08 2020-08-05 Compositions and methods for preparing factor xa and derivatives

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114258405A true CN114258405A (zh) 2022-03-29

Family

ID=74502595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080058518.4A Pending CN114258405A (zh) 2019-08-08 2020-08-05 用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220251534A1 (zh)
EP (1) EP4010379A4 (zh)
JP (1) JP2022543302A (zh)
CN (1) CN114258405A (zh)
WO (1) WO2021026254A2 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023168411A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav vectors for delivery of glp-1 receptor agonist fusions

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4818700A (en) 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4812405A (en) 1986-02-18 1989-03-14 Phillips Petroleum Company Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
US5955349A (en) 1996-08-26 1999-09-21 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
US6258559B1 (en) 1999-03-22 2001-07-10 Zymogenetics, Inc. Method for producing proteins in transformed Pichia
EP1728798A1 (en) * 2005-06-01 2006-12-06 ZLB Behring GmbH Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties
ES2796623T3 (es) 2007-09-28 2020-11-27 Portola Pharm Inc Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos
PT2414517T (pt) * 2009-03-30 2016-12-27 Portola Pharm Inc Antídotos para inibidores do fator xa e métodos de utilização dos mesmos
US20130230901A1 (en) * 2012-02-14 2013-09-05 Portola Pharmaceuticals, Inc. Process for making recombinant antidote to factor xa inhibitor
AU2013270682A1 (en) * 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
US10364288B2 (en) * 2013-05-24 2019-07-30 Biogen Ma Inc. Anti-GPIIB/IIIA antibodies or uses thereof
WO2017147522A1 (en) * 2016-02-24 2017-08-31 Portola Pharmaceuticals, Inc. Lyophilized formulations for factor xa antidote
FR3077296A1 (fr) * 2018-02-01 2019-08-02 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Dimeres de variants du facteur x

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022543302A (ja) 2022-10-11
EP4010379A4 (en) 2023-12-20
WO2021026254A3 (en) 2021-03-18
EP4010379A2 (en) 2022-06-15
WO2021026254A2 (en) 2021-02-11
US20220251534A1 (en) 2022-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2655248C (en) Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
JP6571735B2 (ja) 止血を調節する組成物および方法
EP2256135B1 (en) Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
ES2503365T5 (es) Método para producir proteínas dependientes de vitamina K biológicamente activas por métodos recombinantes
US7220849B2 (en) Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin K-dependent clotting factor
EP1127154B1 (en) Method for the production of fvii
KR20170125977A (ko) 응고 인자 및 다중특이적 항체의 조합 요법
RU2585231C2 (ru) Слитый белок, обладающий активностью фактора vii
JP2015524801A (ja) 修飾第ｘ因子ポリペプチドおよびその使用
US6958322B1 (en) Factor X analog with an improved ability to be activated
CN114258405A (zh) 用于制备因子Xa和衍生物的组合物和方法
JP5513120B2 (ja) 糖鎖を持たない遺伝子組換え血液凝固第ｘ因子およびその製法
US20220259287A1 (en) Single chain factor viii molecule
WO2008059917A1 (fr) Mutant de la thrombine
AU2013202566B2 (en) Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
KR20140101877A (ko) 혈액 응고 인자를 포함하는 단백질분해적으로 절단가능한 융합 단백질
WO2012031240A2 (en) Therapeutics for trauma induced factor v consumptive coagulopathy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination