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CN114214363B - 一种抗间充质干细胞衰老修饰方法及其应用 - Google Patents

一种抗间充质干细胞衰老修饰方法及其应用 Download PDF

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CN114214363B CN202111465539.0A CN202111465539A CN114214363B CN 114214363 B CN114214363 B CN 114214363B CN 202111465539 A CN202111465539 A CN 202111465539A CN 114214363 B CN114214363 B CN 114214363B
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Abstract

本发明提供一种抗间充质干细胞衰老修饰方法及其应用。本发明通过对SINHCAF基因转录后水平的干预修饰来抑制AMSC衰老，并在细胞水平通过WB、PCR、CCK8细胞增殖分析、SA‑β‑gal染色和细胞及线粒体形态观察等研究手段明确SINHCAF干预修饰对于AMSC衰老的缓解和抑制作用；并通过小鼠肝衰竭模型等体内实验明确SINHCAF干预修饰对于提高衰老AMSC肝病疗效的作用。本发明提供的制备肝病治疗的生物制剂，其制备周期更短，并且可消除AMSC衰老相关细胞功能损伤带来的不良效应，进而提升该细胞制剂在肝病临床治疗中的应用潜能。

Description

一种抗间充质干细胞衰老修饰方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗间充质干细胞衰老修饰方法及其应用，是通过干预SINHCAF的修饰来抵抗脂肪来源间充质干细胞衰老，进而提高其增殖能力，并提供SINHCAF干预修饰的AMSC(AMSC-SINHCAF)在制备肝脏疾病治疗生物制剂中的应用。。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)已被证实具有强大的分化潜能、自我更新能力、免疫调节作用以及靶向治疗功能。MSC细胞移植已在多种退行性疾病和组织急慢性损伤治疗中显示出明确疗效。动物水平的研究显示，移植MSC能缓解小鼠急、慢性肝损伤模型的肝脏炎症、促进肝细胞再生。并且临床实验研究也显示，重肝患者输注MSC的耐受性良好，可显著改善肝脏功能、降低Child-Pugh和MELD评分、减少腹水及总死亡率。因此，对于目前临床上尚无有效药物和治疗手段的重大疾病，如肝衰竭等，MSC移植有望作为一种极具前景的细胞治疗新策略，用以补充甚或替代因血浆及肝源短缺而受限的目前临床上肝衰竭治疗的两种主要方式，人工肝系统和肝移植。从而有效改善该类患者预后，降低其病死率。
虽然MSC在再生医学及肝病治疗中的作用已备受肯定，但其疗效仍存在局限性。其中增殖、分化和归巢能力差等许多缺陷，可能与其细胞衰老有关。这是由于为了满足治疗所需的细胞量，在MSC移植前往往需要进行体外扩增，这就为复制所诱导的细胞衰老提供了机会。此外，从老年人及代谢性疾病患者身上获取的MSCs也往往具有更高的衰老负荷。因此，缓解甚至抑制MSC衰老，消除衰老相关的细胞功能损伤，有望显著提高MSC移植后的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是要提供一种抗间充质干细胞衰老修饰方法，具体涉及上调AMSC中SINHCAF(SIN3A and HDAC-associated factor，SIN3A和HDAC相关因子)表达水平的表观遗传学修饰方法。
本发明通过以下技术方案实现：
1.脂肪来源的间充质干细胞(AMSC)的制备：
小鼠AMSC(mAMSC)和成人AMSC(hAMSC)按常规方法分离，mAMSC和hAMSC分别采用STEMCELLTM公司的小鼠和人MesenCultTM扩增试剂盒(货号：#05513，#05411)再添加L-谷氨酰胺作为完全培养基进行培养扩增。AMSC增殖接近75％融合时，进行消化、传代。
2.SINHCAF修饰的AMSC的构建：
2.1.SINHCAF修饰的hAMSC的构建：
以hSINHCAF慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-SINHCAF感染hAMSC。hSINHCAF慢病毒载体包含目的片段序列如SEQ:NO.1所示，其特征为包含hSINHCAF mRNA的3’-UTR区的靶向结合序列。该修饰是基于对SINHCAF表达的表观遗传学调控。表观遗传学修饰作为一种在不改变DNA序列情况下，对基因功能的可逆修饰，较之基因编辑具有更高的安全性。
SEQ:NO.1：
5’-CGCCTCAGAGCCGCCCGCCGTTCCTTTTTCCTATGCATATACTTCTTTGAGGATCTGGCCTAAAGAGGTATAGGGCATGGGAAAACGGGGCGGTCGGGTCCTCCCCAGCGCAGTAGTCCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGGCAGTAGTCAGTAGTGTACTTGGGCAGTAGTGTAGAGATTGGTTTGCCTGTTAATGAATTCAAACTAATCTCTACACTGCTGCCCAAGAGCCAGTAGTCCTGCCGGGGCTAAAGTGCTGACAGTGCAGATAGTGGTCCTCTCCGTGCTACCGCACTGTGGGTACTTGCTGCTCCAGCAGGGTAGCACTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAGTGTTTAGTTATCTACTGCATTATGAGCACTTAAAGTACTGCACAGTATTGGGGCCCTGGCTGGGATATCATCATATACTGTAAGTTTGCGATGAGACACTACAGTATAGATGATGTACTAGTCCGGGCACCCCCACAGTAT-3’
第2代hAMSC细胞铺6孔板，完全培养基培养过夜，当融合度达到50％后备用。随后Opti-MEMTM培养基200μl，加入HitransG感染增强液50μl，随后加入10μlpLVX-IRES-ZsgGeen1-SINHCAF慢病毒(滴度为108TU/ml，MOI值＝10)(MOI：感染复数)，混匀后另加入1.75ml的完全培养基并一起加入到hAMSC培养体系中，培养8-12小时观察细胞状态，如果细胞状态出现不好则立即换液，如果未产生变化则继续培养。24小时后换成含5μg/mlpolybrene(聚凝胺)的完全培养基筛选培养3-4天后荧光显微镜观察ZsGreen1荧光情况，当荧光率达到近100％后则可撤除polybrene。以感染空慢病毒的hAMSC(hAMSC-Ctrl)作为对照。
2.2.SINHCAF修饰的mAMSC的构建：
以mSINHCAF慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-SINHCAF感染mAMSC。mSINHCAF慢病毒载体包含目的片段序列如SEQ:NO.2所示，其特征为包含mSINHCAF mRNA的3’-UTR区的靶向结合序列。
SEQ:NO.2：
5’-GTTCCTTTTTCCTATGCATATACTTCTTTGTGGATCTGGTCTAAAGAGGTATAGCGCATGGGAAGATGGAGCCAGTAGTGCCATCCCAGTGTTCAGACTACCTGTTCAGGAGGCTGGGACATGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCCAGTAGTCCAGAGGATACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTACCTGTTCAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTGGGTTAGACCCTCGGCAGTAGTCAGCATGTGGAACACTGTAAAGTGCTGTGTCACGGACACTGACTTTTCAAAGTCCAGTAAGTCAGTCTGCTTAGAGGTCAGTGGGCAATACTATGCTATGTTCTGGCCCCATGTTTACAGTATGGCTGGGATATCATCATATACTGTAAGTTTGTGATGAGACACTACAGTATAGATGATGTACTAGTCACAGTAT-3’
mSINHCAF慢病毒感染mAMSC，进而构建mAMSC-SINHCAF的方法同前。同样以感染空慢病毒的mAMSC(mAMSC-Ctrl)作为对照。
3.AMSC-SINHCAF中SINHCAF表达水平分析：
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中SINHCAF的蛋白表达水平。具体步骤如下：
(1)消化离心收集细胞，于细胞沉淀中加入适量含蛋白酶抑制剂的RIPI裂解液(普利莱，货号：C1053)，并充分混匀，12000g，4℃，离心5分钟，收集上清。
(2)采用BCA试剂盒(Thermo，货号：23228)进行蛋白定量。
(3)上样前吹走4-20％梯度浓度预制胶(GenScript)每孔中的甘油，细胞蛋白样本按40ug/空的蛋白量上样，电压140V跑胶约1小时，然后用自动转膜机转膜(GenScript，Trans-Blot Turbo)约15min。
(4)再在5％BSA(Servicebio，货号：G5001-100G)中封闭约1小时，然后孵育SINHCAF一抗(Novus，1:1000稀释)，4℃过夜。
(5)TBST洗膜3次，每次10分钟分钟；然后用HRP标记的抗兔二抗孵育1小时，再用TBST洗膜3次，每次10分钟。
(6)最后用ECL(BI，货号20-500-120)曝光。条带采用ChemiScope Western Blot成像系统(Clinx Science Instruments Co.,Ltd)扫描后，再用Image J软件(RawakSoftware,Inc.Germany)进行灰度比值分析。
结果显示，经SINHCAF干预修饰的AMSC，其SINHCAF蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSCs，可下调至15～50％水平。
4.在体外培养传代诱导的细胞复制衰老模型中分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞衰老表型：
成人脂肪组织来源的天然hAMSC、hAMSC-Ctrl和hAMSC-SINHCAF细胞分别传至第20代；小鼠脂肪来源的天然mAMSC、mAMSC-Ctrl和mAMSC-SINHCAF细胞分别传至第8代。光镜下观察可见，天然hAMSC、hAMSC-Ctrl细胞显著增大并呈扁平化，细胞核变大，且出现空泡化；电镜下观察天然hAMSC、hAMSC-Ctrl细胞中的线粒体也明显融合增大，具有典型的衰老细胞特征。而hAMSC-SINHCAF细胞则仍能维持经典的MSC细胞的长梭型特征，细胞核及线粒体形态较之传代早期的细胞(如第2代细胞)也无明显改变。同样的，小鼠脂肪来源的mAMSC在体外培养传代后也具有类似表现。表明SINHCAF修饰可有效避免AMSC细胞衰老。
4.1.进一步采用细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒(C0602，碧云天)比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞的染色情况。具体步骤如下：
(1)细胞传至6孔板中培养过夜，吸除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤1次，加入1毫升试剂盒所含的染色固定液，室温固定15分钟。
(2)吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
(3)吸除PBS，每孔加入1毫升染色工作液。工作液配方：染色液A(10μl)+染色液B(10μl)+染色液C(930μl)+X-Gal溶液(50μl)。
(4)用保鲜膜封住6孔板后，37℃孵育过夜。
(5)去除染色工作液，加入2毫升PBS，于普通光学显微镜下观察。
结果显示，SINHCAF干预修饰可显著降低hAMSC和mAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率。
4.2.采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平。
细胞裂解、蛋白样本制备、定量、跑胶、转膜、抗体孵育、洗膜、曝光、成像、灰度比值分析等步骤与前述类似。一抗采用p21一抗(Abcam，货号ab109199，1:1000稀释)和p16一抗(Abcam，人细胞样本采用ab108349，小鼠细胞样本采用ab211542，1:1000稀释)。
结果显示，SINHCAF干预修饰可显著降低hAMSC和mAMSC的p21和p16蛋白表达水平。
本发明的设计思路是构建SINHCAF干预修饰的AMSC，从而延缓甚或抑制AMSC细胞衰老，消除衰老相关的细胞功能损伤，提高细胞扩增能力。所述的细胞衰老包括但不限于传代扩增导致的复制性衰老，化疗药物、毒素、氧化应激、辐照等诱导的细胞衰老，老年个体或代谢性疾病个体来源细胞本身的衰老负荷。
本发明的另一个目的是提供SINHCAF干预修饰的AMSC(AMSC-SINHCAF)在制备治疗肝脏疾病生物制剂中的应用。
本发明还公开了AMSC-SINHCAF细胞制剂在治疗肝脏疾病中的作用及优势，具备以下作用中的任一项或多项：较之同等细胞数量的天然AMSC，AMSC-SINHCAF可更为有效地(1)发挥对肝衰竭等肝脏疾病的疗效；(2)降低血清ALT、AST水平；(3)缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死程度；(4)纠正肝组织细胞线粒体功能异常。
优选地，所述肝脏疾病包括但不限于药物或毒素诱导的急性肝损伤、肝炎、肝衰竭、肝纤维化。所述肝炎包括病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。
本发明提供的制备肝病治疗生物制剂，其主要细胞组分AMSC-SINHCAF的制备周期较传统细胞组分AMSC的制备周期可缩减50％以上；并且可消除衰老相关的AMSC细胞功能损伤，提升该AMSC制剂在肝病临床治疗中的应用潜能。
所述方法可以是体内的。也可以体外的，例如仅用于科学研究。
发明人在前期研究已成功建立了从脂肪组织分离培养MSC的技术。脂肪来源的MSC(AMSC)较之骨髓来源的MSC，其来源更为丰富，获取更为方便，扩增效率更高，因此在临床上具有良好的应用前景。但是我们在小鼠(mAMSC)及人的AMSCs(hAMSC)的体外培养扩增过程中均发现，随着体外传代次数的增加，AMSC表现出明显的衰老特征，如SA-β-gal染色增加，胞内p21和p16的蛋白表达水平升高，细胞和上清中细胞衰老相关分泌表型(SASP)相关因子水平也显著增加，并伴随着细胞增殖速率降低，细胞显著增大并呈扁平化以及细胞核的空泡化。同时，细胞线粒体也出现融合增大，线粒体ROS水平上调。另外，采用出现衰老表型的AMSC进行小鼠肝损伤及肝衰竭模型的治疗，发现其疗效亦显著降低，在抑制肝脏炎症、修复肝脏损伤、恢复肝功能等多个方面均与未衰老(状态良好)AMSC的疗效存在显著差异，甚至较之溶剂对照组无明确疗效。因而，本发明旨在提供一种通过表观遗传学修饰来缓解甚或抑制AMSC衰老，进而提高AMSC在肝衰竭等重大肝脏疾病中的治疗潜能的方法。
本发明的SINHCAF干预修饰的AMSCs的优点有：(1)较之天然AMSC扩增效率更高，并抵抗复制、化疗药物、辐射等多种因素诱导的细胞衰老；(2)可纠正老年个体或代谢性疾病患者脂肪组织来源AMSC的细胞衰老表型，提高该类AMSC的治疗潜能，为自体AMSC移植治疗衰老相关退行性疾病或代谢性疾病提供可行性；(3)所述的AMSC及其所制备的肝病治疗制剂或药物具有更好的肝脏疾病治疗效果。
附图说明
图1：AMSC细胞中SINHCAF蛋白及mRNA表达水平：A.SINHCAF干预修饰可降低小鼠mAMSC及成人hAMSC细胞中SINHCAF蛋白表达水平，而对SINHCAF的mRNA水平无影响。**P＜0.01，ns表示无统计学差异。
图2：SINHCAF干预修饰对AMSC衰老表型的影响：A.SINHCAF干预修饰可降低复制衰老模型的AMSC中SASP相关分子的表达水平。B.SINHCAF干预修饰可降低复制衰老模型的AMSC中p21和p16蛋白表达水平。C.SINHCAF干预修饰可降低复制衰老模型的AMSC中线粒体ROS水平。**P＜0.01，ns表示无统计学差异。
图3：SINHCAF干预修饰纠正老年小鼠AMSC的衰老表型：A.Western Blot实验显示，经SINHCAF干预修饰的oAMSC，其p21和p16蛋白表达水平显著低于对照组oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近。B.细胞ROS水平检测分析显示，oAMSC细胞中ROS水平显著高于yAMSC；而oAMSC-SINHCAF的ROS水平显著低于对照组oAMSC-Ctrl。**P＜0.01；yAMSC:6周龄年轻小鼠AMSC；oAMSC：16月龄老年小鼠AMSC。
图4：SINHCAF干预修饰纠正代谢性疾病小鼠来源AMSC的衰老表型：A.SA-β-gal染色结果显示，mdAMSC细胞的蓝染阳性率显著高于ncAMSC，而mdAMSC-SINHCAF细胞的蓝染阳性率显著低于对照组mdAMSC-Ctrl；B.活性氧(ROS)检测结果显示，mdAMSC细胞的的ROS水平显著高于ncAMSC，而mdAMSC-SINHCAF细胞的ROS水平明显低于对照组mdAMSC-Ctrl。**P＜0.01；mdAMSC:代谢性疾病模型小鼠AMSC；ncAMSC：同周龄正常小鼠AMSC。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1SINHCAF干预修饰影响AMSC细胞中SINHCAF蛋白表达水平：
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中SINHCAF的蛋白表达水平。并采用PCR法检测上述细胞中SINHCAF的mRNA表达水平。
如图1所示，经SINHCAF干预修饰的mAMSC(mAMSC-SINHCAF)，其SINHCAF蛋白表达水平明显低于对照组mAMSC-Ctrl和天然mAMSC；同样的，经SINHCAF干预修饰的hAMSC(hAMSC-SINHCAF)，其SINHCAF蛋白表达水平也明显低于对照组hAMSC-Ctrl和天然hAMSC；而hAMSC和mAMSC细胞中的SINHCAF mRNA水平在经SINHCAF干预修饰后，差异均不显著，显示该修饰主要是在转录后翻译水平影响了SINHCAF的表达。
实施例2SINHCAF干预修饰抵抗培养传代诱导的AMSC细胞衰老：
小鼠及成人脂肪组织来源的天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞分别传至第8代(mAMSC)和第20代(hAMSC)，建立培养传代诱导的细胞复制性衰老模型。
采用SA-β-gal染色法比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞的染色情况。光学显微镜计数5个视野的染色情况，并进行统计分析。结果显示，天然hAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率达39.5±6.4％、hAMSC-Ctrl的蓝染阳性率达44.1±5.4％，而hAMSC-SINHCAF细胞的蓝染阳性率仅为12.5±1.9％。天然mAMSC的SA-β-gal蓝染阳性率达67.9±8.8％、mAMSC-Ctrl的蓝染阳性率达71.6±8.7％，而mAMSC-SINHCAF细胞的蓝染阳性率仅为21.4±4.2％。
采用相对定量Real-time PCR法分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中衰老相关分泌表型Mmp3、Mmp13、PAI-1、MCP-1、TNF-ɑ和IL-6的表达水平(图2A)。结果显示，经SINHCAF干预修饰的AMSC，其SASP相关分子表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC。
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平。结果显示，经SINHCAF干预修饰的AMSC，其p21和p16蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC(图2B)。
线粒体融合增大及ROS水平增加是MSC衰老的一个重要标志。电镜观察细胞线粒体形态，MitoSOXTM Red染色(Thermofisher，M36008)分析线粒体ROS水平。结果显示，经SINHCAF干预修饰的AMSC，其线粒体融合增大程度明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC；并且，AMSC-SINHCAF细胞，其MitoSOXTM红色荧光水平亦明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSC(图2C)。
实施例3SINHCAF干预修饰抵抗化疗药物诱导的AMSC衰老：
采用多柔比星(Doxorubicin,Dox)诱导细胞衰老。AMSC铺6孔板，过夜培养，再加入100nM Dox处理48小时，然后换普通培养基再培养6天，收集细胞，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平。
结果显示，SINHCAF干预修饰可显著降低化疗药物诱导的AMSC细胞中p21和p16蛋白表达升高。另外，在5-FU诱导的细胞衰老模型中，也具有类似现象。表明SINHCAF干预修饰对多种化疗药物诱导的AMSC衰老均具有保护作用。
实施例4SINHCAF干预修饰抵抗辐射诱导的AMSC衰老：
采用137Csγ射线照射建立辐射诱导的hAMSC细胞衰老模型，细胞隔代进行5.0Gy的辐照。收集10代左右细胞，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平；采用SA-β-gal染色法比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞的染色情况。
结果显示，SINHCAF干预修饰可显著降低辐照诱导的AMSC细胞中p21和p16蛋白表达升高，并降低辐照所致的SA-β-gal蓝染阳性。表明SINHCAF干预修饰对辐照诱导的AMSC衰老也有保护作用。
实施例5SINHCAF干预修饰抵抗氧化应激等导致的AMSC衰老：
采用H2O2等诱导细胞衰老。AMSC铺6孔板，过夜培养，再加入50μM H2O2处理2小时，然后换普通培养基再培养48小时，收集细胞，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平。并采用碧云天公司的活性氧(ROS)检测试剂盒分析细胞ROS水平。
结果显示，SINHCAF干预修饰可显著降低H2O2诱导的AMSC细胞中p21和p16蛋白表达升高和ROS水平的升高。另外，在D-半乳糖等诱导的细胞衰老衰老模型中，也具有类似现象。表明SINHCAF干预修饰对氧化应激等诱导的细胞衰老也具有保护作用。
实施例6SINHCAF干预修饰逆转老年小鼠AMSC的衰老表型：
16月龄老年小鼠AMSC(oAMSC)感染SINHCAF慢病毒以构建SINHCAF干预修饰的细胞(oAMSC-SINHCAF)，以感染空慢病毒载体的oAMSC细胞(oAMSC-Ctrl)作为对照，并以6周龄年轻小鼠AMSC(yAMSC)作为比较。
上述细胞均取第4代，采用SA-β-gal染色法比较yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-SINHCAF细胞的染色情况。结果显示，yAMSC细胞的蓝染阳性率显著低于oAMSC；而经SINHCAF干预修饰的oAMSC，其蓝染阳性率显著低于对照组oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近。
采用Western Blot方法检测天然yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平。结果显示，yAMSC细胞中p21和p16蛋白表达水平显著低于oAMSC；而经SINHCAF干预修饰的oAMSC，其p21和p16蛋白表达水平显著低于对照组oAMSC-Ctrl，与yAMSC细胞中的水平相近(图3A)。
采用活性氧(ROS)检测试剂盒分析上述细胞ROS水平，也显示，oAMSC细胞中ROS水平显著高于yAMSC；而oAMSC-SINHCAF的ROS水平显著低于对照组oAMSC-Ctrl(图3B)。
实施例7SINHCAF干预修饰纠正代谢性疾病小鼠来源AMSC的衰老表型：
分离代谢性疾病小鼠(由高脂饮食和STZ处理诱导2型糖尿病合并脂肪肝模型小鼠，mdAMSC)，培养至第2代后，感染SINHCAF慢病毒以构建SINHCAF干预修饰的细胞(mdAMSC-SINHCAF)，以感染空慢病毒载体的mdAMSC细胞(mdAMSC-Ctrl)作为对照，继续传代培养至第4代；并以同周龄正常小鼠来源AMSC(ncAMSC)第4代细胞作为比较。
然后如实施例6所示，分别采用SA-β-gal染色法、Western Blot法、活性氧(ROS)检测试剂盒等分析细胞衰老特征。结果显示，mdAMSC细胞的蓝染阳性率、p21和p16表达水平、ROS水平均显著高于ncAMSC；而SINHCAF干预修饰则能明显纠正上述衰老特征，表现为mdAMSC-SINHCAF细胞的蓝染阳性率、p21和p16表达水平、ROS水平均显著低于对照组mdAMSC-Ctrl，与ncAMSC细胞中的水平相近(图4)。
实施例8SINHCAF干预修饰提高AMSC细胞扩增效率：
采用CCK8法比较天然hAMSC、hAMSC-Ctrl和hAMSC-SINHCAF细胞的增殖情况。结果显示，hAMSC-SINHCAF细胞的增殖速度明显高于天然hAMSC和hAMSC-Ctrl细胞；尤其在10代以后的细胞中，细胞增殖速度的差异更为显著；在20代以后，hAMSC-SINHCAF细胞较之天然hAMSC和hAMSC-Ctrl细胞，其增殖速度可提高2.5倍以上。
进一步比较天然mAMSC、mAMSC-Ctrl和mAMSC-SINHCAF细胞的传代次数。天然mAMSC、mAMSC-Ctrl在分别传至第9和第8代后，细胞增殖速率就明显降低，进入细胞周期停滞状态，几乎难以扩增；而mAMSC-SINHCAF细胞虽然在传代15次以后细胞增殖速度有所降低，但仍可继续传代扩增。
实施例9SINHCAF干预修饰可增强衰老AMSC对肝病线粒体异常的纠正作用：
C57小鼠腹腔注射APAP建立药物诱导的急性肝损伤(DILI)模型。造模后即刻尾静脉输注5×105的yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-SINHCAF细胞，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。造模12h后，处死小鼠并收集血清、肝组织进行肝功能、肝脏病理、线粒体动力学相关分子及线粒体功能等检测。
结果显示，年轻小鼠AMSC(yAMSC)对小鼠DILI模型的疗效显著优于老年小鼠AMSC(oAMSC)，表现为：更有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；纠正线粒体动力学相关分子(如MFN1、MFN2、OPA1、FIS1和p-DRP1/DRP1)水平；降低线粒体ROS水平，恢复线粒体膜电位，抑制线粒体通透性转换孔的开放。
SINHCAF干预修饰可显著提高oAMSC对肝衰竭小鼠模型的疗效，oAMSC-SINHCAF较之oAMSC-Ctrl可更为有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；纠正线粒体动力学相关分子表达水平。oAMSC-SINHCAF对肝衰竭的治疗效果与yAMSC相当，甚至在纠正线粒体功能异常上效果更优。
另外，SINHCAF干预修饰同样能增强复制性衰老及代谢性衰老AMSC对肝病线粒体异常的纠正作用。
实施例10SINHCAF干预修饰可增强衰老AMSC对肝衰竭小鼠模型的疗效：
C57小鼠腹腔注射LPS/GalN(10μg/kg的LPS+500mg/kg的D-GalN)建立急性肝衰竭模型。造模后即刻尾静脉输注5×105的yAMSC、oAMSC、oAMSC-Ctrl和oAMSC-SINHCAF细胞，并尾静脉注射对应体积的PBS作为对照组(Vehicle)。造模6h后，处死小鼠并收集血清、肝组织等进行肝功能、肝脏病理、炎症因子检测等。血清ALT、AST检测分别采用FUJIDRI-CHEMSlide GFP/ALT-PIII和GOT/AST-PIII试剂盒，用DRI-CHEM 4000ie(FUJIFILM)测定。肝脏病理采用HE检测。血清炎症因子采用相应ELISA试剂盒进行检测。
结果显示，年轻小鼠AMSC(yAMSC)对小鼠急性肝衰竭的疗效显著优于老年小鼠AMSC(oAMSC)，表现为：更有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。
SINHCAF干预修饰可显著提高oAMSC对肝衰竭小鼠模型的疗效，oAMSC-SINHCAF较之oAMSC-Ctrl可更为有效地降低血清ALT、AST水平；缓解肝脏炎症，减少肝组织坏死灶；降低血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。oAMSC-SINHCAF对肝衰竭的治疗效果与yAMSC相当，甚至在降低血清炎症因子水平上效果更优。
另外，SINHCAF干预修饰对复制性衰老及代谢性衰老AMSC的肝衰竭治疗作用也有显著提升作用。表现为在LPS/GalN诱导的肝衰竭模型中，高代数mAMSC或是mdAMSC尾静脉输注后不能有效缓解肝损伤，降低血清ALT、AST和炎症因子水平；而高代数mAMSC-SINHCAF较之同代数mAMSC-Ctrl，mdAMSC-SINHCAF较之mdAMSC-Ctrl则能明显改善肝脏病理和肝功能，对肝脏炎症亦有明确的控制作用。
在ConA、APAP、CCl4等其他因素诱导的小鼠急慢性肝损伤模型中，同样显示SINHCAF干预修饰可显著提高衰老AMSC的疗效。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种抗间充质干细胞衰老修饰方法及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 577
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 1
cgcctcagag ccgcccgccg ttcctttttc ctatgcatat acttctttga ggatctggcc 60
taaagaggta tagggcatgg gaaaacgggg cggtcgggtc ctccccagcg cagtagtcca 120
gaggacacct ccactccgtc tacccagtgt ttagactatc tgttcaggac tcccaaattg 180
tacagtagtc tgcacattgg ttaggctggg ctgggttaga ccctcggcag tagtcagtag 240
tgtacttggg cagtagtgta gagattggtt tgcctgttaa tgaattcaaa ctaatctcta 300
cactgctgcc caagagccag tagtcctgcc ggggctaaag tgctgacagt gcagatagtg 360
gtcctctccg tgctaccgca ctgtgggtac ttgctgctcc agcagggtag cactaaagtg 420
cttatagtgc aggtagtgtt tagttatcta ctgcattatg agcacttaaa gtactgcaca 480
gtattggggc cctggctggg atatcatcat atactgtaag tttgcgatga gacactacag 540
tatagatgat gtactagtcc gggcaccccc acagtat 577
<210> 2
<211> 469
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
gttccttttt cctatgcata tacttctttg tggatctggt ctaaagaggt atagcgcatg 60
ggaagatgga gccagtagtg ccatcccagt gttcagacta cctgttcagg aggctgggac 120
atgtacagta gtctgcacat tggttaggcc agtagtccag aggatacctc cactccgtct 180
acccagtgtt tagactacct gttcaggact cccaaattgt acagtagtct gcacattggt 240
taggctgggc tgggttagac cctcggcagt agtcagcatg tggaacactg taaagtgctg 300
tgtcacggac actgactttt caaagtccag taagtcagtc tgcttagagg tcagtgggca 360
atactatgct atgttctggc cccatgttta cagtatggct gggatatcat catatactgt 420
aagtttgtga tgagacacta cagtatagat gatgtactag tcacagtat 469

Claims (2)

1.一种非疾病治疗目的的抗间充质干细胞衰老修饰方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
（1）脂肪来源的间充质干细胞的制备：
小鼠AMSC和成人AMSC按常规方法分离，mAMSC和hAMSC分别采用STEMCELL™公司的小鼠和人MesenCult™扩增试剂盒再添加L-谷氨酰胺作为完全培养基进行培养扩增，AMSC增殖接近75%融合时，进行消化、传代；
（2）SINHCAF修饰的AMSC的构建：
a.SINHCAF修饰的hAMSC的构建：以hSINHCAF慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-SINHCAF感染hAMSC，hSINHCAF慢病毒载体包含目的片段序列如SEQ:NO.1所示，为包含hSINHCAFmRNA的3’-UTR区的靶向结合序列；
b.SINHCAF修饰的mAMSC的构建：
以mSINHCAF慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-SINHCAF感染mAMSC，mSINHCAF慢病毒载体包含目的片段序列如SEQ:NO.2所示，为包含mSINHCAF mRNA的3’-UTR区的靶向结合序列；以感染空慢病毒的mAMSC作为对照；
（3）AMSC-SINHCAF中SINHCAF表达水平分析：
采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中SINHCAF的蛋白表达水平；具体步骤如下：
（a）消化离心收集细胞，收集上清；
（b）进行蛋白定量；
（c）细胞蛋白样本上样、跑胶、转膜、SINHCAF一抗孵育、用HRP标记的抗兔二抗孵育、洗膜；
（d）条带进行灰度比值分析，结果显示，经SINHCAF干预修饰的AMSC，其SINHCAF蛋白表达水平明显低于对照组AMSC-Ctrl和天然AMSCs，可下调至15~50%水平；
（4）在体外培养传代诱导的细胞复制衰老模型中分析天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞衰老表型：
采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒比较天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞的染色情况，采用Western Blot方法检测天然AMSC、AMSC-Ctrl和AMSC-SINHCAF细胞中p21和p16蛋白表达水平，显示，SINHCAF干预修饰可显著降低hAMSC和mAMSC的p21和p16蛋白表达水平。
2.权利要求1所述方法提供的SINHCAF干预修饰的AMSC在制备治疗肝脏疾病生物制剂中的应用，其特征在于，通过构建SINHCAF干预修饰的AMSC，从而延缓甚或抑制AMSC细胞衰老，消除衰老相关的细胞功能损伤，提高细胞扩增能力，所述肝脏疾病为肝衰竭、药物或毒素诱导的急性肝损伤。
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